PL228161B1 - Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR - Google Patents
Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCRInfo
- Publication number
- PL228161B1 PL228161B1 PL403996A PL40399613A PL228161B1 PL 228161 B1 PL228161 B1 PL 228161B1 PL 403996 A PL403996 A PL 403996A PL 40399613 A PL40399613 A PL 40399613A PL 228161 B1 PL228161 B1 PL 228161B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- fungi
- primers
- detection
- amplification
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 62
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims description 54
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 title claims description 12
- 230000010244 detection of fungus Effects 0.000 title claims description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 69
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 46
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 46
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 40
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 39
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 19
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 14
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 20
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000037815 bloodstream infection Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000033629 detection of yeast Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- OMDQUFIYNPYJFM-XKDAHURESA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-2-(hydroxymethyl)-6-[[(2r,3s,4r,5s,6r)-4,5,6-trihydroxy-3-[(2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]methoxy]oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O1 OMDQUFIYNPYJFM-XKDAHURESA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 1
- 229920000926 Galactomannan Polymers 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 208000006218 bradycardia Diseases 0.000 description 1
- 230000036471 bradycardia Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008718 systemic inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego metodą PCR oraz zestaw do wykrywania tych drobnoustrojów w próbce materiału biologicznego. Wynalazek dostarcza sposobu do realizacji jednoczesnej detekcji DNA bakterii Gram ujemnych, Gram dodatnich, grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych w próbce materiału biologicznego, np. ślinie czy krwi pacjenta.
Zakażenia wywoływanie przez bakterie i grzyby od zawsze stanowiły poważny problem medyczny. Najgroźniejszym z nich są zakażenia ogólnoustrojowe czyli sepsy. Mimo postępów w ich leczeniu osiągniętych głównie dzięki zastosowaniu antybiotykoterapii oraz wprowadzenia do praktyki medycznej technologii pozwalających na długotrwałe podtrzymywanie czynności życiowych u pacjentów znajdujących się w stanie krytycznym, nadal nie udaje się utrzymać przy życiu wielu chorych. Paradoksalnie, w miarę rozwoju wiedzy medycznej i wprowadzaniu do lecznictwa coraz to nowszych procedur terapeutycznych, zapadalność na sepsę się zwiększa. Lever i wsp. donoszą że w USA w ciągu roku na sepsę zapada 750 000 osób i jest ona przyczyną ponad 215 000 zgonów. W Unii Europejskiej z powodu ciężkiej sepsy umiera rocznie 146 tys. chorych, w samej tylko Wielkiej Brytanii śmiertelność z jej powodu waha się w przedziale 30 do 50/100 000 w ciągu roku, co plasuje sepsę w czołówce dziesięciu najczęstszych przyczyn śmierci. W krajach rozwiniętych sepsa rozwija się u 2-4/1000 żywo urodzonych dzieci i jest ona główną przyczyną ich śmierci. W Polsce brak jest dokładnych danych epidemiologicznych, ale Zieliński i wsp. podają, że w 2005 roku z powodu sepsy nastąpiło 967 zgonów w tym 43 zgony dzieci. Zwiększająca się śmiertelność z powodu sepsy jest skutkiem narastającej oporności na antybiotyki, stosowania inwazyjnych metod leczenia oraz starzenia się społeczeństwa. Sepsa jest największym zagrożeniem dla osób z obniżoną odpornością, zwłaszcza, kiedy są one długotrwale hospitalizowane, głównie na oddziałach intensywnej opieki medycznej. Dotyka ona zwłaszcza pacjentów ze schorzeniami nowotworowymi, poddawanych immunosupresji, chorych oparzonych, osób w podeszłym wieku oraz dzieci.
W leczeniu zakażeń krwi najważniejszym i najtrudniejszym problemem decydującym o skuteczności terapii i w konsekwencji o kosztach i czasie hospitalizacji jest skuteczna diagnostyka czynników wywołujących ogólnoustrojową odpowiedź zapalną w przebiegu sepsy. Oznaczenie czynnika etiologicznego (mikroorganizm: grzyb lub bakteria) pozwala na zastosowanie skutecznej, celowanej antybiotykoterapii. Materiałem poddawanym badaniu diagnostycznemu jest korzystnie krew pobrana od pacjenta manifestującego objawy kliniczne sepsy np. tachykardię, bradykardię, podwyższoną lub obniżoną ciepłotę ciała, spadek ciśnienia tętniczego krwi, i in.
Krew, jako materiał do badań mikrobiologicznych stawia największe wyzwania spośród wszystkich materiałów biologicznych. Największą trudność sprawia to, że mikroorganizmy odpowiedzialne za zakażenie znajdują się we krwi w bardzo niskich ilościach, lub też następuje tylko ich okresowy wysiew do krwi.
Mimo to, obecnie standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej (np. BACTEC - BectonDickinson). Do zalet tych metod należy ich prostota oraz względnie niski koszt wykonania badania. Słabą stroną metody opartej na hodowli krwi jest jej czasochłonność, sięgająca nawet 5 dni (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje że jedynie w ok. 15-20% hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów. Wskutek tego w zdecydowanej większości przypadków lekarz może stosować jedynie antybiotykoterapię empiryczną z powodu braku uzyskania wzrostu mikroorganizmów odpowiedzialnych za infekcję. Sytuację dodatkowo pogarsza fakt poddawania pacjentów antybiotykoterapii zanim dojdzie do pobrania próbek krwi na posiew - chorzy są często leczeni antybiotykami zanim dojdzie do manifestacji objawów sepsy. Hodowle krwi w takim wypadku są bardzo utrudnione z uwagi na to, iż znajdują się w niej antybiotyki hamujące wzrost mikroorganizmów. Aby zwiększyć szansę na wykrycie czynników mikrobiologicznych we krwi, podejmowane są próby oparcia ich detekcji na metodach serologicznych np. na wykrywaniu lipopolisacharydu (LPS) bakterii Gram-ujemnych czy galaktomannanu grzybów.
Innym celem molekularnym, który umożliwia skuteczną, precyzyjną i szybką diagnostykę zakażeń krwi są kwasy nukleinowe drobnoustrojów będących czynnikami etiologicznymi infekcji. Zarówno DNA, jak i RNA każdego organizmu zawiera sekwencje unikalne dla niego, stanowiące swoisty „odcisk palca”. Dzięki znajomości tych sekwencji możliwe jest zastosowanie metod biologii molekularnej, takich jak PCR czy hybrydyzacja do oznaczania obecności mikroorganizmów we krwi. Czułość metod
PL 228 161 B1 molekularnych znacznie przewyższa czułość metody hodowlanej. Poza tym wcześniejsze zastosowanie antybiotykoterapii nie wpływa na wynik badania z uwagi na to, że nie ma potrzeby uzyskania wzrostu bakterii czy grzybów na podłożu hodowlanym, a jedynie wykrycie ich sekwencji DNA czy RNA.
Liczne zgłoszenia i opisy patentowe, jak przykładowo EP2547782, EP2087134, EP1978111 czy EP2009118, ujawniają zastosowanie metod PCR do detekcji specyficznych mikroorganizmów w oparciu o zaprojektowane startery.
Zgłoszenie EP2547782 ujawnia detekcję mikroorganizmów z grupy Staphyllococus w systemie multiplex PCR w oparciu o zaprojektowane sondy i startery, jednakże bez zastosowania systemu Nested PCR.
Istotą wynalazku jest sposób detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego, w którym DNA zawarte w próbce materiału biologicznego poddaje się amplifikacji w reakcji PCR w czasie rzeczywistym w systemie multipleksowym, przy czym reakcję amplifikacji prowadzi się dwuetapowo z zastosowaniem w pierwszym etapie starterów specyficznych dla bakterii i starterów specyficznych dla grzybów, a następnie produkt pierwszej amplifikacji wykorzystuje się jako matrycę w drugim etapie - amplifikacji z zastosowaniem starterów i sond różnicujących grzyby na grupę grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych i bakterie na Gram-dodatnie i Gram-ujemne.
Jako startery specyficzne dla bakterii stosuje się startery specyficzne dla sekwencji 16S rRNA bakterii, korzystnie oligonukleotydy o następujących sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| NEST_BAC_F | GGCGGACGGGTGAGTAA |
| NEST_BAC_R | CGCATTTCACCGCTA |
Jako startery specyficzne dla grzybów stosuje się startery specyficzne dla sekwencji 18S rRNA grzybów, korzystnie oligonukleotydy o następujących sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| NEST_FUN_F | AATTGACGGAAGGGCACC |
| NEST_FUN_R | TTCCTCGTTGAAGAGCAA |
Zgodnie ze sposobem według wynalazku w drugim etapie amplifikacji do wykrywania i identyfikacji bakterii stosuje się startery o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| GN/GP_F | GACTCCTACGGGAGGC |
| GN/GP_R | GCGGCTGCTGGCAC |
i sondy o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| GP_Probe | Hex-CTGAyssAGCAACGCCGCG-TAMRA (Q) |
| GN_Probe | Cy5-CCTGAysCAGCmATGCCGCG-BHQ-2 |
natomiast do amplifikacji do wykrywania i identyfikacji grzybów stosuje się startery o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| FUN_F | TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT |
| FUN_R | TCTAAGGGCATCACAGACCTG |
PL 228 161 B1 i sondy o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| Candid_probe | FAM-TAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1 |
| Asperg_probe | TexasRed-TCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGC- |
Korzystnie, w sposobie według wynalazku detekcję bakterii i grzybów prowadzi się w próbce materiału biologicznego izolowanego z pacjenta, korzystnie z krwi pacjenta z objawami sepsy.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego metodą nested-multiplex-real time PCR, zawierający następujące oligonukleotydy:
do detekcji bakterii startery specyficzne dla 16S rRNA bakterii:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| NEST_BAC_F | GGCGGACGGGTGAGTAA |
| NEST_BAC_R | CGCATTTCACCGCTA |
i
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| GN/GP_F | GACTCCTACGGGAGGC |
| GN/GP_R | GCGGCTGCTGGCAC |
oraz sondy specyficzne dla 16S rRNA bakterii o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| GP_Probe | Hex-CTGAyssAGCAACGCCGCG-TAMRA (Q) |
| GN_Probe | Cy5-CCTGAysCAGCmATGCCGCG-BHQ-2 |
oraz do detekcji grzybów startery specyficzne dla 18S rRNA grzybów:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| NEST_FUN_F | AATTGACGGAAGGGCACC |
| NEST_FUN_R | TTCCTCGTTGAAGAGCAA |
i
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| FUN_F | TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT |
| FUN_R | TCTAAGGGCATCACAGACCTG |
oraz sondy specyficzne dla 18S rRNA grzybów o sekwencjach:
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' - 3' |
| Candid_probe | FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1 |
| Asperg_probe | TexasRed-TCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGC- |
PL 228 161 B1
Zastrzegany sposób detekcji bazuje na reakcji PCR w czasie rzeczywistym (real time) w systemie multiplex, z możliwą jednoczesną amplifikacją co najmniej dwóch sekwencji DNA. Ponadto, sposób według wynalazku realizuje metodę multiplex PCR w systemie Nested tj. reakcję dwustopniowej amplifikacji, co zwiększa znacznie czułość detekcji.
Zastrzegany sposób umożliwia detekcję wszystkich gatunków grzybów oraz bakterii (z różnicowaniem na bakterie Gram-dodatnie, Gram-ujemne, grzyby drożdżowe i grzyby pleśniowe) w próbkach DNA izolowanych z krwi pacjentów manifestujących objawy sepsy. Możliwe jest wykorzystanie metody do wykrywania tylko bakterii lub tylko grzybów, ale równocześnie zaletą sposobu jest możliwość wykorzystania do jednoczesnego wykrywania zarówno grzybów jak i bakterii, co wpływa na obniżenie kosztów badania.
Detekcja produktów PCR I amplifikacji nie jest wymagana, bowiem ostateczny wynik badania diagnostycznego jest widoczny w II amplifikacji. Jeśli w I amplifikacji nie uda się uzyskać namnożenia DNA przy wykorzystaniu zaprojektowanych starterów, to podczas II etapu amplifikacji także otrzymamy wynik negatywny (brak drobnoustrojów w próbce materiału biologicznego). Nie wyklucza to jednak przeprowadzenia po zakończeniu I amplifikacji detekcji produktu z zastosowaniem elektroforezy DNA w żelu, ewentualnie z zastosowaniem metod spektrofotometrycznych.
Detekcja i identyfikacja produktów PCR etapu II amplifikacji następuje już w trakcie trwania procesu namnażania DNA. Zastosowane sondy GP_probe, GN_probe, Candid_probe, Asperg_probe przyłączają się specyficznie do powstających produktów namnażania sekwencji DNA typowych dla bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych i emitują światło fluorescencyjne rejestrowane przez detektor w trakcie amplifikacji. Każda z czterech sond wyposażona jest w znacznik fluoryzujący o ściśle określonej, typowej dla danej sondy długości emisji fali światła, co pozwala na zróżnicowanie pomiędzy konkretnymi czterema grupami mikroorganizmów.
Wynalazek wykorzystuje specyficzne startery uniwersalne dla bakterii i startery uniwersalne dla grzybów, których zastosowanie do amplifikacji materiału genetycznego próbek metodą PCR pozwala na objęcie całości panelu mikroorganizmów bakteryjnych i grzybiczych (z różnicowaniem na bakterie Gram-ujemne, Gram-dodatnie, grzyby drożdżowe i grzyby pleśniowe) lecz bez typowania konkretnych gatunków. Taka informacja jest dla lekarza bardzo przydatna w dobraniu odpowiedniego leczenia, zanim dotrze wynik identyfikacji z laboratorium mikrobiologicznego określający gatunek bakterii, czy grzybów.
Obecnie stosowane systemy nie posiadają wskazanej uniwersalności. Stosowane systemy (np. SeptiFast - Roche) umożliwiają wykrywanie kilkunastu konkretnych gatunków drobnoustrojów, lub (jak SeptiTest - Molzym) pozwalają na detekcję teoretycznie każdego możliwego gatunku, ale wymagane jest sekwencjonowanie produktu PCR, co zwiększa koszty oraz wydłuża czas oczekiwania na wynik.
Sposób według wynalazku wykorzystujący techniki multiplex real-time PCR pozwala na jednoczesną detekcję bakterii i grzybów w czasie rzeczywistym, bez oczekiwania na wyniki elektroforezy DNA, jak ma to miejsce w przypadku klasycznej metody PCR. Dodatkowo, zastosowanie systemu Nested pozwala na zwiększenie czułości metody detekcji o dwa rzędy wielkości w porównaniu do PCR jedno stopniowego. Nie jest także konieczne zastosowanie sekwencjonowania produktu PCR w celu identyfikacji konkretnego gatunku mikroorganizmu.
Sposób według wynalazku pozwala na szybkie wykrywanie wszystkich gatunków grzybów (z rozróżnieniem na drożdżowe i pleśniowe) oraz wszystkich gatunków bakterii (z rozróżnieniem na Gram-ujemne i Gram-dodatnie), bez identyfikacji konkretnych gatunków. Sposób detekcji pozwala szybko, z dużą czułością potwierdzić obecność zakażenia, przezwyciężając wady komercyjnie dostępnych metod, które wymagają więcej czasu i całego spektrum eksperymentów wycelowanych w konkretne, najczęściej występujące gatunki.
W zastrzeganym sposobie wytypowanie konkretnego gatunku drobnoustroju jest również możliwe po sekwencjonowaniu produktu PCR uzyskanego w amplifikacji I lub II, jednakże do wstępnej diagnozy nie jest to wymagane.
W korzystnych przykładach wykonania wynalazek przedstawiony został na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia sekwencje 18S rRNA grzybów z zaznaczonymi zaprojektowanymi starterami NEST_FUN_F, NEST_FUN_R (szara ramka) oraz znanymi z publikacji starterami FUN_F, FUN_R (przeźroczysta ramka) - sekwencje znajdują się na jednej nici DNA, zatem zaznaczona w szarej ramce sekwencja końcowa jest odwrócona i komplementarna w stosunku do zsyntetyzowanego odpowiednika R;
PL228 161 Β1
Fig. 2 przedstawia sekwencje 16S rRNA bakterii z zaznaczonymi zaprojektowanymi starterami NEST_BAC_F, NEST_BAC_R (szara ramka) oraz znanymi z publikacji starterami GN/GP_F, GN/GP_R (przeźroczysta ramka) - sekwencje znajdują się na jednej nici DNA, zatem zaznaczona w szarej ramce sekwencja końcowa jest odwrócona i komplementarna w stosunku do zsyntetyzowanego odpowiednika R;
Fig. 3 przedstawia porównanie odsetek wyników pozytywnych uzyskanych z badania sposobem według wynalazku 102 próbek krwi pochodzących od pacjentów z klinicznymi objawami sepsy: systemowo oraz z rozbiciem na cztery grupy mikroorganizmów; natomiast
Fig. 4 przedstawia porównanie odsetek wyników pozytywnych w badaniu 102 próbek krwi od pacjentów z klinicznymi objawami sepsy przy użyciu metody posiewu w systemie BACTEC oraz zgodnie ze sposobem według wynalazku.
Część eksperymentalna
Metodyka amplifikacji DNA drobnoustrojów zrealizowana została na matrycy DNA wyizolowanego z krwi ludzkiej.
Amplifikacja w systemie Nested (gniazdowym) była prowadzona w dwóch oddzielnych etapach amplifikacji oznaczonych rzymskimi literami I i II. W etapie I użyte zostały zaprojektowane nowe startery specyficzne dla Procaryota (bakterie) oraz Eucaryota (grzyby), specyficzne dla sekwencji jednostki 16S rRNA (bakterie) i 18S rRNA (grzyby). Następnie, produkt pierwszej (I) amplifikacji PCR został wykorzystany, jako matryca w procesie drugiej (II) amplifikacji, gdzie zastosowanie znalazły znane z literatury startery i sondy różnicujące grzyby na grupę grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych oraz bakterie na bakterie Gram-dodatnie i bakterie Gram-ujemne. Zastosowanie systemu Nested PCR pozwala na zwiększenie czułości metody.
W sposobie według wynalazku zastosowano startery oraz sondy TaqMan znane z literatury, przy czym w projekcie opracowano system multipleks, pozwalający połączyć je w jednej reakcji.
Startery dla I amplifikacji projektowano i testowano in silico przy wykorzystaniu bazy BLAST/NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), co ilustruje Fig. 1. W celu oznaczenia czułości metody przeprowadzono izolację DNA z próbek krwi (pochodzących od zdrowych wolontariuszy), które sztucznie zakażano drobnoustrojami wzorcowymi: bakterie Gram-ujemne - Escherichia coli ATCC 25922 (American Type Culture Collection); bakterie Gram-dodatnie - Staphylococcus aureus ATCC 33497; grzyby drożdżopodobne - Candida albicans ATCC 10231, grzyby pleśniowe - Aspergillus fumigatus ATCC 14110, tak aby wytworzyć gradient ich liczby we krwi. Wyizolowane DNA wykorzystywano do przeprowadzenia zaprojektowanej amplifikacji multiplex PCR w systemie Nested. Wyniki oznaczenia czułości metody zamieszczono w Tabeli 1. Tabela 1 zawiera również dane porównawcze dla amplifikacji z pominięciem systemu Nested, w którym zastosowano zaprojektowane startery, jednakże zmniejszeniu ulega wówczas czułość metody.
Tabela 1
Czułość detekcji bakterii oraz grzybów we krwi przy pomocy metody real-time PCR w odmianie NESTED multiplex PCR oraz multiplex PCR z zaprojektowanymi starterami
| Grupy mikroorganizmów / gatunek | Czułość metody multiplet real-time PCR [CFU/ml] | |
| NESTED multiplex PCR | Multiplex PCR | |
| Grzyby pleśniowe {A. fumigatus) | 4,0 x 102 | 3,25 x 104 |
| Grzyby drożdżowe (C. albicans) | 2,0 x 101 | 9,5 x 102 |
| Bakterie Gram (-) (c. coli) | 6,5 x 102 | 5,2 x 103 |
| Bakterie Gram (+) (S. aureus) | 6,0 x 102 | 5,i x 103 |
Sekwencje stosowanych oligeonukleotydów (sond i starterów) zestawiono w Tabeli 2.
PL228 161 Β1
Tabela 2
Sekwencje starterów i sond wykorzystanych w badaniach
| oligonukleotyd | Sekwencja 5' -3’ | Sekwencje docelowe |
| NESI_BAC_F * | GGCGGACGGGTGAGTAA | 16S rRNA |
| NESI_BAC_R * | CGCATTTCACCGCTA | 16S rRNA |
| NEST_FUN_F * | AATTGACGGAAGGGCACC | 18S rRNA |
| NESI_FLN_R * | TTCCTCGTTGAAGAGCAA | 18S rRNA |
| FUN_F | TTGGTGG AGTG ATTTGTCTG CT | 18S rRNA |
| FUN_R | TCTAAGGGCATCACAGACCTG | 18S rRNA |
| Candid_probe | FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1 | 18S rRNA |
| Asperg_probe | TexasRed-TCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGC-Eclipse | 18S rRNA |
| GN/GP_F | GACTCCTACGGGAGGC | 16S rRNA |
| GN/GP_R | GCGGCTGCTGGCAC | 16S rRNA |
| GP_Probe | Hex- CTGAyssAGCAACGCCGCG -TAMRA (Q) | 16S rRNA |
| GN_Probe | Cy5 -CCTGAysCAGCmATGCCGCG- BHQ-2 | 16S rRNA |
* sekwencje starterów wykorzystane dla potrzeb wynalazku
Skład mieszanin reakcyjnych multiplex PCR oraz multiplex PCR w systemie Nested podano w Tabeli 3, gdzie dodatkowo umieszczono stosowane odczynniki oraz profile termiczne amplifikacji.
PL228 161 Β1
Tabela 3
Skład mieszanin reakcyjnych, użyte odczynniki oraz profile termiczne reakcji PCR
| NESTED multiplex PCR | Multiplex PCR | ||
| I amplifikacja [objętość końcowa25 μΙ] | II amplifikacja [objętość końcowa 10 μΙ] | [objętość końcowa 40 μΙ] | |
| 1. Woda 6,7 μ| 2. Bufor B 2,5 μΙ 3. NESTBACF 0,125 μΙ 4. NEST_ BACR 0,125 μΙ 5. NEST FUN F 0,125 μΙ 6. NEST FUN R 0,125 μΙ 7. dNTP's 2,5 μΙ 8. MgCIz 2,5 μΙ 9. Polimeraza 0,3 μΙ 10. Perpetual Taq 11. DNA 10 μΙ | 1. Woda 2,08 μ| 2. Bufor B 1,0 μ| 3. GN/GPF 0,2 μ| 4. GN/GP_R 0,2 μΙ 5. GP probe 0,05 μΙ 6. GN probe 0,05 μΙ 7. FUN_F 0,2 μ| 8. FUN_R 0,2 μΙ 9. Asperg prob 0,05 μΙ 10. Candid_probe 0,05 μΙ 11. dNTP's 1,0 μ| 12. MgCIz 1,8 μ| , 13. Polimeraza 0,12 μΙ Perpetual Taq 14. DNA 3,0 μΙ (produkt 1 amplif ikacji) | 1. Woda 0,4 μ| 2. Bufor B 5,0 μ| 3. GN/GP_F 1,0 μΙ 4. GN/GPR 1,0 μ| 5. GP probe 0,25 μΙ 6. GN probe 0,25 μΙ 7. FUN_F 1,0 μ| 8. FUN_R 1,0 μΙ 9. Asperg_prob 0,25 μΙ 10. Candid_probe 0,25 μΙ 11. dNTP's 5,0 μ| 12. MgCIz 9,0 μΙ 13. Polimeraza ο,θ μ| Perpetual Taq 14. DNA 25,0 μΙ | |
| • Bufor B 10x (EURx) » dNTP's 2mM (EURx) • MgCI2 mM (DNAGdansk) • Polimeraza Perpetual Taq 2,5 U/μΙ (EURx) • *NEST_BAC_F 10 μΜ (Genomed) — starter Nested do wykrywania bakterii • *NEST_BAC_R 10 μΜ (Genomed)-starter Nested do wykrywania bakterii • *NEST_FUN_F 10 μΜ (Genomed)-starter Nested do wykrywania grzybów • *NEST_FUN , R 10 μΜ (Genomed) - starter Nested do wykrywania grzybów • GN/GPF 20μΜ (Genomed) - starter Nested do wykrywania bakterii » GN/GP_R 20μΜ (Genomed)-starter Nested do wykrywania bakterii • GP_probe 20μΜ (Genomed) - sonda do wykrywania bakterii Gram ujemnych • GN probe 20μΜ (Genomed)-sonda do wykrywania bakterii Gram dodatnich • FUN F 20μΜ (Genomed) - starter do wykrywania grzybów • FUN_R 20μΜ (Genomed)-starter do wykrywania grzybów • Asperg_prab 20μΜ (Genomed)-sonda do wykrywania grzybów pleśniowych • Cardid probe 20μΜ (Genomed)-sonda do wykrywania grzybówdrożdżowych | |||
| 95°C-5min 95°C-20 sec” | 1ΙΊ .. | 95°C-5min 95°C-15sec - 40x | 95°C-5 min 95°C-15sec - 40x |
| 46°C-20 sec _ 72 UC - 30 sec | ju x | 55 °C-lmin | 65°C-lmin |
* Sekwencje wykorzystanych starterów
PL228 161 Β1
Przykład 1
Nested-multiplex-real time PCR do równoczesnej detekcji bakterii i grzybów Przeprowadzono badanie z wykorzystaniem zaprojektowanej metody Nested-multiplex-real time
PCR na 102 próbkach DNA izolowanego z krwi pacjentów manifestujących objawy kliniczne sepsy w celu detekcji bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych. Pierwszą amplifikację pobranego DNA przeprowadzono w objętości końcowej 25 μΙ w obecności starterów NEST_BAC_F, NEST_BAC_R, NEST_FUN_F, NEST_FUN_R o sekwencjach podanych w Tabeli 1, stosując Polimerazę Perpetual Taq, realizując 30 cykli o parametrach temperatury i czasu podanych w Tabeli 4. Następnie 3 μΙ mieszaniny z I etapu amplifikacji zawierającej namnożone DNA wykrywanego drobnoustroju, poddano II amplifikacji w objętości końcowej 10 μΙ mieszaniny opisanej w Tabeli 4, realizując 40 cyklów termicznych.
Tabela 4
Skład mieszanin reakcyjnych, użyte odczynniki oraz profile termiczne reakcji PCR
| NESTED multiplex PCR | |
| I arrplifikacja [objętość końcowa25 μΙ] | II amplifikacja [objętość końcowa 10 μΙ] |
| 1. Woda 6,7 μ! 2. Bufor B 2,5 μΙ 3. NEST BAC F 0,125 μΙ 4. NEST_BAC_R 0,125 μΙ 5. NEST FUN F 0,125 μΙ 6. NEST_FUN_R 0,125 μΙ 7. dNTP's 2,5 μ| 8. MgCI2 2,5 μΙ 9 Polimeraza 0,3 μΙ Perpetual Taq 10. DNA 10 μΙ | 1. Woda 2,08 μΙ 2. Bufor B 1,0 μ| 3. GN/GPF 0,2 μΙ 4. GN/GP_R 0,2 μΙ 5. GPprobe 0,05 μΙ 6. GN_probe 0,05 μΙ 7. FUN_F 0,2 μΙ 8. FU N R 0,2 μΙ 9. Asperg_prob 0,05 μΙ 10. Candid_probe 0,05 μΙ 11. dNTP's 1,0 μΙ 12. MgCI2 1,8 μΙ . 13. Polimeraza 0,12 μΙ Perpetual Tacj |
| 14. DNA (produkt 1 3,0 μΙ amplifikacji) | |
| 95°C-5min 95°C-20sec“| „„ 30 X 46 C - 20 sec 72 °C- 30 sec | 95°C-5min 95°C-15secJ- 40 x 65°C-lmin |
PL228 161 Β1
Detekcję i identyfikację produktów PCR II amplifikacji prowadzono w trakcie trwania procesu namnażania DNA. Zastosowane sondy GP_probe, GN_probe, Candid_probe, Asperg_probe, po przyłączeniu specyficznie do powstających produktów namnażania sekwencji DNA typowych dla bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych emitowały światło fluorescencyjne rejestrowane przez detektor w trakcie amplifikacji, umożliwiające identyfikację namnożonego produktu.
Uzyskane wyniki porównano z dostępnymi wynikami z posiewów tych samych 102 próbek krwi, uzyskanych z klasycznej metody diagnostyki sepsy, opartej na hodowli w systemie automatycznym BACTEC (BectonDickinson). We wszystkich próbkach potwierdzono rezultaty uzyskane z posiewu oraz dodatkowo uzyskano pozytywne wyniki na obecność bakterii i grzybów w części próbek ujemnych w posiewie. Potwierdza to wysoką czułość nowej metody. Szczegółowe wyniki przedstawiono na fig. 3 i 4.
Przykład 2
Nested-multiplex-real time PCR do detekcji bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Detekcję przeprowadzono analogicznie do metody stosowanej w Przykładzie 1, stosując startery NEST_BAC_F i NEST_BAC_R do amplifikacji DNA bakterii, w warunkach opisanych w Tabeli 5.
Tabela 5
Skład mieszanin reakcyjnych, użyte odczynniki oraz profile termiczne reakcji PCR do detekcji bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych
| NESTED multiplex PCR | ||
| I amplifikacja [objętość końcowa25 μΙ] | II amplifikacja [objętość końcowa | 0 μΙ[ |
| 1) Woda 6,95 μΙ | 1) Woda | 2,58 μΙ |
| 2) Bufor B 2,5 μΙ | 2) Bufor B | ι,ο μΐ |
| 3) NEST BAC F 0,125 μΙ | 3) GN/GPF | o,2 μΙ |
| 4) NESTBACR 0,125 μΙ | 4) GN/GP_R | 0,2 μΙ |
| 5) dNTP‘s 2,5 μ| | 5) GPprobe | 0,05 μΙ |
| 6) MgCl2 2,5 μ| | 6] GNprobe | 0,05 μΙ |
| 7) Polimeraza 0?3 μΙ | 7) dNTP's | 1,0 μΙ |
| 8) Perpetual Taq | 8) MgClz | 1,8 μΙ |
| 9) DNA 10 μΙ | 9) Polimeraza | 0,12 μΙ |
| 10) Perpetual Taq | ||
| 11) DNA | 3,0 μΙ | |
| (produkt 1 | ||
| amplifikacji) | ||
| 95°C-5min | 95°C-5 min | |
| 95°C-20 sec~| | 95 °C-15 sec l· 40 x | |
| 46°C-20sec 3°X | n J 65 °C-lmin | |
| 72°C-30 sec |
Przykład 3
Metoda Nested-multiplex-real time PCR do detekcji grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych.
Detekcję przeprowadzono analogicznie do metody stosowanej w Przykładzie 1, stosując w I amplifikacji startery NEST_FUN_F i NEST_FUN_R do detekcji grzybów, w warunkach opisanych w Tabeli 6, a następnie prowadząc II amplifikację w mieszaninie opisanej w tabeli, realizując zdefiniowane tam cykle termiczne.
PL228 161 Β1
Tabela 6
Skład mieszanin reakcyjnych, użyte odczynniki oraz profile termiczne reakcji PCR do detekcji grzybów drożdżowych i grzybów pleśniowych
| NESTED multiplex PCR | ||||
| I amplifikacja | II amplifikacja | |||
| [objętość końcowa25 μΙ] | [objętość końcowa 10 μΙ] | |||
| 1) Woda | 6.95 μ| | 1) Woda | 2,58 μΙ | |
| 2) Bufor B | 2,5 μΙ | 2) Bufor Β | 1,0 μΙ | |
| 3) NEST_FUN_F | 0,125 μΙ | 3) FUN_F | 0,2 μΙ | |
| 4) NE5T_FUN_R | 0,125 μΙ | 4) FUN_R | 0,2 μΙ | |
| 5) dNTP's | 2,5 μΙ | 5) Asperg_prob | 0,05 μΙ | |
| 6) MgCI2 | 2,5 μΙ | 6) Candid_probe | 0,05 μΙ | |
| 7) Polimeraza | 0,3 μΙ | 7) dNTP's | 1,0 μΙ | |
| 8) Perpetual Taq | 8) MgCI2 | 1,8 μΙ | ||
| 9) DNA | 10 μΙ | 9) Polimeraza | 0,12 μΙ | |
| 10) Perpetual Taq | ||||
| 11) DNA | 3,0 μΙ | |||
| (produkt i | ||||
| amplifikacji) | ||||
| 95°C-5min | 95°C-5min | |||
| 95 °C-20 sec~ | 95 °C-15 sec k 40 x | |||
| 46°C-20 sec | - 30 x | 65°C-lmin | ||
| 72 °C-30sec |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (9)
1. Sposób detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego, w którym DNA zawarte w próbce materiału biologicznego poddaje się amplifikacji w reakcji PCR w czasie rzeczywistym w systemie multipleksowym, znamienny tym, że reakcję amplifikacji prowadzi się dwuetapowo z zastosowaniem w pierwszym etapie starterów specyficznych dla bakterii i starterów specyficznych dla grzybów, a następnie produkt pierwszej amplifikacji wykorzystuje się, jako matrycę w drugim etapie - amplifikacji z zastosowaniem starterów i sond różnicujących grzyby na grupę grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych i bakterie na Gram-dodatnie i Gram-ujemne.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako startery specyficzne dla bakterii stosuje się startery specyficzne dla sekwencji 16S rRNA bakterii.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako startery specyficzne dla 16S rRNA bakterii stosuje się oligonukleotydy o następujących sekwencjach:
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
NEST_BAC_F
GGCGGACGGGTGAGTAA
NEST_BAC_R
CGCATTTCACCGCTA
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako startery specyficzne dla grzybów stosuje się startery specyficzne dla sekwencji 18S rRNA grzybów.
5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że jako startery specyficzne dla 18S rRNA grzybów stosuje się oligonukleotydy o następujących sekwencjach:
PL 228 161 B1
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
NEST_FUN_F
AATTGACGGAAGGGCACC
NEST_FUN_R
TTCCTCGTTGAAGAGCAA
6. Sposób według zastrz. 1-5, znamienny tym, że w drugim etapie amplifikacji do wykrywania i identyfikacji bakterii stosuje się startery o sekwencjach:
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
GN/GP_F
GACTCCTACGGGAGGC
GN/GP_R
GCGGCTGCTGGCAC i sondy o sekwencjach:
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
GP_Probe
Hex-CTGAyssAGCAACGCCGCG-TAMRA
GN_Probe
Cy5-CCTGAysCAGCmATGCCGCG-BHQ-2
7. Sposób według zastrz. 1-5, znamienny tym, że w drugim etapie amplifikacji do wykrywania i identyfikacji grzybów stosuje się startery o sekwencjach:
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
FUN_F
TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT
FUN_R
TCTAAGGGCATCACAGACCTG i sondy o sekwencjach:
oligonukleotyd
Sekwencja 5' - 3'
Candid_probe
FAM-TAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1
Asperg_probe
TexasRed-TCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGC-Eclipse
8. Sposób według zastrz. 1 albo 3, albo 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że detekcję bakterii i grzybów prowadzi się w próbce materiału biologicznego izolowanego z pacjenta, korzystnie z krwi pacjenta z objawami sepsy.
9. Zestaw do detekcji bakterii i/lub grzybów w próbce materiału biologicznego sposobem opisanym w zastrz. 1, zawierający następujące oligonukleotydy:
do detekcji bakterii startery specyficzne dla 16S rRNA bakterii:
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403996A PL228161B1 (pl) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR |
| US14/892,458 US10415096B2 (en) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by PCR, primers as well as bacteria and fungi detection kit |
| ES14736045.7T ES2618834T3 (es) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Método para la detección simultánea de bacterias y hongos en una preparación biológica mediante PCR, cebadores así como kit de detección de bacterias y hongos |
| EP14736045.7A EP2999798B1 (en) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit |
| PCT/PL2014/050029 WO2014189398A1 (en) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Method for simultaneous detection of bacteria and fungi in a biological preparation by pcr, primers as well as bacteria and fungi detection kit |
| PL14736045T PL2999798T3 (pl) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metodą PCR, startery oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403996A PL228161B1 (pl) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL403996A1 PL403996A1 (pl) | 2014-11-24 |
| PL228161B1 true PL228161B1 (pl) | 2018-02-28 |
Family
ID=51134194
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL403996A PL228161B1 (pl) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR |
| PL14736045T PL2999798T3 (pl) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metodą PCR, startery oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL14736045T PL2999798T3 (pl) | 2013-05-21 | 2014-05-21 | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metodą PCR, startery oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10415096B2 (pl) |
| EP (1) | EP2999798B1 (pl) |
| ES (1) | ES2618834T3 (pl) |
| PL (2) | PL228161B1 (pl) |
| WO (1) | WO2014189398A1 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL235777B1 (pl) | 2015-07-10 | 2020-10-19 | Univ Jagiellonski | Startery, sposób i zestaw diagnostyczny do diagnozowania sepsy |
| EP3673086A1 (en) * | 2017-08-24 | 2020-07-01 | Clinical Micro Sensors, Inc. (DBA GenMark Diagnostics, Inc.) | Electrochemical detection of bacterial and/or fungal infections |
| US20190062809A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Clinical Micro Sensors, Inc. (dba GenMark Diagnostics, Inc.) | Electrochemical detection of bacterial and/or fungal infections |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US750000A (en) | 1904-01-19 | Eugene p | ||
| US7718354B2 (en) * | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| GB0601302D0 (en) * | 2006-01-23 | 2006-03-01 | Semikhodskii Andrei | Diagnostic methods and apparatus |
| GB0621864D0 (en) * | 2006-11-02 | 2006-12-13 | Univ Manchester | Assay for fungal infection |
| FR2909099B1 (fr) | 2006-11-24 | 2012-10-19 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de diagnostic et de suivi d'une vaginose bacterienne par quantification moleculaire. |
| EP1978111B1 (en) | 2007-04-02 | 2013-03-27 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of Pseudomonas aeruginosa |
| CZ301112B6 (cs) | 2007-04-23 | 2009-11-11 | Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v.v.i. | Zpusob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis polymerázovou retezovou reakcí v reálném case |
| MX340406B (es) | 2009-01-15 | 2016-07-07 | Nat Univ Corp Univ Of Toyama | Preparacion enzimatica que contiene polimerasa de adn termoestable, metodo para su produccion, y metodo para detectar un organismo objeto. |
| CA2793660C (en) | 2010-03-19 | 2020-12-22 | The Translational Genomics Research Institute | Methods, kits and compositions for detection of mrsa |
-
2013
- 2013-05-21 PL PL403996A patent/PL228161B1/pl unknown
-
2014
- 2014-05-21 ES ES14736045.7T patent/ES2618834T3/es active Active
- 2014-05-21 EP EP14736045.7A patent/EP2999798B1/en active Active
- 2014-05-21 US US14/892,458 patent/US10415096B2/en active Active
- 2014-05-21 PL PL14736045T patent/PL2999798T3/pl unknown
- 2014-05-21 WO PCT/PL2014/050029 patent/WO2014189398A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2999798A1 (en) | 2016-03-30 |
| PL403996A1 (pl) | 2014-11-24 |
| US10415096B2 (en) | 2019-09-17 |
| PL2999798T3 (pl) | 2017-07-31 |
| ES2618834T3 (es) | 2017-06-22 |
| WO2014189398A1 (en) | 2014-11-27 |
| EP2999798B1 (en) | 2016-12-28 |
| US20160177378A1 (en) | 2016-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6258360B2 (ja) | 抗生物質耐性細菌を検出するための方法およびキット | |
| ES2850073T3 (es) | Cebadores universales de ARN ribosómico 16S y su uso en análisis y diagnóstico microbiológico | |
| US20100255474A1 (en) | Method for Detecting Bacteria and Fungi | |
| Huy et al. | Development of a single-tube loop-mediated isothermal amplification assay for detection of four pathogens of bacterial meningitis | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| CN111440886A (zh) | 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法 | |
| US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
| PL228161B1 (pl) | Sposób jednoczesnej detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR oraz zestaw do detekcji bakterii i grzybów w preparacie biologicznym metoda PCR | |
| ES2689308T3 (es) | Cebadores para detección y tipado de cepas bacterianas productoras de carbapenemasas, método y kit de detección | |
| CN109735645B (zh) | 一种检测球形孢子丝菌的实时荧光pcr引物、探针及试剂盒 | |
| RU2715333C1 (ru) | Набор реагентов для выявления и идентификации днк возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-бруцеллез-рв" | |
| CN114134218B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法 | |
| RU2684314C2 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа Beijing В0-кластер в формате реального времени | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| JPH03206899A (ja) | クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法 | |
| US10106858B2 (en) | Method for the in vitro detection of strains of Legionella pneumophila resistant to antibiotics | |
| Shin et al. | DNA Microarray-based detection of bacteria in samples containing antibiotics: Effect of antibiotics on the performance of pathogen detection assays | |
| JP5621992B2 (ja) | カンジダ種を検出および同定するための方法 | |
| JP2014064543A (ja) | ビフィドバクテリウム・ロンガムの検出および／または定量用オリゴヌクレオチド | |
| RU2738358C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени | |
| WO2020218553A1 (ja) | デジタル微生物叢解析 | |
| TW201943726A (zh) | 檢測美人魚發光桿菌殺魚亞種之特異性引子及其使用方法 | |
| KR102499837B1 (ko) | 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 | |
| RU2732923C1 (ru) | Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника | |
| WO2020218557A1 (ja) | 単一生物単位の生菌由来核酸の選択的検出、カウント、ゲノム解析 |