PL235777B1

PL235777B1 - Startery, sposób i zestaw diagnostyczny do diagnozowania sepsy

Info

Publication number: PL235777B1
Application number: PL413090A
Authority: PL
Inventors: Tomasz GOSIEWSKI; Tomasz Gosiewski; Dominika SALAMON; Dominika Salamon; Małgorzata BULANDA; Małgorzata Bulanda; Piotr RADKOWSKI; Piotr Radkowski; Agnieszka LUDWIG-GAŁĘZOWSKA; Agnieszka Ludwig-Gałęzowska; Paweł WOŁKOW; Paweł Wołkow; Agnieszka SROKA; Agnieszka Sroka
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2020-10-19
Also published as: US20180195111A1; EP3320110A1; EP3320110B1; PL413090A1; WO2017009693A1; ES2850073T3

Abstract

Przedmiotem wynalazku są: para starterów, sposób mikrobiologicznej analizy materiału biologicznego, zastosowanie metody sekwencjonowania NGS w diagnostyce mikrobiologicznej krwi oraz zestaw diagnostyczny. Opracowana została nowatorska metoda diagnozowania płynów ustrojowych pod kątem mikrobiologicznym tj. kompleksowe badanie profili bakterii w próbkach.

Description

Przedmiotem wynalazku jest para starterów, sposób oraz zestaw diagnostyczny do diagnozowania sepsy. Bardziej szczegółowo opracowana została nowatorska metoda diagnozowania płynów ustrojowych pod kątem mikrobiologicznym tj. kompleksowe badanie profili bakterii w próbkach.

Mikrobiologiczna diagnostyka krwi jest jednym z najbardziej problematycznych wyzwań diagnostycznych. Obecność we krwi bakterii (bakteriemia) bardzo często skutkuje sepsą, czyli ogólnoustrojowym stanem zapalnym wywołanym zakażeniem. Sepsa stanowi jeden z najbardziej palących problemów współczesnej medycyny.

W leczeniu zakażeń krwi najważniejszym i najtrudniejszym problemem decydującym o skuteczności terapii i, w konsekwencji, o kosztach i czasie hospitalizacji jest skuteczna diagnostyka czynników wywołujących ogólnoustrojową odpowiedź zapalną w przebiegu sepsy. Oznaczenie czynnika etiologicznego pozwala na zastosowanie skutecznej, celowanej antybiotykoterapii. Materiałem poddawanym badaniu diagnostycznemu jest krew pobrana od pacjenta manifestującego objawy kliniczne sepsy. Do tej pory tzw. „złotym standardem” diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej. Do zalet tych metod należy ich prostota oraz względnie niski koszt wykonania badania. Słabą stroną metody opartej na hodowli krwi jest jej czasochłonność, sięgająca nawet 5 dni (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje, że jedynie w ok. 15-20% hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów. Ponadto, zwykle udaje się wykryć jeden gatunek bakterii, choć może być ich więcej w krwi pacjenta.

Aby zwiększyć szansę na wykrycie czynników mikrobiologicznych we krwi podejmowane są próby oparcia ich detekcji na metodach genetycznych. Metody te oparte są o detekcję kwasów nukleinowych drobnoustrojów we krwi, takie jak PCR czy FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) i pozwalają na szybsze wykrycie śladowych nawet ilości mikroorganizmów w próbkach. Czułość metod molekularnych znacznie przewyższa czułość metody hodowlanej, poza tym wcześniejsze zastosowanie antybiotykoterapii nie wpływa na wynik badania z uwagi na to, że nie ma potrzeby uzyskania wzrostu bakterii czy grzybów na podłożu hodowlanym, a jedynie wykrycie ich sekwencji DNA czy RNA.

Na rynku obecne są bardzo nieliczne zestawy diagnostyczne stosowane w molekularnej diagnostyce sepsy, takie jak np. SeptiFast (Roche), SeptiTest (Molzym) czy VYOO (SIRS-Lab). Umożliwiają one detekcję wybranych gatunków lub grup drobnoustrojów, co umożliwia jedynie potwierdzenie zakażenia, lecz nie pozwala na jego wykluczenie. Możliwe jest także alternatywne podejście, które polega na wykrywaniu wszystkich możliwych drobnoustrojów, a zatem umożliwia potwierdzenie, jak i wykluczenie sepsy, ale pozwala na ogólne identyfikowanie drobnoustrojów jako Gram ujemnych i Gram dodatnich bakterii oraz grzybów drożdżowych i pleśniowych. Opracowanie skutecznych molekularnych metod wykrywania obecności bakterii i grzybów we krwi jest wciąż problemem wymagającym prac badawczych.

Metoda posiewu krwi oraz dostępne metody molekularne nie są w pełni skuteczne, mimo że u pacjentów występują objawy wskazujące na sepsę. Pomijając ograniczenia opisanych metod, pozostaje pytanie jak często występują i jak różnorodne taksonomicznie mogą być bakteriemie?

Od niedawna mikrobiolodzy dysponują nową techniką sekwencjonowania nowej generacji (NGS - New Generation Sequencing), która umożliwia identyfikację w próbce wszystkich gatunków bakterii, wraz z ich klasyfikacją taksonomiczną, tj. analizę metagenomiczną 16S. Metoda ta jest stosowana do szczegółowej analizy mikrobiomu człowieka i zwierząt oraz badania próbek środowiskowych, np. próbek gleby czy wody morskiej. Technologia NGS pozwala wyeliminować wymienione wyżej trudności.

Przebieg sekwencjonowania nowej generacji podzielić można na trzy główne etapy. Pierwszym z nich jest izolacja DNA, kolejnym amplifikacja, której celem jest stworzenie biblioteki DNA, ostatnim zaś masowe równoległe sekwencjonowanie. Obecnie na rynku istnieje kilka komercyjnie dostępnych platform do sekwencjonowania, m.in. Illumina, Roche454, SOLiD, IonTorrent oraz Pacific Biosciences. Cechami wspólnymi każdej z nich są izolacja DNA i tworzenie biblioteki jednoniciowych DNA. Kolejne etapy sekwencjonowania różnią się w zależności od wybranej platformy. Każda z nich ma inne przeznaczenie i poszczególne parametry techniczne. Wszystkie metody sekwencjonowania nowej generacji są bardzo wydajne.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym (numer publikacji WO2014/190394) ujawniono sposoby identyfikacji i/lub klasyfikowania drobnoustrojów, stosując jeden lub więcej polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) w 16S rybosomalnym RNA (16S rRNA) u Procaryota i/lub jeden lub

PL 235 777 B1 więcej polimorfizmów w 5.8S rybosomalnym RNA (rRNA), 5.8S. Ponadto ujawnione zostały sondy, startery i zestawy, które są użyteczne w opisanych metodach. Ujawnione zostały w zgłoszeniu również sposoby diagnozowania sepsy w oparciu o zastrzegane SNP.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe (numer publikacji WO2004043236) ujawnia wczesne przewidywanie lub diagnozowania sepsy, które umożliwia interwencję kliniczną jeszcze przed postępem choroby (tj. we wczesnym jej stadium). Wczesna diagnoza następuje przy pomocy metody diagnostyki molekularnej, porównując profil ekspresji biomarkerów danej osoby do profili uzyskanych z jednej lub więcej prób kontrolnych.

Zgłoszenia patentowe i opisy takie jak EP 2547782, EP 2087134, EP 1978111 czy EP 2009118 ujawniają zastosowanie metod PCR do detekcji specyficznych mikroorganizmów w oparciu o zaprojektowane startery.

Polskie zgłoszenie patentowe numer P 403 996 ujawnia sposób detekcji bakterii i grzybów w próbce materiału biologicznego, w którym DNA zawarte w próbce materiału biologicznego poddaje się amplifikacji w reakcji PCR w czasie rzeczywistym w systemie multipleksowym, z zastosowaniem w pierwszym etapie starterów specyficznych dla bakterii i starterów specyficznych dla grzybów, a w drugim etapie powstały DNA jest amplifikowany z zastosowaniem starterów i sond różnicujących grzyby na grupę grzybów pleśniowych i drożdżopodobnych i bakterie na Gram dodatnie i Gram ujemne. Wynalazek obejmuje także nowe oligonukleotydowe startery do detekcji bakterii i grzybów metodą PCR oraz zestaw do równoczesnej detekcji bakterii i grzybów.

Polski patent numer PL 219 490 ujawnia sposób, który umożliwia jednoczesne izolowanie DNA bakteryjnego i grzybiczego z krwi. W sposobie wykorzystuje się lizę enzymatyczną, lizę mechaniczną oraz lizę termiczną.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych starterów do amplifikacji oraz nowego sposobu diagnozowania pacjentów z klinicznymi objawami sepsy. Założony przez Twórców cel to identyfikacja ilościowa i taksonomiczna drobnoustrojów we krwi pacjenta z klinicznymi objawami sepsy, dzięki zastosowaniu techniki sekwencjonowania nowej generacji.

Pomimo wielu istniejących na rynku rozwiązań dotyczących detekcji drobnoustrojów, nadal istnieje potrzeba prac nad przedmiotową materią i poszukiwań coraz to szybszych i bardziej dokładnych metod. Na rynku nie ma do tej pory testu NGS do zastosowania specjalistycznego w diagnostyce mikrobiologicznej krwi czy innych próbek klinicznych - dostępne są jedynie ogólne zestawy naukowe, pozwalające na sekwencjonowanie genów czy całych genomów lub RNA, badanie metylacji DNA i inne. Testy tego typu są produkowane przez kilku producentów, m.in.: Illumina, Roche, Life Technologies (http://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html, http://454.com/applications/index.asp, czy https://www.lifetechnologies.com/pl/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing.html).

Przedmiotem wynalazku są startery do wykrywania bakterii we krwi pacjentów z objawami sepsy przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w systemie nested (nested-PCR), charakteryzujące się tym, że stanowią je oligonukleotydy o sekwencji:

F 5’ - ACGGCCNNRACTCCTAC - 3’

R 5‘ - TTACGGNNTGGACTACHV - 3’

Korzystnie startery pozwalają na amplifikację regionów 16sDNA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania sepsy, charakteryzujący się tym, że izoluje się DNA bakterii z krwi pacjentów z objawami sepsy z wykorzystaniem lizy enzymatycznej, mechanicznej oraz termicznej, następnie DNA poddaje się amplifikacji w reakcji nested-PCR przy użyciu starterów określonych w zastrzeżeniu numer 1, po czym następuje procedura sekwencjonowania metodą New Generation Sequencing (NGS) powielonych uprzednio sekwencji, zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta platformy do sekwencjonowania.

Korzystnie gdy sposób charakteryzuje się tym, że amplifikację prowadzi się z użyciem gotowego zestawu PCR składającego się z polimerazy, buforu reakcyjnego, dNTPs i MgCl2.

Korzystnie, gdy polimerazę stanowi polimeraza o niskim stopniu wprowadzania błędów w amplifikowanych produktach.

PL 235 777 B1

Korzystnie, sekwencjonowanie składa się z następujących etapów: oczyszczanie amplifikowanych sekwencji DNA, znakowanie próbek poddawanych sekwencjonowaniu, dalsze oczyszczanie amplifikowanych sekwencji DNA po reakcji nested-PCR, oznaczenie stężenia oczyszczonych bibliotek, denaturacja i rozcieńczenie kontroli wewnętrznej biblioteki oraz przygotowanie końcowej biblioteki.

Korzystnie sposób charakteryzuje się tym, że sekwencjonowanie polega na jednoczesnym odczytywaniu sekwencji utworzonej biblioteki DNA kodującego regiony 16SrRNA bakterii, a następnie na wstępnym dopasowaniu sekwencji do konkretnych taksonów na różnych poziomach taksonomicznych.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do diagnozowania sepsy, znamienny tym, że zawiera startery określone w zastrzeżeniu num er 1 oraz komercyjne podzespoły konieczne do przeprowadzenia samego sekwencjonowania metodą New Generation Sequencing (NGS):

• katdridż zawierający odczynniki niezbędne do procesu sekwencjonowania w sekwenserze, • zestaw indeksów, znakujących każdą próbkę indywidualnym kodem, pozwalającym na przyporządkowanie odczytanych sekwencji do danej próbki (pacjenta), • DNA bakteriofaga, stanowiące kontrolę sekwencjonowania.

Wynalazek to nowy sposób wykorzystania istniejącej technologii NGS pozwalającej m.in. na kompleksowe badanie profili bakterii w próbkach. Do tej pory nie opisano możliwości wykorzystania tej techniki do badania krwi u pacjentów z sepsą. Kolejną cechą wyróżniającą przedmiotowe rozwiązanie ze stanu techniki jest wykorzystanie zaprojektowanej pary starterów do prowadzenia amplifikacji w systemie Nested PCR, która poprzedza proces sekwencjonowania NGS.

Wynalazek umożliwia nowatorskie podejście do problemu jakim jest diagnostyka krwi pod kątem mikrobiologicznym. Obecne na rynku komercyjne (naukowe) zestawy do sekwencjonowania NGS są bardzo ogólne - przy ich pomocy można badać każdy rodzaj próbek (klinicznych czy środowiskowych). Istnieje również możliwość zastosowania NGS w diagnostyce medycznej do badań bakteriologicznych - technika ta (NGS) pozwala otrzymać całościowy obraz obecności DNA bakterii w próbce, np. krwi.

Zaleca się zastosowanie konkretnych starterów PCR w reakcji NGS, niemniej jednak Twórcy przedmiotowego wynalazku zaprojektowali dodatkową parę starterów pozwalający na amplifikację regionów V3 i V4 16sDNA, celem przeprowadzenia amplifikacji PCR w systemie Nested, co znacznie zwiększyło czułość metody NGS.

Wynalazek, to nowy sposób wykorzystania czysto naukowej metody sekwencjonowania nowej generacji. Cały proces wymaga izolacji DNA drobnoustrojów z krwi; przeprowadzenia amplifikacji 16sDNA celem utworzenia biblioteki i dokonaniu jej sekwencjonowania NGS. Sekwenser podaje ilościowe oraz jakościowe zestawienie taksonomiczne wszystkich obecnych w próbce bakterii, ale możliwa jest dalsza obróbka bioinformatyczna, celem uzyskania bardziej szczegółowych informacji.

Istota rozwiązania została przedstawiona w przykładach wykonania opisanych poniżej, które jednak nie mają charakteru ograniczającego zakres ochrony.

Przeprowadzono doświadczalną weryfikację na próbkach DNA wyizolowanych z krwi pacjentów z podejrzeniem sepsy (n = 42) oraz pacjentów zdrowych (n = 13). Pacjenci byli kwalifikowani do badania przez lekarzy anestezjologów, na podstawie występowania u nich klinicznych objawów sepsy. Procedura pobierania krwi była prowadzona zgodnie z wytycznymi obowiązującymi dla pobierania krwi na posiew, celem potwierdzenia obecności bakterii przy użyciu metody hodowli. Potwierdzono różnicę w składzie bakterii (ich DNA) w obydwu grapach pacjentów.

P r z y k ł a d 1

Izolacja DNA bakteryjnego z krwi

1. 1,5 ml pełnej krwi dodano do 6 ml 0,17 M chlorku amonu,

2. Próbki inkubowano w 37°C przez 20 minut,

3. Wirowano z prędkością 10000 rpm przez 10 minut,

4. Wylano nadsącz,

5. Osad zawieszono w 100 μl roztworu lizozymu (2 mg/ml) i lizostafiny (0,2 mg/ml) w buforze PBS,

6. Próbki przeniesiono do probówek z kulkami szklanymi 700-1100 μm i poddano dezintegracji mechanicznej w czasie 20 sek., z prędkością 4,0 m/s,

7. Próbki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C,

8. Wirowano z prędkością 12 000 rpm w czasie 10 minut.

PL 235 777 Β1

Uzyskany osad poddaje się dalszej preparatyce, przy wykorzystaniu komercyjnego zestawu do izolacji DNA, zgodnie z protokołem postępowania dostarczonym przez producenta. W wyniku procedury otrzymuje się DNA gotowe do dalszych etapów analiz, np. przeprowadzenia reakcji PCR celem wykrycia bakterii.

P rzykład 2

Nested - multiplex - real time PCR do detekcji bakterii

Metodyka amplifikacji DNA drobnoustrojów zrealizowana została na matrycy DNA wyizolowanego z krwi ludzkiej. Amplifikacja w systemie Nested (gniazdowym) była prowadzona w dwóch oddzielnych etapach oznaczonych rzymskimi literami I i II. W tabelach poniżej (Tabela 1 i Tabela 2) przedstawiono skład mieszanin reakcyjnych oraz profile termiczne reakcji. W etapie I użyte zostały zaprojektowane nowe startery specyficzne:

I amplifikacja

F (1 ampl) ACGGCCNNRACTCCTAC

R (1 ampl) TTACGGNNTGGACTACHV

Tabela 1

PCR

I amplifikacja [objętość końcowa 10 μ!| Woda2,6

Kapa5,0

Starter 1 (F)0,2

Starter 2 (R)0.2

DNA2,0

95° -5 min

95° - 15 sec. x 40

48° -20 sec. x 40

72° - 30 sec. x 40

72°-5 min

II amplifikacja F

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG

RGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

Tabela 2

NESTED PCR amplifikacja [objętość końcowa 25 μΐ]

Woda	10,5
Kapa	12.5
Starter 1 (F)	0,5
Starter 2 (R)	0,5
Amplikon	1.0

95° -5 min

95° - 30 sec. x 40

55° - 30 sec. x 40

72° - 30 sec. x 40

72°-5 min

PL 235 777 B1

Amplifikację prowadzono przy użyciu gotowego zestawu PCR, zawierającego polimerazę o niskim stopniu wprowadzania błędów w amplifikowanych produktach. Skład zestawu: polimeraza, bufor reakcyjny, dNTPs i MgCl2 (w końcowym stężeniu wynoszącym 2,5 mM)

P r z y k ł a d 3

Sekwencjonowanie NGS powielonych sekwencji

Procedurę sekwencjonowania prowadzono w aparacie MiSeq (Illumina), który pracował pod kontrolą dostarczonego przez producenta oprogramowania komputerowego. Proces sekwencjonowania polegał na jednoczesnym odczytywaniu wszystkich sekwencji utworzonej biblioteki DNA kodującego regiony 16SrRNA bakterii, a następnie na wstępnym dopasowaniu sekwencji do konkretnych taksonów na różnych poziomach taksonomicznych.

Produkty amplifikacji zostały poddane oczyszczaniu z użyciem magnetycznych kulek, w celu usunięcia wolnych starterów lub dimerów starterów.

Procedura oczyszczania:

1. Płytkę (96 dołków) PCR z amplikonami wirowano z prędkością 1,000 x g przez 1 min.

2. Roztwór z magnetycznymi kulkami - AMPure XP (służy do oczyszczania DNA) worteksowano przez około 30 sek., a następnie naniesiono po 20 μl do każdej studzienki z amplikonami.

3. Całość wymieszano poprzez 10-krotne pipetowanie góra-dół.

4. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min.

5. Ustawiono płytkę na mieszadle magnetycznym do czasu, aż supernatant będzie przeźroczysty.

6. Nie ściągając płytki z mieszadła magnetycznego, delikatnie usunięto pipetą supernatant.

7. Do każdej próbki dodano po 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu.

8. Inkubowano na mieszadle magnetycznym przez 30 sek.

9. Usunięto supernatant.

10. Powtórzono kroki od 7-9.

11. Umieszczoną w dalszym ciągu na mieszadle magnetycznym płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min, w celu osuszenia kulek.

12. Usunięto płytkę z mieszadła magnetycznego. Dodano do każdej próbki po 52,5 μl 10 mM buforu Trisu (pH 8,5).

13. Wymieszano poprzez 10-krotne pipetowanie (góra-dół), lub do czasu aż kulki zostaną całkowicie zawieszone w buforze Trisie.

14. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 min.

15. Umieszczono płytkę PCR na mieszadle magnetycznym i inkubowano do czasu, aż supernatant będzie przeźroczysty.

16. Przeniesiono 50 μl supernatantu z każdej studzienki na nową 96-cio dołkową płytkę PCR.

Znakowanie amplikonów (próbek poddawanych sekwencjonowaniu) - Index PCR - Procedura:

1. Przeniesiono po 5 μl z każdego, oczyszczonego amplikonu do nowej płytki PCR. (Pozostałe 45 μl można zamrozić i ponownie używać).

2. Umieszczono startery oznaczone, jako Index 1 równolegle do wierszy A-H płytki PCR, a startery oznaczone, jako Index 2 równolegle do kolumn 1-12.

3. Przygotowano mieszaninę reakcyjną według tabelki poniżej i naniesiono do studzienek z amplikonami.

4. Wymieszano przez 10-krotne pipetowanie (góra-dół).

5. Płytkę PCR zaklejono taśmą dołączoną do zestawu i wirowano z prędkością 1,000 x g przez 1 min.

PL 235 777 Β1

Tabela 3

Skład mieszaniny reakcyjnej oraz profil termiczny reakcji

Skład mieszaniny reakcyjnej:	Warunki termiczne:
Woda 10μ1	95°-3 min
Kapa 25μ1	95°-30 sec. x 8
Starter (Index 1) 5μ1	55°-30 sec. x 8
Starter (Index 2) 5μ1	72° - 30 sec. x 8
	72° - 5 min

Oczyszczanie produktu po reakcji PCR - Procedura:

1. Płytkę (96 dołków) PCR z amplikonami wirowano z prędkością 280 x g przez 1 min.

2. Roztwór z magnetycznymi kulkami AMPure XP worteksowano przez około 30 sek., a następnie naniesiono po 56 μΙ do każdej studzienki z amplikonami.

3. Całość wymieszano poprzez 10-krotne pipetowanie góra-dół.

4. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min.

7. Do każdej próbki dodano po 200 μΙ świeżo przygotowanego 80% etanolu.

8. Inkubowano na mieszadle magnetycznym przez 30 sek.

9. Usunięto supernatant.

10. Powtórzono kroki od 7-9.

12. Usunięto płytkę z mieszadła magnetycznego. Dodano do każdej próbki po 27,5 μΙ 10 mM Trisu (pH 8,5).

13. Wymieszano poprzez 10-krotne pipetowanie (góra-dół), lub do czasu aż kulki zostaną całkowicie zawieszone w Trisie.

14. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 min.

16. Przeniesiono 25 μΙ supernatantu z każdej studzienki na nową 96-cio dołkową płytkę PCR.

Kwantyfikacja biblioteki (oznaczenia stężenia DNA)

Obliczanie stężenia DNA w próbce w nM w oparciu o pomiar fluorymetryczny przy użyciu spektrofluorymetru.

stężenie w ng/\il

660g moi * średnia wielkość biblioteki

Rozcieńczono amplikony przy użyciu 10 nM Trisu (pH 8,5) do stężenia 4 nM. Z każdej studzienki pobrano do jednej probówki po 5 μΙ rozcieńczonego DNA. Całość wymieszano na worteksie.

Następnie, wszystkie próbki (biblioteki) zmieszano razem, po czym zostały zdenaturowane początkowo w NaOH, rozcieńczonym w buforze do hybrydyzacji, a następnie w wysokiej temperaturze. Każda seria zawierała co najmniej 5% PhiX - substancję, stanowiącą kontrolę wewnętrzną bibliotek.

Przygotowanie:

1. Ustawiono temperaturę termobloku na 96°C.

2. Przygotowano pojemnik z kąpielą lodową (2 części lodu i 1 część wody).

Procedura:

1. Do przygotowanej biblioteki dodano odpowiednią ilość świeżo przygotowanego 0,2 N NaOH. (Na 5 μΙ 4nM biblioteki przypada 5 μΙ 0,2N NaOH).

2. Całość worteksowano, a następnie wirowano z prędkością 280 x g przez 1 min.

PL 235 777 Β1

3. Inkubowano w temperaturze pokojowej, w celu denaturacji DNA do pojedynczych nici.

4. Dodano odpowiednią ilość schłodzonego buforu do hybrydyzacji (na 10 μΙ zdenaturowanego DNA przypada 990 μΙ buforu).

Dodanie wg powyższych zaleceń buforu do hybrydyzacji skutkuje uzyskaniem 20 pM zdenaturowanej biblioteki w 1 mM NaOH.

5. Umieszczono probówkę z zdenaturowanym DNA na lodzie.

6. Rozcieńczono zdenaturowane DNA do pożądanego stężenia, stosując się do podanego przykładu:

Tabela 4

Zasady rozcieńczenia biblioteki w celu uzyskania pożądanego stężenia

Końcowe stężenie	2pM	4pM	6pM	8ρΜ	ΙΟρΜ
20μ1 zdenaturowanej biblioteki	60μ1	120μ1	180μ1	240μ1	300μ1
Schłodzony bufor do hybrydyzacji	540μΐ	480μ1	420μ1	360μ1	30()μ1

7. Wymieszano probówkę z rozcieńczonym i zdenaturowanym DNA poprzez kilkukrotne odwracanie, a następnie pulsacyjnie wirowano.

8. Umieszczono zdenaturowane i rozcieńczone DNA na lodzie.

Denaturacja i rozcieńczenie kontroli wewnętrznej biblioteki (PhiX ) - Procedura:

1. Rozcieńczono PhiX do stężenia 4 mM: dodać 2 μΙ 10 nM biblioteki PhiX do 3 μΙ 10 mM Trisu (pH 8,5) i wymieszano.

2. Pobrano 5 μΙ rozcieńczonej biblioteki PhiX do 4 mM, dodać do 5 μΙ 0,2N NaOH, całość wymieszano.

3. Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min w celu denaturacji PhiX do pojedynczych nici.

4. Dodano odpowiednią ilość schłodzonego bufom do hybrydyzacji do probówki zawierającej zdenaturowaną bibliotekę PhiX w celu otrzymania 20 μΜ biblioteki PhiX, w tym celu należy dodać do 10 μΙ zdenaturowanej biblioteki kontroli PhiX do 990 μΙ schłodzonego bufom do hybrydyzacji.

5. Rozcieńczono zdenaturowaną 20 pM bibliotekę PhiX do tego samego stężenia, co bibliotekę amplikonów, korzystając z tabelki 4.

6. Wymieszano probówkę z zdenaturowaną i rozcieńczoną biblioteką PhiX poprzez kilkukrotne odwracanie, a następnie pulsacyjnie wirowano.

7. Umieszczono probówkę na lodzie.

Przygotowanie końcowej biblioteki - Procedura:

1. Dodano 30 μΙ zdenaturowanej i rozcieńczonej biblioteki PhiX do 570 μΙ zdenaturowanej i rozcieńczonej biblioteki amplikonów.

2. Całość wymieszano i umieszczono na lodzie.

3. Próbkę z biblioteką PhiX i amplikonów umieszczono w termobloku ogrzanym do 96°C na 2 min.

4. Po inkubacji, wymieszano probówkę poprzez dwukrotne odwracanie i od razu umieszczono w kąpieli z lodem przez 5 min.

5. Przygotowaną próbkę naniesiono do odpowiednio oznakowanego miejsca kasety do sekwencjonowania.

Zaskoczeniem dla Twórców było to, że również u zdrowych osób wykryto DNA bakteryjne we krwi, jednak profile ilościowe były istotnie różne, co przedstawiono na Fig. 1. Figura 1 przedstawia ilościowy skład bakteryjnego DNA na poziomie gromad bakterii w grupie kontrolnej oraz pacjentów z sepsą.

Ograniczeniem metody jest brak możliwości oceny, czy w próbkach znajdowały się żywe komórki bakterii, czy też ich pozostałości w postaci DNA. To może w pewnych przypadkach utrudniać ocenę kliniczną stanu pacjenta w kontekście uzyskanych wyników NGS.

PL 235 777 B1

Literatura

1) Nested-PCR as a tool for the detection and differentiation of Gram-positive and Gram-negative bacteria in patients with sepsis-septic shock. Patricia Lozano Zarainl, Genaro Lopez-Tellezl, Rosa del Carmen Rocha-Gracial, Cuauhtemoc Romero-López, Ygnacio Martinez-Lagunal, Antonio Rivera, Eduardo Brambila, African Journal of Microbiology Research Vol. 6(21), pp. 4601-4607, 9 June, 2012.

2) The diagnosis of infectious diseases by whole genome next generation sequencing: a new era is opening, MarcLecuit and MarcEloit.

Frontiers in Cellular and lnfection Microbiology, March 2014 I Volume4 I Article25.

3) Detection of Transient Bacteraemia following Dental Extractions by 16S rDNA Pyrosequencing: A Pilot Study Alfonso Beni’tez-Pa’ez, Maximiliano A’lvarez, Pedro Belda-Ferre, Susana Rubido, Alex Mira, Inmaculada Toma’.

PLOS ONE I www.plosone.org 1 March 2013 I Volume 8 I Issue 3.

4) Next-generation-sequencing-based diagnosis of sepsis directly from blood, Dr Justin O’Grady, Professor John Wain. Faculty of Medicine and Health Sciences Graduate School, School of study: Norwich Medical School.

5) 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation

Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System, Part # 15044223 Rev. B.

6) Applications of Next Generation Sequencing to Blood and Marrow Transplantation, Michael Chapman, Edus H. Warren III, Catherine J. Wu, MD, Biol Blood Marrow Transplant. 2012 January; 18(1 Suppl): S151-S160.

7) Molecular Diagnostics: Double-Digit Growth Anticipated, Executive Summary, INSIGHT PHARMA REPORTS.

8) Genome-Wide Sequencing of Cellular microRNAs Identifies a Combinatorial Expression Signature Diagnostic of Sepsis. Yuqian Mal, David Vilanova, Kerem Atalar, Olivier Delfour, Jonathan Edgeworth, Marlies Ostermann, Maria Hernandez-Fuentes, Sandrine Razafimahatratra, Bernard Michot, David H. Persing, Ingrid Ziegler, et al. PLOS ONE I www.plosone.org 1 October 2013 I Volume 8 I Issue 10.

9) Detection and identification of plasma bacterial and viral elements in HIV/AIDS patients in comparison to healthy adults. S.-K. Lil, R. K-K. Leung, H.-X. Guo, J.-F. Wei, J.-H. Wang, K.-T. Kwong, S.-S. Lee, C. Zhang and S. K.-W. Tsui Clinical Microbiology and Infection §2011 European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.

Claims

1. Startery do wykrywania bakterii we krwi pacjentów z objawami sepsy przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w systemie nested (nested-PCR), znamienne tym, że stanowią je oligonukleotydy o sekwencji:

F 5’ - ACGGCCNNRACTCCTAC - 3’

R5‘ - TTACGGNNTGGACTACHV - 3’

2. Startery według zastrz. 1, znamienne tym, że pozwalają na amplifikację regionów 16sDNA.

3. Sposób diagnozowania sepsy, znamienny tym, że izoluje się DNA bakterii z krwi pacjentów z objawami sepsy z wykorzystaniem lizy enzymatycznej, mechanicznej oraz termicznej, następnie DNA poddaje się amplifikacji w reakcji nested-PCR przy użyciu starterów określonych w zastrz. 1, po czym następuje procedura sekwencjonowania metodą New Generation Sequencing (NGS) powielonych uprzednio sekwencji, zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta platformy do sekwencjonowania.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że amplifikację prowadzi się z użyciem gotowego zestawu PCR składającego się z polimerazy, buforu reakcyjnego, dNTPs i MgCL.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że polimerazę stanowi polimeraza o niskim stopniu wprowadzania błędów w amplifikowanych produktach.

PL 235 777 B1

6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencjonowanie składa się z następujących etapów: oczyszczanie amplifikowanych sekwencji DNA, znakowanie próbek poddawanych sekwencjonowaniu, dalsze oczyszczanie amplifikowanych sekwencji DNA po reakcji nested-PCR, oznaczenie stężenia oczyszczonych bibliotek, denaturacja i rozcieńczenie kontroli wewnętrznej biblioteki oraz przygotowanie końcowej biblioteki.

7. Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 3 do 6, znamienny tym, że sekwencjonowanie polega na jednoczesnym odczytywaniu sekwencji utworzonej biblioteki DNA kodującego regiony 16SrRNA bakterii, a następnie na wstępnym dopasowaniu sekwencji do konkretnych taksonów na różnych poziomach taksonomicznych.

8. Zestaw diagnostyczny do diagnozowania sepsy, znamienny tym, że zawiera startery określone w zastrz. 1 oraz komercyjne podzespoły konieczne do przeprowadzenia samego sekwencjonowania metodą New Generation Sequencing (NGS):

• katdridż zawierający odczynniki niezbędne do procesu sekwencjonowania w sekwenserze, • zestaw indeksów, znajdujących każdą próbkę indywidualnym kodem, pozwalającym na przyporządkowanie odczytanych sekwencji do danej próbki (pacjenta), • DNA bakteriofaga, stanowiące kontrolę sekwencjonowania.