KR102008451B1

KR102008451B1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 자폐증 진단방법

Info

Publication number: KR102008451B1
Application number: KR1020180047608A
Authority: KR
Inventors: 김윤근
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2019-08-07
Also published as: EP3636780A4; EP3636780C0; JP6993723B2; US20230132988A1; KR20180129627A; CN110869519A; EP3636780A1; JP2020521469A; EP3636780B1

Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 자폐증을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 자폐증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균, 고세균 등의 미생물에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 뇌를 포함하여 여러 장기로 분포하여, 염증반응 및 뇌기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 염증을 특징으로 하는 자폐증은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 자폐증 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 자폐증의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 자폐증의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 자폐증 진단방법{Method for diagnosis of Autism using analysis of bacteria metagenome}

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 자폐증을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 자폐증을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.

자폐증(自閉症)이란, 의사소통과 사회적 상호작용 이해 능력에 저하를 일으키는 신경 발달 장애를 뜻한다. 이 증상의 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만 몇몇 연구자들은 정서적인 원인이 아닌 유전적 발달 장애로 추측하고 있다. 발생확률은 1000명에 한 명꼴이며 남녀의 비율은 미국 기준으로 4:1정도이다. 2011년의 조사에 의하면 국내에서의 자폐증 유병률은 2% 이상으로 나타나서 주목을 받고 있다. 자폐증은 전반적으로 '자폐 스펙트럼 장애' 혹은 '자폐 범주성 장애'(Autism Spectrum Disorder)라고 부르며, 이 장애는 학계에서 3가지 정도로 나뉘어 논의된다. 첫째로는 레오 카너가 정의한 아동을 부르는 자폐증(Autism; Kanner's Syndrome), 둘째로는 한스 아스퍼거가 논의한 아스퍼거 증후군(Asperger's Syndrome), 그리고 마지막으로는 서번트 증후군(Savant Syndrome)을 포함한 고기능성 자폐증(High Functional Autism)이다.

성장하는 아기들은 일반적으로 사람들을 응시하거나 목소리를 주목하거나 손가락을 움켜쥐거나 웃음을 보이는 등의 사회적 활동을 보인다. 하지만 자폐 증상이 있는 아기는 얼굴을 마주 보는 것을 싫어하고, 인간 사회의 상호 작용을 이해하는 것에 굉장한 어려움을 겪는다. 의사소통과 관련해선, 일반적인 아기들이 첫 생일 즈음에 단어들을 말하고, 자신의 이름을 부르면 반응하고 장난감을 원하면 손가락으로 가리키는 등의 행동을 하는 반면, 자폐 증상이 있는 아기는 의사소통 발달에서 다른 길을 선택한다. 몇몇은 읽고 쓸 수 있는 능력이 충분함에도 불구하고 평생동안 침묵을 지키고, 대신에 이들은 다른 방법, 즉 그림이나 수화 등의 방법을 선호한다.

자폐증의 원인과 관련해서 초기에는 후천적으로 발생한다고 보는 학설도 있었으나, 현재는 선천적 원인으로 발병한다고 보는 것이 지배적이다. 대개 뇌 구조의 이상, 유전적 결함, 그리고 신경전달물질 이상이 원인으로 지목되고 있다. 또한 아이가 음주를 좋아하는 임신 상태의 산모로부터 악영향을 받는 태아 알코올 증후군 역시 원인으로 지목되기도 했다. 그러나 아직까지 정확한 원인인자에 대해선 논란이 있다.

미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다.

환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(국내공개특허 제2011-073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다. 그러나 자폐증 발병에 있어서, 소변 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 자폐증의 원인인자를 동정하고 자폐증을 예측하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 자폐증의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 정상인 및 피검자 유래 샘플인 소변에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 자폐증의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 자폐증을 진단하기 위한 정보제공방법, 자폐증 진단방법, 및 자폐증 발병 위험도 예측방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 자폐증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:

(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 자폐증 진단방법을 제공한다:

(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 자폐증의 발병 위험도 예측방법을 제공한다:

본 발명의 일구현예로, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 소변이고,

상기 (c) 단계에서, 아르마티모나스문(Armatimonadetes) 및 써미(Thermi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 및 데이노코키(Deinococci)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 리조비움목(Rhizobiales), 스핑고모나달레스(Sphingomonadales), 및 데설포비브리오날레스(Desulfovibrionales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 스핑고모나다시에(Sphingomonadaceae), 및 데설포비브리오나시에(Desulfovibrionaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는

핌브리모나스(Fimbriimonas), 아크로모박터(Achromobacter), 로시텔레스(Roseateles), 아그로박테리움(Agrobacterium), 스핑고모나스(Sphingomonas), 코쿠리아(Kocuria), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 할로모나스(Halomonas), 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,

써미(Thermi) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,

데이노코키(Deinococci) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,

데설포비브리오날레스(Desulfovibrionales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,

데설포비브리오나시에(Desulfovibrionaceae) 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는

코쿠리아(Kocuria), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 할로모나스(Halomonas), 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 자폐증으로 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,

아르마티모나데테스(Armatimonadetes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 및 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 리조비움목(Rhizobiales), 및 스핑고모나달레스(Sphingomonadales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,

핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 및 스핑고모나다시에(Sphingomonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는

핌브리모나스(Fimbriimonas), 아크로모박터(Achromobacter), 로시텔레스(Roseateles), 아그로박테리움(Agrobacterium), 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 자폐증으로 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 아르마티모나스문(Armatimonadetes) 및 써미(Thermi)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria), 및 데이노코키(Deinococci)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 리조비움목(Rhizobiales), 스핑고모나달레스(Sphingomonadales), 및 데설포비브리오날레스(Desulfovibrionales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현에로, 상기 (c) 단계에서 핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 스핑고모나다시에(Sphingomonadaceae), 및 데설포비브리오나시에(Desulfovibrionaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 핌브리모나스(Fimbriimonas), 아크로모박터(Achromobacter), 로시텔레스(Roseateles), 아그로박테리움(Agrobacterium), 스핑고모나스(Sphingomonas), 코쿠리아(Kocuria), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 할로모나스(Halomonas), 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.

환경에 존재하는 세균, 고세균 등의 미생물에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 염증반응을 특징으로 하는 자폐증은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 자폐증 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 자폐증의 위험군을 조기에 진단 및 예측 가능하며, 또한 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 자폐증의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 자폐증으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있다.

도 1a는, 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 소변 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 자폐증환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 자폐증환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 자폐증환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 자폐증환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 자폐증환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 자폐증을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 자폐증의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.

이에, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 자폐증을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "자폐증 진단" 이란 환자에 대하여 자폐증이 발병할 가능성이 있는지, 자폐증이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 자폐증이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 자폐증 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 자폐증을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.

본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 소변일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 자폐증 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 소변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Armatimonadetes 및 Thermi 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 자폐증환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 소변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadia, Alphaproteobacteria, 및 Deinococci 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 자폐증환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 소변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadales, Rhizobiales, Sphingomonadales, 및 Desulfovibrionales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 자폐증환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 소변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadaceae, Rhizobiaceae, Alcaligenaceae, Sphingomonadaceae, 및 Desulfovibrionaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 자폐증환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 소변 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonas, Achromobacter, Roseateles, Agrobacterium, Sphingomonas, Kocuria, Desulfovibrio, Halomonas, 및 Jeotgalicoccus 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 자폐증환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 자폐증 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석

장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.

장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 소변(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 소변, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.

실시예 2. 소변으로부터 소포 분리 및 DNA 추출

소변으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 소변을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.

상기 방법에 따라 소변으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.

primer		서열	서열번호
16S rDNA	16S_V3_F	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'	1
16S rDNA	16S_V4_R	5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3	2

실시예 3. 소변에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석

상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).

실시예 4. 소변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 자폐증 진단모형

상기 실시예 3의 방법으로, 자폐증환자 20명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 28명의 소변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 정확도, 민감도, 및 특이도를 산출하였다.

소변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Armatimonadetes 및 Thermi 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 자폐증에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).

	대조군		자폐		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	Accuracy	sensitivity	specificity
p__Armatimonadetes	0.0038	0.0065	0.0000	0.0001	0.0046	0.00	0.74	0.73	0.57	0.95
p__Thermi	0.0007	0.0015	0.0047	0.0052	0.0031	6.47	0.81	0.71	0.82	0.55

소변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadia, Alphaproteobacteria, 및 Deinococci 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 자폐증에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).

	대조군		자폐		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	Accuracy	sensitivity	specificity
c__Fimbriimonadia	0.0038	0.0065	0.0000	0.0001	0.0046	0.00	0.74	0.73	0.57	0.95
c__Alphaproteobacteria	0.1529	0.1278	0.0484	0.0258	0.0002	0.32	0.85	0.77	0.79	0.75
c__Deinococci	0.0007	0.0015	0.0047	0.0052	0.0031	6.47	0.81	0.71	0.82	0.55

소변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadales, Rhizobiales, Sphingomonadales, 및 Desulfovibrionales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 자폐증에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).

	대조군		자폐		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	Accuracy	sensitivity	specificity
o__Fimbriimonadales	0.0038	0.0065	0.0000	0.0001	0.0046	0.00	0.74	0.73	0.57	0.95
o__Rhizobiales	0.0569	0.0539	0.0105	0.0092	0.0001	0.19	0.91	0.83	0.86	0.80
o__Sphingomonadales	0.0629	0.0642	0.0198	0.0159	0.0018	0.31	0.81	0.73	0.82	0.60
o__Desulfovibrionales	0.0006	0.0014	0.0053	0.0059	0.0019	9.66	0.82	0.81	0.93	0.65

소변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonadaceae, Rhizobiaceae, Alcaligenaceae, Sphingomonadaceae, 및 Desulfovibrionaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 자폐증에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).

	대조군		자폐		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	Accuracy	sensitivity	specificity
f__Fimbriimonadaceae	0.0038	0.0065	0.0000	0.0001	0.0046	0.00	0.74	0.73	0.57	0.95
f__Rhizobiaceae	0.0458	0.0504	0.0018	0.0028	0.0001	0.04	0.96	0.88	0.89	0.85
f__Alcaligenaceae	0.0253	0.0409	0.0012	0.0029	0.0044	0.05	0.79	0.75	0.82	0.65
f__Sphingomonadaceae	0.0627	0.0642	0.0198	0.0159	0.0019	0.32	0.81	0.73	0.82	0.60
f__Desulfovibrionaceae	0.0006	0.0014	0.0053	0.0059	0.0019	9.66	0.82	0.81	0.93	0.65

소변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Fimbriimonas, Achromobacter, Roseateles, Agrobacterium, Sphingomonas, Kocuria, Desulfovibrio, Halomonas, 및 Jeotgalicoccus 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 자폐증에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).

	대조군		자폐		t-test
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	Accuracy	sensitivity	specificity
g__Fimbriimonas	0.0038	0.0065	0.0000	0.0001	0.0046	0.00	0.74	0.73	0.57	0.95
g__Achromobacter	0.0242	0.0396	0.0005	0.0015	0.0038	0.02	0.83	0.77	0.86	0.65
g__Roseateles	0.0112	0.0184	0.0002	0.0006	0.0040	0.02	0.88	0.79	0.86	0.70
g__Agrobacterium	0.0383	0.0507	0.0011	0.0022	0.0006	0.03	0.93	0.88	0.89	0.85
g__Sphingomonas	0.0417	0.0438	0.0071	0.0087	0.0003	0.17	0.85	0.79	0.82	0.75
g__Kocuria	0.0006	0.0025	0.0030	0.0035	0.0083	4.75	0.76	0.73	0.96	0.40
g__Desulfovibrio	0.0004	0.0011	0.0048	0.0061	0.0048	10.88	0.81	0.77	0.89	0.60
g__Halomonas	0.0012	0.0031	0.0172	0.0228	0.0054	14.61	0.91	0.79	0.93	0.60
g__Jeotgalicoccus	0.0003	0.0009	0.0050	0.0051	0.0007	14.70	0.84	0.81	0.93	0.65

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for diagnosis of Autism using analysis of bacteria metagenome <130> MP18-012 <150> KR 10-2017-0065329 <151> 2017-05-26 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims

(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고,
상기 정상인 및 피검자 샘플은 소변이고,
상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
할로모나스(Halomonas) 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
핌브리모나스(Fimbriimonas) 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 자폐증으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 자폐증 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
할로모나스(Halomonas) 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
핌브리모나스(Fimbriimonas) 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며 ;
써미(Thermi) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
데이노코키(Deinococci) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
데설포비브리오날레스(Desulfovibrionales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
데설포비브리오나시에(Desulfovibrionaceae) 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
코쿠리아(Kocuria) 및 데설포비브리오(Desulfovibrio)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우
자폐증으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 자폐증 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
할로모나스(Halomonas) 및 제오트갈리코커스(Jeotgalicoccus) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
핌브리모나스(Fimbriimonas) 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며 ;
아르마티모나데테스(Armatimonadetes) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포, 핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 및 알파프로테오박테리아(Alphaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 리조비움목(Rhizobiales), 및 스핑고모나달레스(Sphingomonadales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 리조비아시에(Rhizobiaceae), 알칼리제나시에(Alcaligenaceae), 및 스핑고모나다시에(Sphingomonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
아크로모박터(Achromobacter), 로시텔레스(Roseateles), 및 스핑고모나스(Sphingomonas)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우
자폐증으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 자폐증 진단을 위한 정보제공방법.
삭제