KR20180077068A

KR20180077068A - 세균 메타게놈 분석을 통한 간질환 진단 방법

Info

Publication number: KR20180077068A
Application number: KR1020170180044A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 박태성; 윤정환; 임상섭
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-07-06
Also published as: KR101940425B1

Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 간암 및 간경변 등의 간질환을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 간암 및 간경변을 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 및 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 간암 및 간경변 등의 간질환은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포에 존재하는 유전자에 대하여 메타게놈 분석을 통해 간암 및 간경변 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 간질환의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 간경변 혹은 간암 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 간암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 간질환 진단 방법{Method for diagnosis of liver disease using analysis of bacteria metagenome}

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 간암 및 간경변 등의 간질환을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 간질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

간암(liver cancer)은 간에서 발생하는, 암 사망률 2위를 놓고 위암, 폐암과 다투는 3대 암 중 하나로서 흔히 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)를 말한다. 40~60대에 호발하며, 남자가 여자보다 4배 정도 많이 발생한다. 기저 간질환이 있는 경우 간암이 발생하기 쉬운데, 원인 불문하고 간경변이 있으면 간암의 위험인자가 된다. 간암 환자의 75~85%에서 간경변이 있으며, 간경변환자의 10~30%가 간암이 발생한다고 한다. 또한 바이러스성 간염이 있는 경우도 중요한 위험 인자인데, 그중에서도 B형간염이 간암환자의 60~70%에서, C형간염이 간암환자의 10%정도가 관련된다고 한다. 우리나라에서 B형간염이 있는 사람의 간암발생률은 정상인의 6배라고 하며, 일본, 미국, 유럽에서는 C형간염이 간암의 가장 중요한 위험인자라고 알려져 있다. 또한 술이 중요한 위험인자인데, 우리나라 간암의 10~20%가 알코올성 간 질환에서 발생한다. 그 외 대사질환, 예를 들어 혈색소증, 윌슨병 등을 가지고 있는 경우에도 간암 발생이 증가할 수 있으며, 경구피임약 (에스트로겐이 함유된 제품)도 간암의 발생 위험을 높인다. 당뇨, 비만, 조영제 사용 등도 간암 발생과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 대표적인 간세포암의 종양표지자는 알파태아단백 (Alphafetoprotein, AFP)으로서 혈액검사로 측정한다. 다른 종양표지자도 마찬가지지만 민감도 50~80%, 특이도 60~90%로 그다지 높지 않기 때문에 다른 검사 결과와 같이 해석해야 하는 한계가 있다. 최근에 나온 표지자로 PIVKA-II라고 하는 단백질도 있는데, 민감도 60-90%, 특이도 90%로 알파태아단백보다 좋다.

간부전 (肝不全, hepatic failure)은 간이 정상적인 생리 작용으로서의 단백질 합성과 대사 기능을 수행할 수 없는 상태를 말하고, 간기능부전 (肝機能不全) 또는 간기능상실(肝機能喪失)이라고도 한다. 간부전에는 두 가지 형태가 알려져 있는데, 급성 간부전은 간 문제로 인한 첫 증상 (황달 등)을 보인 후 4주 내로 간성 뇌증 (혼란, 인사불성, 혼수상태)이 진행되고, 단백질 (알부민 등) 혈액 응고 단백질의 생산이 줄어든다. 만성 간부전은 과도한 음주, B형 간염 혹은 C형 간염 바이러스, 자가면역, 유전적 원인, 철, 구리의 과잉섭취 등 대사적 원인 등에 의해 발생하는데, 간경변 (肝硬便, 영어: liver Cirrhosis)을 수반한다. 간경변은 간의 조직 세포에 문제가 생겨 간이 굳고 오므라드는 것이 특징이고, 간경화, 간섬유증으로도 부른다. 간경변은 광범위한 간세포 파괴의 결과로 섬유조직의 증식과 재생성 결절 형성의 형태학적 특징을 보이며, 2차적으로 간내혈관의 변형 및 간기능의 저하가 초래되는 질병이다. 간의 섬유화는 서서히 진행되어 상당한 경과가 있더라도 간기능 부전이 일어나기 전까지 자각증상이 없다. 따라서 조기에 간경변의 발생을 진단하는 것은 매우 어렵다.

한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.

환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(국내 공개특허 제2011-0073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) platform을 이용하여 분석한다. 그러나 간암 발병에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 간암의 원인인자를 동정하고 간암 발병 위험도를 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 간경변 및 간암의 원인인자를 기반으로 간질환을 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 혈액에서 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 간암 및 간경변 등의 간질환의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 간암을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 간경변환자에서 간암을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 간경변을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는

상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 간경변환자와 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는

상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간경변환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 간질환 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 간질환의 발병 위험도 예측방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Lactobacillales, Enterobacteriales, 및 Bacillales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간암을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Streptococcaceae, Pasteurellaceae, Enterobacteriaceae, Moraxellaceae, 및 Staphylococcaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간암을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Streptococcus, Blautia, Klebsiella, Acinetobacter, Staphylococcus, Trabulsiella로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간암을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 간경변환자 유래 샘플과 비교하여 Trabulsiella 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간암을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Streptococcaceae, Moraxellaceae, Staphylococcaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간경변을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Streptococcus, Acinetobacter, Trabulsiella, Staphylococcus, Succiniclasticum로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 간경변을 진단하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 샘플은 혈액일 수 있으며, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.

환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 간암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 또는 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 간암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 간암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 간암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 간암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자를 예측하여, 원인인자에 대한 노출을 피함으로써 간암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.

도 1은 체내에서 세균 유래 세포밖 소포의 분포양상을 평가하기 위한 것으로, 도 1a는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 소포(EV)를 구강으로 투여한 후 시간별(0, 5min, 3h, 6h, 및 12h)로 이들의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 세포밖 소포(EV)를 구강으로 투여하고 12시간 후 혈액 및 다양한 장기(심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육)를 적출하여 상기 세균 및 세포밖 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 2는 간암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 간암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 간암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 간암환자 및 간경변환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 간경변암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 7은 간경변암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 간질환을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 간질환의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.

이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;

상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간경변환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 간질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "간암 진단" 이란 환자에 대하여 간암이 발병할 가능성이 있는지, 간암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 간암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 간암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 간암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "간경변 진단" 이란 환자에 대하여 간경변이 발병할 가능성이 있는지, 간경변이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 간경변이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 간경변 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 간경변을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.

본 발명에 있어서, 상기 피검체 샘플은 혈액일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 정상인, 간경변환자, 및 간암환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 간암 및 간경변 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Lactobacillales, Enterobacteriales, 및 Bacillales 목 세균 유래 소포가 간암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Streptococcaceae, Pasteurellaceae, Enterobacteriaceae, Moraxellaceae, 및 Staphylococcaceae 과 세균 유래 소포가 간암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Streptococcus, Blautia, Klebsiella, Acinetobacter, Staphylococcus, 및 Trabulsiella 속 세균 유래 소포가 간암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 간경변환자와 간암환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 간경변환자에서 간암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Trabulsiella 속 세균 유래 소포가 간암환자와 간경변환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상인과 간경변환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 천식환자에서 간암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Streptococcaceae, Moraxellaceae, 및 Staphylococcaceae 과 세균 유래 소포가 간경변환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Streptococcus, Acinetobacter, Trabulsiella, Staphylococcus, 및 Succiniclasticum 속 세균 유래 소포가 간경변환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).

본 발명은 상기와 같은 실시예 결과를 통해, 혈액으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인 및 간경변환자와 비교하여 간암환자에서 함량이 유의하게 변화한 세균 유래 소포들을 동정하였으며, 메타게놈 분석을 통해 상기 각 수준에서 세균 유래 소포들의 함량 증감을 분석함으로써 간암을 진단할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 실시예 결과를 통해, 혈액으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인과 비교하여 간경변환자에서 함량이 유의하게 변화한 세균 유래 소포들을 동정하였으며, 메타게놈 분석을 통해 상기 각 수준에서 세균 유래 소포들의 함량 증감을 분석함으로써 간경변을 진단할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석

장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.

장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 혈액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.

실시예 2. 혈액으로부터 소포 분리 및 DNA 추출

혈액으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.

상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.

primer		서열	서열번호
16S rDNA	16S_V3_F	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'	1
16S rDNA	16S_V4_R	5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3	2

실시예 3. 혈액 내 소포에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석

상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).

실시예 4. 정상인과 간암환자 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 간암 진단모형

상기 실시예 3의 방법으로, 간암환자 86명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 331명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.

혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Lactobacillales, Enterobacteriales, 및 Bacillales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).

	정상대조군		간암		t-test		Training Set			Test Set
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity	AUC	sensitivity	specificity
o__Lactobacillales	0.0972	0.0630	0.0345	0.0345	0.0000	0.36	0.87	0.92	0.42	0.89	0.95	0.45
o__Enterobacteriales	0.0722	0.0515	0.1747	0.1747	0.0000	2.42	0.80	0.98	0.44	0.74	0.99	0.35
o__Bacillales	0.0360	0.0295	0.1182	0.1182	0.0000	3.28	0.87	0.96	0.53	0.87	0.96	0.50

혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Streptococcaceae, Pasteurellaceae, Enterobacteriaceae, Moraxellaceae, 및 Staphylococcaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).

	정상대조군		간암		t-test		Training Set			Test Set
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity	AUC	sensitivity	specificity
f__Streptococcaceae	0.0573	0.0552	0.0128	0.0128	0.0000	0.22	0.86	0.94	0.48	0.88	0.94	0.55
f__Pasteurellaceae	0.0041	0.0082	0.0018	0.0018	0.0010	0.43	0.68	1.00	0.02	0.64	1.00	0.05
f__Enterobacteriaceae	0.0722	0.0515	0.1747	0.1747	0.0000	2.42	0.80	0.98	0.44	0.74	0.99	0.35
f__Moraxellaceae	0.0395	0.0475	0.1061	0.1061	0.0000	2.69	0.79	0.96	0.18	0.87	0.99	0.40
f__Staphylococcaceae	0.0198	0.0243	0.1054	0.1054	0.0000	5.31	0.90	0.96	0.55	0.86	0.95	0.60

혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Streptococcus, Blautia, Klebsiella, Acinetobacter, Staphylococcus, 및 Trabulsiella 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).

	정상대조군		간암		t-test		Training Set			Test Set
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity	AUC	sensitivity	specificity
g__Streptococcus	0.0568	0.0553	0.0124	0.0124	0.0000	0.22	0.86	0.94	0.48	0.88	0.94	0.50
g__Blautia	0.0095	0.0134	0.0043	0.0043	0.0000	0.45	0.68	0.99	0.02	0.69	1.00	0.05
g__Klebsiella	0.0221	0.0294	0.0546	0.0546	0.0000	2.48	0.74	0.96	0.21	0.72	0.97	0.15
g__Acinetobacter	0.0179	0.0243	0.0725	0.0725	0.0000	4.05	0.80	0.96	0.30	0.82	0.98	0.40
g__Staphylococcus	0.0198	0.0243	0.1053	0.1053	0.0000	5.32	0.90	0.96	0.55	0.86	0.95	0.60
g__Trabulsiella	0.0074	0.0147	0.0436	0.0436	0.0000	5.90	0.82	0.96	0.50	0.78	0.97	0.45

실시예 5. 간경변환자와 간암환자 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 간암 진단모형

상기 실시예 3의 방법으로, 간암환자 84명과 간경변환자 86명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.

혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Trabulsiella속 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).

간경변

간암

t-test

Training Set

Test Set

Taxon

Mean

SD

Mean

SD

p-value

Ratio

AUC

sensitivity

specificity

AUC

sensitivity

specificity

g__Trabulsiella

0.0197

0.0325

0.0436

0.0001

2.22

0.73

0.83

0.47

0.55

0.62

0.42

실시예 6. 정상인과 간경변 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 간경변 진단모형

상기 실시예 3의 방법으로, 간암환자 84명과 정상인 331명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.

혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Streptococcaceae, Moraxellaceae, 및 Staphylococcaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간경변에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).

	정상대조군		간경변		t-test		Training Set			Test Set
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity	AUC	sensitivity	specificity
f__Streptococcaceae	0.0573	0.0552	0.0183	0.0183	0.0000	0.32	0.80	0.97	0.22	0.86	0.96	0.25
f__Moraxellaceae	0.0395	0.0475	0.0821	0.0821	0.0000	2.08	0.71	0.98	0.08	0.75	0.97	0.13
f__Staphylococcaceae	0.0198	0.0243	0.0574	0.0574	0.0000	2.89	0.74	0.97	0.23	0.68	0.97	0.21

혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Streptococcus, Acinetobacter, Trabulsiella, Staphylococcus, 및 Succiniclasticum 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 간경변에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 7 및 도 7 참조).

	정상대조군		간경변		t-test		Training Set			Test Set
Taxon	Mean	SD	Mean	SD	p-value	Ratio	AUC	sensitivity	specificity	AUC	sensitivity	specificity
g__Streptococcus	0.0568	0.0553	0.0177	0.0177	0.0000	0.31	0.84	0.96	0.29	0.79	0.96	0.23
g__Acinetobacter	0.0179	0.0243	0.0419	0.0419	0.0000	2.34	0.70	0.98	0.10	0.72	1.00	0.04
g__Trabulsiella	0.0074	0.0147	0.0197	0.0197	0.0011	2.66	0.69	0.99	0.03	0.70	1.00	0.12
g__Staphylococcus	0.0198	0.0243	0.0574	0.0574	0.0000	2.89	0.71	0.98	0.21	0.76	1.00	0.23
g__Succiniclasticum	0.0000	0.0002	0.0036	0.0036	0.0082	241.16	0.67	1.00	0.09	0.66	0.99	0.10

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for diagnosis of liver disease using analysis of bacteria metagenome <130> MP17-341 <150> KR 10-2016-0181483 <151> 2016-12-28 <150> KR 10-2017-0025000 <151> 2017-02-24 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims

(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 간경변환자와 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간경변환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고,
상기 피검체 샘플은 혈액이고,
상기 (c) 단계에서, 락토바실레아레스(Lactobacillales, 엔테로박테리아레스(Enterobacteriales, 및 간균목(Bacillales)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
스트렙토코카시에(Streptococcaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae), 모락셀라과(Moraxellaceae), 및 포도상구균과(Staphylococcaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
연쇄상구균(Streptococcus), 블라우티아(Blautia), 클렙시엘라(Klebsiella), 아시네토박터(Acinetobacter), 포도상구균속(Staphylococcus), 트라불시엘라(Trabulsiella), 및 숙시니클라스티쿰속(Succiniclasticum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서, PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서, PCR 산물의 서열분석을 통하여 간경변환자와 간암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서, PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 간경변환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 간경변을 진단하는 것을 특징으로 하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 간질환 진단을 위한 정보제공방법.