KR102008440B1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 대사증후군 진단방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 대사증후군 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 대사증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 대사증후군을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 우리 몸의 면역기능 및 대사기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 대사증후군은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 대사증후군 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 대사증후군의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 대사증후군의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 대사증후군 진단방법{Method for diagnosis of metabolic syndrome using analysis of bacteria metagenome}
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 대사증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 대사증후군을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
대사증후군(Metabolic syndrome)은 각종 심혈관 질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것이다. 대사증후군을 가질 경우 심혈관 질환 및 인슐린저항성을 동반한 당뇨병의 발병 위험도가 증가된다. 1998년 세계보건기구는 인슐린저항성이 이 증상들의 모든 요소를 다 설명할 수 있다는 확증이 없기에 '인슐린 저항성 증후군' 이라는 용어 대신 '대사증후군'으로 부르기로 했다. 원인은 체내에 인슐린이 있더라도 저항성으로 인해 포도당을 에너지원으로 사용하지 못하여 고혈당이 발생하게 된다. 대사증후군의 주요 임상 양상은 혈당 대사이상으로 인한 당뇨병, 지질대사(lipid metabolism) 이상으로 인한 중성지방 증가, 고혈압 등을 특징으로 한다.
대사증후군은 심혈관질환의 위험과 당뇨병 발병의 위험을 증가시키므로 일단 진단이 되면 이들 질환 발병의 위험을 줄이기 위해 적극적인 치료에 나서야 한다. 그러나 치료할 수 있는 뚜렷한 방법은 아직 밝혀지지 않고 있으므로 예방이 매우 중요하다. 비만이 가장 근본적인 원인이므로 적절한 체중 유지와 규칙적인 운동으로 예방해야 한다. 또한 스트레스를 받지 않도록 정신적ㆍ육체적 환경을 잘 조절해 마음을 편안하게 하는 것이 중요하다. 비만한 사람이 규칙적인 운동을 통해 체중을 줄이게 되면 신체의 인슐린 저항성이 개선될 뿐 아니라 이와 동반된 당뇨병이나 고혈압, 고지혈증 등의 증상도 호전 될 수 있다는 것이 연구 결과를 통해 증명된 바 있다. 또한, 올바른 식사습관을 갖는 것도 중요한데, 탄수화물 섭취는 전체 칼로리 중 50% 미만으로 낮추는 것이 좋다. 탄수화물은 단순 다당류의 탄수화물보다는 정제하지 않은 곡류로 만든 빵이나 제품, 현미가 좋다고 알려져 있다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(국내공개특허 제2011-073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다. 그러나 대사증후군 발병에 있어서, 타액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 대사증후군의 원인인자를 동정하고 대사증후군을 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 대사증후군의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 정상인 및 피검자 유래 샘플인 타액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 대사증후군의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 대사증후군을 진단하기 위한 정보제공방법, 대사증후군 진단방법, 및 대사증후군 발병 위험도 예측 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 진단방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 발병 위험도 예측 방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 구현예로, 상기 (c) 단계에서 푸소박테리아(Fusobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 타액에서 비교하여 대사증후군을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 구현예로, 상기 (c) 단계에서 푸소박테리아(Fusobacteriia) 및 할로박테리아(Halobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 타액에서 비교하여 대사증후군을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 아에로모나달레스(Aeromonadales), CW040, 버크홀데리아레스(Burkholderiales), 산토모나다레스(Xanthomonadales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 할로박테리아레스(Halobacteriales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 투리시박터아레스(Turicibacterales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 타액에서 비교하여 대사증후군을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 페니바실라시에(Paenibacillaceae), 렙토트리키아시에(Leptotrichiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 할로박테리아시에(Halobacteriaceae), 산토모나다시에(Xanthomonadaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 푸소박테리아시에(Fusobacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 투리시박테라시에(Turicibacteraceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 및 티시에렐라시에(Tissierellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 타액에서 비교하여 대사증후군을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 필리팍터(Filifactor), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 렙토트리키아(Leptotrichia), 라우트로피아(Lautropia), 브레분디모나스(Brevundimonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 베일로넬라(Veillonella), 메가모나스(Megamonas), 나이세리아(Neisseria), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 노보스핑고비움(Sphingobium), 헤모필루스(Haemophilus), 푸소박테리움(Fusobacterium), 코프로코커스(Coprococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 투리시박터(Turicibacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 피네골디아(Finegoldia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 타액에서 비교하여 대사증후군을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 타액이고,
상기 (c) 단계에서 푸소박테리아(Fusobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
푸소박테리아(Fusobacteriia) 및 할로박테리아(Halobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
아에로모나달레스(Aeromonadales), CW040, 버크홀데리아레스(Burkholderiales), 산토모나다레스(Xanthomonadales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 할로박테리아레스(Halobacteriales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 투리시박터아레스(Turicibacterales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
페니바실라시에(Paenibacillaceae), 렙토트리키아시에(Leptotrichiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 할로박테리아시에(Halobacteriaceae), 산토모나다시에(Xanthomonadaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 푸소박테리아시에(Fusobacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 투리시박테라시에(Turicibacteraceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 및 티시에렐라시에(Tissierellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
필리팍터(Filifactor), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 렙토트리키아(Leptotrichia), 라우트로피아(Lautropia), 브레분디모나스(Brevundimonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 베일로넬라(Veillonella), 메가모나스(Megamonas), 나이세리아(Neisseria), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 노보스핑고비움(Sphingobium), 헤모필루스(Haemophilus), 푸소박테리움(Fusobacterium), 코프로코커스(Coprococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 투리시박터(Turicibacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 피네골디아(Finegoldia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
투리시박터아레스(Turicibacterales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 투리시박테라시에(Turicibacteraceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 및 티시에렐라시에(Tissierellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
코프로코커스(Coprococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 투리시박터(Turicibacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 및 피네골디아(Finegoldia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 대사증후군으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
푸소박테리아(Fusobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
푸소박테리아(Fusobacteriia) 및 할로박테리아(Halobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
아에로모나달레스(Aeromonadales), CW040, 버크홀데리아레스(Burkholderiales), 산토모나다레스(Xanthomonadales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 할로박테리아레스(Halobacteriales), 및 파스테우렐라레스(Pasteurellales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
페니바실라시에(Paenibacillaceae), 렙토트리키아시에(Leptotrichiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 할로박테리아시에(Halobacteriaceae), 산토모나다시에(Xanthomonadaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 및 푸소박테리아시에(Fusobacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
필리팍터(Filifactor), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 렙토트리키아(Leptotrichia), 라우트로피아(Lautropia), 브레분디모나스(Brevundimonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 베일로넬라(Veillonella), 메가모나스(Megamonas), 나이세리아(Neisseria), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 노보스핑고비움(Sphingobium), 헤모필루스(Haemophilus), 및 푸소박테리움(Fusobacterium)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 대사증후군으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 샘플은 타액일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 면역 및 대사기능에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 대사증후군은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 대사증후군의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 대사증후군의 위험군을 조기에 진단할 수 있으며, 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 대사증후군 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 대사증후군의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 대사증후군으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 타액 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 대사증후군환자 및 정상인 타액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 대사증후군환자 및 정상인 타액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 대사증후군환자 및 정상인 타액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 대사증후군환자 및 정상인 타액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 대사증후군환자 및 정상인 타액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 대사증후군을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 대사증후군의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 대사증후군을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사증후군" 이란 인슐린저항성 혹은 고혈당, 중성지방 증가와 같은 지질대사 이상, 고혈압, 비만 등을 특징으로 하는 만성질환으로서, 비만, 고혈압, 및 제2형 당뇨병 등을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대사증후군 진단" 이란 환자에 대하여 대사증후군이 발병할 가능성이 있는지, 대사증후군이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대사증후군이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대사증후군 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대사증후군을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 타액일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 대사증후군 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 타액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 대사증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 타액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Fusobacteriia 및 Halobacteria 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 대사증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 타액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Aeromonadales, CW040, Burkholderiales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Halobacteriales, Pasteurellales, 및 Turicibacterales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 대사증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 타액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Paenibacillaceae, Leptotrichiaceae, Oxalobacteraceae, Burkholderiaceae, Nocardiaceae, Comamonadaceae, Peptostreptococcaceae, Halobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Carnobacteriaceae, Pasteurellaceae, Fusobacteriaceae, Propionibacteriaceae, Planococcaceae, Turicibacteraceae, Corynebacteriaceae, 및 Tissierellaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 대사증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 타액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Filifactor, Cupriavidus, Stenotrophomonas, Leptotrichia, Lautropia, Brevundimonas, Psychrobacter, Rhodococcus, Aggregatibacter, Veillonella, Megamonas, Neisseria, Granulicatella, Sphingobium, Haemophilus, Fusobacterium, Coprococcus, Propionibacterium, Anaerococcus, Turicibacter, Corynebacterium, 및 Finegoldia 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 대사증후군환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 대사증후군 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
세균과 세균 유래 소포가 점막을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 세균과 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
세균과 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 타액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 타액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 타액으로부터 소포 분리 및 DNA 추출
타액으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 타액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 타액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' 2
실시예 3. 타액에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 타액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대사증후군 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대사증후군환자 40명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 215명의 타액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 정확도, 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
타액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대사증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 대조군 대사증후군 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
p__Fusobacteria 0.0097 0.0140 0.0039 0.0073 0.0005 0.40 0.86 0.85 0.97 0.12
타액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Fusobacteriia 및 Halobacteria 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대사증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 대조군 대사증후군 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
c__Fusobacteriia 0.0097 0.0140 0.0039 0.0073 0.0005 0.40 0.86 0.85 0.97 0.12
c__Halobacteria 0.0013 0.0035 0.0005 0.0008 0.0052 0.41 0.83 0.85 0.97 0.09
타액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Aeromonadales, CW040, Burkholderiales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Halobacteriales, Pasteurellales, 및 Turicibacterales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대사증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 대조군 대사증후군 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
o__Aeromonadales 0.0006 0.0020 0.0001 0.0003 0.0029 0.22 0.83 0.86 0.97 0.15
o__CW040 0.0007 0.0022 0.0002 0.0004 0.0009 0.25 0.84 0.86 0.97 0.15
o__Burkholderiales 0.0223 0.0333 0.0070 0.0056 0.0000 0.32 0.87 0.86 0.96 0.21
o__Xanthomonadales 0.0026 0.0053 0.0009 0.0017 0.0005 0.36 0.83 0.86 0.97 0.12
o__Fusobacteriales 0.0097 0.0140 0.0039 0.0073 0.0005 0.40 0.86 0.85 0.97 0.12
o__Halobacteriales 0.0013 0.0035 0.0005 0.0008 0.0052 0.41 0.83 0.85 0.97 0.09
o__Pasteurellales 0.0349 0.0461 0.0167 0.0219 0.0004 0.48 0.85 0.86 0.97 0.12
o__Turicibacterales 0.0009 0.0014 0.0028 0.0032 0.0024 3.02 0.88 0.88 0.97 0.27
타액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Paenibacillaceae, Leptotrichiaceae, Oxalobacteraceae, Burkholderiaceae, Nocardiaceae, Comamonadaceae, Peptostreptococcaceae, Halobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Carnobacteriaceae, Pasteurellaceae, Fusobacteriaceae, Propionibacteriaceae, Planococcaceae, Turicibacteraceae, Corynebacteriaceae, 및 Tissierellaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대사증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 대조군 대사증후군 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
f__Paenibacillaceae 0.0001 0.0004 0.0000 0.0000 0.0006 0.07 0.83 0.86 0.98 0.12
f__Leptotrichiaceae 0.0035 0.0070 0.0008 0.0023 0.0000 0.24 0.87 0.86 0.97 0.18
f__Oxalobacteraceae 0.0060 0.0190 0.0015 0.0018 0.0008 0.25 0.83 0.86 0.97 0.15
f__Burkholderiaceae 0.0086 0.0244 0.0024 0.0043 0.0007 0.27 0.85 0.86 0.96 0.18
f__Nocardiaceae 0.0004 0.0009 0.0001 0.0003 0.0007 0.30 0.83 0.85 0.97 0.09
f__Comamonadaceae 0.0066 0.0133 0.0022 0.0033 0.0001 0.34 0.84 0.86 0.98 0.09
f__Peptostreptococcaceae 0.0020 0.0070 0.0007 0.0007 0.0091 0.35 0.83 0.86 0.98 0.09
f__Halobacteriaceae 0.0013 0.0035 0.0005 0.0006 0.0015 0.35 0.83 0.85 0.97 0.09
f__Xanthomonadaceae 0.0026 0.0053 0.0009 0.0017 0.0005 0.36 0.83 0.86 0.97 0.12
f__Carnobacteriaceae 0.0062 0.0109 0.0025 0.0048 0.0013 0.40 0.83 0.87 0.98 0.15
f__Pasteurellaceae 0.0349 0.0461 0.0167 0.0219 0.0004 0.48 0.85 0.86 0.97 0.12
f__Fusobacteriaceae 0.0062 0.0096 0.0030 0.0053 0.0076 0.49 0.85 0.85 0.96 0.09
f__Propionibacteriaceae 0.0061 0.0066 0.0129 0.0083 0.0001 2.11 0.86 0.89 0.98 0.30
f__Planococcaceae 0.0027 0.0033 0.0062 0.0053 0.0009 2.27 0.85 0.90 0.97 0.39
f__Turicibacteraceae 0.0009 0.0014 0.0028 0.0032 0.0024 3.02 0.88 0.88 0.97 0.27
f__Corynebacteriaceae 0.0159 0.0211 0.0863 0.0839 0.0000 5.42 0.91 0.90 0.98 0.42
f__[Tissierellaceae] 0.0028 0.0056 0.0169 0.0187 0.0002 6.07 0.89 0.90 0.98 0.39
타액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Filifactor, Cupriavidus, Stenotrophomonas, Leptotrichia, Lautropia, Brevundimonas, Psychrobacter, Rhodococcus, Aggregatibacter, Veillonella, Megamonas, Neisseria, Granulicatella, Sphingobium, Haemophilus, Fusobacterium, Coprococcus, Propionibacterium, Anaerococcus, Turicibacter, Corynebacterium, 및 Finegoldia 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대사증후군에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 대조군 대사증후군 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
g__Filifactor 0.0013 0.0067 0.0000 0.0001 0.0081 0.04 0.85 0.86 0.97 0.15
g__Cupriavidus 0.0041 0.0115 0.0005 0.0010 0.0000 0.12 0.84 0.87 0.98 0.15
g__Stenotrophomonas 0.0019 0.0051 0.0004 0.0014 0.0005 0.21 0.84 0.87 0.98 0.12
g__Leptotrichia 0.0030 0.0069 0.0008 0.0023 0.0005 0.26 0.86 0.85 0.96 0.15
g__Lautropia 0.0085 0.0244 0.0022 0.0044 0.0007 0.26 0.85 0.86 0.97 0.18
g__Brevundimonas 0.0010 0.0022 0.0003 0.0005 0.0001 0.27 0.83 0.87 0.98 0.12
g__Psychrobacter 0.0002 0.0007 0.0001 0.0002 0.0074 0.30 0.83 0.86 0.98 0.12
g__Rhodococcus 0.0004 0.0009 0.0001 0.0003 0.0009 0.30 0.83 0.85 0.97 0.09
g__Aggregatibacter 0.0029 0.0081 0.0009 0.0025 0.0061 0.31 0.84 0.86 0.98 0.12
g__Veillonella 0.0278 0.0436 0.0089 0.0117 0.0000 0.32 0.87 0.88 0.97 0.24
g__Megamonas 0.0008 0.0017 0.0003 0.0006 0.0010 0.34 0.84 0.86 0.98 0.12
g__Neisseria 0.0329 0.0608 0.0120 0.0261 0.0011 0.37 0.83 0.87 0.98 0.15
g__Granulicatella 0.0061 0.0108 0.0024 0.0047 0.0013 0.39 0.83 0.87 0.98 0.15
g__Sphingobium 0.0005 0.0011 0.0002 0.0003 0.0078 0.45 0.83 0.86 0.97 0.12
g__Haemophilus 0.0307 0.0415 0.0150 0.0190 0.0005 0.49 0.85 0.86 0.97 0.12
g__Fusobacterium 0.0062 0.0096 0.0030 0.0053 0.0076 0.49 0.85 0.85 0.96 0.09
g__Coprococcus 0.0016 0.0020 0.0033 0.0029 0.0035 2.04 0.87 0.85 0.96 0.15
g__Propionibacterium 0.0060 0.0066 0.0129 0.0083 0.0001 2.13 0.87 0.89 0.98 0.30
g__Anaerococcus 0.0012 0.0041 0.0034 0.0038 0.0035 2.86 0.84 0.87 0.98 0.15
g__Turicibacter 0.0009 0.0014 0.0028 0.0032 0.0024 3.02 0.88 0.88 0.97 0.27
g__Corynebacterium 0.0159 0.0211 0.0863 0.0839 0.0000 5.42 0.91 0.90 0.98 0.42
g__Finegoldia 0.0008 0.0026 0.0105 0.0122 0.0001 13.32 0.92 0.92 0.99 0.45
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for diagnosis of metabolic syndrome using analysis of bacteria metagenome <130> MP18-011 <150> KR 1020170135468 <151> 2017-10-18 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (4)

  1. (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 타액이고,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
    아내로코커스(Anaerococcus) 및 피네골디아(Finegoldia) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
    쿠프리아비두스(Cupriavidus) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 대사증후군으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대사증후군 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
    아내로코커스(Anaerococcus) 및 피네골디아(Finegoldia) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
    쿠프리아비두스(Cupriavidus) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며 ;
    투리시박터아레스(Turicibacterales) 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 투리시박테라시에(Turicibacteraceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 및 티시에렐라시에(Tissierellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    코프로코커스(Coprococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 투리시박터(Turicibacter), 및 코리네박테리움(Corynebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우
    대사증후군으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대사증후군 진단을 위한 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여
    아내로코커스(Anaerococcus) 및 피네골디아(Finegoldia) 속(genus) 세균 유래 소포의 함량이 증가되어 있고,
    쿠프리아비두스(Cupriavidus) 및 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속 (genus) 세균 유래 소포의 함량이 감소되어 있으며 ;
    푸소박테리아(Fusobacteria) 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    푸소박테리아(Fusobacteriia) 및 할로박테리아(Halobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    아에로모나달레스(Aeromonadales), 버크홀데리아레스(Burkholderiales), 산토모나다레스(Xanthomonadales), 푸소박테리아레스(Fusobacteriales), 할로박테리아레스(Halobacteriales), 및 파스테우렐라레스(Pasteurellales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    페니바실라시에(Paenibacillaceae), 렙토트리키아시에(Leptotrichiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 노카르디아시에(Nocardiaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 펩토스트렙토코카시에(Peptostreptococcaceae), 할로박테리아시에(Halobacteriaceae), 산토모나다시에(Xanthomonadaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 및 푸소박테리아시에(Fusobacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    필리팍터(Filifactor), 렙토트리키아(Leptotrichia), 라우트로피아(Lautropia), 브레분디모나스(Brevundimonas), 사이크로박터(Psychrobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 아그레가티박터(Aggregatibacter), 베일로넬라(Veillonella), 메가모나스(Megamonas), 나이세리아(Neisseria), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 노보스핑고비움(Sphingobium), 헤모필루스(Haemophilus), 및 푸소박테리움(Fusobacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우
    대사증후군으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대사증후군 진단을 위한 정보제공방법.
  4. 삭제
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