CN106192022B - 16SrRNA多重测序文库的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种16SrRNA多重测序文库的构建方法。所述的构建方法包括以下步骤：(1)、扩增PCR：使用引物F1和引物R1构成引物对，PCR扩增样品中的16SrRNA序列；(2)、建库PCR：使用引物F2和引物R2构成引物对，以步骤(1)获得的PCR产物为模板，进行PCR扩增。本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法获得测序文库测序反应得到的数据质量和平衡性更好，测序结果更加准确；可以实现的文库样品标记数量远大于现有技术；更加适用于土壤样品中细菌多样性的研究；大大提高了样品中细菌多样性研究的准确性。

Description

16SrRNA多重测序文库的构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种16SrRNA多重测序文库的构建方法。
背景技术
细菌多样性和人类生活生产中的众多领域存在密切联系，了解和掌握不同生境中的细菌多样性信息能对食品加工、农业生产、医学治疗等诸多方面有重要指导作用。随着分子生物学技术的发展，以16SrRNA序列为基础的细菌多样性研究方法不断完善。此类方法通过对未知样品中的微生物环境基因组(也成宏基因组，Metagenome，即某生境中全部微小生物遗传物质的总和)进行提取，通过16SrRNA引物扩增其中的16SrRNA序列，构建16SrRNA测序文库，在连接测序接头等必要接头后，与高通量测序技术相结合，能够快速高效地获得特定样品中的全部16SrRNA信息，进而得知该样品中的细菌组成情况。
早期的测序文库构建方法仅能实现对单个文库样品的测序，无法实现对多个测序文库样品的混合测序。然而，在实际应用中，通常会同时涉及到数百个，甚至上千个测序文库样品，因此单个文库样品的测序已无法满足实际需求。为了实现多个文库样品混合测序，避免测序资源浪费，进而发展出了多重核酸测序技术(Multiplex sequencing)。多重测序技术在没测测序文库中加入一段用于识别样品的索引标签(也称为Index)，在测序后，根据不同的索引标签序列，区分不同的文库样品，即利用不同的Index标记不同的样品。
为了使用方便，目前已经发展出为测序文库添加Index的成熟方法和商品试剂盒。例如，Illunima公司的Nextera XT Index Kit和Nextera XT v2 Index Kit，二者均是用于构建16SrRNA多重测序文库。前者提供22条引物(包含20个Index)，能够实现对96个不同样品的标记；后者提供42条引物(包含40个Index)，能够实现对384个不同样品的标记。然而值得注意的是，并非任何核苷酸序列都适合用作Index，在实际测序反应中，混合不同文库同时进行测序，常常会因为测序反应对标签中碱基的偏好性，造成检测插入片段时光强参数的波动，影响输出的数据质量和平衡性，导致数据结果不可信并且重复性低，不能真实的反映样品的相关信息。因此，开发能够获得高质量和平衡性测序数据的Index并且提高Index的使用效率，以相对较少的Index数目获得相对更多的样品标记数量，对细菌多样性研究工作十分重要。
另一方面，虽然目前已有成熟的16SrRNA扩增引物和其测序文库构建引物，然后这些引物并非广泛适用于各种类型的样品。经对比实验发现，现有技术中的16SrRNA测序文库构建引物(如Illunima公司提供的引物)在用于肠道等样品时能够获得相对特异的扩增结果；但用于土壤样品时，获得的16SrRNA扩增产物特异性不高，电泳显示扩增条带弥散严重，这将严重影响后续测序和分析结果的准确性。
再一方面，尽管现有技术已经提高了多重测序中可混合测序的不同文库样品的数量，然而随着研究需要的不断提高，需要进行混合测序的样品数量也不断提高。因此，需要提供一种新的16SrRNA多重测序文库的构建方法，提高Index的利用效率，使用尽可能少的Index获得尽可能多的测序样品区分数量。
综上所述，开发一种16SrRNA多重测序文库的构建方法，使之更加适用于土壤样品，并且能够利用较少的Index数目实现更多数量的样品标记数量，能够使得细菌多样性研究工作更加高效便捷。
发明内容
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“Index”指索引标签，具体指一段用于区分不同测序样品的核苷酸序列；术语“PCR”指聚合酶链式反应。
本发明提供了一种16SrRNA多重测序文库的构建方法，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)、扩增PCR：使用引物F1和引物R1构成引物对，PCR扩增样品中的16SrRNA序列；
(2)、建库PCR：使用引物F2和引物R2构成引物对，以步骤(1)获得的PCR产物为模板，进行PCR扩增。
所述的构建方法中，引物F1是含有如下所示的Index1-40中的任意一个Index的16SrRNA的5’端扩增引物：
做为优选，所述的构建方法中的16SrRNA的5’端扩增引物的序列可以为SEQ IDNO：1-10中所示的任意一条核苷酸序列，其中Index位于16SrRNA的5’端扩增引物的核苷酸序列中的第28和29个核苷酸之间：
所述的构建方法中，引物R1是含有本发明所述的Index1-40中的任意一个Index的16SrRNA的3’端扩增引物。
作为优选，所述的构建方法中的16SrRNA的3’端扩增引物的序列可以为SEQ IDNO：11-20中所示的任意一条核苷酸序列，其中Index位于16SrRNA的5’端扩增引物的核苷酸序列中的第29和30个核苷酸之间。
所述的构建方法中，引物R2是在如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列中包含了本发明所述的Index1-40中的任意一个Index构成的核苷酸序列,其中Index位于SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列中的第24和25个核苷酸之间。
所述的构建方法中，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC。
所述的构建方法中，所述的引物F1和引物R1中包含的Index的序列为不同核苷酸序列。
所述的构建方法中，所述的引物F1和引物R2中包含的Index的序列为不同核苷酸序列。
所述的构建方法中，所述的引物R1和引物R2中包含的Index的序列为不同核苷酸序列。
所述的构建方法中，所述的引物F1、引物R1和引物R2中包含的Index的序列为不同核苷酸序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法中所使用的40个Index在设计时，充分考虑到彼此之间的序列差异程度和测序反应对不同Index序列的数据产出偏好性，加大程度地降低了其序列合成或测序过程中可能出现的错误率；引物F2、F1和R1、R2经过两轮PCR获得的测序文库，在测序时，测序反应得到的数据质量和平衡性更好，测序结果更加准确。
2、本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法采用两轮PCR，并且分别在第一轮和第二轮PCR引入2个和1个Index，使得能够标记的文库样品数量大大提高。例如，没法明共提供了40个不同Index，若将其中15个用于引物F1的，15个用于引物R1，10个用于引物R2，则能够获得15条不同的引物F1、15条不同的引物R1和10条不同的引物R2，在步骤(1)和步骤(2)两轮PCR后，能够实现对15*15*10个不同文库样品的标记，也就是使用41条引物(含有40个Index)能够实现对多达2250个不同文库样品的标记。而按照现有技术，例如Illunima公司提供的Nextera XT Index Kit和Nextera XT v2 Index Kit，前者提供22条引物(包含20个Index)，仅能够实现对96个不同文库样品的标记；后者提供42条引物(包含40个Index)，仅能够实现对384个不同文库样品的标记。因此，本发明提供的测序文库构建方法可以实现的文库样品标记数量远大于现有技术。
3、本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法中所使用的引物R1和F1非常适用于对土壤样品中16SrRNA的扩增，获得的扩增产物特异性高，电泳结果显示目的条带清晰，无明显弥散现象，而现有技术中提供的引物用于土壤样品时，获得的16SrRNA扩增产物特异性差，电泳结果显示弥散严重。因此，本发明提供的测序文库构建方法比现有技术更加适用于土壤样品中细菌多样性的研究，极大程度地保证了后续测序反应和研究结果的准确性，使得土壤样品中细菌多样性研究更加高效便捷准确。
4、本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法中所使用的引物R1、F1和引物R2、F2分别能够使得步骤(1)和步骤(2)的PCR扩增循环数降低，使得步骤(1)中扩增循环数在低至12时，仍能够获得较为清晰的扩增产物，使得步骤(2)中扩增循环数在低至6时，仍能够获得较为清晰的扩增产物。这极大程度的缩小了由于PCR循环数的提高使得测序结果对样品中实际细菌多样性情况的偏离，本发明提供的构建方法获得的测序文库的测序结果更加逼近样品中细菌多样性的实际情况，大大提高了样品中细菌多样性研究的准确性。
5、本发明提供的16SrRNA多重测序文库的构建方法中所使用的引物R2和F2中插入了Illumina MiSeq测序平台的测序接头，因此步骤(2)获得的扩增产物可混合后，使用Illumina MiSeq测序平台进行测序。
附图说明
图1为实验例1步骤(2)中的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为对比例1中的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“ddH2O”指双蒸水。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
Soil DNA Kit购自Omega公司；KOD-Plus-Neo购自TOYOBO公司；引物合成委托生工生物工程股份有限公司进行；800个不同来源的土壤样品由中科院北京基因组研究所提供。
实施例1构建800个不同来源土壤样品的多重测序文库
(1)、样品基因组DNA的提取：
用 Soil DNA Kit提取土壤样品中的基因组DNA，获得800个基因组DNA样品，提取步骤参见产品说明书。
(2)、扩增PCR：使用引物F1和引物R1构成引物对，分别以步骤(1)获得的800个基因组DNA作为模板，PCR扩增样品中的16SrRNA序列；
共使用10条引物F1，其序列如下所示：
共使用10条引物R1，其序列如下所示：
将10条引物R1和10条引物F1两两配对共可组成100个引物对，其组成如下所示
随机将800个基因组DNA样品分为100组，每组8个样品，使用引物对1-100分别对第1-100组样品进行PCR扩增。PCR扩增体系如下所示：
成分 含量
样品基因组DNA(10ng/μL) 2μL
引物(10μM) 各0.75μL
MgSO4(25mM) 3μL
dNTPs(2mM) 5μL
10×KOD-Plus-Neo Buffer 5μL
KOD-Plus-Neo 1μL
ddH2O 32.5μL
共计 50μL
PCR扩增程序如下所示：
对获得的800个扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度0.8％，电泳结果显示采用本发明提供的引物获得的16SrRNA扩增产物条带清晰，无弥散现象。由于样品数量较多，随机挑选20个样品的电泳图自此展示，如图1所示，16SrRNA扩增产物目的条带明确，无弥散现象，其余样品的扩增产物电泳图和此20个样品相似或相同。
(3)、建库PCR：使用引物F2和引物R2构成引物对，以步骤(2)获得的800个扩增产物为模板，进行PCR扩增。
共使用8条引物R2，其序列如下所示：
引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC。
分别利用引物F2和8条引物R2构成8对引物对，其组成如下所示：
引物对 SEQ ID NO 引物对 SEQ ID NO
101 22+43 105 22+47
102 22+44 106 22+48
103 22+45 107 22+49
104 22+46 108 22+50
分别使用引物对101-108作为建库PCR引物，分别以上述100组样品中的每组8个样品的扩增产物作为模板，进行PCR扩增。例如100组样品中的某组样品编号为1-8，则用引物对101-108分别对样品1-8在步骤(2)中获得的扩增产物进行PCR扩增，其他样品组以此为例进行扩增。
PCR扩增体系如下所示：
PCR扩增程序如下所示：
使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化步骤(3)获得的800个扩增产物，纯化后的扩增产物混合后，即为800个不同来源土壤样品的多重测序文库。该文库可使用IlluminaMiSeq测序平台进行测序，测序结果经分析后，可反应样品中的细菌多样性情况。
对比例1
以下引物对1和引物对2分别为常规16SrRNA扩增引物和Illunima公司提供的16SrRNA测序文库构建引物。
引物对1：
5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’
5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’
引物对2：
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’；
5’-GTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。
利用上述两个引物对对本发明实施例1中涉及的800个不同来源土壤样品中的随机200个样品中的16SrRNA进行扩增。
样品基因组DNA的提取方法同实施例1步骤(1)，PCR体系和PCR程序同实施例1步骤(2)。
将获得的200个扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度和电泳条件同实验例1步骤(2)，电泳结果显示：采用引物对1和引物对2获得的16SrRNA扩增产物电泳后目的条带不清晰，弥散严重。由于样品数量较多，在此随机挑选20个扩增产物电泳图进行展示，电泳结果如图2所示，目的条带不清晰，弥散严重；其余样品的电泳结果与图2相同或相似，扩增产物目的条带不清晰，弥散严重。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种16SrRNA多重测序文库的构建方法，其特征在于：所述的构建方法包括以下步骤：(1)、扩增PCR：使用引物F1和引物R1构成引物对，PCR扩增样品中的16SrRNA序列；(2)、建库PCR：使用引物F2和引物R2构成引物对，以步骤(1)获得的PCR产物为模板，进行PCR扩增；（3）、引物F1是含有如下所示的29个Index中的任意一个Index的16SrRNA的5’端扩增引物；（4）、16SrRNA的5’端扩增引物的序列为SEQ ID NO：1-10所示的任意一条核苷酸序列，其中Index位于16SrRNA的5’端扩增引物的核苷酸序列中的第28和29个核苷酸之间；（5）、引物R1是含有如下所示的29个Index中的任意一个Index的16SrRNA的3’端扩增引物；（6）、16SrRNA的3’端扩增引物的序列为SEQ ID NO：11-20所示的任意一条核苷酸序列，其中Index位于16SrRNA的3’端扩增引物的核苷酸序列中的第29和30个核苷酸之间；（7）、引物R2是在SEQID NO：21所示的核苷酸序列中包含了以下的29个Index中的任意一个Index而构成的核苷酸序列,其中Index位于SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列中的第24和25个核苷酸之间；（8）、引物F2的序列为SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列；（9）、引物F1、引物R1和引物R2中包含的Index的序列为不同核苷酸序列；
Index1：TGTACGCT； Index2：GACTAGTC；
Index4：ACTAGATG； Index5：GATGTACA；
Index6：TGATCTAC； Index8：TATGTCAC；
Index9：TCTAGCAT； Index10：GATCACTA；
Index11：GTGACTAT； Index13：CATCAGAT；
Index14：TACAGCGT； Index15：ACTCATGA；
Index17：CACGTGAT； Index18：CATCGAGT；
Index20：GTACATGA； Index21：GTGATCAG；
Index22：AGATCACG； Index23：TGCACTAG；
Index25：ATCAGACT； Index26：AGATACTG；
Index27：TCAGATAC； Index28：TCGTGATA；
Index29：TGACGTAG； Index30：TGCTACAT；
Index34：TCTACAGA； Index35：CATCTGTA；
Index37：CATGTCTA； Index38：ATAGTGCT；
Index39：CTGCGTAT。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：通过所述的构建方法获得的单个测序文库含有由三个不同的Index构成的Index组合，用于和其他混合测序文库样品进行区分。
3.权利要求1所述的构建方法在细菌多样性检测中的应用，所述应用用于非诊断或治疗目的。
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