CN111893192A - 混合检材分析微单倍型复合扩增体系及构建及单倍型频率 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种混合检材分析中微单倍型复合扩增体系的构建方法及相关单倍型频率。本发明提供了一组遗传标记组合共计18个微单倍型及其rs号。根据18个微单倍型的扩增引物，构建了用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系。本文还提供了包括前述18个微单倍型的扩增引物的试剂盒。本发明提供的微单倍型复合扩增体系可以对混合检材进行法医学鉴定，且灵敏度高，识别能力强。

Description

混合检材分析微单倍型复合扩增体系及构建及单倍型频率
技术领域
本发明属于法医学领域，具体涉及一种用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系及微单倍型复合扩增体系的构建方法及其单倍型频率。
背景技术
自DNA分析技术面世以来，更准确、稳定、信息量大、易于检测的人类DNA的多态性位点的开发一直是法医物证学研究的热点。目前常用的DNA分型技术主要依靠短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)等多态性遗传标记。
其中STR因其高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性、结果高度准确性、易于标准化等优点，已经发展成为目前法医DNA分型中使用的主流遗传标记。但是因为STR本身“串联重复”的属性，在STR扩增过程中，时常会出现复制滑脱的现象，导致出现影子峰，影子峰的存在给混合样本的分型带来了极大的困难，而且STR存在等位基因扩增不平衡的问题。
SNP相较与STR，有扩增片段小，更易于从降解材料中获得信息、突变率低、分析方法多、易于自动化、没有影子峰等人工伪峰、可预测种族来源或表型等优点。但是因为SNP二等位基因所提供信息量有限的性质，导致同时需要很多的SNP遗传标记才可以达到法医学中要求的识别能力。这大大提升了同时复合扩增的难度，这也是SNP应用于法医DNA分型的一个重大难题。
为了解决STR与SNP遗传标记在混合斑分析时所存在的问题，人们将微单倍型(microhaplotype)遗传标记引入法医学领域，其定义是：在200bp范围内2-5个SNP的组合是一种多等位基因遗传标记。微单倍型遗传标记是一种序列多态性遗传标记，通过以微单倍型作为遗传标记，构建复合扩增体系，用二代测序对样本进行检测，可以一次性扩增出设计的所有的单倍型位点，而后通过对数据进行分析可以得到每个样本的单倍型分型。微单倍型遗传标记兼具STR和SNP遗传标记的优点。相较STR遗传标记，扩增片段短而且微单倍型遗传标记不存在影子峰的干扰，解决了影子峰对混合样本的分型的干扰问题。相对比SNP来说，微单倍型比单个SNP具有更高的鉴别能力，可以更好的可以提供关于生物地理祖先的信息，并且可用于检测DNA的混合物。
微单倍型对于混合样本分析的实用价值通常使用有效等位基因数Ae值(effective number of alleles)进行评估，据Kidd等人结果显示，由4个或4个以上SNP组成的微单倍型具有很高的Ae值(通常大于3)，SNP数越多其Ae越高，越适合应用于混合样本分析。Ae的计算公式为1/Σpi2，pi为第i个等位基因的频率。现有技术开发的微单倍型的Ae值通常为3，包含的SNP数量小于5个，多态性较低，对于复杂的混合样本的分析效果有限。
在当前的法医学混合斑研究中，常染色体上遗传标记位点主流的分型方法是通过STR遗传多态性，而对于常染色体上的微单倍型遗传标记位点的研究很少。
例如：中国专利201811617425.1中公开了一种复合体系及其检测不平衡混合检材的方法和应用。该复合体系包括扩增18个SNP-STR位点的引物，实现SNP和STR位点的同步扩增，可同时获得两种遗传标记的分型。但该检测体系只适用于检测两种DNA的混合斑，应用范围较小，且该方法未能改善SNP和STP用于遗传标记所存在的问题。
而中国专利201810336988.7中公开了一种29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用。该复合扩增体系对混合生物检材中提取到的DNA模板进行扩增，并将扩增结果进行大规模并行测序，获得各微单倍型位点在DNA模板中测序深度的数值，最终达到对混合生物检材的分型目的。但该技术方案中的扩增次数分为三次进行，操作繁琐，有待进一步优化。
发明内容
术语：
除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
rs号：美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的SNP数据库中的rs号。
微单倍型命名规则：基于既往报道的原则进行命名，以mh01YJW001为例，其中，mh表示微单倍型(microhaplotype)的英文缩写，01表示1号染色体，YJW表示发现这个位点的实验室，001用于进一步区分同一条染色体上发现的不同微单倍型位点。
Hs Taq：DNA聚合酶。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸。
Buffer：扩增体系的缓冲液，如无特别说明，本申请所述的扩增体系的缓冲液是为本领域技术人员熟知的。
Primer F：正向引物。
Primer R：反向引物。
扩增条件中的cycles指循环数，即所包含的步骤的重复次数。
为了解决上述问题，本发明在基因组序列中筛选出一组用来分析法医学案件中混合检材的微单倍型位点，并对每一位点设计了一对引物，且构建了扩增所需的复合扩增体系，最后使用二代测序技术对所得到的序列进行分析得到分型结果，而后对设计的单倍型位点进行频率计算。
一方面，本发明提供了一种混合检材微单倍型复合扩增系统的构建方法，包括如下步骤：
(1)位点选择：
①从HapMap数据库中下载一定数量的中国人在1-22号染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据位置，选择片段在250bp范围内，包含3个以及以上SNP的序列；
③利用haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因的频率大于或等于0.1的位点。
(2)引物设计：上述选择的位点后续工作中需要进行PCR复合扩增，可用于多重复合扩增PCR的引物设计要求为：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致，Tm值主要依靠primer的软件设计结果；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR长度控制在250bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个及以上碱基；引物在PCR中得到的扩增产物单一。
(3)单样本PCR扩增检测：对设计的引物，分别进行单基因座PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测，并选择扩增效率好、无非特异性扩增、目的条带单一的单基因座扩增引物，进行下一步的复合扩增。
(4)复合体系PCR扩增：将上述经过单样本PCR扩增后筛选出来的引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下，最合适的引物浓度，使复合体系中的每个基因座尽量做到最优扩增。
另一方面，本发明提供了一种混合检材分析遗传标记组合物。
具体地，所述的遗传标记组合物包括分别位于常染色体上不同位置的18个微单倍型。
具体地，所述的18个微单倍型的SNP位点组成及其所位于的染色体编号如表1所示(SNP位点以美国国立生物技术信息中心的SNP数据库中的rs号命名)：
表1 18个微单倍型的SNP位点组成
Figure BDA0002629434720000041
Figure BDA0002629434720000051
再一方面，本发明提供了一种用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系。
具体地，所述的微单倍型复合扩增系统包括用于扩增上述18个微单倍型的引物对。
具体地，所述的扩增体系还包括性别鉴定基因座的引物对。
优选地，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座(Amelogenin)。
优选地，所述的用于扩增上述18个微单倍型和Amelo基因座的19组引物的序列以及每组引物在复合扩增体系中的浓度如表2所示：
表2 18个微单倍型和Amelo基因座的扩增引物及浓度
Figure BDA0002629434720000052
Figure BDA0002629434720000061
具体地，表2中所述的引物浓度是指每组引物中的正向引物和反向引物的浓度和为该浓度，即在上表2的所述特定浓度下，每个微单倍型的扩增效率尽可能的保持一致。
具体地，所述的扩增体系还包括PCR体系常用的其他试剂。
进一步具体地，所述的常用的其他成分还包括但不限于DNA聚合酶，Buffer，ddH2O，dNTP。
优选地，所述的复合扩增体系各试剂加样量如下表3所示：
表3复合扩增体系
Figure BDA0002629434720000062
其中，所述的Pimer mix为表2所示的引物的混合物。
优选地，所述的复合扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s，59℃，45s，72℃，90s，30cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
又一方面，本发明提供了一种用于混合检材分析的微单倍型复合扩增试剂盒。
具体地，所述的试剂盒包括前述用于扩增18个微单倍型和性别鉴定基因座的引物对。
优选地，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座(Amelogenin)。
优选地，所述的引物对序列及引物对的浓度如表2所示。
具体地，所述的试剂盒还包括但不限于DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
又一方面，本发明提供了前述遗传标记组合、混合检材微单倍型复合扩增体系和混合检材微单倍型复合扩增试剂盒在法医鉴定、检测领域中的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于混合生物检材分型、个体识别、亲子鉴定、种族认定。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种混合检材微单倍型复合扩增体系的构建方法，可用于快速构建微单倍型复合扩增体系，应用于法医学鉴定、检测领域中。
(2)本发明提供了一组由位于常染色体上的18个微单倍型组成的遗传标记组合物，所述的微单倍型包含的SNP数平均值在4左右，Ae值可高达4.8左右，所述的遗传标记组合物采用更少的SNP位点，获得更高的多态性，即Ae值，能够有效的应用于法医学鉴定、检测领域中混合生物检材分型、个体识别、亲子鉴定、种族认定等工作中，同时有效降低因测序错误问题导致的假阳性分型。
(3)本发明提供了扩增上述18个微单倍型的复合扩增系统或试剂盒，本发明针对每个微单倍型均设计了一对特定引物且采用特定的引物浓度，使每个微单倍型的扩增效率尽可能的一致，扩增结果最大程度的保持平衡有效。
(4)从分型结果看，本发明提供的微单倍型复合扩增体系或试剂盒，可以对法医学鉴定中的混合检材进行鉴定以完成个体识别等工作，其灵敏度高，识别能力强，系统效能高，遗传标记数量足够，解决了目前STR与SNP遗传标记检测分析技术存在的缺点，可以更好的应用于法医学鉴定工作。
附图说明
图1为实施例2中18个微单倍型位点以及Amelo基因的单个位点的PCR扩增结果电泳图。
图2为实施例2中对比实验1的扩增结果电泳图。
图3为实施例2中对比实验2的扩增结果电泳图。
图4为实施例5灵敏度检测复合PCR扩增结果电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1微单倍型复合扩增体系的构建
(1)位点选择：
①从hapmap数据库中下载82个中国人在1-22号染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据位置，选择片段在250bp范围内，包含3个以及以上SNP的序列；
③利用haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因的频率大于或等于0.1的位点。
(2)引物设计：上述选择的位点后续工作中需要进行PCR复合扩增，可用于多重复合扩增PCR的引物设计需要考虑：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致，Tm值主要依靠primer的软件设计结果；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR长度控制在250bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个及以上碱基；引物在PCR中得到的扩增产物单一。
(3)单样本PCR扩增检测：对设计的引物，分别进行单基因座PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测，并选择扩增效率好、无非特异性扩增、目的条带单一的单基因座扩增引物，进行下一步的复合扩增。
(4)复合体系PCR扩增：将上述经过单样本PCR扩增后筛选出来的引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下，最合适的引物浓度，使复合体系中的每个基因座尽量做到最优扩增。
实施例2一种微单倍型复合扩增体系
1、根据实施例1的构建方法得到的一种微单倍型复合扩增体系。
1.1微单倍型位点
表4为在每条染色体上选择的SNP位点数以及对应的rs号，以及利用PCR将这些位点扩增出来的扩增片段长度和PCR产物在人类全基因组Feb.2009(GRCh37/hg19版本)参考基因组中的位置。其中，PCR的扩增产物长度均在250bp范围内，且微单倍型包括的SNP都在4个及以上。
表4微单倍型目的片段长度、在hg19参考基因组中的位置以及rs号
Figure BDA0002629434720000091
1.2复合扩增体系中的扩增引物
复合扩增体系中，18个微单倍型每条染色体上的正反向引物如表2所示，为使每条染色体上的扩增效率尽可能的一致，通过调整复合体系中每对引物的浓度，最终调整后的引物浓度如表2所示。
1.3除以上微单倍型位点外，该体系中还增加了性别鉴定基因座Amelo基因的相关引物，如表2所示。
1.4 18个微单倍型位点以及Amelo基因的单个位点的PCR扩增
上述18个微单倍型位点的单引物扩增体系如下表5所示：
表5 18个微单倍型位点的单引物扩增体系
Figure BDA0002629434720000101
其中Primer F和Primer R选自表2。
18个微单倍型位点的单引物扩增程序如下：95℃，3min；95℃，30s，59℃，30s，72℃，45s，30cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
图1为18个微单倍型位点以及Amelo基因的单个位点的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳的结果图。该图表明，以上每条染色体上均表现出良好的扩增效率，且扩增的目的片段具有特异性。
1.5对比实验1
本对比实验采用与上述扩增体系、扩增程序相同，但引物浓度统一修改为0.05μM，对相同的DNA模板进行扩增。
对扩增产物进行凝胶电泳检测，电泳图谱如图2所示，可以看出当引物浓度统一修改为0.05μM后，微单倍型均未被扩增出来。
1.6对比实验2
本对比实验采用与上述扩增体系、扩增程序相同，但引物浓度统一修改为2.0μM，对相同的DNA模板进行扩增。
对扩增产物进行凝胶电泳检测，电泳图谱如图3所示，可以看出当引物浓度统一修改为2.0μM后，微单倍型扩增条带出现大量拖带以及引物过剩情况。
对比实验1和对比实验2结果表明复合引物浓度修改之后，与表2引物浓度不同的情况下，扩增效果变差。
2、本实施例提供的PCR复合扩增体系各试剂加样量如下表6所示。
表6 PCR复合扩增体系
Figure BDA0002629434720000111
其中，DNA来源于所测样本，Primer mix为前述引物的混合物，通过将干粉引物稀释至浓度为10μM后按表7的比例配置。
表7配置引物混合物中各引物加样量
Figure BDA0002629434720000112
Figure BDA0002629434720000121
3、PCR复合扩增反应条件：95℃，3min；95℃，30s，59℃，45s，72℃，90s，30cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
实施例3汉/藏/维族3个群体50个样本单倍型频率结果
由于本发明提供的微单倍型均为新设计，应用到试剂盒中时没有对应可用来对混合检材进行分析的频率信息，因此需要先计算这些微单倍型的频率。
(1)DNA提取：利用凯杰
Figure BDA0002629434720000123
DNA Investigator Kit试剂盒提取样本的全基因组DNA。
(2)根据实施例2提供的复合扩增体系对提取的DNA进行复合PCR扩增。
(3)对得到的PCR产物进行凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，库检合格后，用MiSeq测序仪进行测序。
(4)对测序得到的fastq文件进行质量控制，将质控后的fastq文件转换为fasta文件，利用正向引物调出测序得到的每条染色体上包含正反向引物的序列，对得到的序列做blast，其中blast的库文件为每条染色体上利用正反向引物从ucsc中的电子PCR得到的序列，然后找到每个个体中，对应位置处的SNP碱基，将每条染色体上对应的SNP组合到一起，即为该个体在该染色体上的单倍型分型。
(5)利用Haploview软件对单倍型的频率进行计算。本实施例中，在北京的汉族(汉)、西藏藏族自治区的藏族(藏)、新疆维吾尔自治区的维吾尔族(维)3个群体各选取50个样本，每条染色体上出现的单倍型以及对应的频率如表8所示。
表8汉/藏/维族样本中每条染色体上的单倍型分型及对应频率
Figure BDA0002629434720000122
Figure BDA0002629434720000131
Figure BDA0002629434720000141
Figure BDA0002629434720000151
实施例4一种混合检材分析微单倍型复合扩增体系对混合检材的分型效果
选择混合检材，样品1为法医DNA鉴定标准品9948(男性)，样品2为法医DNA鉴定标准品9947(女性)，样品3为知情同意女性DNA样本HT，样品4为知情同意男性DNA样本SLY，样品3和样品4通过凯杰
Figure BDA0002629434720000152
DNA Investigator Kit提取血液样本DNA，并通过invitrogen Qubit4定量。
1.根据实施例2提供的复合扩增体系对混合样品DNA进行扩增，得到的产物通过Miseq测序仪进行测序。通过微单倍型v1.0分析软件分析测序结果(微单倍型数量阈值设为150，即reads数小于150次的微单倍型结果会被过滤；并过滤掉各个位点基因型reads数占该位点总reads数1.5％以下的分型)样品中所含微单倍型的具体信息如下：
(1)样品1:样品2混合比例为1:1，采用本发明所述的复合扩增体系并利用illumina进行二代测序，微单倍型分型结果如下表9：
表9样品1和样品2混合比例为1:1微单倍型分型结果
Figure BDA0002629434720000161
(2)样品1:样品2混合比例为1:9，采用本发明所述的复合扩增体系并利用illumina进行二代测序，微单倍型分型结果如下表10：
表10样品1和样品2混合比例为1:9微单倍型分型结果
Figure BDA0002629434720000171
由以上表9、表10结果可知，采用本发明所述的复合扩增体系可在样品1和样品2即法医DNA鉴定标准品9948(男性)、样品2为法医DNA鉴定标准品9947(女性)1:1混合比例与1:9混合比例下对主要贡献者与次要贡献者的等位基因型进行准确分型。
2.样品3和样品4进行1：1混合与1：9混合，使用
Figure BDA0002629434720000172
26plex QS试剂盒，Applied Biosystems公司3500DNA分析仪器进行一代测序检测结果如下：
(1)利用一代测序技术及
Figure BDA0002629434720000173
26plex QS试剂盒，其中有2个不能用于区分的性别位点与3个STR分型相同位点，具体如下表11所示：
表11 2个性别位点与3个STR分型相同位点
Figure BDA0002629434720000181
(2)剩余20个位点分型如下表12所示：
表12剩余20个位点分型结果
Figure BDA0002629434720000182
Figure BDA0002629434720000191
由表12可知，现有技术采用一代测序及
Figure BDA0002629434720000192
26plex QS试剂盒在样品3和样品4混合比为1:1时可成功检出所有分型，而在混合比为1:9时只能在TH01、Penta E、D22S1045、D13S317四个遗传位点检测到少贡献者等位基因分型，远不能达到对主要贡献者和次要贡献者个人识别的要求。
实施例5灵敏度测试
根据实施例2提供的复合扩增体系，分别采用不同浓度的DNA样本SLY模板进行扩增。对产物进行琼脂糖凝胶电泳，并使用Miseq进行测序，进一步进行单倍型分型。
其中，DNA模板浓度分别为：2ng、1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng、0.0625ng。
微单倍型检测结果如下表13所示：
表13灵敏度实验
Figure BDA0002629434720000193
Figure BDA0002629434720000201
由该结果可知：本发明提供的复合扩增体系可以对浓度为0.0625ng的DNA模板进行准确检测，灵敏度高，识别能力强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> 混合检材分析微单倍型复合扩增体系及构建及单倍型频率
<130> 20200723
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
cttttgcagg gaatctaggt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gccatctggc tattagaaga 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
agcctggctt tctacaag 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
agggcacaaa tctccata 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ttgctgtttc cctaaccttg 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gcatttttga ggttgcca 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
tccttgtcct ctccttgtgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
cagggtcctc tggaaattgg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tgtcactgga gccaatgc 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
tccccgttct cactttca 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ggtggtagca atggctaaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
cacactgaag atggtgaggg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gatatgcagc aaacaaccca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
taagtttgca tttaaggcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
tcagtggcac aaaacaacaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
tgtaagggaa aaagctgcca 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
ttctgtgtta ggtttatcg 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
tccaggatgg tggtctct 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gctgacacga gccctttc 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
tgtagatgac cccttttgtg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
aaggaagagg tctaggagga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
gctgtgatca ggtggactta 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
aaagatctcc ctcctgaatt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
agaaaagaga agccatgtct 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
ccttttctgg ttttccacct 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
accatccctt cctttcaaca 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gggagagttt tactgaggtt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gtcaggtcca accagagtca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
ctgtggaatc ctttggtttt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
tccttcccac tcatcttcat 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
cccagtttgg ctctgcttct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
aggcggaatc caatatgctg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
gcaatgtcta atggtccctt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
tctcaaacca aaccacattc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
caaacatcaa gatggcctgg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
ttggtttttt cgctgcttgc 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
atcagagctt aaactgggaa gctg 24

Claims (10)

1.一种用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的微单倍型复合扩增体系包括可识别或扩增一组遗传标记组合物的引物对，所述的遗传组合标记物包括18个微单倍型，所述的18个微单倍型的SNP位点及其rs号：
微单倍型 rs号 mh01YJW001 rs648216/rs648310/rs659070/rs11587876 mh01YJW002 rs1858232/rs347311/rs347312/rs1858233 mh01YJW003 rs2880605/rs10799891/rs6686926/rs6686942 mh01YJW004 rs7540307/rs3765968/rs3765967/rs3765966 mh04YJW002 rs13144371/rs17013181/rs17013182/rs1054628 mh06YJW003 rs9296095/rs210138/rs11757379/rs557559 mh07YJW002 rs11763670/rs11763698/rs11761388/rs6963255 mh07YJW003 rs2215564/rs12374823/rs2215563/rs10236489 mh08YJW004 rs17063147/rs2623746/rs2623745/rs2623744 mh09YJW003 rs7854255/rs7853944/rs7857013/rs7857243 mh09YJW004 rs10901086/rs1887777/rs1887778/rs13294330 mh10YJW002 rs7912120/rs7896306/rs7896428/rs11591973 mh11YJW002 rs7928557/rs2129529/rs2171344/rs4406819 mh11YJW003 rs274502/rs11606430/rs274503/rs274504 mh14YJW001 rs10047938/rs10047852/rs243146/rs243145/rs10047856 mh15YJW003 rs8043094/rs8043208/rs17116286/rs7178438/rs8039047 mh15YJW004 rs903561/rs1039037/rs903562/rs3784474 mh16YJW002 rs17227296/rs735819/rs890884/rs4479213
。
2.根据权利要求1所述的用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系还包括识别或者扩增性别鉴定基因座的引物对，所述的性别鉴定基因座为Amelo基因座。
3.根据权利要求1或2任一项所述的用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系包括：用于扩增所述的18个微单倍型和Amelo基因座的19对引物及每对引物在复合扩增体系中的浓度：
Figure FDA0002629434710000021
4.根据权利要求3所述的用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的体系中还包括DNA聚合酶、Buffer、ddH2O、dNTP。
5.根据权利要求4所述的用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增体系中各试剂的加样量为：
Figure FDA0002629434710000022
Figure FDA0002629434710000031
其中，所述的Primer mix是所述的用于扩增所述的18个微单倍型和Amelo基因座的19对引物的混合物。
6.根据权利要求5所述的用于混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的Primer mix通过将干粉引物稀释至浓度为10μM后按比例配制而成，所述的比例为：
名称 加样量 mh01YJW001 12.5μL mh01YJW002 5μL mh01YJW003 5μL mh01YJW004 5μL mh04YJW002 10μL mh06YJW003 5μL mh07YJW002 7.5μL mh07YJW003 5μL mh08YJW004 12.5μL mh09YJW003 5μL mh09YJW004 3μL mh10YJW002 15μL mh11YJW002 7.5μL mh11YJW003 4μL mh14YJW001 7.5μL mh15YJW003 3μL mh15YJW004 12.5μL mh16YJW002 7.5μL Amelo 3μL
。
7.根据权利要求6所述的混合检材分析的微单倍型复合扩增体系，其特征在于，所述的复合扩增的条件为：95℃，3min；95℃，30s，59℃，45s，72℃，90s，30cycles；72℃，7min；4℃，贮存。
8.一种混合检材微单倍型复合扩增系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)位点选择：
①从HapMap数据库中下载一定数量的中国人在1-22号染色体上具有rs号的SNP位点；
②根据位置，选择片段在250bp范围内，包含3个以及以上SNP的序列；
③利用haploview软件计算这些位点的单倍型分型以及每种分型对应的频率；
④选择在特定位置的微单倍型分型数大于4个，且每种分型的概率相差比较近的位点；
⑤将上述选择的位点，放在华大的中国人群数据库中计算频率，选择等位基因的频率大于或等于0.1的位点；
(2)引物设计：上述选择的位点后续工作中需要进行PCR复合扩增，可用于多重复合扩增PCR的引物设计要求为：引物长度在18-25bp之间；各基因座引物的Tm值尽量一致，Tm值主要依靠Primer的软件设计结果；引物间不能形成二聚体、发夹结构等；PCR长度控制在250bp以内；引物内最好不要有连续相同的四个及以上碱基；引物在PCR中得到的扩增产物单一；
(3)单样本PCR扩增检测：对设计的引物，分别进行单基因座PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳检测，并选择扩增效率好、无非特异性扩增、目的条带单一的单基因座扩增引物，进行下一步的复合扩增；
(4)复合体系PCR扩增：将上述经过单样本PCR扩增后筛选出来的引物混合至一个反应体系中，并选择在保证模板浓度一定的条件下，最合适的引物浓度，使复合体系中的每个基因座尽量做到最优扩增。
9.一种用于混合检材法医学鉴定的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于扩增权利要求1所述的18个微单倍型的扩增引物。
10.权利要求1所述的微单倍型复合扩增体系、权利要求8所述的微单倍型复合体系构建方法和权利要求9所述的试剂盒中的任一项在混合检材法医学鉴定、检测中的应用。
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