CN110218781A - 21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法。该复合扩增体系中的21个微单倍型位点来自于21个常染色体，等位基因频率均衡，位点间相互独立，具有多态性、突变率低等优势。该试剂盒中包含如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53所示的53条PCR扩增单端特异性引物，能够在同一反应体系中检测上述21个微单倍型位点。本发明所提供的复合扩增体系和试剂盒以及分型方法能够解决目前STR分型技术无法获得理想的分型结果、SNP位点数过多位可能出现等位基因丢失的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法。
背景技术
短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)是目前法医物证实验室进行个人识别和亲缘关系鉴定的主流遗传标记，具有分布广泛、多态性高、可实现自动化分型等特点，在DNA数据库建设和司法实践中发挥着重要作用。单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)是基因组中单个核苷酸变异导致的序列多态性，与STR相比，突变率低、扩增片段短、在法医亲缘关系鉴定及降解检材分析上更具有优势。而且SNP还能提供祖先信息、预测个体表型特征，为案件侦破提供更多有价值的线索。虽然在法医实际检案中，STR与SNP两种遗传标记都发挥了非常重要的作用，但二者仍然存在一定的局限性。例如，对于高度降解检材、混合检材、超微量检材等，应用常规的STR分型技术往往无法获得理想的分型结果；SNP是二等位基因遗传标记，单个SNP的多态性显著低于STR，要达到与STR相似的效能，需要增加检测的SNP位点数。然而，复合过多位点可能影响位点间扩增效率均衡性，出现等位基因丢失。
发明内容
针对现有检测方法STR分型技术无法获得理想的分型结果、SNP位点数过多位可能出现等位基因丢失的技术问题，本发明提供了一种21个微单倍型位点的复合扩增体系。
以及，本发明还提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒。
以及，本发明还提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种21个微单倍型位点的复合扩增体系，包括分别位于21个常染色体上的21个微单倍型，所述21个微单倍型的SNP位点为：
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本体系中的微单倍型位点分别来自于千人基因组数据库的208个样本的21条常染色体，所选的21个微单倍型杂合度高，等位基因频率均衡，位点间相互独立，既有STR的多态性，也保留了SNP片段长度短、突变率低且具有可以提供祖先信息、表型信息和家系信息的优势，通量高、数据量大，可解决目前STR分型技术无法获得理想的分型结果、SNP位点数过多位可能出现等位基因丢失的技术问题，并能够解决目前STR和SNP无法解决的祖先预测、混合DNA分析及复杂亲缘关系鉴定等问题。以上微单倍型基因座的命名方法包括微单倍型英文字母缩写“mh”、染色体编号、各SNP在染色体上的位置。例如mh02-173420626/672/733，其中“mh”为微单倍型简称，用以区分不同遗传标记，“02”表示该基因座位于2号染色体，“174285354”表示在hg19版本上，基因座第一个SNP在染色体上的位置，“672/733”分别表示第二个和第三个SNP染色体位置的后几位数字。该命名方法有利于添加新的SNP位点，并且在以后研究中随着研究人群的增多，便于将在不同人群中多态性较差的SNP位点剔除，从而准确命名更多具有更高多态性的微单倍型。
以及，本发明还提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒，所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括上述21个微单倍型位点的53条PCR扩增单端特异性引物，所述PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53所示。
下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)可对单一来源样本或混合样本中的每条DNA单链分别克隆并测序，从而区分出每一个亲本微单倍型位点的等位基因(单倍型)，具有通量高、准确性高、灵敏度高等特点，还可用于对微量降解检材的检测。本试剂盒采用单端特异性引物延伸技术，基于基于MiSeq平台和下一代测序技术，可以在同一反应体系中检测上述21个微单倍型位点。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液(FragmentationBuffer,10x)、FERA缓冲液(FERA Solution)、酶切反应中酶混合物(Fragmentation EnzymeMix)、5×连接反应缓冲液(Ligation Buffer,5x)、连接接头、DNA连接物(DNA Ligase)、连接溶液(Ligation solution)、5×靶向PCR反应缓冲液(TEPCR buffer,5x)、与所述53条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物(IL-Forward primer)、Taq DNA聚合酶(HotStarTaq DNA Polymerase)和5×常规PCR反应缓冲液(UPCR Buffer,5x)。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、实时荧光定量试剂盒和labcip质检分析试剂盒。
优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂，使该试剂盒能够在MiSeq平台进行下一代测序分型。
以及，本发明实施例还提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型方法，所述方法中用上述试剂盒进行样品检测。
优选地，所述下一代测序分型方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的53条PCR扩增单端特异性引物构建文库；
步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果与hg19参考基因进行序列对比，得到分型结果。
本方法利用上述21个微单倍型位点的53条单端特异性引物作为PCR扩增引物，能够在同一反应体系中实现21个微单倍型位点下一代测序分型，能够解决目前STR分型技术无法获得理想的分型结果、SNP位点数过多位可能出现等位基因丢失的技术问题，并解决目前STR和SNP无法解决的祖先预测、混合DNA分析及复杂亲缘关系鉴定等问题。
优选地，步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物；所述靶向富集的引物为所述53条单端特异性引物。
优选地，所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min。该参数条件能确保使用上述53条单端特异性引物进行PCR扩增的顺利进行，实现靶向富集。
优选地，步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。
优选地，步骤c中变性使用的试剂为0.2N-NaOH。该变性试剂更适用于IlluminaMiSeq FGx平台。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒，包括下一代测序定制panel试剂盒、血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、下一代测序定制panel试剂盒、实时荧光定量试剂盒、labcip质检分析试剂盒和MiSeq上机测序试剂。下一代测序定制panel试剂盒中包括21个微单倍型位点的53条单端特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53所示)，以及酶切反应缓冲液、FERA溶液、酶切反应中酶混合物、连接反应缓冲液、连接接头、DNA连接物、连接溶液、靶向PCR反应缓冲液、与所述53条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和常规PCR反应缓冲液。
实施例2
本发明实施例提供了一种21个微单倍型位点的下一代测序分型方法，该方法用实施例1中21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒进行样品检测。包括以下操作步骤：
1、提取待测血液的DNA
应用血液DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取2mL血液样本的DNA，应用核酸蛋白定量仪对所提取的DNA进行检测，并记录下每个样本DNA的纯度，分装于-20℃保存，作为样本DNA。
2、血液DNA定量
用Qubit dsDNA HS定量试剂盒对样本DNA进行浓度测定，并稀释至20ng/μL，作为模板DNA。
3、构建文库
用下一代测序定制panel试剂盒构建文库。
3.1 DNA片段化、末端加A
片段化反应体系(25μL)包括以下成分：1μL步骤2所得模板DNA，2.5μL10×酶切反应缓冲液，0.75μL FERA溶液，15.75μL无核酶水，酶切反应中酶混合物。
反应参数为：4℃，1min；32℃，24min；72℃，30min；4℃保温。
3.2连接接头
制备接头连接反应体系(50μL)，其中包含以下组份：25μL步骤1所得DNA，10μL5×连接反应缓冲液，2.8μL IL-N7系列接头，5μL DNA连接物，7.2μL连接液。将该反应体系在PCR仪上20℃、孵育15min。
3.3清洗DNA
3.3.1将3.2所得的孵育后的混合液加入到1.5mL的EP管中，加入50μL无核酶水，使每个样本变成100μL；
3.3.2加100μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；
3.3.3将EP管放到磁力架上10min至澄清，弃上清；
3.3.4加入200μL80％(v/v)的无水乙醇，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；
3.3.5同步骤3.3.4，之后置于磁力架上室温干燥10min；
3.3.6从磁力架上移下，向EP管中加入52μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.3.7将EP管放到磁力架上至澄清，转移50μL上清至新的EP管中；
3.3.8向新的EP管中加50μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；
3.3.9将EP管放到磁力架上5min至澄清，弃上清；
3.3.10加入200μL80％(v/v)的无水乙醇，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；
3.3.11同步骤3.3.10，之后置于磁力架上室温干燥15min；
3.3.12从磁力架上移下，向EP管中加入12μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.3.13将EP管放到磁力架上至澄清，转移9.4μL上清DNA至新的小EP管中。
3.4靶向富集
PCR反应体系(20μL)包括以下成分：9.4μL步骤3.3.13所得DNA，4μL5×靶向PCR反应缓冲液，5μL53条单端特异性引物作为PCR扩增引物，0.8μL与所述53条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物，0.8μL Taq DNA聚合酶。
反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。
3.5清洗靶向富集产物
3.5.1将3.4所得的富集产物加入到1.5mL的EP管中，加入80μL无核酶水，使每个样本变成100μL；
3.5.2按3.3.2～3.3.5的操作方法进行清洗；
3.5.3从磁力架上移下，向EP管加16μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.5.4将EP管放到磁力架上至澄清，转移13.4μL上清至新的小EP管中。
3.6常规PCR
PCR反应体系(20μL)包括以下成分：13.4μL步骤3.5.4所得DNA，4μL5×常规PCR反应缓冲液，1μL Taq DNA聚合酶，1.6μL无核酶水。将上述体系加入到对应的带有IL-S5系列接头的EP管中。
反应循环参数如下：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，60℃，2min，24次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。
3.7清洗常规PCR产物
3.7.1按3.5.1～3.5.2的操作方法进行清洗；
3.7.2从磁力架上移下，向EP管加30μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；
3.7.3将EP管放到磁力架上至澄清，转移28μL上清至新的小EP管中。
4、对所述文库进行片段检测、定量
使用PerkinElmer公司的labcip质检分析试剂盒(内含24 DNA Extended Rangelabchip和DNA High Sens Reagent Kit)进行文库的片段检测分析。
应用实时荧光定量试剂盒(德国QIAGEN公司的QIAseq Library Quant AssayKit)定量试剂盒对文库进行定量：文库起始浓度为1nM左右；试剂盒DNA标准品按1:10的梯度稀释；文库按1:2000和1:20000两个梯度稀释至定量；PCR荧光定量体系(90μL)包括以下成分：30.6μL无核酶水，45μL SYBR Green Mastermix，3.6μL混合引物(10μM)，10.8μL模板。
25μLPCR体系放入相应的3个副孔内，简短离心至气泡去除。
PCR荧光定量循环参数设置为：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，2min，30次循环。
将结果CT值放入本定量试剂盒相应的表格，计算得到文库最终浓度。
5、对文库中的样本进行均一化、变性、稀释
使用MiSeq上机测序试剂盒，按照步骤4的实时荧光定量结果，将步骤4所得样品进行均一化，将样本稀释至2nM。
取5μL文库(2nM)和5μL的0.2N-NaOH混匀，得到10μL变性文库。
280×g离心1min，室温孵育5min；用990μL已预冷的杂交缓冲液(HybridizationBuffer，HT1)和10μL变性文库混匀，得到10pM的变性稀释文库1mL。
6、测序
使用Illumina Experiment Manager(IEM)进行上机测序参数设置；将597μL的HT1和3μL的QIASeq A Read1 Custom PrimerⅠ混匀，得到终浓度为0.5μM的样品，加入上机板18号孔；将600μL的10pM变性稀释文库加入load sample孔。使用Research use only Run模式进行MiSeq上机测序。
运用linux系统，将MiSeq平台下机的Fastq文件格式原始数据与hg19版本参考基因组进行序列比对，挖掘出各样本的基因座序列信息。我们将同一个样本重复测序三次，获得了相同的分型结果，说明采用本发明所提供的21个微单倍型位点的下一代测序分型的方法能够获得良好的分型结果，能够为混合DNA分析以复杂亲缘关系鉴定提供新的解决方案。重复样本等位基因组成如表1所示：
表1重复样本等位基因组成
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学
<120> 21个微单倍型位点的复合扩增体系、下一代测序分型试剂盒及分型方法
<130> 2019.4.17
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
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<213> mh07引物4
<400> 20
acagacgcgt cacagtggac agt 23
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> mh08引物1
<400> 21
ccaaattgat cgaaaggaaa tgtcagagga gg 32
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> mh08引物2
<400> 22
ggaacaaatc ctcaaacaca gttgctgata att 33
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> mh08引物3
<400> 23
ccactgagtt tgtggttatg gaatcccag 29
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> mh09引物1
<400> 24
acggatagga aaataataaa tctttgaatg accctgcag 39
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> mh09引物2
<400> 25
tcacagatag cattcctatt ctttaagcaa gcaataa 37
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> mh09引物3
<400> 26
aattgtttca gcattactct taccacaatt attacaggaa atg 43
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> mh09引物4
<400> 27
tggtaagagt aatgctgaaa caattaaacc tccaac 36
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> mh010引物1
<400> 28
gggtcagtgg ctggtcgcag 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> mh10引物2
<400> 29
cagacgctgc ctcgaccacg 20
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> mh11引物1
<400> 30
ggaggacgaa caggtgcctc agc 23
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> mh11引物2
<400> 31
ctcatggctc cacccctact acatttataa gc 32
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> mh11引物3
<400> 32
tccgctctag gaatcaggac ctggtaaa 28
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> mh12
<400> 33
gtgcttttaa cattgcagca cattccctct aa 32
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> mh13引物1
<400> 34
ggctctggtg atgtctgttt ttgttaggc 29
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> mh13引物2
<400> 35
aagccttcac taaagctaaa ctaataggaa gctg 34
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> mh13引物3
<400> 36
ggttgttctg ggacaaaaga aagtctgcat t 31
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> mh14引物1
<400> 37
cagtatatgc ctatatccct ttgctaagga tgtcat 36
<210> 38
<211> 35
<212> DNA
<213> mh14引物2
<400> 38
ttatccccaa gtgaaattag ggtgattttg agacg 35
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> mh16引物1
<400> 39
ggtcttggca gcactggtga gaaag 25
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> mh16引物2
<400> 40
aggttagcgg atctttggaa tccaagattc tg 32
<210> 41
<211> 37
<212> DNA
<213> mh17引物1
<400> 41
gctctctatt cactttatca aagatcaagg gtaggag 37
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> mh17引物2
<400> 42
gcacgatctg aggaataaga gggttggatt t 31
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> mh18引物1
<400> 43
gagttcatgt ttaatgggca cagaggtttt gttag 35
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> mh18引物2
<400> 44
gaaaaagttc gggagatggt gatggag 27
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> mh19引物1
<400> 45
aaagtaaaaa acaaactcat ttcccaaaac ttgttaattg agaa 44
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> mh19引物2
<400> 46
cagctcttca ggaagttgag gcgtga 26
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> mh20引物1
<400> 47
tggaatccac tctgctccag tgtttaagc 29
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> mh20引物2
<400> 48
cgcgggtcga ggtggcttta ag 22
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> mh20引物3
<400> 49
gggaactatg ctggaaagag attgattgaa agtaca 36
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> mh21引物1
<400> 50
gtccacaact cccacagccc aaag 24
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> mh21引物2
<400> 51
ctccaggagc tgagagtgtg gg 22
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> mh22引物1
<400> 52
cgtaaagacc ccatcacacc gtcctaa 27
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> mh22引物2
<400> 53
cgtaaagacc ccatcacacc gtcctaaag 29
Claims (10)
1.一种21个微单倍型位点的复合扩增体系，其特征在于：包括分别位于21个常染色体上的21个微单倍型，所述21个微单倍型的SNP位点为：
mh01-16625882/5986/6082：rs9658928/rs915311/rs11799496；
mh02-173420626/672/733：rs7571747/rs7571654/rs10195588；
mh03-76203483/585/662：rs36133796/rs13059597/rs75922169；
mh04-154004438/489/571：rs58857469/rs55944510/rs34333259；
mh05-109298481/535/591：rs72793064/rs72660784/rs2900038；
mh06-20609220/276/401：rs67320261/rs13206468/rs12179172；
mh07-206577/644/658/772：rs62430281/rs74195447/rs113868763/rs71536273；
mh08-427270/350/458：rs12550792/rs11136669/rs7844307；
mh09-64336444/514/516/557：rs62559686/rs78089663/rs77983584/rs4104944；
mh10-1126258/263/331/354：rs59259654/rs113900916/rs7085880/rs10794722；
mh11-70104795/890/982：rs1893082/rs2515254/rs10898363；
mh12-676119/144/195/203：rs149286105/rs4980843/rs112044584/rs112687193；
mh13-94252446/552/555/615：rs8002895/rs4142200/rs4142201/rs9524387；
mh14-97687441/503/591：rs12878346/rs144072844/rs234145；
mh16-492362/425/507：rs72767828/rs8051171/rs62033255；
mh17-6382544/569/668：rs1399062/rs1399063/rs1399064；
mh18-666903/6957/7017：rs62090118/rs373128618/rs1672569；
mh19-15985747/768/889：rs9807868/rs7251944/rs185767781；
mh20-61329346/412/514：rs73304579/rs12625465/rs62198853；
mh21-42477084/101/166/193/207：rs59317074/rs13048879/rs56825875/rs190105066/rs9753814；
mh22-50029417/479/549/556：rs201136646/rs137895/rs137897/rs137898。
2.一种21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括如权利要求1所述的21个微单倍型位点的53条PCR扩增单端特异性引物，所述PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.53所示。
3.根据权利要求2所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序定制panel试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液、FERA缓冲液、酶切反应中酶混合物、5×连接反应缓冲液、连接接头、DNA连接物、连接溶液、5×靶向PCR反应缓冲液、与所述53条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和5×常规PCR反应缓冲液。
4.根据权利要求3所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、实时荧光定量试剂盒和labcip质检分析试剂盒。
5.根据权利要求4所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂。
6.一种21个微单倍型位点的下一代测序分型方法，其特征在于：用权利要求2～5任一项所述21个微单倍型位点的下一代测序分型试剂盒进行样品检测。
7.根据权利要求6所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述方法至少包括以下操作步骤：
步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用所述53条PCR扩增单端特异性引物构建文库；
步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；
步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；
步骤d、将测序结果与hg19参考基因进行序列对比，得到分型结果。
8.根据权利要求7所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物；所述靶向富集的引物为53条所述PCR扩增单端特异性引物。
9.根据权利要求8所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min。
10.根据权利要求7所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行，变性使用的试剂为0.2N-NaOH。
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