CN109554453A

CN109554453A - 43个str位点的下一代测序分型试剂盒及方法

Info

Publication number: CN109554453A
Application number: CN201910100089.1A
Authority: CN
Inventors: 李淑瑾; 丛斌; 刘青霞; 付丽红
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Medical University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明涉及一种43个STR位点的下一代测序分型的试剂盒和方法，所述试剂盒中包括PCR扩增试剂盒，所述PCR扩增试剂盒中包括43个STR位点的79条PCR扩增单端特异性引物，所述PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.79所示。本试剂盒中的引物能够使每个基因座的多态性提高，从而提高非父排除概率和系统效能，使检测结果更准确可靠，检测结果可以为NGS‑STR分型技术的发展提供新数据，为现有技术中需要联合应用多个试剂盒STR位点才能检测目标失踪人口调查及复杂亲缘关系鉴定等案件提供新的检测方案。

Description

43个STR位点的下一代测序分型试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及43个STR位点的下一代测序分型试剂盒及方法。

背景技术

亲子鉴定和个人识别是法医遗传学中两个主要研究内容，DNA分型技术是法医遗传学研究的主要工具。常染色体短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是法医DNA实验室的主流遗传标记，是全球各国的大多数法庭DNA数据库的建立基础。目前，法医DNA实验室检测STR的主要技术仍然是毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术，采用多色荧光标记复合扩增技术同时对多个STR基因座进行分型，并通过CE进行片段长度分析，以获得STR基因座的长度信息。但是，传统的CE技术在一个复合体系中最多能够同时复合20～30个STR基因座，而且CE技术仅仅能够得到STR核心序列的长度信息。现阶段，对于失踪人口调查及复杂亲缘关系鉴定通常需要联合使用多个试剂盒的STR位点信息。

随着下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)的发展，NGS也被考虑用于法医STR基因座的检测。但STR分型是基于荧光标记的PCR产物的大小进行等位基因的分离，在传统的复合PCR中，难以实现所有引物的熔解温度(Tm值)相近以确保所有位点的退火温度相同，使下一代测序分型(NGS-STR)技术受限。

发明内容

针对现有检测方法需要多个试剂盒联合应用、引物的Tm值难以相近而使NGS-STR分型技术受限的技术问题，本发明提供了一种43个STR位点的下一代测序分型试剂盒。

以及，本发明还提供了一种43个STR位点的下一代测序分型方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种43个STR位点的下一代测序分型试剂盒，所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括43个STR位点的79条PCR扩增单端特异性引物，所述PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQID NO.79所示。

本试剂盒用于NGS-STR技术，可在一次反应体系中检测更多的STR基因座；同时，NGS技术不仅能够获得STR的长度信息，还能获得完整的序列信息，发现更多相同长度片段中存在的重复区域序列结构不一致的同等位基因，相当于增加了有效等位基因的数目，以CE群调结果的基因座等位基因频率计算，43个STR位点联合应用的二联体累计非父排除概率(cumulative probability of exclusion，CPE)大于0.999999999998208，而现有技术中试剂盒联合应用的Goldeneye 20A系统、Goldeneye 22NC系统和Microreader^TM 23sp ID系统的CPE分别为0.999993、0.999996、0.9999992359。因此，以本申请试剂盒中43个STR位点的79条单端特异性引物作为PCR扩增引物进行下一代测序分型，每个基因座的多态性提高，从而提高非父排除概率和系统效能，使检测结果更准确可靠，检测结果可以为NGS-STR分型技术的发展提供新数据，为现有技术中需要联合应用多个试剂盒STR位点才能检测目标失踪人口调查及复杂亲缘关系鉴定等案件提供新的检测方案。

优选地，所述下一代测序定制panel试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液(Fragmentation Buffer,10x)、FERA缓冲液(FERA Solution)、酶切反应中酶混合物(Fragmentation Enzyme Mix)、5×连接反应缓冲液(Ligation Buffer,5x)、连接接头、DNA连接物(DNA Ligase)、连接溶液(Ligation solution)、5×靶向PCR反应缓冲液(TEPCRbuffer,5x)、与所述79条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物(IL-Forwardprimer)、Taq DNA聚合酶(HotStarTaq DNA Polymerase)和5×常规PCR反应缓冲液(UPCRBuffer,5x)。其中连接接头为IL-N7系列接头(IL-N7##adapter)和IL-S5系列接头(IL-S5##adapter)，用以在测序过程中区分样本。如，Sample1标签为N701-S502，则同一批测序的Sample2就必须至少有一端接头与Sample1不同，因此Sample2可人为加接头，除了N701-S502这一种接头组合外，Sample2可以接其他接头组合。IL-N7系列有12种，IL-S5系列接头有8种，Sample2的接头选择共有12×8-1＝95种。

优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、实时荧光定量试剂盒和labcip质检分析试剂盒。

优选地，所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂，使该试剂盒能够在MiSeq平台进行下一代测序分型。

以及，本发明实施例还提供了一种43个STR位点的下一代测序分型方法，所述方法中用上述试剂盒进行样品检测。

优选地，所述下一代测序分型方法至少包括以下操作步骤：

步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用上述试剂盒中的79条PCR扩增单端特异性引物构建文库；

步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；

步骤c、根据步骤b的定量结果，对文库中的样本进行均一化，然后变性、稀释，测序；

步骤d、将测序结果与hg19参考基因进行序列对比，得到分型结果。

本方法利用上述43个STR位点的79条单端特异性引物作为PCR扩增引物，能够在同一反应体系中实现43个STR位点下一代测序分型，突破了传统毛细管电泳STR分型的限制，每个基因座的多态性提高，提高了该检测方法排除非生物学父亲的能力。

优选地，步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物；所述靶向富集的引物为79条所述PCR扩增单端特异性引物。

优选地，所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min。该参数条件能确保使用上述79条单端特异性引物进行PCR扩增的顺利进行，实现靶向富集。

优选地，步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。

优选地，步骤c中变性使用的试剂为0.2N-NaOH。该变性试剂更适用于IlluminaMiSeq FGx平台。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例提供了一种43个STR位点的下一代测序分型试剂盒，包括下一代测序定制panel试剂盒、血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、下一代测序定制panel试剂盒、实时荧光定量试剂盒、labcip质检分析试剂盒和MiSeq上机测序试剂。下一代测序定制panel试剂盒中包括43个STR位点的79条单端特异性引物(核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.79所示)，以及酶切反应缓冲液、FERA溶液、酶切反应中酶混合物、连接反应缓冲液、连接接头、DNA连接物、连接溶液、靶向PCR反应缓冲液、与所述79条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和常规PCR反应缓冲液。

实施例2

本发明实施例提供了一种43个STR位点的下一代测序分型方法，该方法用实施例1中43个STR位点的下一代测序分型试剂盒进行样品检测。包括以下操作步骤：

1、提取待测血液的DNA

应用血液DNA提取试剂盒(OMEGA公司)提取2mL血液样本的DNA，应用核酸蛋白定量仪对所提取的DNA进行检测，并记录下每个样本DNA的纯度，分装于-20℃保存，作为样本DNA。

2、血液DNA定量

用Qubit dsDNA HS定量试剂盒对样本DNA进行浓度测定，并稀释至20ng/μL，作为模板DNA。

3、构建文库

用下一代测序定制panel试剂盒构建文库。

3.1DNA片段化、末端加A

片段化反应体系(25μL)包括以下成分：1μL步骤2所得模板DNA，2.5μL10×酶切反应缓冲液，0.75μL FERA溶液，15.75μL无核酶水，酶切反应中酶混合物。

反应参数为：4℃，1min；32℃，24min；72℃，30min；4℃保温。

3.2连接接头

制备接头连接反应体系(50μL)，其中包含以下组份：25μL步骤(1)所得DNA，10μL 5×连接反应缓冲液，2.8μL IL-N7系列接头，5μL DNA连接物，7.2μL连接液。将该反应体系在PCR仪上20℃、孵育15min。

3.3清洗DNA

3.3.1将3.2所得的孵育后的混合液加入到1.5mL的EP管中，加入50μL无核酶水，使每个样本变成100μL；

3.3.2加100μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；

3.3.3将EP管放到磁力架上10min至澄清，弃上清；

3.3.4加入200μL 80％(v/v)的无水乙醇，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；

3.3.5同步骤3.3.4，之后置于磁力架上室温干燥10min；

3.3.6从磁力架上移下，向EP管中加入52μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；

3.3.7将EP管放到磁力架上至澄清，转移50μL上清至新的EP管中；

3.3.8向新的EP管中加50μL磁珠，用移液枪吹打混匀，室温孵育5min；

3.3.9将EP管放到磁力架上5min至澄清，弃上清；

3.3.10加入200μL 80％(v/v)的无水乙醇，旋转EP管2～3次清洗磁珠，至澄清、弃上清；

3.3.11同步骤3.3.10，之后置于磁力架上室温干燥15min；

3.3.12从磁力架上移下，向EP管中加入12μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；

3.3.13将EP管放到磁力架上至澄清，转移9.4μL上清DNA至新的小EP管中。

3.4靶向富集

PCR反应体系(20μL)包括以下成分：9.4μL步骤3.3.13所得DNA，4μL5×靶向PCR反应缓冲液，5μL 79条单端特异性引物作为PCR扩增引物，0.8μL与所述79条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物，0.8μL Taq DNA聚合酶。

反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。

3.5清洗靶向富集产物

3.5.1将3.4所得的富集产物加入到1.5mL的EP管中，加入80μL无核酶水，使每个样本变成100μL；

3.5.2按3.3.2～3.3.5的操作方法进行清洗；

3.5.3从磁力架上移下，向EP管加16μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；

3.5.4将EP管放到磁力架上至澄清，转移13.4μL上清至新的小EP管中。

3.6常规PCR

PCR反应体系(20μL)包括以下成分：13.4μL步骤3.5.4所得DNA，4μL5×常规PCR反应缓冲液，1μL Taq DNA聚合酶，1.6μL无核酶水。将上述体系加入到对应的带有IL-S5系列接头的EP管中。

反应循环参数如下：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，60℃，2min，24次循环；72℃，5min；4℃，5min后保温。

3.7清洗常规PCR产物

3.7.1按3.5.1～3.5.2的操作方法进行清洗；

3.7.2从磁力架上移下，向EP管加30μL无核酶水洗脱磁珠上结合的DNA；

3.7.3将EP管放到磁力架上至澄清，转移28μL上清至新的小EP管中。

4、对所述文库进行片段检测、定量

使用PerkinElmer公司的labcip质检分析试剂盒(内含24DNA Extended Rangelabchip和DNA High Sens Reagent Kit)进行文库的片段检测分析。

应用实时荧光定量试剂盒(德国QIAGEN公司的QIAseq Library Quant AssayKit)定量试剂盒对文库进行定量：文库起始浓度为1nM左右；试剂盒DNA标准品按1:10的梯度稀释；文库按1:2000和1:20000两个梯度稀释至定量；PCR荧光定量体系(90μL)包括以下成分：30.6μL无核酶水，45μL SYBR Green Mastermix，3.6μL混合引物(10μM)，10.8μL模板。

25μLPCR体系放入相应的3个副孔内，简短离心至气泡去除。

PCR荧光定量循环参数设置为：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，2min，30次循环。

将结果CT值放入本定量试剂盒相应的表格，计算得到文库最终浓度。

5、对文库中的样本进行均一化、变性、稀释

使用MiSeq上机测序试剂盒，按照步骤4的实时荧光定量结果，将步骤4所得样品进行均一化，将样本稀释至2nM。

取5μL文库(2nM)和5μL的0.2N-NaOH混匀，得到10μL变性文库。

280×g离心1min，室温孵育5min；用990μL已预冷的杂交缓冲液(HybridizationBuffer，HT1)和10μL变性文库混匀，得到10pM的变性稀释文库1mL。

6、测序

使用Illumina Experiment Manager(IEM)进行上机测序参数设置；将597μL的HT1和3μL的QIASeq A Read1Custom PrimerⅠ混匀，得到终浓度为0.5μM的样品，加入上机板18号孔；将600μL的10pM变性稀释文库加入load sample孔。使用Research use only Run模式进行MiSeq上机测序。

运用linux系统，将MiSeq平台下机的Fastq文件格式原始数据与hg19版本参考基因组进行序列比对，挖掘出各样本的基因座序列信息，通过对国际推荐的NGS-STR分型命名方法调整，使其与CE分型结果相互兼容。将所得分型结果与CE分型结果进行对比，结果如表1所示：

表1下一代测序分型结果与CE分型结果对比

由以上数据可得，本实施例得到的分型结果与CE结果一致，说明采用本发明所提供的下一代测序分型的方法能够为NGS-STR技术提供新的数据获得方法，为现有技术中需要联合应用多个试剂盒STR位点才能检测目标失踪人口调查及复杂亲缘关系鉴定等案件提供新的检测方案。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学

<120> 43个STR位点的下一代测序分型试剂盒及方法

<130> 2019.1.25

<160> 79

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> D1S1656引物1

<400> 1

ctttcccaat tctccttcag tcctgtgtta gtc 33

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> D1S1656引物2

<400> 2

atggaagaaa atccccatat aagttcaagc ctgtg 35

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> D2S441引物1

<400> 3

agtgcaagag aaggtaagag agattctgtt cct 33

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> D2S441引物2

<400> 4

caggaactgt ggctcatcta tgaaaacttc tatctatc 38

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> TPOX引物1

<400> 5

gcccttctgt ccttgtcagc gtttatttg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> TPOX引物2

<400> 6

ggtccaatcc caggtcttct gaacacaag 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> D2S1338引物1

<400> 7

gtcagtgttc atgcctacat ccctagtacc 30

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> D3S1358引物2

<400> 8

cagggatcta tttttctgtg gtgtgtattc cct 33

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> D2S1338引物1

<400> 9

agcaaaaccc tgaaaatggc aattcctact g 31

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> D3S1358引物2

<400> 10

actcatgaaa tcaacagagg cttgcatgta tctatc 36

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> D3S3045引物1

<400> 11

tctgggcaga gtagaacaat atgtacttct taactac 37

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> D3S3045引物2

<400> 12

gaaatatgat atcctccagt tatgaggacg gttgac 36

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> D3S1744引物1

<400> 13

cagctgagcc actgcctcta aaattgtc 28

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> D3S1744引物2

<400> 14

cacttccagt cctcacttat ctttaagcgg aag 33

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> D4S2366

<400> 15

tttgtcttta actatcctga cattcctagg gtgaac 36

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> FGA引物1

<400> 16

aatatggtta ttgaagtagc tgctgagtga tttgtc 36

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> FGA引物2

<400> 17

gctgagtgat ttgtctgtaa ttgccagcaa aa 32

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> D5S2500引物1

<400> 18

cctgtagacc tgcacacctg tagatcg 27

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> D5S2500引物2

<400> 19

cctcccccat cttattcact ctcttgcatt 30

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> D5S818引物1

<400> 20

gaatgcttta gtgcttttta gccaagtgat tcca 34

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> D5S818引物2

<400> 21

agcttctaat taaagtggtg tcccagataa tctgtact 38

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> CSF1PO

<400> 22

tgagccttct cagatactat ctcctggtg 29

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> D6S477引物1

<400> 23

gcttcctagg ctcaattagg ttcttaatta tggagat 37

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> D6S477引物2

<400> 24

aaacaaatcc ttattggtgt ttgggacttc aaagac 36

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> D6S1043

<400> 25

cttattcatc tagttgcctg tattagctct ccagag 36

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> D7S3048引物1

<400> 26

agtgtccttt atgatttgta ccttcaagct tcac 34

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> D7S3048引物2

<400> 27

ggatttgagg tcaagataat cccacttgga acaa 34

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> D7S820引物1

<400> 28

gtgaggtctt aaaatctgag gtatcaaaaa ctcagagg 38

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> D7S820引物2

<400> 29

taacgattcc acatttatcc tcattgacag aattgc 36

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> D7S820引物3

<400> 30

tggtcaggct gactatggag ttattttaag gttaatata 39

<210> 31

<211> 44

<212> DNA

<213> D7S1517引物1

<400> 31

taaataacaa atagtacatg ttatgtgacc aactgaatta tgtt 44

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> D7S1517引物2

<400> 32

gccaatcagc ctgatcatta ccaggtttaa ataaca 36

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> D8S1132

<400> 33

cattgggcta ggaaaggtta gtggcttaat gtat 34

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> D8S1179

<400> 34

ctgtatcgta tcccattgcg tgaatatgcc tta 33

<210> 35

<211> 44

<212> DNA

<213> D9S925引物1

<400> 35

gtttctttac tttcaaagta attataccag atgatcctga aaat 44

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> D9S925引物2

<400> 36

gtctccataa ataatgtgag ccaaggcctt atagt 35

<210> 37

<211> 32

<212> DNA

<213> D10S1435

<400> 37

tgacttgtgt ggtgctgtgt ttgttataat gc 32

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> D10S1248引物1

<400> 38

atgaacaatc agtaaaaagc aaacctgagc attagc 36

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> D10S1248引物2

<400> 39

tgcttggcaa agagcagatg ctaaaacctc 30

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> D11S2368引物1

<400> 40

agactatgaa gtgggtagga tagggattat tctctt 36

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> D11S2368引物2

<400> 41

tctcttattt tacaatgagg tgcaagaatg tctgtc 36

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> TH01引物1

<400> 42

tgggctgaaa agctcccgat tatcca 26

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> TH01引物2

<400> 43

gggcaaaatt caaagggtat ctgggct 27

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> D12S391

<400> 44

ctgagatgtg aaagccctag tggatgataa gaat 34

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> vWA

<400> 45

ggactgtcat gagatttttc agcctccata tcac 34

<210> 46

<211> 32

<212> DNA

<213> D13S325引物1

<400> 46

gtgtctagag aggagggctt tgagatagac ag 32

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> D13S325引物2

<400> 47

gtttgaaaga taggccatgc agcttaagtt ctt 33

<210> 48

<211> 31

<212> DNA

<213> D13S317引物1

<400> 48

ggaggagagt tcatttcttt agtgggcatc c 31

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> D13S317引物2

<400> 49

cttgaattgt tggtcaaatc tcctccttca act 33

<210> 50

<211> 31

<212> DNA

<213> D14S608引物1

<400> 50

tacctcttca gtgagctttc gtggtttttg t 31

<210> 51

<211> 36

<212> DNA

<213> D14S608引物2

<400> 51

tgtaggcaaa atgaaaagaa agaaaacgtg gtacag 36

<210> 52

<211> 34

<212> DNA

<213> D15S659引物1

<400> 52

atttggcaag aatagataca ggaatgctct cttc 34

<210> 53

<211> 32

<212> DNA

<213> D15S659引物2

<400> 53

taccctgaag gcagtaatgg ttagtggaga at 32

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> Penta E引物1

<400> 54

acataacata catgtgtgta aagtgcttag tatcatgatt ga 42

<210> 55

<211> 44

<212> DNA

<213> Penta E引物2

<400> 55

ttgatacatg gaaagaattc tcttatttgg gttattaatt gaga 44

<210> 56

<211> 31

<212> DNA

<213> D16S539引物1

<400> 56

atcccaagct cttcctcttc cctagatcaa t 31

<210> 57

<211> 36

<212> DNA

<213> D16S539引物2

<400> 57

tgtgcatctg taagcatgta tctatcatcc atctct 36

<210> 58

<211> 28

<212> DNA

<213> D17S1290引物1

<400> 58

gggcaacaga gcaagactgt ccagatag 28

<210> 59

<211> 32

<212> DNA

<213> D17S1290引物2

<400> 59

taaaggactt ctccctgtgc cctctaatct tt 32

<210> 60

<211> 36

<212> DNA

<213> D18S535

<400> 60

ctctcatcta tttagctaca gcaaacttca tgtgac 36

<210> 61

<211> 39

<212> DNA

<213> D18S51引物1

<400> 61

gtgtggagat gtcttacaat aacagttgct actatttct 39

<210> 62

<211> 34

<212> DNA

<213> D18S51引物2

<400> 62

cttctctggt gtgtggagat gtcttacaat aaca 34

<210> 63

<211> 36

<212> DNA

<213> D19S253

<400> 63

tgccctcttc tgtctctcca tagattagat agatca 36

<210> 64

<211> 43

<212> DNA

<213> D19S433引物1

<400> 64

tctttctttc tgtttttatt tcaataggtt tttaaggaac agg 43

<210> 65

<211> 36

<212> DNA

<213> D19S433引物2

<400> 65

tgatattttg gtgcacccat tacccgaata aaaatc 36

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> D20S470引物1

<400> 66

aggagactga ggtaagagga ttagttgagt 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> D20S470引物2

<400> 67

catgagacag gggatatttg ggactccttg 30

<210> 68

<211> 33

<212> DNA

<213> D21S11引物1

<400> 68

gcttgtagat ggtctgttat gggacttttc tca 33

<210> 69

<211> 36

<212> DNA

<213> D21S11引物2

<400> 69

tctccagaga cagactaata ggaggtagat agactg 36

<210> 70

<211> 33

<212> DNA

<213> D21S1270

<400> 70

agatggcctg tgtctatccc actgtattat tca 33

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> Penta D引物1

<400> 71

caggcatggt gaggctgaag taggatc 27

<210> 72

<211> 44

<212> DNA

<213> Penta D引物2

<400> 72

tgattttgtg atatctaaga aatatttgcc taacctatgg tcat 44

<210> 73

<211> 32

<212> DNA

<213> D22-GATA198B05引物1

<400> 73

ccagagagac agaacctata gcatgcaggt ag 32

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> D22-GATA198B05引物2

<400> 74

ccaatttgca tcccaaccgt attagggttc 30

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> AmelogeninX引物1

<400> 75

ctcctcccct cctccctgta aaagc 25

<210> 76

<211> 25

<212> DNA

<213> AmelogeninX引物2

<400> 76

ttgtttgcgt taacaatgcc ctggg 25

<210> 77

<211> 36

<212> DNA

<213> AmelogeninY引物1

<400> 77

catatttagg aggaaagagt caatccgaat ggtcag 36

<210> 78

<211> 36

<212> DNA

<213> AmelogeninY引物2

<400> 78

taaactggga agctgatggt aggaactgta aaattg 36

<210> 79

<211> 33

<212> DNA

<213> AmelogeninY引物3

<400> 79

gatgaagaat ccacccacta ttctttacag agc 33

Claims

1.一种43个STR位点的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒包括下一代测序定制panel试剂盒，所述下一代测序定制panel试剂盒中包括43个STR位点的79条PCR扩增单端特异性引物，所述PCR扩增单端特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.79所示。

2.根据权利要求1所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序定制panel试剂盒还包括10×酶切反应缓冲液、FERA缓冲液、酶切反应中酶混合物、5×连接反应缓冲液、连接接头、DNA连接物、连接溶液、5×靶向PCR反应缓冲液、与所述79条PCR扩增单端特异性引物构成常规PCR的正反向引物、Taq DNA聚合酶和5×常规PCR反应缓冲液。

3.根据权利要求2所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括血液DNA提取试剂盒、Qubit dsDNA HS定量试剂盒、、实时荧光定量试剂盒和labcip质检分析试剂盒。

4.根据权利要求3所述的下一代测序分型试剂盒，其特征在于：所述下一代测序分型试剂盒还包括MiSeq上机测序试剂。

5.一种43个STR位点的下一代测序分型方法，其特征在于：用权利要求1～4任一项所述43个STR位点的下一代测序分型试剂盒进行样品检测。

6.根据权利要求5所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述方法至少包括以下操作步骤：

步骤a、提取待测血液的DNA，定量，采用所述79条PCR扩增单端特异性引物构建文库；

步骤b、对所述文库进行片段检测，定量；

7.根据权利要求6所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤a中构建文库的操作包括DNA片段化、末端加A、连接接头、清洗、靶向富集、清洗富集产物、常规PCR扩增、清洗扩增产物；所述靶向富集的引物为79条所述PCR扩增单端特异性引物。

8.根据权利要求7所述的下一代测序分型方法，其特征在于：所述靶向富集的PCR反应循环参数为：95℃，13min；98℃，2min；98℃，15s，68℃，10min，8次循环；72℃，5min；4℃，5min。

9.根据权利要求6所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤c中，测序的操作在Illumina MiSeq FGx平台进行。

10.根据权利要求9所述的下一代测序分型方法，其特征在于：步骤c中变性使用的试剂为0.2N-NaOH。