CN107904317B - 人类常染色体str多态性位点复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
人类常染色体str多态性位点复合扩增试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含扩增如下25个基因座的特异性扩增引物；所述基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248。本发明所述试剂盒具有以下优点：本发明所述试剂盒在基因座累积的鉴别能力增强的前提下，提高了灵敏度，做到DNA模板量在50pg下全部检出25个基因座，29个循环扩增，可获得完整分型；本发明基因座数量更加满足数据库建设不断扩容，并增加检测基因座的要求；试剂盒高效、稳定，提高了案件现场检材中的检出率，缩短扩增时间。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及STR分子标记，具体为一种涵盖更多基因座、个体识别能力更高的人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒及其应用。
背景技术
短串联重复序列基因座(STR)是由几个碱基对作为核心单位串联重复形成的一类DNA序列。串联重复的核心单位数目可变，因此STR具有很好的遗传多态性。关于STR，早在90年代初就已经发现。STR基因座片段小，能复合扩增，灵敏度高，可快速提供准确、丰富的信息，已被广泛应用于建立DNA数据库。在1997年，美国FBI选择了13个STR基因座：CSF1PO、D16S539、FGA、D18S51、TH01、D5S818、TPOX、VWA、D3S1358、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11；而在今年(2017年1月1日)FBI又公布了7个新增的STR基因座：D1S1656,D2S441,D2S1338,D10S1248,D12S391,D19S433,D22S1045和Amelogenin。这些基因座的个体识别率较高，一般被称为核心基因座。
我国对STR DNA的数据库建设逐步标准化。根据中华人民共和国公共安全最新行业标准《法庭科学DNA数据库选用的基因座及其数据结构》，其中常染色体含有20个核心基因座即Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391，10个优选基因座D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。其中，Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01和TPOX这16个基因座DNA数据库中排序靠前，兼容性好；D6S1043、Penta D和Penta E在DNA数据库中排序靠前，中国人群遗传多态性高，识别率高；D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045和D10S1248是引入的NEWCODIS，由美国FBI在2017年新增的核心位点，同时在欧洲的标准(ESS)中也包含这5个基因座。
商品化的试剂盒ABI的Identifiler，Promega(USA)的PowerPlex16，到现在AB公司的含有24个基因组的AmpFeSTR global filer，和Promega包含27个STR的PowerPlexfusion。在国内，中德美联的17+1，EX20，EX27，公安部物证鉴定中心已经有了含有25个基因座的DNATyper25，基点认知的25A，海尔施的STRtyper26G等。但长期以来，国内厂商由于试剂盒的性能，比如灵敏度抗抑制能力，稳定性不如国外厂商，长期只应用于建库市场，而实际案件检材应用的均为国外厂商产品，在这块，国内试剂盒的应用一片空白。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种具有更高个体识别能力，且能够同时达到更多基因座扩增、高效、快速的目的，本发明提供了人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒及其应用。
技术方案：人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含扩增如下25个基因座的特异性扩增引物；所述基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248。
优选的，所述基因座中Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、PentaD、Penta E和D12S391为核心基因座，D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248为优选基因座，Yindel为辅助性别判断的基因座。
优选的，所述特异性扩增引物的序列如下：D3S1358，SEQ ID NO.1～2；D13S317，SEQ ID NO.3～4；D7S820，SEQ ID NO.5～6；D16S539，SEQ ID NO.7～8；D1S1656，SEQ IDNO.9～10；PentaE，SEQ ID NO.11～12；TPOX，SEQ ID NO.13～14；TH01，SEQ ID NO.15～16；D2S1338，SEQ ID NO.17～18；CSF1PO，SEQ ID NO.19～20；Penta D，SEQ ID NO.21～22；D19S433，SEQ ID NO.23～24；vWA，SEQ ID NO.25～26；D21S11，SEQ ID NO.27～28；D18S51，SEQ ID NO.29～30；D6S1043，SEQ ID NO.31～32；Amelogenin，SEQ ID NO.33～34；D8S1179，SEQ ID NO.35～36；D5S818，SEQ ID NO.37～38；D12S391，SEQ ID NO.39～40；FGA，SEQ ID NO.41～42；D22S1045，SEQ ID NO.43～44；Yindel，SEQ ID NO.45～46；D2S441，SEQ ID NO.47～48；D10S1248，SEQ ID NO.49～50。
进一步的，所述特异性扩增引物在扩增体系中的终浓度为：D3S1358，0.5μM；D13S317，0.45μM；D7S820，0.6μM；D16S539，0.6μM；D1S1656，0.6μM；PentaE，1μM；TPOX，0.45μM；TH01，0.7μM；D2S1338，1μM；CSF1PO，0.65μM；Penta D，1μM；D19S433，0.45μM；vWA，0.4μM；D21S11，0.4μM；D18S51，0.4μM；D6S1043，0.45μM；Amelogenin，0.3μM；D8S1179，0.45μM；D5S818，0.45μM；D12S391，0.6μM；FGA，0.8μM；D22S1045，0.35μM；Yindel，0.5μM；D2S441，0.5μM；D10S1248，0.6μM。
引物序列及其终浓度具体如下表所示：
表1各基因座的引物序列及其终浓度
优选的，每对特异性扩增引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
优选的，所述引物分为5组进行标记，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE为第1组；TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D为第2组；D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第3组；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA为第4组；D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248为第5组。
优选的，所述荧光染料为6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
另外，所述试剂盒中还包含分子量内标，其选用橙色荧光标记SIZ。
优选的，所述试剂盒包括：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液SuperMix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶100μL～300μL；PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40、Brij58或PEG100。
以上所述的人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒在人类个体识别和亲权鉴定中的应用。
本发明所述试剂盒的研发思路为：
一、基因座的确定
参照中华人民共和国公共安全最新行业标准《法庭科学DNA数据库选用的基因座及其数据结构》，其中常染色体含有20个核心基因座即Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391，10个优选基因座D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。其中，Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01和TPOX这16个基因座DNA数据库中排序靠前，兼容性好；D6S1043、Penta D和Penta E在DNA数据库中排序靠前，中国人群遗传多态性高，识别率高；D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045和D10S1248是引入的NEW CODIS，由美国FBI在2017年新增的核心位点，同时在欧洲的标准(ESS)中也包含这5个基因座。
Amelogenin是性别基因座，通常用于判断样本的性别，但其存在Y等位基因丢失风险。因此，需要另外有基因座辅助性别判断。该试剂盒中添加的Yindel则可发挥这一作用。Yindel是Y染色体上插入缺失位点，若是女性样本则为分型1，如果是男性样本则可扩增出相应分型2。
二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本研究采用了优化后的最新的6色荧光组合方案，选用的是蓝、绿、黄、红、紫、橙六种荧光标记物。
选择D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248后，查找各基因座等位基因的范围，按照引物排布位置尽量小的原则，合理的对这些基因座进行分组排布，每组采用不同的荧光染料标记。确定排布后，则对每一个基因座的引物进行设计，每个基因座的一对引物中的一条引物的5’端用荧光染料标记。例如，其中的一种较优的组合方式为：用蓝色荧光染料对D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、PentaE这些基因座进行标记；用绿色荧光染料对TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D这些基因座进行标记；用黄色荧光染料对D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043进行标记；用红色荧光染料对Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA进行标记；用紫色荧光染料对D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248进行标记。选用SIZ-500作为内标，其标记的是橙色荧光染料。
三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立
1、引物及扩增程序的确定
设计引物，对25个位点的单个基因座的引物进行测试，检测引物的扩增效率和峰形等，这个过程中需要不断的调整和反复测试，在退火温度特异性满足要求后，再对这25个位点进行复合扩增。一般情况下，需要经过大量的反复实验测试，筛选和优化出最佳的25个位点复合扩增PCR反应条件，确定复合扩增中的循环参数、退火温度、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等参数，保证扩增产物的均衡性、特异性和准确性等都符合要求，可同时扩增出25个位点。由于涵盖的基因座多，特别是针对某些排布在较大位置的基因座来说，对引物的扩增效率要求很高，需要不断测试、修改和测试，从而找到最佳引物。所以在这一个过程中，需要花费大量的时间和精力，确定最佳的复扩体系。
2、PCR缓冲液的调整
PCR缓冲液对扩增的影响至关重要，考虑到对于扩增效率的影响，考虑到产品应用于各种提取检材，及例如WhatmanFTA卡等直扩检材，考虑抗抑制剂能力、灵敏度等反复调整适合的最佳扩增缓冲条件。同时要考虑到试剂盒的保存稳定性，添加更加有利于保存的添加剂。由于本发明用于检测的平台为毛细管电泳法的遗传分析仪，需要考虑盐离子和核酸均带负电荷，竞争进样的过程，反复调整缓冲液的离子浓度达到不影响PCR过程，又对检测环节进样的影响较小。
有益效果：(1)本发明所述试剂盒在基因座累积的鉴别能力增强的前提下，提高了灵敏度，做到DNA模板量在50pg下全部检出25个基因座，29个循环扩增，可获得完整分型，灵敏度远高于行标GA/T 815-2009所制定的125pg的灵敏度要求，且远高于专利CN104946632A，CN103451311A，CN104745691A等同类型的25个及以上的STR基因座荧光复合扩增试剂盒；(2)与专利CN 106591463A，CN 106521013A相比，本发明基因座数量更加满足数据库建设不断扩容，并增加检测基因座的要求；(3)本发明所述试剂盒即使单扩25个STR位点信息，试剂盒仍能高效和稳定，提高了案件现场检材中的检出率；(4)本发明所述试剂盒在保证高个体识别率的情况下，能够尽可能的缩短扩增时间；(5)本发明所述试剂盒添加了Y染色体插入缺失位点Yindel，对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用。
附图说明
图1是本发明所述试剂盒等位基因标准物分型图；
图2是本发明所述试剂盒对50pg 9948标准品分型图；
图3是本发明所述试剂盒对Whatman血卡样本分型图；
图4是本发明所述试剂盒对博坤加强型血卡分型图；
图5是本发明所述试剂盒对烟头提取样本分型图；
图6是本发明所述试剂盒对擦拭样本1分型图；
图7是本发明所述试剂盒对擦拭样本2分型图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明所述的试剂盒由如下组成：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Super Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶100μL～300μL；PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40、Brij58或PEG100。
1、操作步骤如下：
1.1扩增体系为：
| 组分 | 体积 |
| Super Mix | 10.0μL |
| 提取样本 | 6μL |
| 权利要求1所述的引物 | 5.0μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至25.0μL |
1.2扩增程序为：
1.3扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔(0.5μl AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
1.4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper IDX分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
2、结论
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。对标准品9948(Promega公司美国)梯度稀释至50pg后进行扩增，分型结果如图2示。从图中可以看出，对标准品9948的检测结果与其基因型一致，分型标准物的分型结果也与各个等位基因的分型一致，3500电泳可检出全部基因座分型，这个试剂盒最低可以检出50pg微量DNA模版。扩增市面上使用较多，抑制组分含量较高的Whatman FTA血卡和博坤加强型血卡，扩增较好，如图3和图4所示，说明本发明的试剂盒有较好的抗抑制能力。
实施例2
1、实际案件中的检材血迹、唾液斑、脱落细胞等样本使用本发明试剂盒。引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Super Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，5U/μL的热启动Taq酶100μL～300μL；PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40、Brij58或PEG100。
2、样本准备：采用磁珠法提取，具体方法参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》。
3、操作步骤如下：
3.1扩增体系为：
| 组分 | 体积 |
| Super Mix | 6.0μL |
| 提取样本 | 1-6μL |
| 权利要求1所述的引物 | 3.0μL |
| sdH<sub>2</sub>O | 补足至15μL |
3.2扩增程序为：
3.3扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
取1μL PCR产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder，与12μL去离子甲酰胺和0.5μL AGCU Marker SIZ-500(无锡中德美联生物技术有限公司))混合物混匀，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，采用遗传分析仪3500检测。
3.4、分型分析
应用GeneMapper ID-X(Lifetech公司，美国)软件分析。对照分型标准物(图1)，分析样品数据。
4、结论
用片段分析软件GeneMapper ID-X分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的(图1所示)分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。共检测1000份案件检材样本，其中血迹70份，烟蒂60份，各种擦拭拭子842份，肋软骨5份，粘取物20份，口腔拭子3份。血迹和烟蒂等案件检材，多数情况下可获得足量的DNA模板，能够有效扩增，以某烟蒂的扩增结果作为示例(图5)。对于擦拭拭子和粘取物等，其多数情况下获得的模板DNA浓度较低或有降解，扩增效率(尤其是大片段的)相对较低，以案例中某2种擦拭拭子的扩增结果图作示例(图6和图7)。分析和统计所有检材的扩增结果，检出率如下表所示，本发明的试剂盒EX25检出率明显高于公司以前同类型的产品EX20，在容易出现微量、降解DNA的擦拭拭子和粘取物中的尤其明显。阈值设置200RFU，检出率从9.7％提高到了13.6％，阈值设置在600RFU，检出率从7.1％提高到了10.5％。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒及其应用
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (3)
1.人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增如下25个基因座的特异性扩增引物；所述基因座为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、Penta E、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、Penta D、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA、D22S1045、Yindel、D2S441、D10S1248，其中Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391为核心基因座，D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248为优选基因座，Yindel为辅助性别判断的基因座；所述扩增25个基因座的特异性扩增引物的序列如下：D3S1358，SEQ IDNO.1~2；D13S317，SEQ ID NO.3~4；D7S820，SEQ ID NO.5~6；D16S539，SEQ ID NO.7~8；D1S1656，SEQ ID NO.9~10；Penta E，SEQ ID NO.11~12；TPOX，SEQ ID NO.13~14；TH01，SEQID NO.15~16；D2S1338，SEQ ID NO.17~18；CSF1PO，SEQ ID NO.19~20；Penta D，SEQ IDNO.21~22；D19S433，SEQ ID NO.23~24；vWA，SEQ ID NO.25~26；D21S11，SEQ ID NO.27~28；D18S51，SEQ ID NO.29~30；D6S1043，SEQ ID NO.31~32；Amelogenin，SEQ ID NO.33~34；D8S1179，SEQ ID NO.35~36；D5S818，SEQ ID NO.37~38；D12S391，SEQ ID NO.39~40；FGA，SEQ ID NO.41~42；D22S1045，SEQ ID NO.43~44；Yindel，SEQ ID NO.45~46；D2S441，SEQ IDNO.47~48；D10S1248，SEQ ID NO.49~50；每对特异性扩增引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端；所述扩增25个基因座的特异性扩增引物分为5组进行标记，具体为：D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、D1S1656、Penta E为第1组；TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、PentaD为第2组；D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043为第3组；Amelogenin、D8S1179、D5S818、D12S391、FGA为第4组；D22S1045、Yindel 、D2S441、D10S1248为第5组，所述荧光染料为6-FAM、HEX、SUM、LYN、PUR中任意一种，且每组采用的荧光标记不同。
2.根据权利要求1所述的人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：所述扩增25个基因座的特异性扩增引物所构成的引物混合物，1mL；PCR缓冲液Super Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM , dNTPs 5.0mM～7.5mM, KCl 50 mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，5U/ μL的热启动Taq酶100μL～300μL；PCR增强剂为海藻糖、浓度低于5%的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40、Brij58或PEG100。
3.权利要求1所述的人类常染色体STR多态性位点复合扩增试剂盒在人类个体识别和亲权鉴定中的应用。
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