JP2009540802A - サンプルからの核酸を増幅、検出および定量するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

核酸の増幅、検出およびその後の定量分析は、疾患または障害の診断および予後を含む分子生物学において中心的役割を果たしている。本発明は、サンプルからの核酸を増幅、検出および定量するための方法およびキットに関する。本発明の方法は、母体血漿からの胎児核酸の検出および定量、新生物（悪性または非悪性）からの循環核酸の検出および定量、低頻度対立遺伝子に対する正確なプール分析、または核酸の高感度定量分析を必要とするあらゆるその他の適用を含むがそれに限定されない広範囲の適用に用いられてもよい。

Description

関連する特許出願
２００６年６月１６日に出願された、発明者がＭｉｎ Ｓｅｏｂ Ｌｅｅであって、「サンプルからの核酸を増幅、検出および定量するための方法および組成物」と題し、代理人の登録書番号ＳＥＱ−６００２−ＰＶを有す、米国仮特許出願第６０／８０５，０７３号の利益を、本願は主張する。全ての文章と図を含む米国仮特許出願第６０／８０５，０７３号の全体が、本明細書中に援用される。

本発明は、サンプルからの核酸を増幅、検出および／または定量するための方法およびキットに関する。本発明の方法は、母体血漿からの胎児核酸の検出および定量、新生物（悪性または非悪性）からの循環核酸の検出および定量、低頻度対立遺伝子に対する正確なプール分析、または核酸の高感度定量分析を必要とするあらゆるその他の適用を含むがそれに限定されない広範囲の適用に用いられてもよい。

核酸の増幅、検出およびその後の定量分析は、疾患または障害の診断および予後を含む分子生物学において中心的役割を果たしている。核酸の検出のための公知の方法は多数存在し、その中には異なる種間の核酸配列の差異に基づく核酸の検出方法も含まれる。公知の方法のレビューとして、たとえば非特許文献１を参照されたい。しかし、核酸、特に低コピー数核酸を他の高コピー数核酸種の存在下で検出し正確に定量化することは困難であることが知られている。

Ｎｅｌｓｏｎ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ．１９９８年９月；３５（５）：３６９−４１４

核酸検出の分野においては、低コピー数核酸の高感度検出および定量を可能にする検出方法の有用性が不足している。低コピー数核酸は、非侵襲性の出生前検査、癌の診断および低頻度突然変異の検出を含むがそれに限定されない広範囲の適用において高度の情報を与え得る。そこで本発明は、従来は検出不可能であったか、検出が非常に困難および／または検出の信頼性がなかった低コピー数核酸を、たとえば臨床的環境下で、信頼性ある態様で情報を与えるために十分なレベルで増幅した後に検出および分析するための改善された方法を提供する。この改善された技術の適用において、本発明は、たとえば出生前検査における胎児核酸の検出および定量化のためのより高感度かつより侵襲性の低い方法に対する可能性を導き出した。

よって、１つの局面において、本発明は低コピー数核酸種の偏向対立遺伝子特異的（ｂｉａｓｅｄ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ：ＢＡＳ）増幅のための方法およびキットに関し、この増幅は好ましくはその種の配列特異的な特性に基づくものであり、ここでは低コピー数種に特異的なプライマーが高コピー数種に対するプライマーに対して増加された濃度で導入されることによって、その種を正確な検出および定量に適したレベルまで選択的に増幅する。したがって本発明は、低コピー数核酸種を高コピー数核酸種よりも優先的に増幅してこれら２種の相対的濃度を定量化するための方法を提供する。いくつかの実施形態においては２つまたはそれ以上のプライマーが同時に加えられてもよく、別の実施形態においては異なる時間に加えられてもよい（例、第２のプライマーの前に第１のプライマー、または第１のプライマーの前に第２のプライマー）。いくつかの実施形態においては複数のプライマーが同じ容器に加えられてもよく、特定の実施形態においては異なる容器に加えられてもよい。

より特定的には、本発明は部分的に、サンプル中の核酸を増幅するための方法を提供し、このサンプルは少なくとも第１の核酸種および第２の核酸種を含有し、第１の種は第２の種よりも高コピー数であり、この方法はａ）反応容器中で第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを第１の核酸種にアニーリングするステップを含み、第１のプライマー対は第１の濃度を有し、この方法はさらにｂ）反応容器中で第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、第２のプライマーは第２の濃度を有し、第２の増幅プライマーの第２の濃度は第１の増幅プライマーの第１の濃度よりも高く、この方法はさらにｃ）反応容器中で第１および第２の核酸種に共通となり得る第１および第２の核酸種に実質的に特異的な別の増幅プライマーを第１および第２の核酸種にアニーリングするステップと、ｄ）反応容器中で核酸増幅反応を行なうことによって、第２の核酸種の増幅産物の量を第１の核酸種の増幅産物の量に対して増加させるステップとを含む。ステップ（ｃ）の「別の増幅プライマー」は１つまたはそれ以上のプライマーであってもよい。たとえば１つの付加的プライマーを用いる実施形態においては、そのプライマーは第１の核酸および第２の核酸の両方に共通するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしてもよい。たとえば２つの付加的プライマーを用いる実施形態においては、１つの付加的プライマーが第１の核酸に特異的にハイブリダイズし、第２の付加的プライマーが第２の核酸に特異的にハイブリダイズしてもよい。

本発明の実施形態の１つにおいて、増幅の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、自己持続型（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）シーケンス反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換型増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、またはスプライス重複伸長型（ｓｐｌｉｃｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ポリメラーゼ連鎖反応を含んでもよいが、それを含むことに限定されない。好ましい実施形態において、増幅の方法はＰＣＲである。本発明の別の実施形態において、増幅方法は、ここに引用により援用される米国特許出願公開第２００５０２８７５９２号に記載されるような鋳型依存性ポリメラーゼを利用する。

別の実施形態において、本発明は、第１の核酸種の増幅産物のみ、または第２の種の増幅産物のみ、または第１および第２の種の増幅産物をともに検出するステップをさらに含む、本明細書に記載の増幅方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、ａ）第１の核酸種の増幅産物を検出するステップと、ｂ）第２の核酸種の増幅産物を検出するステップと、ｃ）第１の核酸種のアイデンティティを第２の核酸種のアイデンティティと比較するステップとをさらに含む、本明細書に記載の増幅方法を提供する。関連する実施形態において、検出は質量分析法によって行なわれる。

別の実施形態において、本発明は、ａ）第１の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、ｂ）第２の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、ｃ）第１の核酸種の増幅産物の量を第２の核酸種の増幅産物の量と比較するステップとをさらに含む、本明細書に記載の増幅方法を提供する。関連する実施形態において、定量は質量分析法によって行なわれる。好ましい実施形態において、第１の核酸種は母体由来であり、第２の核酸種は胎児由来である。

別の局面においては、少なくとも第１の種および第２の種を含有するサンプル中の低コピー数核酸種を同定するための方法が提供され、これらの種は２つの別個の反応容器中で増幅される。より特定的には、本発明はサンプル中の核酸を増幅するための方法を提供し、このサンプルは少なくとも第１の核酸種および第２の核酸種を含有し、一方の種は他方の種よりも高コピー数であり、この方法はａ）第１の反応容器中で第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを第１の核酸種にアニーリングするステップを含み、第１のプライマーは第１の濃度を有し、この方法はさらにｂ）第１の反応容器中で第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、第２のプライマーは第２の濃度を有し、第２の増幅プライマーの第２の濃度は第１の増幅プライマーの第１の濃度よりも高く、この方法はさらにｃ）第１の反応容器中で第１および第２の核酸種に共通となり得る第１および第２の核酸種に実質的に特異的な別の増幅プライマーを第１および第２の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、第１の種の方が高コピー数であるときには第２の核酸種の増幅産物が第１の核酸種の増幅産物に対して増加するステップと、ｄ）第２の反応容器中で第１の増幅プライマーを第１の核酸種にアニーリングするステップとを含み、第１の増幅プライマーはステップｂの第２の濃度と同じ濃度で存在し、この方法はさらにｅ）第２の反応容器中で第２の増幅プライマーを第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、第２の増幅プライマーはステップａの第１の濃度と同じ濃度で存在し、よって第１の増幅プライマーの濃度は第２の増幅プライマーの濃度よりも高く、この方法はさらにｆ）第２の反応容器中で第１および第２の核酸種に共通となり得る別の増幅プライマーを第１および第２の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、第２の種の方が高コピー数であるときには第１の核酸種の増幅産物が第２の核酸種の増幅産物に対して増加するステップを含む。

本発明の実施形態の１つにおいては、この２容器の増幅方法は、第１の核酸種の増幅産物を検出するステップをさらに含む。別の実施形態においては、この方法は第２の核酸種の増幅産物を検出するステップをさらに含む。さらに別の実施形態においては、この方法は第１の核酸種および第２の核酸種をともに検出し、第１および第２の核酸種のアイデンティティを比較するステップをさらに含む。別の実施形態においては、この方法は第１の核酸種の増幅産物を定量化し、第２の核酸種の増幅産物を定量化し、第１の核酸種の増幅産物の量を第２の核酸種の増幅産物の量と比較するステップをさらに含む。

別の局面において、本発明は、低コピー数プライマーに対する高コピー数プライマーの好適または最適な比率を定めるための方法を提供する。下記の実施例１を参照されたい。

関連する実施形態において、本発明は、実施例１に記載されるように低コピー数核酸種を優先的に増幅するために十分な第１のＰＣＲプライマーの濃度を定めるための方法を提供する。本発明の方法は、種間の核酸に基づく差異（または対立遺伝子）に基づいて、異なる核酸種を優先的に増幅し、検出および定量化するために用いられてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、突然変異、ならびに転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよびその他の異数性、欠失、付加、増幅、断片、転座、および転位を含むがそれに限定されない染色体異常を検出するために用いられる。多数の異常を同時に検出できる。本発明は、妊婦のサンプルから胎児ＤＮＡの配列を決定するための非侵襲性の方法も提供する。本発明は、点突然変異、リーディングフレームシフト、トランジション、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加欠失、フレームシフト、ミスセンス、逆突然変異、およびマイクロサテライト変化を含むがそれに限定されない、野生型配列と比べたときの遺伝子配列中のあらゆる変化を検出するために用いられ得る。好ましい実施形態において、核酸に基づく差異とは１塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）である。特定の好ましい実施形態において、核酸に基づく差異とは特徴的なメチル化状態である。たとえば、第１の核酸種は第１の核酸に基づくメチル化パターンを有し、第２の核酸種は第２の核酸に基づくメチル化パターンを有し、第１の核酸に基づくメチル化パターンは第２の核酸に基づくメチル化パターンとは異なる。いくつかの実施形態においては、第１および第２のプライマーはメチル化特異的な増幅プライマーである。

好ましい実施形態においては、単一の多重化された反応において２つ以上の核酸に基づく差異が同時に検出される。特定の実施形態においては、対象となる複数の座の対立遺伝子がシーケンシングされ、それらの相対量が定量化されて比較される。実施形態の１つにおいては、鋳型ＤＮＡの単一の染色体上の対象となる１から数十、数百、数千の座の対立遺伝子の配列が決定される。別の実施形態においては、複数の染色体上の対象となる１から数十、数百、数千の座の対立遺伝子の配列が検出され定量化される。たとえば、単一の反応で複数のＳＮＰ（例、２から約１００のＳＮＰ）が検出されてもよい。

別の実施形態においては、第１および第２の核酸種は異なる対立遺伝子を含む。たとえば、母体由来の核酸種と胎児由来の核酸種との場合に、母体核酸は所与の対立遺伝子に対してホモ接合であり、胎児核酸は同じ対立遺伝子に対してヘテロ接合である。よって本発明は、対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子を増幅し、検出した後にその相対量を定量化するための方法を提供し、対象となるヘテロ接合の座は、鋳型ＤＮＡから対象となる座における対立遺伝子の配列を決定することによって予め同定されている。

本発明の方法は、高コピー数核酸種に対して低コピー数核酸種を増幅、検出または定量化するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、サンプル中の高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の出発相対パーセンテージは０．５％から４９％である。関連する実施形態において、高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の最終相対パーセンテージは５．０％から８０％またはそれ以上である。

本発明の方法は、約２０塩基またはそれ以上の短い断片化された核酸を増幅、検出または定量化するために用いられてもよい。約５０塩基またはそれ以上であることがより好ましい。

本発明は部分的に、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオソームのもの、ミトコンドリアのもの、後生的に修飾されたもの、１本鎖のもの、２本鎖のもの、環状のもの、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、人工または合成ＤＮＡ、一意のＤＮＡ配列を含むもの、およびｃＤＮＡなどＲＮＡサンプルから逆転写されたＤＮＡ、ならびにそれらの組合せなどの核酸を増幅、検出または定量化することに関する。好ましい実施形態において、核酸は無細胞核酸である。別の実施形態において、核酸はアポトーシス細胞に由来する。別の実施形態において、核酸の一方の種は胎児由来であり、核酸の他方の種は母体由来である。

本発明は、たとえば全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡のもの）、生検サンプル、尿、便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、胸液、胚細胞および胎児細胞などのサンプルから核酸を増幅、検出または定量化することに関する。好ましい実施形態において、生物サンプルは血漿である。別の好ましい実施形態において、サンプルは無細胞または実質的に無細胞である。関連する実施形態において、サンプルは予め抽出された核酸のサンプルである。別の実施形態において、サンプルはプールされた核酸のサンプルである。

本発明は、母体血漿から胎児核酸を増幅、検出または定量化するために特に有用である。好ましい実施形態において、サンプルは動物、最も好ましくはヒトからのものである。別の好ましい実施形態において、サンプルは妊娠中のヒト（妊婦）からのものである。関連する実施形態において、サンプルは妊娠５週目より後の妊婦から回収される。別の実施形態においては、その妊婦の血液、血漿または羊水における遊離胎児核酸の濃度が上昇している。

本明細書において提供される方法は、核酸の検出および定量のためのあらゆる公知の方法とともに用いられてもよく、その公知の方法とはプライマー伸長法（例、ｉＰＬＥＸ（商標）、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．）、ＤＮＡシーケンシング、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲ）、制限断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ＭＳＰＣＲ）、パイロシーケンシング分析、アシクロプライム（ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ）分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（Ｄｙｎａｍｉｃ ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＰＮＡ）およびロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ）、挿入染料（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、ジェネティックビット分析（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシーケンシング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイミニシーケンシング（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｍｉｎｉｓｅｑ）、アレイドプライマー伸長法（ａｒｒａｙｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長法、Ｔａｇアレイ、コード化ミクロスフェア（Ｃｏｄｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、鋳型指示による組込み（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：ＴＤＩ）、蛍光偏光、比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ：ＯＬＡ）、シーケンスコード化（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｄｅｄ）ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロック（Ｐａｄｌｏｃｋ）プローブ、およびインベーダーアッセイ、またはそれらの組合せを含む。ここにすべて引用により援用される米国特許第６，２５８，５３８号、第６，２７７，６７３号、第６，２２１，６０１号、第６，３００，０７６号、第６，２６８，１４４号、第６，２２１，６０５号、第６，６０２，６６２号、および第６，５００，６２１号も参照されたい。

本明細書において提供される方法は、付加的なステップを導入するよう変更されることによって、たとえば核酸の増幅または検出が改善されたり、増幅後の標的核酸の分析が改善されたりしてもよい。たとえば、当該技術分野において公知の方法によって、高コピー数核酸種の増幅を付加的に抑制してもよい。たとえば、ＮａｓｉｓらのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５０：６９４−７０１（２００４年）を参照されたい。本明細書において提供される方法は、たとえば自動化を改善するためにステップを組合せるように変更されてもよい。

別の実施形態において、本明細書において提供される方法は、たとえば電気泳動、液体クロマトグラフィ、サイズ排除、ろ過、マイクロ透析、電気透析、遠心膜排除、有機または無機抽出、アフィニティクロマトグラフィ、ＰＣＲ、ゲノムワイド（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）ＰＣＲ、配列特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、シリカ膜または分子ふるいの導入、および断片選択的増幅などの、核酸を抽出するための別の方法の前または後に行なわれても、またはそれと同時に行なわれてもよい。

本発明はさらに、本明細書に記載される方法を行なうための試薬を含むキットにも関する。

高コピー数核酸に比べて低コピー数核酸を検出および定量化するための識別力が非常に低い、標準的な対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅方法を示す図である。高コピー数プライマー濃度に対して低コピー数プライマー濃度を選択的に増加させることによって、本発明の偏向対立遺伝子特異的（ＢＡＳ）増幅は、高コピー数分子の増幅および検出を抑制する一方で低コピー数分子の増幅および検出を高めることによって、識別力を著しく増加させることができる。 ＭａｓｓＡｒｒａｙ（登録商標）系を用いて単一ヌクレオチドまたは挿入／欠失多型を検出および測定するための偏向対立遺伝子特異的（ＢＡＳ）増幅に対するアッセイ設計戦略の例を示す図である。対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの３’末端またはその付近が特定の対立遺伝子と相補的であるように設計される。本発明の実施形態の１つにおいて、対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの３’末端の約５またはそれ以下のヌクレオチド位置５’のヌクレオチドにおいて特定の対立遺伝子と相補的である。特定の実施形態において、対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの３’末端の４、３、２または１ヌクレオチド位置５’のヌクレオチドにおいて特定の対立遺伝子と相補的である。別の実施形態において、対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーの３’末端において特定の対立遺伝子と相補的である。共通プライマーは、両方の鋳型に対して同一の核酸種の配列と実質的に相補的である。検出伸長プローブは、多型部位の反対側に位置しても（ａ）、２つの対立遺伝子を識別できるアンプリコン上の別の配列差異に位置しても（ｂ）よい。さらに、図面において、＋記号はプライマーおよび鋳型の相対濃度を示し、＋＋＋は＋よりも高濃度であることを示す。 ２つの検出シナリオ（事例１および事例２）の例を示す図である。標準ＰＣＲで得られる識別は乏しいのに対し、ＢＡＳ増幅では第２ピークの５０％減少が得られる。ＢＡＳ戦略は胎児特異的対立遺伝子（Ｔ）を信頼性高く検出するのみならず、母体対立遺伝子に対する異なる比率をも正確に測定する。

図３の事例２に用いられたプライマーを以下の表Ａに示す。

スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 ２回行なわれた同じ実験の結果を示すグラフであって、ここでＢＡＳプライマーは可変（たとえば図４Ｄにおいては１：１０の比率）であり、標的ＤＮＡは９８：２（女性：男性）の比率に固定される。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 スペクトログラムを示す図であって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変（たとえば図６Ｂにおいては女性：男性が９９：１）である。 ２回行なわれた同じ実験の結果を示すグラフであって、ここでＢＡＳプライマーは（１：５の比率に）固定され、標的ＤＮＡは可変である。 異数性検出アッセイ設計を示す図であって、ここで母はＣＣ遺伝子型を有し、胎児はＣＴＴまたはＣＣＴトリソミー遺伝子型を有する。これらの遺伝子型は次の比率で存在する： ＣＴ ９７．５：２．５ ＣＴＴ ９６．７：３．４ ＣＣＴ ９８．４：１．７ ＢＡＳ増幅が高コピー種の増幅の抑制を可能にする一方で、低コピー種の増幅を増加させて検出可能なレベルにする様子を示す図である。 母および胎児の異なる遺伝子型の組合せを有する別のシナリオを示す図である。「スワブ」は母体のみに由来する核酸を示し、「血漿」は母体および胎児両方の核酸を含有する。ここで用いられる「スワブ」とは、胎児核酸を含まないあらゆる核酸サンプル供給源、たとえばそうした母体細胞などを示す。 母および胎児の異なる遺伝子型の組合せを有する別のシナリオを示す図である。「スワブ」は母体のみに由来する核酸を示し、「血漿」は母体および胎児両方の核酸を含む。ここで用いられる「スワブ」とは、胎児核酸を含まないあらゆる核酸サンプル供給源、たとえばそうした母体細胞などを示す。 母および胎児の異なる遺伝子型の組合せを有する別のシナリオを示す図である。「スワブ」は母体のみに由来する核酸を示し、「血漿」は母体および胎児両方の核酸を含む。ここで用いられる「スワブ」とは、胎児核酸を含まないあらゆる核酸サンプル供給源、たとえばそうした母体細胞などを示す。 母および胎児の異なる遺伝子型の組合せを有する別のシナリオを示す図である。「スワブ」は母体のみに由来する核酸を示し、「血漿」は母体および胎児両方の核酸を含む。ここで用いられる「スワブ」とは、胎児核酸を含まないあらゆる核酸サンプル供給源、たとえばそうした母体細胞などを示す。

発明の詳細な説明
本発明は、核酸を増幅、検出および／または分析する方法を含み、無細胞の低コピー数核酸を高コピー数核酸（例、宿主または母体の核酸）の存在下で増幅、検出および定量するために特に有用である。特にいくつかの実施形態において、本発明の方法は細胞外の供給源から得られた核酸に対して行なわれてもよい。末梢血に無細胞核酸が存在することはよく確認された現象である。無細胞核酸はいくつかの供給源に由来し得るが、循環する細胞外核酸の供給源の１つはアポトーシスとしても知られるプログラム細胞死からのものであることが示されている。アポトーシスの結果生じる核酸の供給源は多くの体液において見出すことができ、宿主における通常のプログラム細胞死、自己免疫疾患の場合の誘導されたプログラム細胞死、敗血性ショック、新生物（悪性または非悪性）、または同種移植片（移植された組織）などの非宿主供給源、または妊婦の胎児もしくは胎盤を含むがそれに限定されないいくつかの供給源に由来し得る。末梢血またはその他の体液からの細胞外核酸の増幅、検出および分析に対する適用は広範にわたり、とりわけ非侵襲性の出生前診断、癌診断、病原体検出、自己免疫応答および同種移植片拒絶反応を含み得る。

本明細書において用いられる「低コピー数」核酸またはプライマーという用語は、別の核酸種よりも少量存在する核酸種を意味する。より少量とは、好ましくはより低濃度であることを意味するが、より少数の分子、または重量ベースでより軽量であることなどを意味してもよい。低コピー数核酸は、たとえば高コピー数核酸に対する低コピー数核酸の比率、または合計核酸に対する低コピー数核酸の比率などの比率によって定量化されてもよい。低コピー数核酸は、たとえばコピー数（例、約１、約２、約３、約４、約５、約１０コピー）、またはグラム、モル、もしくは濃度（例、約０．００１ｎｇから約１ｎｇ、または約０．００１ｎｇから約０．１ｎｇ、約０．００１ｎｇから約０．０１ｎｇ）などによる量として定量化されてもよい。

本明細書において用いられる「高コピー数」核酸またはプライマーという用語は、別の核酸種よりも多量存在する核酸種を意味する。より多量とは、好ましくはより高濃度であることを意味するが、より多数の分子、または重量ベースでより大きい重量であることなどを意味してもよい。

低コピー数および高コピー数核酸またはプライマーという用語は、互いに関して一方の方が低濃度であることを意味してもよいが、他方よりも少数の分子、または重量ベースでより軽量であることなどを意味してもよい。

本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語は、中に外因性核酸を導入して、宿主細胞核酸に加えて外因性核酸を含有する宿主細胞を生産できるようなあらゆる細胞を示す。本明細書において用いられる「宿主細胞核酸」および「内因性核酸」という用語は、宿主細胞が得られたときに細胞中に存在する核酸種（例、ゲノムまたは染色体の核酸）を示す。本明細書において用いられる「外因性」という用語は、宿主細胞核酸以外の核酸を示す；外因性核酸は、宿主細胞に導入されたか、または宿主細胞の祖先に導入された結果として宿主細胞中に存在できる。よって、たとえば特定の宿主細胞に対して外因性の核酸種とは、非内因性の（得られたときの宿主細胞、または宿主細胞の祖先には存在しない）核酸種である。適切な宿主細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞を含むがそれに限定されない。

「核酸」および「核酸分子」という用語は、この開示を通して互いに交換可能に用いられ得る。この用語はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチドポリマー（ＲＮＡ）、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成物、およびポリアミド核酸（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ＰＮＡｓ）の１本鎖または２本鎖のいずれかの形を示し、他に限定されない限り、自然発生するヌクレオチドと類似の態様で機能できる天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。

本明細書において用いられる「核酸種」という用語は、サンプル中の興味の対象となる核酸を示す。ある核酸種は、核酸の差異に基づいて別の核酸種と異なっていてもよく、その差異は突然変異、挿入、欠失、異なる生物からの一意のヌクレオチド配列、または胎児対母体供給源を含むがそれに限定されない。関連する実施形態において、核酸種はアポトーシスＤＮＡ、胎児ＤＮＡ、腫瘍形成ＤＮＡ、またはあらゆる非宿主ＤＮＡからのものである。別の関連する実施形態において、核酸種は無細胞核酸である。別の関連する実施形態において、核酸種はプログラム細胞死の際に生成されたオリゴヌクレオソーム核酸である。異なる核酸種は異なる対立遺伝子であってもよく、各対立遺伝子は１つまたはそれ以上の座において異なる配列を有する（「対立遺伝子」という用語については以下により詳細に説明する）。

本明細書において用いられる「座（ｌｏｃｕｓ）」、「座（ｌｏｃｉ）」および「対象となる座」という用語は、より大きな核酸領域内にある選択された核酸領域を示す。対象となる座は、１〜１００、１〜５０、１〜２０、または１〜１０ヌクレオチド、時には１〜６、１〜５、１４、１〜３、１〜２または１ヌクレオチド（類）を含み得るがそれに限定されない。

本明細書において用いられる「対立遺伝子」という用語は、染色体上の同じ位置を占めるＤＮＡの遺伝子または非コード領域のいくつかの代替形の１つを示す。対立遺伝子という用語は、バクテリア、ウイルス、菌類、原生動物、カビ、酵母、植物、ヒト、ヒト以外のもの（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎｓ）、動物、および古細菌を含むがそれに限定されないあらゆる生物からのＤＮＡを説明するために用いられてもよい。

複数の対立遺伝子は同一の配列を有してもよいし、単一ヌクレオチドまたは２つ以上のヌクレオチドが変化していてもよい。各染色体の２つのコピーを有する生物に関しては、両方の染色体が同じ対立遺伝子を有しているとき、その状態はホモ接合と呼ばれる。２つの染色体における対立遺伝子が異なるとき、その状態はヘテロ接合と呼ばれる。たとえば、対象となる座が染色体１上のＳＮＰ Ｘであって、母性染色体はＳＮＰ Ｘにアデニンを含有し（Ａ対立遺伝子）、父性染色体はＳＮＰ Ｘにグアニンを含有する（Ｇ対立遺伝子）とき、その個体はＳＮＰ Ｘにおいてヘテロ接合である。

「定量する」および「定量化する」という用語ならびにそれらの文法的変形は、本明細書において互いに交換可能に用いられる。

本明細書において用いられる「アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、ポリヌクレオチド中の１つのヌクレオチドまたは２つ以上の連続するヌクレオチドの配列を意味する。たとえばＳＮＰなどの単一ヌクレオチドの場合、「配列」および「アイデンティティ」は本明細書において互いに交換可能に用いられる。特徴的なメチル化状態の場合、アイデンティティとは特定のＣｐＧアイランドのメチル化状態を示す。たとえば、ここに引用により援用される米国出願第２００５０２７２０７０号を参照されたい。

本明細書において用いられる「鋳型」という用語は、本発明における増幅のために用いられ得るあらゆる核酸分子を示す。鋳型核酸はあらゆる生物供給源または非生物供給源から得ることができる。

本明細書において用いられる「プライマー」とは、ハイブリダイゼーション、鎖伸長反応、増幅およびシーケンシングに好適なオリゴヌクレオチドを示す。同様に、プローブとはハイブリダイゼーションに用いられるプライマーである。プライマーとは、典型的には約５から２００ヌクレオチド、一般的には約７０ヌクレオチドまたは７０未満という十分に低質量であって、かつ本明細書において提供される増幅方法および検出方法およびシーケンシングにおいて便利に用いられるために十分なサイズの核酸を示す。これらのプライマーは、安定な２本鎖を形成するために十分な数のヌクレオチド、典型的には約６〜３０ヌクレオチド、約１０〜２５ヌクレオチド、および／または約１２〜２０ヌクレオチドを必要とするような、核酸の検出およびシーケンシングのためのプライマーを含むがそれに限定されない。よって本明細書の目的に対しては、プライマーはあらゆる好適な長さを含むヌクレオチドの配列であり、プライマーの配列および適用に依存して、典型的には約６〜７０ヌクレオチド、１２〜７０ヌクレオチド、または約１４より大きく上限の約７０ヌクレオチドまでを含有する。

本明細書において用いられる「メチル化特異的プライマー」という用語は、別のメチル化状態を越えた特定のメチル化状態を有する配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを示す。ヌクレオチド配列はメチル化が可能であり、特定のヌクレオチド配列は複数の異なるメチル化状態を有し得る。メチル化特異的プライマーは、通常の当業者によって公知であり、選択されることができる（例、２００３年１１月１３日に出願公開第２００３０２１１５２２号として公開された米国特許出願第１０／３４６，５１４号）。

本明細書において用いられる「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブまたはプライマーが標的配列に非標的配列よりも優先的にハイブリダイズすることを示す。当業者は、たとえば温度、プローブまたはプライマーの長さおよび組成、緩衝液組成および塩濃度など、ハイブリダイゼーションに影響するパラメータを熟知しており、これらのパラメータを容易に調整して標的配列への核酸の特異的ハイブリダイゼーションを達成できる。標的配列への優先的ハイブリダイゼーションは、たとえば非標的配列への検出可能なハイブリダイゼーションをほとんどまたはまったく含まない。

本発明の特定の実施形態においては、サンプルは全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、髄液、洗浄液（例、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡のもの）、生検サンプル、組織、尿、便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙、膣分泌液、汗、母乳、胸液、胚細胞および胎児細胞を含んでもよいがそれに限定されない。本明細書において用いられる「血液」という用語は、全血、またはたとえば従来定義される血清および血漿などの血液のあらゆる画分を含む。血漿とは、抗凝血薬で処理した血液の遠心分離によって得られる全血の画分を示す。血清とは、血液サンプルが凝固した後に残る流体の水分の多い部分を示す。好ましい実施形態において、サンプルは血液、血清または血漿である。よって、特定の実施形態においては鋳型ＤＮＡは血清から単離され、他の実施形態においては鋳型ＤＮＡは血漿から単離される。特定の好ましい実施形態において、サンプルは無細胞または実質的に無細胞である。関連する実施形態において、サンプルは予め抽出、単離または精製された核酸を含有するサンプルである。核酸種を標的にするやり方の１つは、生物サンプルの非細胞画分を用いることである；すなわち、サンプルに混入する完全な細胞材料（例、長鎖ゲノムＤＮＡ）の量を制限する。本発明の実施形態の１つにおいては、予め澄ませた血漿および尿などの無細胞サンプルに、酵素、カオトロピック物質、界面活性剤、またはそれらいずれかの組合せを加えることによって、細胞内ヌクレアーゼを不活性化する処理が最初に行なわれる。いくつかの実施形態においては、サンプルには最初に、たとえば遠心分離、ろ過、アフィニティクロマトグラフィなどの当該技術分野において公知の方法のいずれかによって、サンプルから実質的にすべての細胞を除去するための処理が行なわれる。

胎児核酸は、第１トリメスタ以降から母体血漿中に存在し、妊娠期間の進行に伴って濃度が増加する（Ｌｏら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）６２：７６８−７７５）。出産後、胎児核酸は非常に迅速に母体血漿から取除かれる（Ｌｏら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（１９９９）６４：２１８−２２４）。母体血漿中の胎児核酸は、母体血液の細胞画分中の胎児核酸よりもかなり高い画分濃度で存在する（Ｌｏら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）６２：７６８−７７５）。よって別の実施形態においては、ある核酸種は胎児由来のものであり、他方の核酸種は母体由来のものである。

いくつかの実施形態において、サンプルは遊離母体鋳型ＤＮＡおよび遊離胎児鋳型ＤＮＡを含有する。特定の実施形態において、鋳型ＤＮＡは母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの混合物を含んでもよく、実施形態の１つにおいては、鋳型ＤＮＡから対象となる座の対立遺伝子の配列を決定する前に、母体ＤＮＡをシーケンシングして対象となるホモ接合の座を同定し、この対象となるホモ接合の座とは鋳型ＤＮＡ中で分析される対象の座である。いくつかの実施形態においては、母体ＤＮＡをシーケンシングして対象となるヘテロ接合の座を同定し、この対象となるヘテロ接合の座とは鋳型ＤＮＡ中で分析される対象の座である。特定の実施形態においては、配列を決定する前に鋳型ＤＮＡが単離された。いくつかの実施形態においては、胎児ＤＮＡにおける対象の座の配列を決定する前に、母体鋳型ＤＮＡにおける対象の座の配列が決定された。いくつかの実施形態においては、胎児ＤＮＡにおける対象の座の配列を決定する前に、父性鋳型ＤＮＡにおける対象の座の配列が決定される。いくつかの実施形態において、対象となる座は単一ヌクレオチド多型である。他の実施形態において、対象となる座は突然変異である。いくつかの実施形態においては、対象となる複数の座の配列が決定される。これらの実施形態のいくつかにおいては、対象となる複数の座は複数の染色体上にある。

本発明のサンプルは、細胞溶解、細胞ヌクレアーゼの不活性化、および細胞デブリからの所望の核酸の分離を伴ってもよい。通常の溶解手順は、機械的破壊（例、粉砕、低張溶解）、化学処理（例、界面活性剤溶解、カオトロピック薬剤、チオール還元）、および酵素分解（例、プロテイナーゼＫ）を含む。本発明において、生物サンプルはまず溶解緩衝液、カオトロピック薬剤（例、塩）、およびプロテイナーゼまたはプロテアーゼの存在下で溶解されてもよい。細胞膜破壊および細胞内ヌクレアーゼの不活性化が組合されてもよい。たとえば、単一の溶液が細胞膜を可溶化するための界面活性剤と、細胞内酵素を不活性化するための強いカオトロピック塩とを含有してもよい。細胞溶解およびヌクレアーゼ不活性化の後、ろ過または沈殿によって細胞デブリが容易に除去され得る。

別の実施形態においては、溶解が妨げられてもよい。これらの実施形態においては、サンプルを細胞溶解を阻害する薬剤と混合することによって、細胞が存在するときには細胞の溶解を阻害してもよく、その薬剤は膜安定剤、架橋剤、または細胞溶解阻害剤である。これらの実施形態のいくつかにおいては、その薬剤は細胞溶解阻害剤であり、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒドの誘導体、ホルムアルデヒド、ホルマリン、またはホルムアルデヒドの誘導体であってもよい。ここに引用により援用される米国特許出願第２００４０１３７４７０号を参照されたい。

本発明の方法は、核酸種の配列を検出するステップを含んでもよい。当該技術分野において公知のあらゆる検出方法が用いられてもよく、その方法はゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、蛍光偏光、ＤＮＡシーケンシング、サンガージデオキシシーケンシング、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、飛行時間型質量分析法、４重極質量分析法、扇形磁場型（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｃｔｏｒ）質量分析法、扇形電場型（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｓｅｃｔｏｒ）質量分析法、蛍光測定法、赤外線分光測定法、紫外線分光測定法、ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ電流測定法、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＨｕＳＮＰアレイ、ＢｅａｄＡｒｒａｙｓ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＳＮＰ−ＩＴ、ＴａｑＭａｎアッセイ、インベーダーアッセイ、ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ、サザンブロット、スロットブロット、またはドットブロットを含むがそれに限定されない。

本発明の方法は、高コピー数核酸種に対して低コピー数核酸種を増幅、検出または定量化するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、サンプル中の高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の出発相対パーセンテージは０．５％から４９％である。関連する実施形態において、サンプル中の高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の出発相対パーセンテージは、０．５〜１．０％の低コピー数核酸種、約１．０〜２．０％の低コピー数核酸種、約２．０〜３．０％の低コピー数核酸種、約３．０〜４．０％の低コピー数核酸種、約４．０〜５．０％の低コピー数核酸種、約５．０〜６．０％の低コピー数核酸種、約７．０〜８．０％の低コピー数核酸種、約８．０〜９．０％の低コピー数核酸種、約９．０〜１０％の低コピー数核酸種、約１０〜１２％の低コピー数核酸種、約１２〜１５％の低コピー数核酸種、約１５〜２０％の低コピー数核酸種、約２０〜２５％の低コピー数核酸種、約２５〜３０％の低コピー数核酸種、約３０〜３５％の低コピー数核酸種、または約３５〜４５％の低コピー数核酸種である。

関連する実施形態において、高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の最終相対パーセンテージは５％から８０％である。関連する実施形態において、サンプル中の高コピー数核酸種に対する低コピー数核酸種の最終相対パーセンテージは、５．０〜６．０％の低コピー数核酸種、約６．０〜７．０％の低コピー数核酸種、約７．０〜８．０％の低コピー数核酸種、約８．０〜９．０％の低コピー数核酸種、約９．０〜１０％の低コピー数核酸種、約１０〜１５％の低コピー数核酸種、約１５〜２０％の低コピー数核酸種、約２０〜２５％の低コピー数核酸種、約２５〜３０％の低コピー数核酸種、約３０〜３５％の低コピー数核酸種、約３５〜４０％の低コピー数核酸種、約４０〜４５％の低コピー数核酸種、約４５〜５０％の低コピー数核酸種、約５０〜５５％の低コピー数核酸種、約５５〜６０％の低コピー数核酸種、約６０〜６５％の低コピー数核酸種、約６５〜７０％の低コピー数核酸種、約７０〜７５％の低コピー数核酸種、約７５〜８０％の低コピー数核酸種、または約８０％より大きい低コピー数核酸種である。

別の実施例において、本発明の方法は、核酸の抽出、単離または精製に対して好適な当該技術分野におけるあらゆる技術と共に用いられてもよく、その技術は、塩化セシウム勾配、勾配、スクロース勾配、グルコース勾配、遠心分離プロトコル、煮沸、Ｃｈｅｍａｇｅｎ ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ １ｋキット、Ｃｈｅｍａｇｅｎ ｂｌｏｏｄキット、Ｑｉａｇｅｎ精製システム、ＱＩＡ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ精製キット、ＨｉＳｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄキット、Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ精製システム、ＭａｎｇｅＳｉｌ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅに基づくシステム、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ技術、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ精製システム、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ精製キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ精製システム、ＣＯＮＣＥＲＴ精製システム、Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ精製システム、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ ＢｌｏｏｄＳｐｉｎキット、ＵｌｒａＣｌｅａｎ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡキット、およびＭｉｃｒｏｃｏｎ １００フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＡ）によるろ過を含むがそれに限定されない。

別の実施形態においては、核酸を抽出、精製、単離または濃縮することは必須ではない；核酸は増幅可能な形で提供される必要があるだけである。増幅前にプライマーによって核酸鋳型をハイブリダイズする必要はない。たとえば、当該技術分野において周知の標準プロトコルを用いて、細胞またはサンプル溶解物中で増幅を行なうことができる。固体支持上、固定された生物調製物中、または別様で非ＤＮＡ物質を含有する組成物中にあるＤＮＡであって、最初にその固体支持または固定された調製物または組成物内の非ＤＮＡ物質から抽出することなく増幅可能なＤＮＡは、そのＤＮＡを適切なプライマーとアニーリングさせてコピー、特に増幅させることができて、かつそのコピーまたは増幅された産物を回収して本明細書に記載されるとおりに利用できる限り、さらなる精製なしに直接用いることができる。

別の実施形態において、記載される方法は、すべてその全体がここに引用により援用される公開された米国特許出願第２００３００２７１３５号、第２００３００８２５３９号、第２００３０１２４５５６号、第２００３０１７５６９６号、第２００３０１７５６９５号、第２００３０１７５６９７号、および第２００３０１９０６０５号、ならびに米国特許出願第１０／３２６，０４７号、第１０／６６０，９９７号、第１０／６６０，１２２号、および第１０／６６０，９９６号に開示およびクレームされるような、核酸増幅と分子量分析による情報提供アンプリコンの主成分組成の決定との組合せを用いて未知の生物薬剤（ｂｉｏａｇｅｎｔｓ）を迅速に同定するための方法と組合せて用いられてもよい。

本発明はさらに、本発明の方法を実行するためのキットにも関する。キットは、本明細書に記載される組成物および／または成分の１つまたはそれ以上を含有する１つまたはそれ以上のコンテナを含んでもよい。キットは成分の１つまたはそれ以上をあらゆる数の別個のコンテナ、小包、管、ガラス瓶、マイクロタイタプレートなどの中に含んでもよく、または複数の成分がこうしたコンテナ中でさまざまな組合せで組合されてもよい。キットは本明細書に記載される方法と共に利用でき、時には本明細書に記載される１つもしくはそれ以上の方法を行なうための指示書、および／または本明細書に記載される１つもしくはそれ以上の組成物もしくは試薬の説明書を含む。指示書および／または説明書は、印刷された形であってもよく、キット挿入物に含まれてもよい。キットは、こうした指示書または説明書を提供するインターネット上の場所の記載を含んでもよい。

アポトーシス核酸の検出および定量分析
本明細書において提供される方法は、サンプル中のアポトーシス核酸の増幅、検出および定量に特に有用である。プログラム細胞死すなわちアポトーシスは、すべての多細胞生物における形態形成、発達、分化、およびホメオスタシスにおいて必須の機構である。典型的にアポトーシスは、ＤＮＡ断片化、クロマチン凝縮、細胞質および核の分解、ならびにアポトーシス体の形成を含む特有の形態的特徴をもたらす特定の経路の活性化によって、壊死と区別される。

カスパーゼ活性化ＤＮアーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＤＮａｓｅ：ＣＡＤ）は、代替的にＤＮＡ断片化因子（ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：ＤＦＦまたはＤＦＦ４０）とも呼ばれ、クロマチンのヌクレオソーム内リンカ領域における２本鎖ＤＮＡ破壊を生じて、およそ１８０塩基対またはその倍数のＤＮＡオリゴマーからなるヌクレオソームラダーをもたらすことが示されている。ラダー断片の大多数（最大７０％）は、１８０ｂｐのヌクレオソームモノマーとして生じる。すべての断片は５’−リン酸化末端を有し、その大多数は平滑末端である（ここに引用により援用されるＷｉｄｌａｋらのＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００年３月１７日；２７５（１１）：８２２６−３２）。

よって、高バックグラウンドの野生型ＤＮＡの存在下で、特定の細胞または組織由来の、または生物流体中に細胞外断片として存在する特定のＤＮＡ断片の既知の突然変異およびエピ変異（ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ）を標的特異的な態様で特徴付ける必要性が高まっている（例、薬物処理の生体異物に応答する細胞からの；炎症を起こした、悪性または別様で疾患を有する組織からの；移植、または妊娠中の胎児および母体ＤＮＡの差異からのＤＮＡの体細胞突然変異）。

したがって本発明は、サンプル中に低濃度存在する短く断片化した核酸種を選択的に増幅、検出および定量化するための方法を提供する。この方法は、オリゴヌクレオソームを検出するために特に有用である。オリゴヌクレオソームはクロマチンの反復する構造単位であり、その各々は、インビトロおよびインビボにおいてＤＮＡをヌクレアーゼ分解から部分的に保護するヒストンコアの周囲に巻かれたおよそ２００塩基対のＤＮＡからなる。これらの単位はモノマーまたはマルチマーとして見出されることができ、一般にアポトーシスＤＮＡラダーと呼ばれるものを生成する。この単位はヒストンに結合されていないフランキングＤＮＡのヌクレアーゼ分解によって形成されるため、大多数のオリゴヌクレオソームは平滑末端であり、かつ５’−リン酸化されている。アポトーシス細胞のパーセンテージが低い生物系、またはアポトーシスが非同時的に起こっている生物系においては、オリゴヌクレオソームの検出は困難であり、単離はもっと困難である；しかし、オリゴヌクレオソームは疾患およびその他の状態を予測するものとなり得る（ここに引用により援用される米国特許出願第２００４０００９５１８号を参照されたい）。よって本明細書に記載される方法は、約１０００塩基対またはそれ以下、約７５０塩基対またはそれ以下、約５００塩基対またはそれ以下、および約３００塩基対またはそれ以下のサイズを有する核酸（例、胎児核酸）を検出するために利用できる。

診断上の適用
患者の血漿および血清中の循環核酸は、特定の疾患および状態に関連している（Ｌｏ ＹＭＤら、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ １９９８；３３９：１７３４−８；Ｃｈｅｎ ＸＱら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９６；２：１０３３−５、Ｎａｗｒｏｚ Ｈら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９６；２：１０３５−７；Ｌｏ ＹＭＤら、Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５１：１３２９−３０；Ｌｏ ＹＭＤら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００；４６：３１９−２３を参照されたい）。さらに、血中で循環するこれらの疾患に関連する低コピー数核酸を検出および正確に定量化できることは、疾患の診断および予後に非常に有益であることが判明するだろう（Ｗａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００４年１月；５０（１）：２１１−３）。

循環核酸の特徴および生物学的出所は完全には理解されていない。しかし、アポトーシスを含む細胞死が１つの主要な要素であるようだ（Ｆｏｕｒｎｉｅら、Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ １９９３；３９：２１５−２１； Ｆｏｕｒｎｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １９９５；９１：２２１−７）。理論に縛られることなく、アポトーシスを受ける細胞は核酸をアポトーシス体内に処理するため、ヒト対象の血漿または血清中の循環核酸の少なくとも一部は、微粒子関連ヌクレオソームの形を取る短い断片化ＤＮＡであり得る。本発明は、血漿または血清中に存在する他の高コピー数種よりも低濃度で対象の血漿または血清中に存在する短い断片化循環核酸種を増幅、検出および定量化するための方法を提供する。

本発明は、ある疾患状態の疑いがあるか、またはある疾患状態であることが知られる患者におけるその疾患状態を評価する方法を提供する。本発明の実施形態の１つにおいて、本発明は、ある疾患状態の疑いがあるか、またはある疾患状態であることが知られる患者から生物サンプルを得て、本明細書において提供される方法を用いて低コピー数核酸種を優先的に増幅、検出または定量化し、その核酸種の量または濃度または特徴を定めてその核酸種の量または濃度または特徴を対照（例、生物サンプルからのバックグラウンドゲノムＤＮＡ、高コピー数種、高頻度対立遺伝子など）と比較することによって疾患状態を評価することを含む。

「疾患状態を評価する」という表現は、患者の疾患状態を評定することを示す。たとえば、患者の状態の評価とは、患者における疾患の有無の検出を含んでもよい。一旦患者における疾患の存在が検出されると、患者の疾患状態の評価は、患者における疾患の深刻度の判定を含んでもよい。その判定を用いて疾患の予後、たとえば予後または処置計画などを作成することがさらに含まれてもよい。患者の状態の評価は、患者が疾患を有するか、または過去に疾患状態だったことがあるかを定めることを含んでもよい。その時の疾患状態の評価は、患者におけるその疾患状態の再発の可能性の判定または再発のモニタリングを含んでもよい。疾患状態の評価は、疾患の徴候についての患者のモニタリングを含んでもよい。したがって疾患状態の評価は、患者の疾患状態の検出、診断またはモニタリング、および患者の予後または処置計画の判定を含む。疾患状態を評価する方法はリスク層別化を助ける。

癌
本明細書において提供される方法は腫瘍形成核酸を増幅、検出および定量化するために用いられてもよく、さらに癌に関係する障害の診断または予後のために用いられてもよい。癌患者からの血漿には、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が存在することが知られている（Ｌｏ ＫＷら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（１９９９）４５，１２９２−１２９４）。これらの分子はおそらくアポトーシス体に収められており、したがって「遊離ＲＮＡ」に比べてより安定化している（Ａｎｋｅｒ ＰおよびＳｔｒｏｕｎ Ｍ、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（２００２）４８、１２１０−１２１１；Ｎｇ ＥＫら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００３）１００、４７４８−４７５３）。

１９８０年代後半および１９９０年代にはいくつかのグループが、癌患者由来の血漿ＤＮＡが鎖安定性の低下、Ｒａｓおよびｐ５３の突然変異、マイクロサテライトの変化、選択された遺伝子の異常なプロモータの高度メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ミトコンドリアＤＮＡ突然変異および腫瘍に関係するウイルスＤＮＡを含む、腫瘍に特異的な特徴を示すことを証明した（Ｓｔｒｏｕｎ Ｍら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（１９８９）４６，３１８−３２２；Ｃｈｅｎ ＸＱら、Ｎａｔ Ｍｅｄ（１９９６）２，１０３３−１０３５；Ａｎｋｅｒ Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ（１９９９）１８，６５−７３；Ｃｈａｎ ＫＣおよびＬｏ ＹＭ、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ（２００２）１７，９３７−９４３）。広範囲の悪性腫瘍に対する腫瘍特異的ＤＮＡが見出された：血液、結腸直腸、膵臓、皮膚、頭部および頸部（ｈｅａｄ−ａｎｄ−ｎｅｃｋ）、肺、胸、腎臓、卵巣、鼻咽頭、肝臓、嚢、胃、前立腺および頸部（ｃｅｒｖｉｘ）のものである。まとめると、上述のデータから、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡは罹患患者に遍在しており、それはアポトーシスなどの通常の生物プロセスの結果らしいことが示される。癌患者からのこれらの血漿ＤＮＡ断片のサイズを調べたところ、その大多数がアポトーシスＤＮＡ断片化の特徴であるヌクレオソームＤＮＡの倍数の長さを示すことが明らかになった（Ｊａｈｒ Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００１）６１，１６５９−１６６５）。

癌が特異的なウイルスＤＮＡ配列または腫瘍サプレッサおよび／または腫瘍遺伝子突然変異配列を示すとき、この方法。しかし、ほとんどの癌（およびほとんどのメンデル障害）に対して、臨床的適用は、腫瘍特異的ＤＮＡを血漿中に存在する患者の正常ＤＮＡと比較して単離、定量化および特徴付けする方法の最適化を待っている。したがって、当該技術分野におけるさらなる進歩を達成するには、正常な個体の血漿中のＤＮＡの分子構造および動力学を理解する必要がある。

よって本発明は、新生物疾患、悪性になる前の疾患、または増殖性疾患に関連するヒトまたは動物の血液の血漿または血清画分における特定の細胞外核酸の検出に関する。特定的に本発明は、突然変異腫瘍遺伝子またはその他の腫瘍関連ＤＮＡに由来する核酸の検出と、本明細書において提供されるような突然変異ＤＮＡの濃縮を伴うＤＮＡ抽出を用いることによって血液の血漿または血清画分に見出される細胞外突然変異腫瘍遺伝子または腫瘍関連ＤＮＡを検出およびモニタリングする方法とに関する。特に本発明は、本明細書において提供されるサイズ選択的濃縮方法を通じて新生物に関連する突然変異を含有するヒトまたはその他の動物における良性新生物、悪性になる前の新生物、または悪性新生物の存在、進行または臨床的状態の検出、同定またはモニタリング、およびその後の濃縮ＤＮＡにおける新生物の突然変異核酸の検出に関する。

本発明は、生物サンプルにおける腫瘍に由来するＤＮＡを同定するための方法を特徴とする。これらの方法は、生物サンプルにおいてアポトーシス体またはヌクレオソームの形をとる腫瘍由来ＤＮＡを区別または検出するために用いられてもよい。好ましい実施形態において、非癌ＤＮＡと腫瘍由来ＤＮＡとは核酸サイズの差を観察することによって区別され、ここでは低塩基対ＤＮＡが癌に関連している。

出生前診断
１９９７年以降、妊婦の血液循環において遊離胎児ＤＮＡを検出できることが公知である。妊娠関連の合併症がないとき、循環ＤＮＡの合計濃度は１０〜１００ｎｇまたは１，０００から１０，０００ゲノム当量／ｍｌ血漿の範囲であり（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｕｐｄａｔｅ．２００５年１月−２月；１１（１）：５９−６７およびそこに引用される参考文献）、胎児ＤＮＡ画分の濃度は第１トリメスタにおける約２０コピー／ｍｌから第３トリメスタにおける＞２５０コピー／ｍｌまで増加する。電子顕微鏡による調査および限外ろ過濃縮実験によって、胎盤由来の断片化ヌクレオソームＤＮＡを有するアポトーシス体が母体血漿における胎児ＤＮＡの供給源であると著者らは結論付ける。

妊婦における循環ＤＮＡ分子のサイズは非妊婦よりも顕著に大きいことが立証されており、妊婦および非妊婦に対する＞２０１ｂｐの合計血漿ＤＮＡの中央パーセンテージはそれぞれ５７％および１４％であり、サイズが＞１９３ｂｐおよび＞３１３ｂｐの胎児由来ＤＮＡの中央パーセンテージはそれぞれたった２０％および０％である（Ｃｈａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００４年１月；５０（１）：８８−９２）。

以下の発見が独立して確認された（Ｌｉら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００４年６月；５０（６）：１００２−１１）；ここに引用により援用される米国特許出願第２００５１６４２４号は、概念の証拠として、予備アガロースゲル電気泳動および＜３００ｂｐサイズ画分の溶出を介したサイズ排除クロマトグラフィによって、合計循環血漿ＤＮＡの約５％から＞２８％まで、胎児ＤＮＡの＞５倍相対濃縮が可能であることを示した。残念ながら、この方法は自動化が困難であり、ＤＮＡ材料が損失し得ること、および関連アガロースゲル部分から回収されるＤＮＡ濃度が低いことから、信頼性あるルーチン的使用に対してあまり実用的ではない。

よって本発明は、生物サンプル中の異なる個体に由来するＤＮＡ種を区別するための方法を特徴とする。これらの方法は、母体サンプル中の胎児ＤＮＡを区別、検出および定量化するために用いられてもよい。

超音波検査、羊水穿刺、絨毛生検（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｉ ｓａｍｐｌｉｎｇ：ＣＶＳ）、母体血液中の胎児血液細胞、母体血清アルファフェトプロテイン、母体血清ベータ−ＨＣＧ、および母体血清エストリオールを含むさまざまな非侵襲性および侵襲性の技術が出生前診断のために利用可能である。しかし、非侵襲性の技術は特異性が低く、高い特異性および高感度を有する技術は侵襲性が高い。さらに、ほとんどの技術は最大有用性のために妊娠中の特定の期間にしか適用できない。

母体血漿における胎児ＤＮＡ検出のために開発された最初のマーカは、男の胎児に存在するＹ染色体だった（Ｌｏら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ（１９９８）６２：７６８−７７５）。Ｙ染色体マーカの堅牢性は、当該技術分野における多くの研究者によって再現された（Ｃｏｓｔａ ＪＭら、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２１：１０７０−１０７４）。このアプローチは胎児の性別を判定するための高度に正確な方法を構成し、この方法は性別に関係する疾患の出生前調査に有用である（Ｃｏｓｔａ ＪＭ、Ｅｒｎａｕｌｔ Ｐ（２００２）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４８：６７９−６８０）。

母体血漿ＤＮＡ分析は、ＲｈＤ陰性の妊婦における胎児のＲｈＤ血液型状態の非侵襲性出生前判定にも有用である（Ｌｏら（１９９８）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３９：１７３４−１７３８）。このアプローチは正確であることが多くのグループによって示され、２００１年からＢｒｉｔｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅによるルーチンサービスとして導入されている（Ｆｉｎｎｉｎｇ ＫＭら（２００２）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４２：１０７９−１０８５）。

より近年には、母体血漿ＤＮＡ分析は胎児のβ−サラセミアメジャーの非侵襲性出生前排除に有用であることが示された（Ｃｈｉｕ ＲＷＫら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ ３６０：９９８−１０００）。ＨｂＥ遺伝子の出生前検出にも類似のアプローチが用いられる（Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ Ｇら（２００３）Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２３：３９３−３９６）。

母体血漿における胎児ＤＮＡのその他の遺伝子的適用は、軟骨発育不全症（Ｓａｉｔｏ Ｈら（２０００）Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１１７０）、筋緊張性ジストロフィー症（Ａｍｉｃｕｃｃｉ Ｐら（２０００）Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４６：３０１−３０２）、嚢胞性繊維症（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＭＣら（２００２）Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２２：９４６−９４８）、ハンチントン病（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＭＣら（２００３）Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２３：２３２−２３４）、および先天性副腎皮質過形成（Ｒｉｊｎｄｅｒｓ ＲＪら（２００１）Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ９８：３７４−３７８）の検出を含む。こうした適用の範囲は今後数年間のうちに増加することが期待される。

本発明の別の局面においては、患者は妊娠しており、患者またはその胎児における疾患または生理的状態を評価する方法は、患者またはその胎児の検出、モニタリング、予後または処置を助ける。より特定的には、本発明は、母から得られた生物サンプル中の胎児ＤＮＡを検出することによって胎児の異常を検出する方法を特徴とする。本発明に従う方法は、ＤＮＡの特徴（例、サイズ、重量、５’リン酸化、平滑末端）に基づいて胎児ＤＮＡを母体ＤＮＡと区別することによって母体サンプル中の胎児ＤＮＡを検出することを提供する。Ｃｈａｎら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００４年１月；５０（１）：８８−９２；およびＬｉら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００４年６月；５０（６）：１００２−１１を参照されたい。こうした方法を用いて、遺伝子の異常または遺伝子に基づく疾患を予測する胎児ＤＮＡを同定できることによって、出生前診断のための方法を提供できる。これらの方法は、核酸の変化、突然変異またはその他の特徴（例、メチル化状態）が疾患状態に関連するような、妊娠に関連するあらゆるすべての状態に適用可能である。本発明の方法およびキットは、染色体の異常（例、異数性またはダウン症候群に関連する染色体の異常）または遺伝的なメンデル遺伝子障害、およびそれぞれに関連する遺伝子マーカ（例、嚢胞性繊維症または異常ヘモグロビン症などの単一遺伝子障害）に伴う形質を含む胎児遺伝子形質の分析を可能にする。付加的な診断可能な疾患は、たとえば子癇前症、早産、妊娠悪阻、子宮外妊娠、胎児染色体異数性（トリソミー１８、２１または１３など）、および子宮内成長遅滞などを含む。

別の実施形態においては、対象となる複数の座の対立遺伝子がシーケンシングされ、それらの相対量が定量化および比較される。実施形態の１つにおいては、鋳型ＤＮＡ上の単一染色体の１から数十から数百から数千の対象となる座の対立遺伝子の配列が決定される。別の実施形態においては、複数の染色体の１から数十から数百から数千の対象となる座の対立遺伝子の配列が検出および定量化される。

分析可能な染色体に関する制限はない。あらゆる染色体上の対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子の比率を、あらゆる他の染色体上の対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子の比率と比較できる。別の実施形態においては、１つの染色体上の対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子の比率が、２、３、４または５以上の染色体上の対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子の比率と比較される。別の実施形態においては、１つの染色体上の対象となる複数の座における対立遺伝子の比率が、２、３、４または５以上の染色体上の対象となる複数の座における対立遺伝子の比率と比較される。これらの実施形態のいくつかにおいては、比較される染色体は、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、Ｘ、またはＹなどのヒト染色体である。関連する実施形態においては、染色体１３、１８および２１の対象となるヘテロ接合の座における対立遺伝子の比率が比較される。別の実施形態においては、妊婦のサンプルから得られた鋳型ＤＮＡ上の１から数十から数百から数千の対象となる座の配列が決定される。実施形態の１つにおいては、対象となる座は１つの染色体上にある。別の実施形態においては、対象となる座は複数の染色体上にある。

「染色体の異常」という用語は、対象染色体と正常な相同染色体との構造の偏差を示す。「正常」という用語は、特定の種の健康な個体において見出される優勢な核型またはバンディングパターンを示す。染色体の異常は数的なものまたは構造的なものであってもよく、異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部の欠失、付加、染色体の一部の付加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体の転位、および転座を含むがそれに限定されない。染色体の異常は、病理的状態の存在または病理的状態になる傾向と相関関係であり得る。

その他の疾患
多くの疾患、障害および状態（例、組織または器官の拒絶反応）は、本明細書において提供される方法によって検出できるアポトーシスＤＮＡまたはヌクレオソームＤＮＡを生成する。アポトーシスＤＮＡを生成すると考えられる疾患および障害は、糖尿病、心疾患、卒中、外傷および慢性関節リウマチを含む。紅斑性狼瘡（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）（ＲｕｍｏｒｅおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０年７月；８６（１）：６９−７４）。Ｒｕｍｏｒｅらは、ＳＬＥ血漿から精製したＤＮＡが、オリゴヌクレオソームＤＮＡにみられる特徴的な２００ｂｐ「ラダー」によく似た約１５０〜２００、４００、６００、および８００ｂｐのサイズに対応する別個のバンドを形成することを示した。

本発明は、外傷を有する疑いのある患者、または外傷を有することが知られている患者の疾患状態を評価する方法も提供する。この方法は、外傷を有する疑いのある患者、または外傷を有することが知られている患者から血漿または血清のサンプルを得るステップと、サンプル中のミトコンドリア核酸の量または濃度を検出するステップとを含む。

下記の実施例は例示的なものであって制限的なものではない。以下に記載される偏向対立遺伝子特異的（ＢＡＳ）増幅方法は、低コピー数の核酸を検出および測定するために利用でき、たとえば個体の遺伝子型を決定するために適合できる。この実施例において、こうした遺伝子型は単一ヌクレオチド多型である。たとえば質量分析法に基づく系を用いてこうした遺伝子型を決定するために用いられ得るステップの一例は次のとおりである。実施例１および実施例２におけるステップなど、いくつかのステップはデータを生成するために１回だけ行なわれる必要があり、そのデータはその後ＳＮＰ（またはその他の）アッセイの実行において用いられる（または提供されるか、または試験キットもしくはアルゴリズムに組込まれる）。

実施例１：プライマー比率の最適化
特定のＳＮＰの同定（ＳＮＰアッセイ）のために、低コピー数プライマーに対する高コピー数プライマーの最適な比率が決定される。こうした決定を行ない得る実験構成の例を表１および表２に示す。表３−５および関連する本文中に特定の増幅条件を示す。

男性および女性サンプルの異なる混合比率を有する８ｎｇのゲノムＤＮＡが、表に示されるように変動する比率の対立遺伝子特異的オリゴとともにＰＣＲ増幅にかけられる。

ＰＣＲサイクリングは４５サイクル用であり、各サイクルは９４℃で１５分間、９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間、７２℃で３分間であり、その後産物は４℃で維持される。

５マイクロリットルＰＣＲ反応の各々に２マイクロリットルのＳＡＰ混合物を加える。ＳＡＰ処理ＰＣＲ反応をインキュベートし、次いで以下の温度で維持する：３７℃で２０分間、８５℃で５分間、それ以降は４℃。

ｉＰＬＥＸ伸長に対しては、２００の短サイクルが行なわれ、各サイクルは９４℃で３０秒間、９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、８０℃で５秒間、および７２℃で３分間を含み、その後産物は４℃で維持される。さらなる処理および分析は、６ｍｇの樹脂による脱塩（ｄｅｓｌａｔｉｎｇ）、ＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐ Ｂｉｏａｒｒａｙｓへの供与およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を含む。

この実施例においては、男性および女性からの既知の核酸濃度の核酸サンプルがある割合で混合されることによって、Ｙ軸に示される特定のＹ染色体対立遺伝子の比率（Ｙ ＤＮＡの比率）が与えられる。この実施例においては、Ｙ染色体のみに存在する（または少なくともＸ染色体には存在しない）ことが知られる特定のＳＮＰが選択されて使用され、Ｘ染色体のみに存在する（または少なくともＹ染色体には存在しない）ことが知られる別の特定のＳＮＰが選択されて使用される。たとえば０．００％の比率は男性核酸を有さず、よってＹ対立遺伝子を有さない。５０％のＹ ＤＮＡの比率は、混合されることによって女性サンプルよりも男性サンプルの量が多くなって、５０％のＹ対立遺伝子が与えられ、これは女性のＸＸ染色体構成と男性のＸＹ染色体構成とを考慮に入れたものである。表１のＸ軸は、示されるＸオリゴの割合を与えるために混合されたＸおよびＹ特異的オリゴ溶液の体積の割合を示す。表１に明示される９６の反応条件（結果を生成する増幅反応の付加的な詳細がここに提供される）の各々からの核酸サンプルは、この場合には次いで質量分析法によって分析される。表２も参照されたい。

図４Ａ−Ｆに示されるとおり、さまざまな質量スペクトログラムが得られる。２つのピークの各々は特異的なものであり、一方はＸ染色体ＳＮＰに対するもの、他方はＹ染色体ＳＮＰに対するものである。たとえば、図４Ａ−Ｆのスペクトログラムは（（標的ＤＮＡ Ｆ：Ｍ ９８：２）と示されるとおり）Ｃ行に対応し、これは男性またはＹ対立遺伝子が２％存在することを意味する。しかし、図４Ａはプライマーの１：１０のＸ：Ｙ比率を例示し、これは列６に示される条件にほぼ対応する。例示されるとおり、（この場合はＹ染色体ＳＮＰに対する）低コピー数プライマーの割合が増加するにつれて、右手のピークのサイズが増加する。図４Ａでは、Ｙ特異的プライマーの存在が０であり、このとき男性特異的（右手側）ピークは検出できない。図４Ｆでは、Ｙ特異的プライマーが５０倍過剰であり、このとき男性ピークは非常に大きい。大多数でなくても、多くの適用（すなわち検出方法）に対する最適なプライマー比率は、約１：１のピークサイズ比率が得られるものである。図４Ｃ−Ｄに例示されるとおり、１：５のプライマー比率は小さすぎ、１：１０のプライマー比率は大きすぎ、約１：７の比率であれば１：１の面積のピークが得られることが期待される（図示せず）。これらの特徴は図５にも例示される。ＳＮＰが検出および定量化される、これらのプライマーを用いるこの特定のアッセイに対して、高コピー数プライマーの低コピー数プライマーに対するプライマー比率１：１０を用いることによって、低コピー数種を含む核酸（血漿または血清における母体核酸中の胎児核酸など）が核酸の約１％から約１５％であるようなあらゆるその他のサンプルを分析できる。同様の考察およびステップを利用して、たとえばリアルタイムＰＣＲおよび蛍光に基づく検出系など、他の検出スキームにこのアッセイを適合させてもよい。最適な１：１のピーク比率が得られるこの１：１０のプライマー比率はアッセイによって変動する可能性があり、低コピー数核酸対高コピー数核酸のパーセンテージに基づいて変動し得る。こうした変動は、たとえば１：２から約１：２０であってもよい。

実施例２：低コピー数核酸の増幅
図６Ａ−図６Ｆに例示されるとおり、一旦最適なプライマー比率が分かると、このプライマーの比率を用いて、変動する割合の低コピー数核酸および高コピー数核酸が増幅される。高コピー数（女性）核酸の低コピー数（男性）核酸に対する割合は、たとえば図４Ａにおける１００：０から図４Ｆにおける５０：５０まで変動し得る。両ピークの合計に対する一方のピークの面積は、図７に示されるようにプロットできる。

実施例３：遺伝子型情報の決定
個体の遺伝子型を決定することが可能であり、特に当該技術の特定の適用において、胎児と母とのＲｈＤ適合性または不適合性を決定できる。こうした実施形態においては、母と胎児との間に４つの遺伝子型の組合せが可能であり、それが図９−図１２に例示される。母のみのサンプルを得て、その母体サンプルに対する３つの別個の反応を行ない、それらを母体プラス胎児サンプルに対して得られた３つの別個の反応と比較することによって、母および胎児の遺伝子型を決定できる。３つの別個の反応とは、高コピー数Ｃ対立遺伝子プライマー、高コピー数Ｔ対立遺伝子プライマー、ならびに同濃度のＣ対立遺伝子およびＴ対立遺伝子プライマーの反応である。両方のサンプル型に対して、これらの同じ３つの反応が行なわれる。

実施例４：遺伝子型情報の定量評価
染色体の異数性の判定など、当該技術の特定の適用に対しては、定量的判定が必要とされる。図７に示されるようなプロットを得て、低コピー数核酸の高コピー数核酸に対するパーセンテージが未知であるサンプルに対するスペクトログラムを得るとき、サンプル中に生じたピークの面積を比較することによってスペクトログラムが分析されてもよい。特定的には、Ｘ軸に示されるような（０から１の）比率が得られてから、対応するＹ軸上の高：低コピー数の比率を決定できる。たとえば面積の比率が０．６であれば、図７に示されるとおりＦ：Ｍ比率は９８：２である。異数性の結果を定めるためには、各々が異なる低コピー数：高コピー数の比率を与える少なくとも２つのＳＮＰアッセイを用いることが好ましい。このアプローチの一例は次のとおりである。母体バックグラウンドに対する胎児の遺伝子型（しばしば１％〜５％胎児対９９％〜９５％母体；図８Ａ−図８Ｂ）を決定する。母体の遺伝子型はホモ接合（野生型または突然変異／優性または劣性）であり、胎児の遺伝子型はヘテロ接合である。母は１つの対立遺伝子においてＣＣであり、胎児はＣＣＴであると仮定する。母および胎児の両方がホモ接合であれば、このアッセイは情報を与えない。この可能性は、たとえば５より多い、またはより好ましくは約１０より多い複数のＳＮＰアッセイを用いることによって、すべてのアッセイが情報を与えない可能性を非常に低くすることによって克服できる。したがってこの実施例においては、別のＳＮＰ遺伝子型が定められ、母はＣＣであり胎児はＣＴＴである。上記に示したとおりに算出された比率を用いて、各ＳＮＰに対する偏向対立遺伝子増幅反応が行なわれる。得られたスペクトログラムピークの比率を比較することによって、トリソミーの検出およびそのトリソミーがＣＣＴかＣＴＴかの決定の両方が可能である。

本明細書において参照した特許、特許出願、公開公報および文献の各々の全体がここに引用により援用される。上記の特許、特許出願、公開公報および文献の引用は、前述のいずれかが関係先行技術であることを承認するものでも、これらの公開公報または文献の内容または日付に関するいかなる承認を構成するものでもない。

本発明の基本的局面から逸脱することなく、上述に修正が加えられてもよい。１つまたはそれ以上の特定の実施形態を参照して本発明をかなり詳細に説明したが、この出願において特定的に開示される実施形態に変更が加えられてもよく、これらの修正および改善は本発明の範囲および意図のうちであることが通常の当業者に認識されるであろう。

本明細書に例示的に記載された本発明は、好適には本明細書に特定的に開示されないあらゆる構成要素（単数または複数）の不在下で実行されてもよい。たとえば、本明細書における各々の場合に、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はいずれも他方の２つの用語のいずれかに置換えられてもよい。用いられた用語および表現は説明の用語として用いられたものであって限定の用語ではなく、こうした用語および表現の使用は提示および記載された特徴のあらゆる同等物またはその部分を排除するものではなく、クレームされる本発明の範囲内でさまざまな修正が可能である。「ａ」または「ａｎ」という用語は、構成要素の１つまたは構成要素の２つ以上のいずれが記載されているのかが文脈上明らかでない限り、その用語が修飾する構成要素の１つまたは複数個を示すことができる（例、「デバイス（ａ ｄｅｖｉｃｅ）」は１つまたはそれ以上のデバイスを意味し得る）。本明細書において用いられる「約」という用語は、時にはその下にあるパラメータの１０％以内の値（すなわちプラスまたはマイナス１０％）を、時にはその下にあるパラメータの５％以内の値（すなわちプラスまたはマイナス５％）を、時にはその下にあるパラメータの２．５％以内の値（すなわちプラスまたはマイナス２．５％）を、時にはその下にあるパラメータの１％以内の値（すなわちプラスまたはマイナス１％）を、時には変動しないパラメータを示す。たとえば、「約１００グラム」という重量は、９０グラムから１１０グラムの重量を含み得る。よって、本発明は代表的な実施形態および任意の特徴によって特定的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正形および変更形が当業者によって用いられてもよく、こうした修正形および変更形は本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるべきである。

本発明の実施形態は、添付の請求項に示される。

Claims (31)

1. サンプル中の核酸を増幅するための方法であって、前記サンプルは少なくとも第１の核酸種および第２の核酸種を含有し、前記第１の種は前記第２の種よりも高コピー数であり、前記方法は、
   ａ）反応容器中で前記第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを前記第１の核酸種にアニーリングするステップを含み、第１のプライマーは第１の濃度を有し、前記方法はさらに
   ｂ）前記反応容器中で前記第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを前記第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、第２のプライマーは第２の濃度を有し、前記第２の増幅プライマーの前記第２の濃度は前記第１の増幅プライマーの前記第１の濃度よりも高く、この方法はさらに
   ｃ）前記反応容器中で、前記第１および第２の核酸種に共通となり得かつ前記第１および第２の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第１および第２の核酸種にアニーリングするステップと、
   ｄ）前記反応容器中で核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第２の核酸種の増幅産物の量が前記第１の核酸種の増幅産物の量に対して増加するステップと
   を含む、方法。
2. 前記第１の核酸種の前記増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２の核酸種の前記増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. ａ）前記第１の核酸種の前記増幅産物を検出するステップと、
   ｂ）前記第２の核酸種の前記増幅産物を検出するステップと、
   ｃ）前記第１の核酸種のアイデンティティを前記第２の核酸種のアイデンティティと比較するステップと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記検出は質量分析法によって行なわれる、請求項４に記載の方法。
6. ａ）前記第１の核酸種の前記増幅産物を定量化するステップと、
   ｂ）前記第２の核酸種の前記増幅産物を定量化するステップと、
   ｃ）前記第１の核酸種の前記増幅産物の量を前記第２の核酸種の前記増幅産物の量と比較するステップと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記定量化は質量分析法によって行なわれる、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の核酸種は母体由来であり、前記第２の核酸種は胎児由来である、請求項１に記載の方法。
9. 前記第１の核酸種は第１の核酸に基づくメチル化パターンを有し、前記第２の核酸種は第２の核酸に基づくメチル化パターンを有し、前記第１の核酸に基づくメチル化パターンは前記第２の核酸に基づくメチル化パターンとは異なる、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１および第２のプライマーはメチル化特異的増幅プライマーである、請求項９に記載の方法。
11. サンプル中の核酸を増幅するための方法であって、前記サンプルは少なくとも第１の核酸種および第２の核酸種を含有し、一方の種は他方の種よりも高コピー数であり、前記方法は
    ａ）第１の反応容器中で前記第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを前記第１の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第１のプライマーは第１の濃度を有し、前記方法はさらに
    ｂ）前記第１の反応容器中で前記第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを前記第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第２のプライマーは第２の濃度を有し、前記第２の増幅プライマーの前記第２の濃度は前記第１の増幅プライマーの前記第１の濃度よりも高く、前記方法はさらに
    ｃ）前記第１の反応容器中で、前記第１および第２の核酸種に共通となり得かつ前記第１および第２の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第１および第２の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第１の種の方が前記高コピー数であるときには前記第２の核酸種の増幅産物が前記第１の核酸種の増幅産物に対して増加するステップと、
    ｄ）第２の反応容器中で前記第１の増幅プライマーを前記第１の核酸種にアニーリングするステップとを含み、前記第１の増幅プライマーはステップｂの前記第２の濃度と同じ濃度で存在し、前記方法はさらに
    ｅ）前記第２の反応容器中で前記第２の増幅プライマーを前記第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第２の増幅プライマーはステップａの前記第１の濃度と同じ濃度で存在し、よって前記第１の増幅プライマーの濃度は前記第２の増幅プライマーの濃度よりも高く、前記方法はさらに
    ｆ）前記第２の反応容器中で、前記第１および第２の核酸種に共通となり得る別の増幅プライマーを前記第１および第２の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第２の種の方が前記高コピー数であるときには前記第１の核酸種の増幅産物が前記第２の核酸種の増幅産物に対して増加するステップを含む、方法。
12. 前記第１の核酸種の前記増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第２の核酸種の前記増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
14. ａ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種のアイデンティティを請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種のアイデンティティと比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
15. 前記検出は質量分析法によって行なわれる、請求項１４に記載の方法。
16. ａ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種のアイデンティティを請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種のアイデンティティと比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
17. 前記検出は質量分析法によって行なわれる、請求項１６に記載の方法。
18. ａ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｄ）請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種の増幅産物を検出するステップと、
    ｅ）請求項１１のステップａおよびｂの前記第１および第２の核酸種のアイデンティティを請求項１１のステップｄおよびｅの前記第１および第２の核酸種のアイデンティティと比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
19. ａ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種の前記増幅産物の量を請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種の前記増幅産物の量と比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
20. ａ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種の前記増幅産物の量を請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種の前記増幅産物の量と比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
21. ａ）請求項１１のステップａの前記第１の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｂ）請求項１１のステップｂの前記第２の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｃ）請求項１１のステップｄの前記第１の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｄ）請求項１１のステップｅの前記第２の核酸種の増幅産物を定量化するステップと、
    ｅ）請求項１１のステップａおよびｂの前記第１および第２の核酸種の前記増幅産物の量を請求項１１のステップｄおよびｅの前記第１および第２の核酸種の前記増幅産物の量と比較するステップと
    をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
22. 前記第１の核酸種は母体由来であり、前記第２の核酸種は胎児由来である、請求項１１に記載の方法。
23. 前記第１の核酸種は第１の核酸に基づくメチル化パターンを有し、前記第２の核酸種は第２の核酸に基づくメチル化パターンを有し、前記第１の核酸に基づくメチル化パターンは前記第２の核酸に基づくメチル化パターンとは異なる、請求項１１に記載の方法。
24. 前記第１および第２のプライマーはメチル化特異的な増幅プライマーである、請求項２３に記載の方法。
25. 非標的核酸をも含有するサンプル中に存在する標的核酸のアイデンティティを検出するための方法であって、前記標的核酸および非標的核酸は大きい方のコピー数および小さい方のコピー数を有し、前記方法は、
    ａ）核酸のサンプルと、前記標的核酸に実質的に特異的な標的増幅プライマーと、前記非標的核酸に実質的に特異的な非標的増幅プライマーと、標的核酸および非標的核酸の両方に実質的に特異的な第３の増幅プライマーとを含む第１の反応混合物を調製するステップを含み、前記標的増幅プライマーは前記非標的増幅プライマーに対して低濃度であり、前記方法はさらに
    ｂ）核酸のサンプルと、前記標的核酸に実質的に特異的な標的増幅プライマーと、前記非標的核酸に実質的に特異的な非標的増幅プライマーと、標的核酸および非標的核酸の両方に実質的に特異的な第３の増幅プライマーとを含む第２の反応混合物を調製するステップを含み、前記標的増幅プライマーは前記非標的増幅プライマーに対して高濃度であり、前記方法はさらに
    ｃ）前記第１および第２の反応混合物を増幅して第１の組の増幅産物と第２の組の増幅産物とを得るステップを含み、前記第１の組の増幅産物は前記第２の組の増幅産物と区別可能である、方法。
26. 前記第１の組の増幅産物を前記第２の組の増幅産物と比較し、これによって、前記小さい方のコピー数が前記標的核酸または非標的核酸のいずれかに割当てられ得るステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第１の組の増幅産物を前記第２の組の増幅産物と比較し、これによって、前記標的核酸の遺伝子型が決定されるステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
28. 前記サンプルは少なくとも第３の核酸種および第４の核酸種を含有し、前記第３の種は前記第４の種よりも高コピー数であり、前記方法はさらに
    ｅ）ステップａ）−ｄ）と同じ反応容器中で前記第３の核酸種に実質的に特異的な第３の核酸種増幅プライマーを前記第３の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第３のプライマーは第３の濃度を有し、前記方法はさらに
    ｆ）ステップａ）−ｄ）と同じ反応容器中で前記第４の核酸種に実質的に特異的な第４の増幅プライマーを前記第４の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第４のプライマーは第４の濃度を有し、前記第４の増幅プライマーの前記第４の濃度は前記第３の増幅プライマーの前記第３の濃度よりも高く、前記方法はさらに
    ｇ）ステップａ）−ｄ）と同じ反応容器中で、前記第３および第４の核酸種の各々に共通となり得かつ前記第３および第４の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第３および第４の核酸種にアニーリングするステップと、
    ｄ）ステップａ）−ｄ）と同じ反応容器中で核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第３の核酸種の増幅産物の量が前記第４の核酸種の増幅産物の量に対して増加するステップと
    を含む、請求項１に記載の方法。
29. 前記サンプルは少なくとも第３の核酸種および第４の核酸種を含有し、前記第３の種は前記第４の種よりも高コピー数であり、前記方法はさらに
    ｇ）ステップａ）−ｃ）と同じ第１の反応容器中で前記第３の核酸種に実質的に特異的な第３の核酸種増幅プライマーを前記第３の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第３のプライマーは第３の濃度を有し、前記方法はさらに
    ｈ）ステップａ）−ｃ）と同じ第１の反応容器中で前記第４の核酸種に実質的に特異的な第４の増幅プライマーを前記第４の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第４のプライマーは第４の濃度を有し、前記第４の増幅プライマーの前記第４の濃度は前記第３の増幅プライマーの前記第３の濃度よりも高く、前記方法はさらに
    ｉ）ステップａ）−ｃ）と同じ第１の反応容器中で、前記第３および第４の核酸種の各々に共通となり得かつ前記第３および第４の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第３および第４の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第３の種の方が前記高コピー数であるときには前記第４の核酸種の増幅産物が前記第３の核酸種の増幅産物に対して増加するステップと、
    ｊ）ステップｄ）−ｆ）と同じ第２の反応容器中で前記第３の増幅プライマーを前記第３の核酸種にアニーリングするステップとを含み、前記第３の増幅プライマーはステップｈの前記第４の濃度と同じ濃度で存在し、前記方法はさらに
    ｋ）ステップｄ）−ｆ）と同じ第２の反応容器中で前記第４の増幅プライマーを前記第４の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第４の増幅プライマーはステップｇの前記第３の濃度と同じ濃度で存在し、よって前記第３の増幅プライマーの濃度は前記第４の増幅プライマーの濃度よりも高く、前記方法はさらに
    ｌ）ステップｄ）−ｆ）と同じ第２の反応容器中で前記第３および第４の核酸種に共通となり得る別の増幅プライマーを前記第３および第４の核酸種にアニーリングし、核酸増幅反応を行ない、これによって、前記第４の種の方が前記高コピー数であるときには前記第３の核酸種の増幅産物が前記第４の核酸種の増幅産物に対して増加するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
30. ｅ）第２の反応容器中で前記第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを前記第１の核酸種にアニーリングするステップをさらに含み、第１のプライマーは第１の濃度を有し、前記方法はさらに
    ｆ）前記第２の反応容器中で前記第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを前記第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第２のプライマーは第２の濃度を有し、前記第２の増幅プライマーの前記第２の濃度は前記第１の増幅プライマーの前記第１の濃度と等しく、前記方法はさらに
    ｇ）前記第２の反応容器中で、前記第１および第２の核酸種に共通となり得かつ前記第１および第２の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第１および第２の核酸種にアニーリングするステップを含む、請求項１に記載の方法。
31. ｇ）第３の反応容器中で前記第１の核酸種に実質的に特異的な第１の増幅プライマーを前記第１の核酸種にアニーリングするステップをさらに含み、前記第１のプライマーは第１の濃度を有し、前記方法はさらに
    ｈ）前記第３の反応容器中で前記第２の核酸種に実質的に特異的な第２の増幅プライマーを前記第２の核酸種にアニーリングするステップを含み、前記第２のプライマーは第２の濃度を有し、前記第２の増幅プライマーの前記第２の濃度は前記第１の増幅プライマーの前記第１の濃度と等しく、前記方法はさらに
    ｉ）前記第３の反応容器中で、前記第１および第２の核酸種に共通となり得かつ前記第１および第２の核酸種に実質的に特異的である別の増幅プライマーを前記第１および第２の核酸種にアニーリングするステップを含む、請求項１１に記載の方法。

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