JP6431769B2 - 実験条件を要因として含める診断プロセス - Google Patents
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Description
この特許出願は、2012年1月20日に出願された表題「DIAGNOSTIC PROCESSES THAT FACTOR EXPERIMENTAL CONDITIONS」、発明者Cosmin Deciuの米国仮特許出願第61/589,202号(代理人管理番号SEQ−6040−PVと指定)の利益を主張し、2012年10月5日に出願された表題「METHODS AND PROCESSES FOR NON−INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS」、発明者Cosmin Deciu、Zeljko Dzakula、Mathias EhrichおよびSung Kimの米国PCT出願第PCT/US2012/059123号(代理人管理番号SEQ−6034−PCと指定)の利益を主張し、2012年10月4日に出願された表題「METHODS AND PROCESSES FOR NON−INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS」、発明者Cosmin Deciu、Zeljko Dzakula、Mathias EhrichおよびSung Kimの米国仮特許出願第61/709,899号(代理人管理番号SEQ−6034−PV3と指定)の利益を主張し、そして2012年6月22日に出願された表題「METHODS AND PROCESSES FOR NON−INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS」、発明者Zeljko DzakulaおよびMathias Ehrichの米国仮特許出願第61/663,477号(代理人管理番号SEQ−6034−PV2と指定)の利益を主張する。
当該技術は、一部において、遺伝的変異を非侵襲的に評価するための方法、プロセスおよび装置に関する。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目2)
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)上記試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(g)上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目3)
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目4)
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(c)上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を検出するステップと
を含む、方法。
(項目5)
上記試料核酸が上記妊婦由来の血漿由来のものである、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
上記試料核酸が上記妊婦由来の血清由来のものである、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
上記胎児の異数性が13トリソミーである、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
上記胎児の異数性が18トリソミーである、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
上記胎児の異数性が21トリソミーである、項目1から3.1のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの間である、項目10に記載の方法。
(項目12)
上記ポリヌクレオチドの長さが約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの間である、項目11に記載の方法。
(項目13)
上記予測カウントがカウント中央値である、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均(trimmed or truncated mean)、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
上記カウントを、GC含量、ビン様式での正規化、GC LOESS、PERUN、GCRM、またはそれらの組合せによって正規化する、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目1から16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目1から17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目18に記載の方法。
(項目20)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目1から19のいずれか一項に記載の方法。(項目21)
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目20または21に記載の方法。
(項目23)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目20から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目1から23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
上記正規化されたカウントがzスコアである、項目1から24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
上記正規化されたカウントがロバストなzスコアである、項目1から25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
上記第1のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第1のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目1から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目13から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
上記パーセント表示が染色体表示である、項目24から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目31)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)上記試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(g)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目32)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目33)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目34)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目30から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目30から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
上記医学的状態ががんである、項目36に記載の方法。
(項目38)
上記医学的状態が異数性である、項目36に記載の方法。
(項目39)
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目30から35のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの間である、項目41に記載の方法。
(項目43)
上記ポリヌクレオチドの長さが約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの間である、項目42に記載の方法。
(項目44)
上記予測カウントがカウント中央値である、項目30から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目30から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
上記カウントを、GC含量、ビン様式での正規化、GC LOESS、PERUN、GCRM、またはそれらの組合せによって正規化する、項目30から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目30から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目30から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目30から48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目49に記載の方法。
(項目51)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目30から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目50または51に記載の方法。
(項目53)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目51または52に記載の方法。
(項目54)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目51から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目30から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
上記正規化されたカウントがzスコアである、項目30から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
上記正規化されたカウントがロバストなzスコアである、項目30から56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
上記第1のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第1のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目30から57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目44から58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
上記パーセント表示が染色体表示である、項目55から59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)(c)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(e)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(d)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(g)(f)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目62)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)上記試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目63)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)(b)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(c)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(f)(e)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目64)
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)(a)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と上記参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(e)(d)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目65)
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、1つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目61から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
上記遺伝的変異が微小欠失である、項目61から65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
上記微小欠失が第22染色体上にある、項目66に記載の方法。
(項目68)
上記微小欠失が第22染色体の領域22q11.2において起こっている、項目67に記載の方法。
(項目69)
上記微小欠失が、参照ゲノムhg19による第22染色体のヌクレオチド19,000,000位と22,000,000位の間で起こっている、項目67に記載の方法。
(項目70)
上記正規化されたカウントの誘導値がZスコアである、項目61から69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
上記ZスコアがロバストなZスコアである、項目70に記載の方法。
(項目72)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目61から71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目61から71のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目61から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
上記医学的状態ががんである、項目74に記載の方法。
(項目76)
上記医学的状態が異数性である、項目74に記載の方法。
(項目77)
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目61から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目77に記載の方法。
(項目79)
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目61から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの間である、項目79に記載の方法。
(項目81)
上記ポリヌクレオチドの長さが約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの間である、項目80に記載の方法。
(項目82)
上記予測カウントがカウント中央値である、項目61から81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目61から81のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
上記カウントを、GC含量、ビン様式での正規化、GC LOESS、PERUN、GCRM、またはそれらの組合せによって正規化する、項目61から83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目61から84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目61から85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目61から86のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目87に記載の方法。
(項目89)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目61から88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目88または89に記載の方法。
(項目91)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目89または90に記載の方法。
(項目92)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目89から91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目61から92のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
上記正規化されたカウントがzスコアである、項目61から93のいずれか一項に記載の方法。
(項目95)
上記正規化されたカウントがロバストなzスコアである、項目61から94のいずれか一項に記載の方法。
(項目96)
上記第1のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第1のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目61から95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目82から96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
上記パーセント表示が染色体表示である、項目93から97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)(c)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(e)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(d)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(g)(f)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目100)
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)上記試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目101)
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)(b)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(c)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(f)(e)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目102)
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)(a)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(e)(d)における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目103)
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、1つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目99から102のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
上記微小欠失が第22染色体上にある、項目103に記載の方法。
(項目105)
上記微小欠失が第22染色体の領域22q11.2において起こっている、項目104に記載の方法。
(項目106)
上記微小欠失が、参照ゲノムhg19による第22染色体のヌクレオチド19,000,000位と22,000,000位の間で起こっている、項目104に記載の方法。
(項目107)
上記正規化されたカウントの誘導値がZスコアである、項目99から106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
上記ZスコアがロバストなZスコアである、項目107に記載の方法。
(項目109)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目99から108のいずれか一項に記載の方法。
(項目110)
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目99から108のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目99から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
上記医学的状態ががんである、項目111に記載の方法。
(項目113)
上記医学的状態が異数性である、項目111に記載の方法。
(項目114)
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目99から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目115)
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目114に記載の方法。
(項目116)
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目99から110のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの間である、項目116に記載の方法。
(項目118)
上記ポリヌクレオチドの長さが約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドの間である、項目117に記載の方法。
(項目119)
上記予測カウントがカウント中央値である、項目99から118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目99から118のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
上記カウントを、GC含量、ビン様式での正規化、GC LOESS、PERUN、GCRM、またはそれらの組合せによって正規化する、項目99から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目99から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目99から122のいずれか一項に記載の方法。
(項目124)
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目99から123のいずれか一項に記載の方法。
(項目125)
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目124に記載の方法。
(項目126)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目99から125のいずれか一項に記載の方法。
(項目127)
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目125または126に記載の方法。
(項目128)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目126または127に記載の方法。
(項目129)
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目126から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目99から129のいずれか一項に記載の方法。
(項目131)
上記正規化されたカウントがzスコアである、項目99から130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
上記正規化されたカウントがロバストなzスコアである、項目99から131のいずれか一項に記載の方法。
(項目133)
上記第1のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第1のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目99から132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目119から133のいずれか一項に記載の方法。
(項目135)
上記パーセント表示が染色体表示である、項目130から134のいずれか一項に記載の方法。
(項目136)
上記正規化された試料カウントが、上記カウントの上記誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化することを含むプロセスによって得られ、上記誘導値が上記第1のゲノムセクションについてのカウントを上記第1のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについてのカウントで割ることによって決定される第1のゲノムセクションカウント表示である、項目1から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目137)
上記第1のゲノムセクションについての上記カウントの上記誘導値を上記予測カウントの誘導値に従って正規化し、上記予測カウントの上記誘導値が、上記第1のゲノムセクションについての予測カウントを上記第1のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについての予測カウントで割ることによって決定される予測された第1のゲノムセクションカウント表示である、項目136に記載の方法。
(項目138)
上記第1のゲノムセクションが染色体または染色体の部分であり、上記複数のゲノムセクションが常染色体を含む、項目1から137のいずれか一項に記載の方法。
(項目139)
上記染色体が第21染色体、第18染色体または第13染色体である、項目138に記載の方法。
(項目140)
上記正規化された試料カウントが、上記第1のゲノムセクションについてのカウントから上記予測カウントを引き算し、それにより減算値を生成し、上記減算値を上記カウントの変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、項目1から120、項目138および項目135のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
上記予測カウントの変動性の上記推定値が上記カウントの中央絶対偏差(MAD)である、項目140に記載の方法。
(項目142)
上記カウントの変動性の上記推定値が、RousseeuwおよびCrouxによって導入されるMADの代替値、またはブートストラップ推定値である、項目140に記載の方法。
(項目143)
上記変動性の上記推定値が、1つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目140から142のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
上記変動性の上記推定値が、1つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、項目140から142のいずれか一項に記載の方法。(項目145)
上記変動性の上記推定値および上記予測カウントが、1つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目140から144のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
上記正規化された試料カウントが、上記第1のゲノムセクションカウント表示から上記予測された第1のゲノムセクションカウント表示を引き算し、それにより減算値を生成し、上記減算値を上記第1のゲノムセクションカウント表示の変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、項目1から139のいずれか一項に記載の方法。
(項目147)
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が上記カウント表示の中央絶対偏差(MAD)である、項目146に記載の方法。
(項目148)
上記カウント表示の変動性の上記推定値が、RousseeuwおよびCrousによって導入されるMADの代替値またはブートストラップ推定値である、項目146に記載の方法。
(項目149)
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が、1つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目146から148のいずれか一項に記載の方法。
(項目150)
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が、1つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、項目146から148のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値および上記予測された第1のゲノムセクションカウント表示が、1つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目146から150のいずれか一項に記載の方法。
(項目152)
上記1つまたは複数の共通の実験条件がフローセルを含む、項目1から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目153)
上記1つまたは複数の共通の実験条件がフローセル内のチャネルを含む、項目1から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目154)
上記1つまたは複数の共通の実験条件が試薬プレートを含む、項目1から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目155)
上記試薬プレートを使用して配列決定のために核酸を段階分けする、項目154に記載の方法。
(項目156)
上記試薬プレートを使用して配列決定のために核酸ライブラリーを調製する、項目154に記載の方法。
(項目157)
上記1つまたは複数の共通の実験条件が同定タグ指標を含む、項目1から151のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
上記正規化された試料カウントを、上記ヌクレオチド配列読み取りまたは上記試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正する、項目1から157のいずれか一項に記載の方法。
(項目159)
上記カウントまたは上記正規化された試料カウントを局所重み付け多項式回帰に供するステップを含む、項目158に記載の方法。
(項目160)
上記局所重み付け多項式回帰がLOESS回帰である、項目159に記載の方法。
(項目161)
上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、項目1から159のいずれか一項に記載の方法。
(項目162)
上記カウントまたは上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、項目161に記載の方法。
(項目163)
上記正規化された試料カウントを得る前に上記カウントをフィルタリングするステップを含む、項目1から162のいずれか一項に記載の方法。
(項目164)
上記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目1から163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
上記試料核酸が二本鎖核酸を含む、項目1から163のいずれか一項に記載の方法。
(項目166)
上記ヌクレオチド配列読み取りを得るステップが、上記試料核酸を、配列決定デバイスを使用した配列決定プロセスに供することを含む、項目1から165のいずれか一項に記載の方法。
(項目167)
アウトカムをもたらすステップが、上記試料核酸中の胎児核酸の分率をファクタリングすることを含む、項目1から166のいずれか一項に記載の方法。
(項目168)
上記試料核酸中の胎児核酸の分率を決定するステップを含む、項目1から167のいずれか一項に記載の方法。
(項目169)
上記正規化された試料カウントを、上記ヌクレオチド配列読み取りまたは上記試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正せずに得る、項目1から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目170)
上記正規化された試料カウントを1つの実験条件について得る、項目1から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目171)
上記実験条件がフローセルである、項目170に記載の方法。
(項目172)
上記正規化された試料カウントを2つの実験条件について得る、項目1から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目173)
上記実験条件がフローセルおよび試薬プレートである、項目172に記載の方法。
(項目174)
上記実験条件がフローセルおよび同定タグ指標である、項目172に記載の方法。
(項目175)
上記正規化された試料カウントを3つの実験条件について得る、項目1から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目176)
上記実験条件がフローセル、試薬プレートおよび同定タグ指標である、項目175に記載の方法。
(項目177)
上記正規化された試料カウントを、(i)グアニンおよびシトシンの含量に従って補正し、(i)の後に、(ii)実験条件に従って補正した後に得る項目1から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目178)
上記正規化された試料カウントを、(i)の前に上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正した後に得る、項目177に記載の方法。
(項目179)
(ii)が、フローセルに従って補正することからなる、項目177または175に記載の方法。
(項目180)
(ii)が、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目177または175に記載の方法。
(項目181)
(ii)が、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目177または175に記載の方法。
(項目182)
(ii)が、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目177または175に記載の方法。
(項目183)
上記正規化された試料カウントを、フローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目169に記載の方法。
(項目184)
上記正規化された試料カウントを、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目169に記載の方法。
(項目185)
上記正規化された試料カウントを、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目169に記載の方法。
(項目186)
上記正規化された試料カウントを、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目169に記載の方法。
(項目187)
上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正し、その後に上記実験条件に従って補正した後に得る、項目180から186のいずれか一項に記載の方法。
(項目188)
上記正規化された試料カウントがZスコアである、項目136から186のいずれか一項に記載の方法。
(項目189)
(i)が、
(a)各試料について(i)上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと(ii)上記部分のそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした関係から、複数の試料について上記参照ゲノムの部分のそれぞれについてのグアニンおよびシトシン(GC)の偏りを決定することと、
(b)(i)上記GCの偏りと(ii)上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係から上記参照ゲノムの部分のそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度をもたらし、それにより、上記算出されたゲノミックセクションの高度において、上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントの偏りが減少することと
を含む、項目177から188のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
上記参照ゲノムの部分が染色体内にある、項目189に記載の方法。
(項目191)
上記参照ゲノムの部分が染色体の部分内にある、項目189に記載の方法。
(項目192)
上記染色体が第21染色体である、項目189から191のいずれか一項に記載の方法。
(項目193)
上記染色体が第18染色体である、項目189から191のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
上記染色体が第13染色体である、項目189から191のいずれか一項に記載の方法。
(項目195)
(b)の前に、上記参照ゲノムの部分のいくつかまたは全部にマッピングされた配列読み取りのカウントについて誤差の尺度を算出し、上記参照ゲノムの特定の部分についての配列読み取りのカウントを上記誤差の尺度の閾値に従って除去または重み付けすることを含む、項目189から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目196)
上記閾値を、第1のゲノミックセクションの高度と第2のゲノミックセクションの高度との間の標準偏差ギャップ3.5以上に応じて選択する、項目195に記載の方法。
(項目197)
上記誤差の尺度がR因子である、項目195または196に記載の方法。
(項目198)
R因子が約7%〜約10%である上記参照ゲノムの部分についての配列読み取りのカウントを(b)の前に除去する、項目197に記載の方法。
(項目199)
(b)の上記フィッティングした関係がフィッティングした線形関係である、項目189から198のいずれか一項に記載の方法。
(項目200)
上記関係の傾きを線形回帰によって決定する、項目199に記載の方法。
(項目201)
各GCの偏りがGCの偏り係数であり、上記GCの偏り係数が(i)上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと(ii)上記部分のそれぞれについてのGC含量との間の線形関係の傾きである、項目199または200に記載の方法。
(項目202)
(b)の上記フィッティングした関係がフィッティングした非線形関係である、項目189から198のいずれか一項に記載の方法。
(項目203)
各GCの偏りが、GC曲率推定値を含む、項目202に記載の方法。
(項目204)
(c)の上記フィッティングした関係が線形である、項目189から203のいずれか一項に記載の方法。
(項目205)
上記関係の傾きを線形回帰によって決定する、項目204に記載の方法。
(項目206)
(b)の上記フィッティングした関係が線形であり、(c)の上記フィッティングした関係が線形であり、ゲノミックセクションの高度Liが、上記参照ゲノムの部分のそれぞれについて、方程式α:
Li=(mi−GiS)I−1 方程式α
に従って決定され、式中、GiはGCの偏りであり、Iは(c)の上記フィッティングした関係の切片であり、Sは(c)の上記関係の傾きであり、miは測定された、上記参照ゲノムの各部分にマッピングされたカウントであり、そしてiは試料である、項目189から205のいずれか一項に記載の方法。
(項目207)
上記参照ゲノムの部分の数が約40,000以上の部分である、項目189から206のいずれか一項に記載の方法。
(項目208)
上記参照ゲノムの各部分が所定の長さのヌクレオチド配列を含む、項目189から207のいずれか一項に記載の方法。
(項目209)
上記所定の長さが約50キロベースである、項目208に記載の方法。
(項目210)
(b)の上記GCの偏りをGCの偏りモジュールによって決定する、項目189から209のいずれか一項に記載の方法。
(項目211)
コンピュータ可読プログラムコードが組み込まれたコンピュータで使用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、上記コンピュータ可読プログラムコードが、配列受信モジュール、論理処理モジュール、およびデータディスプレイ編成モジュールを含む別個のソフトウェアモジュールを含み、かつ、試料核酸における遺伝的変異の有無を同定するための方法であって、
(a)上記配列受信モジュールによって、試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)上記論理処理モジュールによって、上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)上記論理処理モジュールによって、各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)上記論理処理モジュールによって、1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)上記論理処理モジュールによって、上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムを生成するステップと、
(f)上記データディスプレイ編成モジュールによって、上記論理処理モジュールによって決定されるのに応じて上記試料核酸における上記遺伝的変異の有無を示すデータディスプレイを編成するステップと
を含む方法の実行が遂行されるように適合されている、コンピュータプログラム製品。
(項目212)
項目F1のコンピュータプログラム製品が記憶されているメモリを含む装置。
(項目213)
項目F1に記載のコンピュータプログラム製品の1つまたは複数の機能を実行するプロセッサを含む、項目F2に記載の装置。
(項目214)
核酸配列決定装置および処理装置を含むシステムであって、上記配列決定装置によって試料核酸からヌクレオチド配列読み取りが得られ、上記処理装置によって上記配列決定装置からのヌクレオチド配列読み取りが得られ、かつ
(a)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)上記正規化された試料カウントに基づいて上記試料核酸における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む方法が実施される、システム。
(項目215)
ヒト参照ゲノムhg19による第22染色体のヌクレオチド19,000,000位と22,000,000位の間の22q11.2微小欠失の有無を同定する方法であって、
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)上記試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)第22染色体のヌクレオチド19,000,000位と22,000,000位の間に対応する1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(項目216)
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、1つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目F1からF3のいずれか一項に記載の方法。
(項目217)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(b)上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている、システム。
(項目218)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリは、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(b)上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている、装置。
(項目219)
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、1つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
(a)参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(c)上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
(項目220)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(b)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、システム。
(項目221)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリは、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(b)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、装置。
(項目222)
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、1つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
(a)参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
(c)上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
(項目223)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(a)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
(d)(c)における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、システム。
(項目224)
1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリが、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムの部分にマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントを含み、上記1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
(a)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(a)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
(d)(c)における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、装置。
(項目225)
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、1つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
(a)参照ゲノムの部分にマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
(e)(d)における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
遺伝分散の有無は、本明細書に記載の方法または装置を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および装置によってもたらされるアウトカムに応じて1つまたは複数の遺伝的変異の有無を決定する。遺伝的変異は、一般には、特定の個体に存在する特定の遺伝的表現型であり、多くの場合、遺伝的変異は、個体の統計的に有意な亜集団に存在する。遺伝的変異の非限定的な例としては、1つまたは複数の欠失(例えば、微小欠失)、重複(例えば、微小重複(micro−duplication))、挿入、突然変異、多型(例えば、一塩基多型)、融合、反復(例えば、短いタンデム反復)、別個のメチル化部位、別個のメチル化パターンなど、およびそれらの組合せが挙げられる。挿入、反復、欠失、重複、突然変異または多型は、任意の観察される長さであってよく、いくつかの実施形態では、約1塩基または塩基対(bp)〜1,000キロベース(kb)の長さ(例えば、約10bp、50bp、100bp、500bp、1kb、5kb、10kb、50kb、100kb、500kb、または1000kbの長さ)である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、下でさらに詳細に記載されている染色体異常(例えば異数性)、部分的な染色体異常またはモザイク現象である。
いくつかの実施形態では、胎児の性別の予測を、本明細書に記載の方法または装置によって決定することができる。性別の決定は、一般には、性染色体に基づく。ヒトでは、X染色体およびY染色体の2種の性染色体が存在する。XXの個体は女性であり、XYは男性であり、また、非限定的なバリエーションンとしてXO、XYY、XXXおよびXXYが挙げられる。
いくつかの実施形態では、胎児の染色体異常の有無は、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定することができる。染色体異常としては、限定することなく、染色体全体または1つまたは複数の遺伝子を含む染色体の領域の増減が挙げられる。染色体異常としては、モノソミー、トリソミー、ポリソミー、異型接合性の欠如、不均衡転座によって引き起こされる欠失および重複を含めた1つまたは複数のヌクレオチド配列(例えば、1つまたは複数の遺伝子)の欠失および/または重複が挙げられる。「異数性(aneuploidy)」および「異数性の(aneuploid)」という用語は、本明細書で使用される場合、生物体の細胞内の染色体の数が異常であることを指す。異なる生物体が有する染色体組は広範に変動するので、「異数性」という用語は、染色体の特定の数を指すのではなく、生物体内の所与の1つまたは複数の細胞の染色体含量の状況が異常である状況を指す。
いくつかの実施形態では、子癇前症の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定する。子癇前症は、妊娠中に高血圧症が生じ(すなわち妊娠誘導性高血圧症)、尿中に著しい量のタンパク質を伴う状態である。いくつかの場合には、子癇前症は、細胞外核酸のレベルの上昇および/またはメチル化パターンの変更にも関連する。例えば、細胞外胎児由来高メチル化RASSF1Aレベルと子癇前症の重症度との間の正の相関が観察された。ある特定の例では、子癇前症の胎盤において、正常対照と比較して、H19遺伝子についてDNAのメチル化の増加が観察される。
いくつかの実施形態では、病原となる状態の有無を本明細書に記載の方法または装置によって決定する。病原となる状態は、宿主が、これだけに限定されないが、細菌、ウイルスまたは真菌を含めた病原体に感染することよって引き起こされる可能性がある。病原体は、一般には、宿主核酸と区別可能であり得る核酸(例えば、ゲノムDNA、ゲノムRNA、mRNA)を保有するので、本明細書において提供される方法および装置を使用して、病原体の有無を決定することができる。多くの場合、病原体は、例えば、後成的な状態および/または1つまたは複数の配列の変動、重複および/または欠失などの特定の病原体に独特の特性を持つ核酸を保有する。したがって、本明細書において提供される方法を使用して、特定の病原体または病原体の変異体(例えば株)を同定することができる。
いくつかの実施形態では、細胞増殖障害(例えば、がん)の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定する。例えば、血清中の無細胞核酸のレベルが、種々の種類のがんの患者において健康な患者と比較して上昇する可能性がある。転移性疾患の患者では、例えば、時には、血清DNAレベルが非転移性患者のおよそ2倍であり得る。転移性疾患の患者は、例えば、がん特異的マーカーおよび/またはある特定の一塩基多型または短いタンデム反復によって同定することもできる。循環しているDNAのレベルの上昇と正に相関する可能性があるがんの種類の非限定的な例としては、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肝細胞がん、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、膀胱がん、ヘパトーマ、子宮頸がん、食道がん、膵がん、および前立腺がんが挙げられる。種々のがんは、例えば、後成的な状態および/または配列の変動、重複および/または欠失などの、非がん性の健康な細胞由来の核酸と区別可能な特性を持つ核酸を保有する可能性があり、時にはそれらを血流中に放出する可能性がある。そのような特性は、例えば、特定のがんの種類に特異的であり得る。したがって、さらに、本明細書において提供される方法を使用して、特定のがんの種類を同定することができることが意図されている。
いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、遺伝的変異は、コピー数多型(CNV)、微小欠失、重複、または影響を受けていない個体において観察された予測遺伝子の量からの遺伝子の量の変動を引き起こすまたはもたらす任意の状態から選択される1つまたは複数の状態である。いくつかの実施形態では、コピー数多型とは、1つまたは複数のゲノミックセクション、染色体、または染色体の一部の構造的再編成を指し、この再編成は、多くの場合、欠失、重複、逆位、および/または転座によって引き起こされる。CNVは、遺伝性のものまたは新規の突然変異によって引き起こされるものであり得、一般には、1つまたは複数のゲノミックセクションのコピーの数が異常になる(例えば、影響を受けていない試料に対して遺伝子量が異常になる)。いくつかの実施形態では、コピー数多型は1キロベースの小ささから数メガベースまでにわたる領域において起こり得る。CNVは、種々の細胞遺伝学的方法(FISH、CGH、aCGH、核型分析)および/または配列決定方法を使用して検出することができる。
試料
本明細書に記載の方法および装置において利用する核酸は、多くの場合、被験体から得た試料から単離される。いくつかの実施形態では、被験体は試験被験体と称され、ある特定の実施形態では、被験体は試料被験体または参照被験体と称される。いくつかの実施形態では、試験被験体とは、遺伝的変異の有無について評価される被験体を指す。試料被験体、または参照被験体は、多くの場合、試験被験体と比較するための基礎とし利用される被験体であり、参照被験体は、時には、参照被験体が、試験被験体について評価している遺伝的変異を有さない、またはそれを有することが分かっているという知見に基づいて選択される。被験体は、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌または原生生物を含めた任意の生きている生物体または生きていない生物体であってよい。これだけに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物(例えば、ウシ)、ウマ科の動物(例えば、ウマ)、ヤギ亜科およびヒツジ属の動物(例えば、ヒツジ、ヤギ)、イノシシ科の動物(例えば、ブタ)、ラクダ科の動物(例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ)、サル、類人猿(例えば、ゴリラ、チンパンジー)、クマ科の動物(例えば、クマ)、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含めた任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができる。被験体は雄であっても雌(例えば女性)であってもよい。
核酸は、1つまたは複数の供給源(例えば、細胞、土壌など)から当技術分野で公知の方法によって得ることができる。細胞溶解手順および試薬は当技術分野で公知であり、一般に、化学的溶解方法、物理的溶解方法、または電解による溶解方法によって実施され得る。例えば、化学的方法では、一般に、溶解剤を使用して細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、その後、カオトロピック塩で処理する。凍結/解凍し、その後に粉砕すること、細胞圧搾の使用などの物理的方法も有用である。高塩濃度溶解手順も一般に使用される。例えば、アルカリ性溶解手順を利用することができる。後者の手順では伝統的にフェノール−クロロホルム溶液の使用が組み込まれ、3つの溶液を伴う、フェノール−クロロホルムを含まない代替的な手順を利用することができる。後者の手順では、1つの溶液は15mMのトリス、pH8.0;10mMのEDTAおよび100μg/mlのRNA分解酵素Aを含有してよく、第2の溶液は0.2NのNaOHおよび1%のSDSを含有してよく、第3の溶液は3MのKOAc、pH5.5を含有してよい。これらの手順は、その全体が本明細書に組み込まれるCurrent Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.、6.3.1〜6.3.6(1989年)において見ることができる。
配列決定、マッピングおよび関連する分析方法は当技術分野で公知である(例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第2009/0029377号)。そのようなプロセスのある特定の態様は下に記載されている。
マッピングヌクレオチド配列読み取り(すなわち、物理的なゲノムの位置が未知の断片からの配列情報)をいくつもの方法で実施することができ、これは多くの場合、得られた配列読み取りを参照ゲノム内のマッチする配列とアラインメントすることを含む(例えば、Liら、「Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality score」、Genome Res.、2008年8月19日)。そのようなアラインメントでは、一般に、配列読み取りを参照配列に対してアラインメントし、アラインメントした配列読み取りは「マッピングされた」または「配列タグ」と称される。いくつかの場合には、マッピングされた配列読み取りは、「ヒット」と称される。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りを種々のパラメータに応じて一緒に群分けし、下でさらに詳細に考察されている特定のゲノムセクションに割り当てる。
いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取り(すなわち配列タグ)を種々のパラメータに応じて一緒に群分けし、特定のゲノムセクションに割り当てる。多くの場合、個々のマッピングされた配列読み取りを使用して、試料中に存在するゲノムセクションの量を同定することができる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションの量は、試料中のより大きな配列(例えば染色体)の量を示す可能性がある。「ゲノムセクション」という用語は、「配列ウィンドウ」、「セクション」、「ビン」、「遺伝子座」、「領域」、「区分」または「セグメント」と互換的に使用することもできる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、染色体全体、染色体の部分、多数の染色体の部分、多数の染色体、多数の染色体由来の部分、および/またはそれらの組合せである。いくつかの場合には、ゲノムセクションは、例えば、配列の長さまたは特定の1つまたは複数の特徴を含む1つまたは複数のパラメータに基づいて線引きされる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、ゲノム配列の特定の長さに基づく。いくつかの実施形態では、方法は、複数のゲノムセクションにマッピングされた多数の配列読み取りを分析することを含む。ゲノムセクションはほぼ同じ長さであってもよく、ゲノムセクションは異なる長さであってもよい。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、約10キロベース(kb)〜約100kb、約20kb〜約80kb、約30kb〜約70kb、約40kb〜約60kb、および時には約50kbである。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは約10kb〜約20kbである。本明細書で考察されているゲノミックセクションは、連続したひと続きの配列に限定されない。したがって、ゲノムセクションは、連続した配列または連続していない配列で構成されていてよい。本明細書で考察されているゲノミックセクションは、単一の染色体に限定されず、いくつかの実施形態では、個々の染色体を超越し得る。いくつかの場合には、ゲノミックセクションは、1つの染色体全体、2つの染色体全体、またはより多くの染色体全体にわたってよい。さらに、ゲノミックセクションは、多数の染色体の接合部または分離部にわたってよい。
「配列タグ密度」とは、異なる試料を比較するため、およびその後の分析のために配列タグ密度を使用する定義済みのゲノムセクションについての配列タグまたは読み取りの値を指す。いくつかの実施形態では、配列タグの値は、正規化された配列タグの値である。配列タグ密度の値は、時には試料内で正規化し、時には試料の一群(例えば、フローレーンにおいて処理された試料、ライブラリー生成プレートにおいて調製された試料、段階分けプレートにおいて採取された試料など、およびそれらの組合せ)についての中央値に対して正規化する。
いくつかの遺伝的変異は医学的状態に関連付けられる。遺伝的変異は、多くの場合、遺伝的変異がない参照被験体に対して試験被験体のゲノムまたは遺伝情報の検出可能な変化をもたらす遺伝情報(例えば、染色体、染色体の部分、多型領域、転座した領域、変更されたヌクレオチド配列など、または前述のものの組合せ)の増加、減少および/または変更(例えば、重複、欠失、融合、挿入、突然変異、再編成、置換または異常なメチル化)を含む。遺伝的変異の有無は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の通り、ゲノミックセクション(例えば、ゲノムのビン)にマッピングされた配列読み取りを分析し、かつ/または操作することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、非限定的な例が表1Aおよび1Bにおいて提供される公知の状態、症候群および/または異常の有無を、本明細書に記載の方法を利用して検出し、かつ/または決定することができる。
いくつかの実施形態では、選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割された配列読み取りを定量して、各ゲノミックセクション(例えば、ビン、区分、ゲノムのセグメントなど)にマッピングされた読み取りの数を決定することができる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列読み取りの総数をマッピングされた配列読み取りの全てをカウントすることによって決定し、いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの総数を、各ビンまたは区分にマッピングされたカウントを合計することによって決定する。いくつかの実施形態では、カウントすることを、読み取りをマッピングするプロセスにおいて実施する。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列読み取りのサブセットをマッピングされた配列読み取りの所定のサブセットをカウントすることによって決定し、いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセットを、所定のビンまたは区分のそれぞれにマッピングされたカウントを合計することによって決定する。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセットは、1〜nの配列読み取りを含んでよく、nは、試験被験体試料、1つまたは複数の参照被験体試料、フローセル内で処理された全ての試料、または1つまたは複数のフローセルを使用した分析のためにプレート内で調製された全ての試料から生成された全ての配列読み取りの合計と等しい数を表す。試験被験体試料、1つまたは複数の参照被験体試料、フローセル内で処理された全ての試料、またはプレート内で調製された全ての試料についてマッピングされ、カウントされた配列読み取りは、時には試料カウントと称される。試料カウントは、時には、試料を単離した被験体(例えば、試験被験体試料カウント、参照被験体試料カウントなど)を参照することによってさらに区別される。
いくつかの実施形態では、値は、高度(例えば、数)に帰する。高度は、適切な方法、操作または数学的プロセスによって決定することができる(例えば、処理された高度)。高度は、多くの場合、ゲノミックセクションのセットについてのカウント(例えば、正規化されたカウント)である、またはそれに由来する。時には、ゲノミックセクションの高度は、ゲノミックセクションにマッピングされたカウントの総数(例えば、正規化されたカウント)と実質的に等しい。多くの場合、高度は、当技術分野で公知の適切な方法、操作または数学的プロセスによって処理、変換または操作されたカウントから決定する。時には、高度は処理されたカウントに由来し、処理されたカウントの非限定的な例としては、重み付けされたカウント、除去されたカウント、フィルタリングされたカウント、正規化されたカウント、補正されたカウント、平均されたカウント、平均として導かれたカウント(例えば、平均高度)、足し算されたカウント、引き算されたカウント、変換されたカウントまたはその組合せが挙げられる。時には、高度は、正規化されたカウント(例えば、ゲノミックセクションの正規化されたカウント)を含む。高度は、適切なプロセスによって正規化されたカウントについてのものであってよく、その非限定的な例としては、ビンに関した(bin−wise)正規化、GC含量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、GC LOESS、LOWESS、PERUN、RM、GCRM、cQnなど、および/またはそれらの組合せが挙げられる。高度は、正規化されたカウントまたはカウントの相対量を含んでよい。時には、高度は、平均された2つ以上のゲノミックセクションのカウントまたは正規化されたカウントについてのものであってよく、高度は、アベレージ高度と称される。時には、高度は、平均カウントまたは正規化されたカウントの平均値を有するゲノミックセクションのセットについてのものであり、平均高度と称される。時には、高度は、生のカウントおよび/またはフィルタリングされたカウントを含むゲノミックセクションについて誘導される。いくつかの実施形態では、高度は、生のカウントに基づく。時には、高度は、不確実性値を伴う。ゲノミックセクションについての高度は、時には、「ゲノミックセクションの高度」と称され、これは、本明細書では「ゲノミックセクションレベル」と同義である。
いくつかの実施形態では、正規化されたカウントのプロファイルは、プロファイル内に別の高度(例えば、第2の高度)とは有意に異なる高度(例えば、第1の高度)を含む。第1の高度は第2の高度よりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態では、第1の高度は、コピー数多型(例えば、母体のコピー数多型、胎児のコピー数多型、または母体のコピー数多型および胎児のコピー数多型)を含む1つまたは複数の読み取りを含むゲノミックセクションのセットについてのものであり、第2の高度は、コピー数多型を実質的に有さない読み取りを含むゲノミックセクションのセットについてのものである。いくつかの実施形態では、有意に異なるとは、観察可能な差異を指す。時には、有意に異なるとは、統計学的に異なることまたは統計的有意差を指す。統計的有意差は、時には、観察された差異の統計学的評価である。統計的有意差は、当技術分野における適切な方法によって評価することができる。任意の適切な閾値または範囲を使用して、2つの高度が有意に異なることを決定することができる。いくつかの場合には、約0.01パーセント以上異なる(例えば、高度値の一方またはいずれかの0.01パーセント)2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なる。時には、約0.1パーセント以上異なる2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なる。いくつかの場合には、約0.5パーセント以上異なる2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なる。時には、約0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%または約10%超異なる2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なる。時には、2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なり、いずれの高度にもオーバーラップは存在せず、かつ/または一方の高度または両方の高度について算出された不確実性値によって定義される範囲内にオーバーラップは存在しない。いくつかの場合には、不確実性値はシグマとして表される標準偏差である。時には、2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なり、これらは約1倍以上不確実性値が異なる(例えば、1シグマ)。時には、2つの高度(例えば、平均高度)は有意に異なり、これらは約2倍以上(例えば、2シグマ)、約3倍以上の、約4倍以上、約5倍以上、約6倍以上、約7倍以上、約8倍以上、約9倍以上、または約10倍以上不確実性値が異なる。時には、2つの高度(例えば、平均高度)は、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、または4.0倍以上不確実性値が異なる場合に、有意に異なる。いくつかの実施形態では、2つの高度の間の差異が増加するに従い信頼水準が増加する。いくつかの場合には、2つの高度の間の差異が減少するに従い、かつ/または不確実性値が増加するに従い、信頼水準が減少する。例えば、時には、信頼水準は高度と標準偏差(例えば、MAD)の間の差異の比率と共に増加する。
カウントされた、マッピングされた配列読み取りは、本明細書では、データが操作されていないカウント(例えば、生のカウント)を表すので、生のデータと称される。いくつかの実施形態では、データセット内の配列読み取りデータをさらに補正および/または処理し(例えば、数学的かつ/または統計学的に操作し)、かつ/または提示してアウトカムをもたらすことを容易にすることができる。補正された配列読み取りデータは、多くの場合、配列読み取り、データセット内のデータ、および/または試料核酸の一部または全部を操作することによってもたらされる。任意の適切な操作を使用して配列読み取り、データセット内のデータおよび/または試料核酸の一部または全部を補正することができる。いくつかの実施形態では、配列読み取り、データセット内のデータおよび/または試料核酸に対する補正は、フィルタリング(例えば、選択された特徴または変数に基づいてデータの一部を除去すること;反復配列を除去すること、情報価値のないビンまたはゼロカウント中央値を有するビンを除去すること)、補正すること(例えば、データの一部または全部を推定量に基づいて再尺度化および/または再重み付けすること;試料カウントをG/C含量に基づいて再重み付けすること、データの一部または全部を胎児分率に基づいて再尺度化および/または再重み付けすること)、1つまたは複数の推定量または統計学的操作を用いて正規化すること(例えば、所与のフローセル内の全てのデータをフローセル内の全てのデータの中央絶対偏差に対して正規化すること)などから選択されるプロセスである。いくつかの実施形態では、推定量はロバストな推定量である。ある特定の実施形態では、配列読み取りデータの一部を補正および/または処理し、いくつかの実施形態では、配列読み取りデータの全てを補正および/または処理する。
試料は、時には、共通の実験条件の影響を受ける。実質的に同じ時間にまたは実質的に同じ条件および/または試薬を使用して処理された試料は、時には、異なる時間におよび/または同時に異なる条件および/または試薬を使用して処理された他の試料と比較して、同様の実験条件(例えば、共通の実験条件)に誘導されるデータの変動性を示す。多くの場合、実験手順の間の任意の所与の時間に調製、処理および/または分析することができる試料の数を限定する実施上の考慮すべき問題が存在する。ある特定の実施形態では、アウトカムを生成するために試料を原料から処理するための時間枠は、時には数日、数週間、さらには数ヶ月である。単離と最後の分析の間の時間に起因して、大量の試料を分析するハイスループットな実験により、時には、バッチの影響または実験条件に誘導されるデータの変動性が生じる。実験条件に誘導されるデータの変動性は、多くの場合、試料の単離、保管、調製および/または分析の結果であるあらゆるデータの変動性を含む。実験条件に誘導される変動性の非限定的な例としては、配列の過大表示または過小表示;ノイズの多いデータ;偽データ点または外れ値データ点、試薬の影響、人員の影響、研究所条件の影響などを含む、フローセルに基づく変動性および/またはプレートに基づく変動性が挙げられる。実験条件に誘導される変動性は、時には、データセット内の試料の亜集団に対して生じる(例えば、バッチの影響)。バッチは、多くの場合、実質的に同じ試薬を使用して処理された試料、同じ試料調製プレート(例えば、試料の調製;核酸の単離のために使用するマイクロウェルプレート)において処理された試料、同じ段階分けプレート(例えば、試料をフローセルにローディングする前に組織化するために使用するマイクロウェルプレート)において分析のために段階分けされた試料、実質的に同じ時間に処理された試料、同じ人員によって処理された試料、および/または実質的に同じ実験条件(例えば、温度、CO2レベル、オゾンレベルなど、またはそれらの組合せ)の下で処理された試料である。実験条件バッチの影響は、時には、同じフローセルで分析され、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて調製され、かつ/または、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて分析のために段階分けされた(例えば、配列決定するために核酸ライブラリーを調製すること)試料に影響を及ぼす。追加的な変動性の原因は、単離された核酸の質、単離された核酸の量、核酸を単離した後保管するまでの時間、保管時間、保管温度など、およびそれらの組合せを含み得る。バッチ(例えば、同時に、かつ/または同じ試薬および/または実験条件を使用して処理されたデータセット内の試料の亜集団)内のデータ点の変動性は、時には、バッチ間で見られるデータ点の変動性を超える。このデータの変動性は、時には、その大きさがデータセット内の他のデータのいくつか、または全ての解釈に影響を及ぼす可能性がある偽データまたは外れ値データを含む。データセットの一部または全部は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知のデータ処理ステップを用いて、実験条件について補正することができる;例えば、フローセル内で分析された、またはマイクロウェルプレートにおいて処理された全ての試料について算出された中央絶対偏差に対する正規化。
核酸指標に関連する誤差を減少させるために特に有用な正規化方法体系は、本明細書では、パラメータ化された誤差除去および不偏正規化(Parameterized Error Removal and Unbiased Normalization)(PERUN)と称される。PERUN方法体系は、種々の核酸指標(例えば、核酸配列読み取り)に、そのような指標に基づく予測を交絡させる誤差の影響を低下させるために適用することができる。
GCの偏りの決定(例えば、参照ゲノムの部分(例えば、ゲノミックセクション)のそれぞれについてのGCの偏りの決定)は、GCの偏りモジュールによって(例えば、GCの偏りモジュールを含む装置によって)もたらされる。いくつかの実施形態では、GCの偏りの決定をもたらすためにはGCの偏りモジュールが必要である。時には、GCの偏りモジュールにより、参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと各部分のGC含量との間のフィッティングした関係(例えば、フィッティングした線形関係)からGCの偏りの決定がもたらされる。GCの偏りモジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、GCの偏りの決定(すなわち、GCの偏りのデータ)は、GCの偏りモジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、GCの偏りのデータは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、GCの偏りモジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、GCの偏りのデータは、以下の1つまたは複数を含む装置によってもたらされる:1つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。GCの偏りモジュールにより、適切な装置またはモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。時には、GCの偏りモジュールにより、配列決定モジュール、正規化モジュール、重み付けモジュール、マッピングモジュールまたはカウントモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。GCの偏りモジュールは、時には、正規化モジュール(例えば、PERUN正規化モジュール)の一部である。いくつかの実施形態では、GCの偏りモジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ/またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、GCの偏りモジュールにより、装置または別のモジュール(例えば、カウントモジュール)からデータおよび/または情報が受け取られ、データおよび/または情報が変換され、GCの偏りのデータおよび/または情報(例えば、GCの偏りの決定、線形フィッティングした関係など)がもたらされる。ある特定の実施形態では、GCの偏りのデータおよび/または情報を、GCの偏りモジュールから、予測カウントモジュール、フィルタリングモジュール、比較モジュール、正規化モジュール、重み付けモジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および/またはアウトカムモジュールに移行することができる。
ある特定の実施形態では、1つまたは複数の補正/処理ステップは、反復配列について補正することを含んでよい。本明細書に記載の通り、反復配列は、多くの場合、情報価値のないデータであり、かつ/またはノイズの多いデータに寄与する可能性があり、それにより、時には、もたらされるアウトカムの信頼度が低下する。本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の反復配列の影響を低下させるための任意の適切な方法(例えば、反復配列の除去)を使用することができる。反復配列を除去するために利用可能なリソースの非限定的な例は、以下の刊行物に見いだすことができる:URLワールドワイドウェブrepeatmasker.org/papers.htmlおよびワールドワイドウェブbiomedcentral.com/1471−2105/11/80。ある特定の実施形態では、もたらされるアウトカムに対する反復配列の存在の影響を、ロバストな推定量を使用してデータセットの一部または全部を予測値に関して補正または正規化することにより、最小限にすることまたは排除することができる。いくつかの実施形態では、アベレージ、中央値、最頻値、中点、平均値、中央絶対偏差、(MAD)、RousseeuwおよびCrouxによって導入されるMADの代替値、ブートストラップ推定値、標準偏差、zスコア、ロバストなzスコア、ANOVA、LOESS回帰分析(例えば、LOESS平滑化、LOWESS平滑化)などから選択される1つまたは複数の推定量を使用して、染色体の部分、または全てについての予測値を算出する。データセットの一部または全部を補正して反復配列の影響を低下させるまたは排除することにより、アウトカムをもたらすことを容易にし、かつ/またはデータセットの複雑さおよび/または次元性を低下させることができる。
データの分析、補正および処理により、1つまたは複数のアウトカムをもたらすことができる。アウトカムは、多くの場合、被験体が遺伝的変異を有するリスクがあった、またはそのリスクがあるかどうかを決定することを容易にするデータの補正および処理の結果である。アウトカムは、多くの場合、1つまたは複数の確率または推定量の考察に関連して本明細書に記載の補正/処理方法を使用して生成した1つまたは複数の数値を含む。確率の考察としては、これだけに限定されないが、変動性の尺度、信頼水準、感度、特異度、標準偏差、変動係数(CV)および/または信頼水準、Zスコア、ロバストなZスコア、パーセント染色体表示、中央絶対偏差、または中央絶対偏差の代替値、カイ値、ファイ値、倍数性値、胎児分率、フィッティングした胎児分率、面積比、中央値の高度など、またはそれらの組合せが挙げられる。確率の考察により、被験体が遺伝的変異を有するリスクがある、または遺伝的変異を有するかどうかを決定することを容易にすることができ、遺伝的障害の有無を決定するアウトカムは、多くの場合そのような考察を含む。
遺伝的変異の有無を決定する1つまたは複数のアウトカムを含む報告を受け取る医療専門家、または他の資格のある個体は、報告書において表示されたデータを使用して、試験被験体または患者の状態に関する呼び出しを作成することができる。いくつかの実施形態では、医療専門家は、もたらされたアウトカムに基づいて推奨を行うことができる。いくつかの実施形態では、医療専門家または資格のある個体は、報告書において提供される1つまたは複数のアウトカムの値および関連する信頼度パラメータに基づいて、試験被験体または患者に遺伝的変異の有無に関する呼び出しまたはスコアを提供することができる。ある特定の実施形態では、スコアまたは呼び出しは、医療専門家または資格のある個体によって、提供された報告書を目で観察することを用いて手動で作成される。ある特定の実施形態では、スコアまたは呼び出しは、時にはソフトウェアに埋め込まれた自動化されたルーチンによって作成され、情報を試験被験体または患者に提供する前に、正確を期するために医療専門家または資格のある個体によって精査される。
本明細書に記載の方法を行うために、装置、ソフトウェアおよびインターフェースを使用することができる。装置、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、ユーザーは、例えば、統計解析アルゴリズム、統計有意性アルゴリズム、統計アルゴリズム、反復ステップと、検証アルゴリズム、およびグラフ表示を実行することを伴ってよい特定の情報、プログラムまたはプロセス(例えば、配列読み取りをマッピングすること、マッピングされたデータを処理すること、および/またはアウトカムをもたらすこと)を使用するためのオプションを入力、要求、問い合わせまたは決定することができる。いくつかの実施形態では、データセットをユーザーがインプット情報として入力することができ、ユーザーは1つまたは複数のデータセットを任意の適切なハードウェア媒体(例えば、フラッシュドライブ)によってダウンロードすることができ、かつ/またはユーザーは、データセットを、その後に処理し、かつ/またはアウトカムをもたらすために、あるシステムから別のシステムに送信する(例えば、配列読み取りをマッピングするために、シークエンサーからの配列読み取りデータをコンピュータシステムに送信する;処理し、アウトカムをもたらし、かつ/または報告するために、マッピングされた配列データをコンピュータシステムに送信する)ことができる。
上記の通り、時には、データをある形態から別の形態に変換する。「変換された(transformed)」、「変換(transformation)」という用語、およびその文法上の派生語または等価な語は、本明細書で使用される場合、物理的な出発材料(例えば、試験被験体試料核酸および/または参照被験体試料核酸)からのデータを物理的な出発材料(例えば、配列読み取りデータ)のデジタル表示に変更することを指し、いくつかの実施形態では、アウトカムをもたらすために利用することができる1つまたは複数のデジタル表示の数値またはグラフ表示にさらに変換することを含む。ある特定の実施形態では、デジタル表示されたデータの数値および/またはグラフ表示の1つまたは複数を利用して、試験被験体の物理的なゲノムの様相を表すことができる(例えば、ゲノムの挿入、重複または欠失の有無を仮想的に表すまたは視覚的に表す;医学的状態に関連付けられる配列の物理量の変動の有無を表す)。時には、仮想表示を、1つまたは複数の、出発材料のデジタル表示の数値またはグラフ表示にさらに変換する。これらの手順により、物理的な出発材料を数値もしくはグラフ表示、または試験被験体のゲノムの物理的様相の表示に変換することができる。
ある特定の態様では、1つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントを含み、1つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、(b)正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定するように構成されているシステムが提供される。
モジュールは、時には、装置、システムまたはソフトウェアの一部であり、情報およびデータの移行および/または処理を容易にすることができる。モジュールの非限定的な例が下に記載されている。
配列決定モジュールによって、または配列決定モジュールを含む装置によって、配列決定、配列決定読み取りの入手をもたらすことができる。「配列受信モジュール」は、本明細書で使用される場合、「配列決定モジュール」と同じである。配列決定モジュールを含む装置は、当技術分野で公知の配列決定技術で核酸の配列を決定する任意の装置であってよい。ある特定の実施形態では、配列決定モジュールを含む装置によって、当技術分野で公知の配列決定反応が実施される。配列決定モジュールにより、一般に、配列決定反応からのデータ(例えば、配列決定装置から生成されたシグナル)に応じて核酸配列読み取りがもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りをもたらすために、配列決定モジュールまたは配列決定モジュールを含む装置が必要である。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールにより、別の配列決定モジュール、コンピュータ周辺機器、オペレーター、サーバー、ハードドライブ、装置から、または適切な供給源から配列読み取りを受け取る、入手する、それにアクセスするまたはそれを回収することができる。時には、配列決定モジュールにより、配列読み取りを操作することができる。例えば、配列決定モジュールにより、アラインメント、集合、断片化、相補配列変換(complement)、逆相補配列変換(reverse complement)、誤り検査、または配列読み取りの誤り訂正を行うことができる。配列決定モジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、配列決定モジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。時には、配列決定モジュールにより、別のモジュール、装置、周辺機器、構成部分または特殊化された構成部分(例えば、シークエンサー)からデータおよび/または情報を集める、集合させる、および/または受け取る。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、以下の1つまたは複数を含む装置によってもたらされる:1つまたは複数のフローセル、カメラ、光検出器、光電池、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。多くの場合、配列決定モジュールにより、配列読み取りを受け取る、集めるおよび/または集合させる。時には、配列決定モジュールにより、装置のオペレーターからインプットデータおよび/または情報を受け入れ、集める。例えば、時には、装置のオペレーターにより、モジュールに命令、定数、閾値、式または所定の値がもたらされる。時には、配列決定モジュールにより、それが受け取ったデータおよび/または情報を連続した核酸配列に変換することができる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールによってもたらされた核酸配列を印刷または提示する。いくつかの実施形態では、配列読み取りは、配列決定モジュールによってもたらされ、配列決定モジュールから装置、または任意の適切な周辺機器、構成部分または特殊化された構成部分を含む装置に移行される。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールから、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置にデータおよび/または情報がもたらされる。いくつかの場合には、配列読み取りに関連するデータおよび/または情報を、配列決定モジュールから任意の他の適切なモジュールに移行することができる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールにより、配列読み取りをマッピングモジュールまたはカウントモジュールに移行することができる。
マッピングモジュールによって、またはマッピングモジュールを含む装置によって、配列読み取りをマッピングすることができ、マッピングモジュールにより、一般に、読み取りが参照ゲノムまたはそのセグメントにマッピングされる。マッピングモジュールにより、配列決定読み取りを当技術分野で公知の適切な方法によってマッピングすることができる。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りをもたらすために、マッピングモジュールまたはマッピングモジュールを含む装置が必要である。マッピングモジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列決定読み取りは、マッピングモジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りを、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってマッピングする。いくつかの実施形態では、マッピングモジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。装置は、マッピングモジュールおよび配列決定モジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、配列読み取りを、以下の1つまたは複数を含む装置によってマッピングする:1つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。いくつかの実施形態では、マッピングモジュールにより、配列決定モジュールから配列読み取りを受け取ることができる。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列決定読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールまたは正規化モジュールに移行することができる。
カウントモジュールによって、またはカウントモジュールを含む装置によって、カウントをもたらすことができる。カウントモジュールにより、当技術分野で公知のカウント方法に従ってカウントを決定し、集合させ、かつ/または提示することができる。カウントモジュールにより、一般に、当技術分野で公知のカウント方法体系に従ってカウントを決定するまたは集合させる。いくつかの実施形態では、カウントをもたらすために、カウントモジュールまたはカウントモジュールを含む装置が必要である。カウントモジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、カウントは、カウントモジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によって読み取りをカウントする。いくつかの実施形態では、カウントモジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、以下の1つまたは複数を含む装置によって読み取りをカウントする:配列決定モジュール、マッピングモジュール、1つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。カウントモジュールにより、配列決定モジュールおよび/またはマッピングモジュールからデータおよび/または情報を受け取り、そのデータおよび/または情報を変換し、カウント(例えば、ゲノミックセクションにマッピングされたカウント)をもたらすことができる。カウントモジュールにより、マッピングされた配列読み取りをマッピングモジュールから受け取ることができる。カウントモジュールにより、正規化されたマッピングされた配列読み取りをマッピングモジュールから、または正規化モジュールから受け取ることができる。カウントモジュールにより、カウント(例えば、カウント、集合カウントおよび/またはカウントの表示)に関連するデータおよび/または情報を任意の他の適切な装置、周辺機器、またはモジュールに移行することができる。時には、カウントに関連するデータおよび/または情報を、カウントモジュールから正規化モジュール、プロッティングモジュール、カテゴリー化モジュールおよび/またはアウトカムモジュールに移行する。
正規化モジュールによって(例えば、正規化モジュールを含む装置によって)、正規化されたデータ(例えば、正規化されたカウント)をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りから得た正規化されたデータ(例えば、正規化されたカウント)をもたらすために、正規化モジュールが必要である。正規化モジュールにより、データ(例えば、カウント、フィルタリングされたカウント、生のカウント)を当技術分野で公知の1つまたは複数の正規化手順によって正規化することができる。正規化モジュールにより、予測カウントの変動性の推定値(例えば、予測カウントのMADおよび/または予測カウント表示のMAD)をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、多数の実験(例えば、時には、異なる実験、時には、1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた実験)から得た予測カウントから多数の中央値を導出し、多数の中央値の絶対誤差(例えば、偏差、変動性、標準偏差、標準誤差)を導出し、算出された絶対誤差の平均値、アベレージ、または中央値を決定することによって予測カウントのMADをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、多数の実験(例えば、時には、異なる実験、時には、1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた実験)から得た予測カウント表示から多数の中央値を導出し、次いで、多数の中央値の絶対誤差(例えば、偏差、変動性、標準偏差、標準誤差)を導出することによって予測カウント表示のMADをもたらすことができる。正規化モジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、正規化モジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、以下の1つまたは複数を含む装置によってもたらされる:1つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。正規化モジュールは、適切な装置またはモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。時には、正規化モジュールにより、配列決定モジュール、正規化モジュール、マッピングモジュールまたはカウントモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ/またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、正規化モジュールにより、別の装置またはモジュールからデータおよび/または情報を受け取り、そのデータおよび/または情報を変換し、正規化されたデータおよび/または情報(例えば、正規化されたカウント、正規化された値、正規化された参照値(NRV)など)をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、正規化されたデータおよび/または情報を正規化モジュールから比較モジュール、正規化モジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および/またはアウトカムモジュールに移行することができる。時には、正規化されたカウント(例えば、正規化されたマッピングされたカウント)を正規化モジュールから予測表示モジュールおよび/または実験に基づく表示モジュールに移行する。
予測カウントモジュールによって(例えば、予測カウントモジュールを含む装置によって)、予測カウントまたは予測カウントの誘導値(例えば、パーセント表示)をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りから得た予測カウントまたは予測カウントの誘導値(例えば、マッピングされた配列読み取りのカウント、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセット)をもたらすために、予測カウントモジュールが必要である。予測カウントモジュールにより、1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについてカウントを合計することができる。時には、予測カウントモジュールにより、配列読み取りおよび/またはカウントに1つまたは複数の数学的操作または統計学的操作を適用する。予測カウントモジュールにより、予測カウントの誘導値を、パーセント表示(例えば、カウント表示)を決定することによって決定することができる。予測カウントモジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、予測カウントモジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、予測カウントモジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、以下の1つまたは複数を含む装置によってもたらされる:1つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ(例えば、LED、LCTまたはCRT)など。予測カウントモジュールは、適切な装置またはモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。時には、予測カウントモジュールにより、配列決定モジュール、予測カウントモジュール、マッピングモジュール、正規化モジュールまたはカウントモジュールからデータおよび/または情報を受け取ることができる。いくつかの実施形態では、予測カウントモジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ/またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、予測カウントモジュールにより、別の装置またはモジュールからデータおよび/または情報を受け取り、そのデータおよび/または情報を変換し、予測カウントまたは予測カウントの誘導値をもたらす。ある特定の実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値を予測カウントモジュールから比較モジュール、予測カウントモジュール、正規化モジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および/またはアウトカムモジュールに移行することができる。
アウトカムモジュールによって、またはアウトカムモジュールを含む装置によって、遺伝的変異の有無(異数性、胎児の異数性、コピー数多型)を同定することができる。時には、遺伝的変異をアウトカムモジュールによって同定する。多くの場合、異数性の有無の決定をアウトカムモジュールによって同定する。いくつかの実施形態では、遺伝的変異(異数性、コピー数多型)を決定するアウトカムをアウトカムモジュールによって、またはアウトカムモジュールを含む装置によって同定することができる。アウトカムモジュールは、特定の遺伝的変異(例えば、トリソミー、21トリソミー、18トリソミー)を決定するために特殊化することができる。例えば、21トリソミーを同定するアウトカムモジュールは、18トリソミーを同定するアウトカムモジュールとは異なり、かつ/または別個であってよい。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異(例えば異数性、コピー数多型)を決定するアウトカムを同定するために、アウトカムモジュールまたはアウトカムモジュールを含む装置が必要である。アウトカムモジュールを含む装置は、少なくとも1つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、アウトカムモジュールからの1つまたは複数の命令(例えば、プロセス、ルーチンおよび/またはサブルーチン)を実施および/または実行することができるプロセッサ(例えば、1つまたは複数のプロセッサ)を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含んでよい装置によって同定される。いくつかの実施形態では、アウトカムモジュールは、1つまたは複数の外部のプロセッサ(例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび/またはストレージネットワーク(例えば、クラウド))と一緒に作動する。時には、アウトカムモジュールを含む装置によって、別のモジュールまたは装置からデータおよび/または情報を集める、集合させる、および/または受け取る。時には、アウトカムモジュールを含む装置によって、別のモジュールまたは装置にデータおよび/または情報をもたらし、かつ/または移行する。時には、アウトカムモジュールにより、構成部分または周辺機器から、またはそれにデータおよび/または情報を移行する、受け取るまたは集める。多くの場合、アウトカムモジュールにより、カウント、高度、プロファイル、正規化されたデータおよび/または情報、参照高度、予測高度、予測範囲、不確実性値、補正、補正された高度、プロット、カテゴリー化された高度、比較および/または定数を受け取る、集めるおよび/または集合させる。時には、アウトカムモジュールにより、装置のオペレーターからインプットデータおよび/または情報を受け入れ、集める。例えば、時には、装置のオペレーターにより、定数、閾値、式または所定の値がアウトカムモジュールにもたらされる。いくつかの実施形態では、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によって、データおよび/または情報がもたらされる。いくつかの実施形態では、適切な周辺機器または構成部分を含む装置によって、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムの同定が提供される。アウトカムモジュールを含む装置によって、正規化モジュール、予測カウントモジュールから正規化されたデータを、範囲設定モジュールから予測高度および/または範囲を、比較モジュールから比較データを、カテゴリー化モジュールからカテゴリー化された高度を、プロッティングモジュールからプロットを、および/または補正モジュールから補正データを受け取ることができる。アウトカムモジュールにより、データおよび/または情報を受け取り、そのデータおよび/または情報を変換し、アウトカムをもたらすことができる。アウトカムモジュールにより、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムに関連するデータおよび/または情報を適切な装置および/またはモジュールにもたらすまたは移行することができる。本明細書に記載の方法によって同定される遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、さらに検査することによって(例えば、母体の核酸および/または胎児核酸の標的化配列決定によって)、それぞれ独立に検証することができる。
盲検試料を使用した遺伝的変異の有無の決定
ダウン症候群についての有効な出生前スクリーニング検査は、多くの場合、母体の年齢と、第1三半期における項部浮腫の超音波測定および/または第1三半期および第2三半期に得られるいくつかの母体の血清スクリーニングマーカーの測定からの情報を組み合わせる。これらの出生前スクリーニング検査では、多くの場合、実質的に全ての症例の約90%に至るまでが約2%の偽陽性率で検出される。ダウン症候群の分布率を考慮すると、侵襲的診断検査(例えば、羊水穿刺または絨毛採取)を勧められたスクリーニング陽性の女性16人に1人で妊娠に影響し、15人では影響しない。200例中1例ものそのような侵襲的手順に胎児喪失が伴い、これは出生前診断の著しい有害な結果である。胎児喪失という著しい有害な結果により、時には、偽陽性率が最小限になるように補正されたスクリーニングカットオフが導かれる。実際には、約5%の偽陽性率が一般的である。
全体的な試験デザイン
本明細書で示されている試験(ワールドワイドウェブURL clinicaltrials.gov NCT00877292参照)には、世界中で27か所の出生前診断センター(例えば、以後登録場所と称される)で登録された患者が関与した。母体の年齢、家族歴または同意を得た陽性血清および/もしくは超音波スクリーニング検査、血漿試料、人口統計および妊娠に関連する情報に基づいてダウン症候群のリスクが高い女性。各登録場所で治験審査委員会の認可(または同等のもの)を得た。患者および試料は試験コードによって識別した。侵襲的検査の直前に試料を抜き取り、6時間以内に処理し、−80℃で保管し、コーディネートセンターにドライアイス輸送した。このコホート内で、ダウン症候群についての盲検DNA検査を用いてコホート内症例対照試験を展開した。妊娠期間(最も近い週;同じ三半期)、登録場所、人種(自己宣言)、および冷凍装置に入っていた時間(1ヶ月以内)に基づいて、各症例に対して7つの正倍数性試料をマッチさせた。偽陰性の結果がないと仮定して、200のダウン症候群妊娠(症例)が80%の検出力を有し、信頼区間(CI)が低いために98%が棄却された。症例は第1三半期および第2三半期の間に同等に分布した。この試験について、ダウン症候群を47、XY、+21または47、XX、+21と定義し、ダウン症候群のモザイクおよび双生児妊娠は排除した。試験のコーディネートおよび試料の保管は独立した大学医療センター(例えば、Women&Infants Hospital)に基づいた。凍結し、コード付けした試料(4mL)を検査するためにSequenom Center for Molecular Medicine(SCMM、San Diego、CA)に送付した。SCMMは、ターンアラウンドタイムを定量することを含めた、核型およびシミュレートされた臨床検査に関する知見を有さなかった。試料のサブセットを、DNA配列決定の経験がある独立した学術的研究所であるロサンゼルスのカリフォルニア大学にあるOrphan Disease Testing Center(UCLA;Los Angeles、CA)において検査するために送付した。どちらの研究所もCLIAによって認定されており、どちらもSCMMによって最初に開発された標準化された書面のプロトコールを使用して臨床的解釈をもたらした。
この産業界から資金提供された試験の完全性、信頼度、および独立性を確実にすることを最優先した。3人の監督委員会(承認を参照されたい)を創設し、試験のデザイン、実施、分析、および解釈に対する評価および推奨の提供を委ねた。試験プロトコールは、登録場所の検査、登録場所を試験のスポンサーから切り離すこと、独立した学術的研究所による確認検査、診断検査結果を多数のレベルで盲検化すること、アウトカムデータにリモートコンピュータアクセスしないこと、学術的な検査場所で生のデータ全てにアクセスすること、配列決定および解釈の結果をコーディネートセンターに即時にファイル転送すること、およびファイルチェックサムを使用してその後の変化を同定することを含んだ。SCMMにより、同様の設備、訓練、解釈用ソフトウェア、および標準の操作プロトコールを備えた独立した研究所が提供された。
上記の通り、MPSSを利用して無細胞DNAについて配列決定した。簡単に述べると、循環している無細胞DNA断片を母体の血漿から単離し、胎児の寄与(胎児分率)を決定するアッセイを用いて定量する。残りの単離物を使用して、配列決定ライブラリーを生成し、正規化し、多重化して、4つの試料について単一のフローセルレーン(例えば、フローセル1個当たり8レーン)で実行することを可能にした。マイクロフルイディクスプラットフォーム(Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)を使用してDNAライブラリーを定量し、cBotプラットフォーム(Illumina、Inc、San Diego、CA)を使用してクラスターを生成した。Illumina HiSeq 2000プラットフォームでフローセルについて配列決定し、生じたデータを、Illuminaソフトウェアを使用して解析した。コンピュータ解釈により、中央の推定値(zスコア)を上回るまたは下回る標準偏差(例えば、SD)のロバストな推定値がもたらされた;zスコア3以上をダウン症候群と一致するとみなした。主要なCLIA研究所(SCMM)の指揮者が結果を精査し、第2の一定分量を検査するための要求を開始し、検査された妊娠の全てについて最終的な「サインアウト」された解釈をもたらした。独立したCLIA研究所(UCLA)の指揮者も同じことをしたが、第2の試料の一定分量を要求することはできなかった。各研究所は自身の結果にのみアクセスした。
暫定的な解析により、16症例のうち3症例超または112例の対照のうち6例超が誤って分類されたことが示された場合には試験を中断する。試験はマッチさせたが、解析はマッチさせないように計画した。SAS(商標)Analytics Pro(Cary、NC;以前は統計解析システムとして公知であった)およびTrue Epistat(Richardson、TX)を使用して、X2検定、t検定、分散分析(ANOVA)、および線形回帰(適切な変換後)を使用して群および関連性の間の差異を調査した。二項分布を用いて割合の信頼区間(CI)を計算した。P値は両側性であり、有意性は0.05レベルであった。
試料母集団
2009年4月からおよび2011年2月の間に、登録場所27か所(以下の表1参照)で適格の妊娠中の女性を同定し、インフォームドコンセントを得、試料を採取した。登録者4664人の中で、218人の単胎児ダウン症候群および3930人の単胎児正倍数性妊娠が起こった。図1には、胎児のアウトカム、血漿試料の状態、および279人の女性(6%)が排除された理由に関する詳細が提供される。以前の刊行物または試験に含まれた試料はなかった。合計4385人の女性(94%)が単胎児妊娠、少なくとも2つの適切な血漿試料および診断検査結果を有した。これらのうち、97%が、両端を含めて11週から20週の間の妊娠期間であり、34%が第1三半期であった。登録された女性51人を除く全てについて胎児の核型(または同等のもの)が入手可能であった。116人の女性については、血漿試料が検査に適するとみなされなかった(例えば、運搬中に解凍された、凍結されるまでに6時間を超えた、一定分量が1つのみである、および体積が不十分である)。さらに112人の女性を、多胎妊娠または現存する胎児死亡が原因で排除した。4385例の生育可能な単胎児妊娠の中で、34%が第1三半期後期に得られ、66%が第2三半期初期に得られた。合計212症例のダウン症候群を検査のために選択した。それぞれの症例について、マッチする正倍数性妊娠を7例選択した(例えば、1484;正倍数性症例とダウン症候群症例の比率7:1)。237例の他のアウトカムは追加的な常染色体異数性、性染色体異数性、モザイクおよび他の染色体異常であった。1つの対照が後で18トリソミーであることが発見されたが、「正倍数性」対照として含まれていた。
MPSSの前に、抽出されたDNAを検査して、母体の血漿中の胎児起源の遊離のDNAの割合(胎児分率)を決定した。ほぼ全て(1687/1696;99.5%)が、許容できる限界(4〜50%)の範囲内の最終的な胎児分率を有し、幾何平均は13.4%であった。偽陰性の結果を最小限にするために、より低いカットオフを選択した。上のカットオフを、研究所の指揮者にこれが稀な事象を表すことを警告するために選択した。9つが許容されないレベルを有した;6つが閾値を下回り、3つが閾値を上回った。ダウン症候群を同定することにおけるMPSSの成功は、胎児分率に高度に左右されるので、16の潜在的な共変量(図4〜19、実施例2参照)を探究した(処理時間、溶血、地理的地域、診断検査の徴候、登録場所、妊娠期間、母体の年齢、母体の体重、膣からの出血、母体の人種、白人民族性、胎児の性別、冷凍装置での保管時間、ならびにDNAライブラリー濃度、マッチする配列の数、および胎児のアウトカムに対する胎児分率の影響)。胎児分率と母体の体重の強力な負の関連が症例女性および対照女性において観察され(図11、実施例2参照)、100ポンド、150ポンド、および250ポンドの体重には、それぞれ17.8%、13.2%、および7.3%の予測胎児分率が伴った。妊娠期間、母体の人種、または検査の徴候については関連が見いだされなかった。他の関連は小さく、大抵有意でなかった。
アッセイプロトコール、および関連する器械使用に関して訓練を受けた30人の科学者、分子技師/技術者により、9週間(2011年の1月から3月まで)にわたって検査が実施された。解釈のために歴史的な基準範囲を使用し、9つが新しいデータのリアルタイムでの精査必要性を伴った。研究所の指揮者による最初のいくつかのフローセルについての精査(サインアウト前)により、参照データに対する補正が必要であったことが明らかになった(実施例2および図20〜22参照)。6つのフローセルからのデータを生成した後、結果は監督委員会によって暫定基準に従って評価され、検査を継続することを可能にするために機密決定が行われた。検査の終わりに、しかし非盲検化する前に、SCMMにより、1696の登録者の中で90の検査失敗のうち85について第2の一定分量が要求された(5.3%;95%CI、4.3〜6.5;実施例2参照)。第2の結果を最終的な解釈のために使用した。
独立した大学研究所(例えば、UCLA)において、最初にSCMMによって処理および検査された605の最初の試料一定分量のサブセットについてのクラスター生成、DNA配列決定、および解釈が実施された。このサブセットは、92の患者試料(例えば、プレート)の完全な群全てからコーディネートセンターによって無作為に選択された。合計578の試料がどちらの場所においても首尾よく検査された(96%)。コンピュータにより解釈されたMPSSの結果は、SCMM値を用いてzスコアとしてとして表されている。合計77例のダウン症候群妊娠および501例の正倍数性妊娠がどちらの場所においても首尾よく検査された。一方の場所または両方の場所において最初の試験で失敗した27の試料は含まれていない。zスコアカットオフ3を使用した。これらの試料の中で、不一致が1つだけ起こった。正倍数性試料がUCLAによっては誤って分類されたが(zスコア=3.46)、SCMMによっては正確に分類された(zスコア=2.02)。どちらの群でも1つのダウン症候群の試料が誤って分類された。77例のダウン症候群妊娠および501例の正倍数性妊娠のどちらの間でも相関は高かった(例えば、それぞれR=0.80および0.83)。この578のサブセットにおいて、SCMMについての検出率、偽陽性率、および最初の失敗率は、それぞれ98.7%、0.0%、および4.4%であった。UCLAについての対応する率は、98.7%、0.2%、および3.9%であった(表3、実施例2参照)。登録者56人の別のサブセットでは、2連の4mLの血漿試料を各研究所で検査した。1つの正倍数性試料が、胎児分率が低いことに起因してどちらの場所においても失敗した。UCLAにおいてさらに2つの正倍数性試料の配列決定が失敗し、そのプロトコールでは再検査が可能でなかった。SCMMおよびUCLAにおける失敗率は、それぞれ1.8%および5.3%であった。残りの53の試料の中で、全ての品質パラメータおよび解釈の結果が2つの場所で合致した(実施例2)。どちらの研究所においても、検出率および偽陽性率はそれぞれ100%および0%であった。
大きなサンプルサイズにより、MPSS結果を解釈する代替的方法を調査するための機会がもたらされた。サインアウト後であるが研究所非盲検化の前に、SCMM研究所で、第21染色体のパーセント結果について、MPSSの性能が改善されることが示されているプロセスであるGC含量についての補正を行い、また、Repeat Mask(URLワールドワイドウェブrepeatmasker.org/PreMaskedGenomes.html)に関してフィルタリングし、結果をコーディネートセンターに送って代替の解釈のアルゴリズムをよりよく実施することができるか、よりロバストであるか、またはその両方であるかを決定した。分析により、対照の結果は、フローセルごとまたはプレート(バッチ処理された3つのフローセル)ごとに変動するが(ANOVA、F=13.5、p<0.001)、SDは一定であり(ANOVA、F=1.2、P=0.23)、これにより、GCについて補正された結果をプレート中央値の倍数に変換することが可能になることが示された。ダウン症候群妊娠および正倍数性妊娠におけるプレート中央値の倍数は、1つの持続的な偽陰性の結果以外は完全に分けられた(実施例2参照)。フローセルに特異的なzスコアを補正することによっても、性能が改善され、2つの偽陰性および1つの偽陽性の結果が残った(実施例2参照)。事後解析は、臨床的解釈を行う時点では利用不可能であった。
2,116の最初の患者試料(1696が本発明で報告されたものであり、420が他の患者試料である)を、2つのHiSeq2000プラットフォームを使用して、1週間当たり患者235人の処理量で検査した。ターンアラウンドタイム(例えば、試料の解凍からサインアウトまで)が9週間の検査に対して改善され、最終的な20フローセルのうち18について10日の標的に見合った(実施例2参照)。これは、第2の一定分量を必要とした試料の5%を含まないが、失敗は多くの場合、検査プロセスの初期に検出されたので、第2の一定分量を必要とした試料についてのターンアラウンドタイムは倍にはならない。
本明細書において報告されているものを含め、合計350例のダウン症候群および2061例の対照妊娠が報告された。報告されたダウン症候群および対照妊娠の全体で99.0%の感度および特異度が実証され(例えば、95%CI、98.2〜99.8%、I2=0%;表5、実施例2参照)、これにより、MPSSに基づくダウン症候群についての検査の臨床的な有効性の決定的な証拠がもたらされる。陽性の結果では、時には、ダウン症候群のリスクが490倍増加し(例えば、98.6%検出/0.2%偽陽性率)、陰性の結果では、時には、リスクが72分の1低下した(例えば、99.8%/1.4%)。検査は女性1000人に992人で上首尾であった。最初の検査の5.3%で品質確認できなかったが、これらの82%は第2の一定分量の検査後に解決された。残りの検査失敗は、多くの場合、胎児分率が少ないことに関連し、これは時には、妊娠の1週間または2週間後に反復試料採取することによって解決することができた。MPSSの性能は独立した研究所により(例えば、実施例2の表5参照)、元の血漿試料および血漿DNA調製物を使用して確認された。
盲検試料を使用した遺伝的変異の有無の決定:追加的な材料、方法および結果
試験の完全性
試験の独立性および完全性の継続の保証に役立てるために、2009年2月に試験監督委員会を創設した。委員会の構成は、出生前検査および分子遺伝学的方法の臨床的態様および研究的態様の両方の専門知識を有する産科学および遺伝学の学術コミュニティが代表されるように設計した。委員会は、2009年および2010年の間に平均して年に3回、試験Co−Principal Investigators(Co−PI’s)と直接または電話によって会合し、2011年2月にその任務を完了し、最後の電話会議を開き、活発な試験登録を終えた。委員会のメンバーは、試験のスポンサー(Sequenom)と秘密保持契約を結ばないことを選択し、したがって、彼らは独占的な方法または結果の知見を有さず、また、試験の過程中にSequenomの人員と直接やり取りしなかった。監督委員会のインプットは、1)検査用の試料をコード付けおよび選択する安全な方法、2)試験結果の暫定的確認、および3)試験のスポンサーとコーディネートセンターの分離、および動員場所の活動を維持するための規則の実行において必須であった。
Women&Infants Hospital(WIH)がコーディネートセンターとして機能し、試験の全体的な責任を有した。責任は、試験デザインを実行し、順守すること、登録場所との通信を動員し、確立すること、安全な試験データベースおよびウェブサイトを維持すること、患者データを収集し、検証すること、処理された血漿試料バンクを維持すること、および監督委員会を編成し、利用することを含んだ。センターは2つの場所に位置し、1つはメイン州、スタンディッシュにあり、そこではコンピュータ化されたデータをCo−PIおよび試験コーディネーターの監督の下で保持し、1つはロードアイランド州、プロビデンスにあり、そこでは、登録場所から試料を入手し、−80℃で保管し、必要に応じて検査研究所に輸送し、また、登録場所に対する行政的支持および供給支持が位置した。試験はWIHにより、連邦のガイドラインに従って施行された。WIHと試験のスポンサーの間で守秘義務契約が結ばれ、これにより、Co−PIが試験全体を通して暫定データおよび研究結果にアクセスすることが可能になった。
多数の患者へのサービス、統合スクリーニング、または第1三半期の診断検査を提供している場所を優先的に探した。27の参加登録場所(表1参照、実施例1)により、第1三半期後期および/または第2三半期初期におけるダウン症候群(または他の常染色体異数性)についての診断検査が提供された。全ての場所が、厳重なプロトコールに従って血漿試料を採取し、処理し、保管し、輸送する能力を有した。場所は治験審査委員会(または同等のもの)の認可を獲得し、試験に登録された各女性のインフォームドコンセントを得た。
Sequenom Center for Molecular Medicine in San Diego(SCMM−SD)は、高複雑度分子遺伝学研究所としてCLIAによって認定されている。研究所には2つのIllumina HiSeq 2000 Next Generation Sequencerがあり、この試験ではその両方を使用した。カリフォルニア大学Los Angeles School of Medicine(UCLA)にあるOrphan Disease Testing Centerも、CLIAによって認定された高複雑度遺伝学研究所であり、この試験の間Illumina HiSeq 2000プラットフォームを1つ有した。UCLAは、盲検化された試験試料の大規模並列処理配列決定の実施においてSCMM−SDと協力し、SCMM−SDにおいて作成された、Illumina HiSeq 2000プラットフォームで使用するために更新された標準化された書面のプロトコールに従って臨床的解釈をもたらした。
診断検査を予定している妊娠中の女性に関する情報を各登録場所で精査して、試験基準に従って異数性のリスクが高く、胎児が妊娠期間21週6日以下の女性を同定した。高リスクを、血清検査および/または超音波検査によるダウン症候群または他のトリソミーについてのスクリーニング陽性、分娩時の母体の年齢が38歳以上(試験の初期にはこれは40歳以上に設定していた)、または異数性の家族歴と定義した。必要条件を満たした女性に、遺伝学カウンセラーまたは医師によって試験に関する情報が与えられ、参加することを選択した場合はサインされたインフォームドコンセントがもたらされた。各女性のサインおよび完全な同意書を現地で保存した。選択された人口統計および妊娠に関連する情報を、標準化された形態で入手し、併せて、診断手順の前に抜き取った静脈血が入った少なくとも2つ(最大5つ)の上部が紫色の10mLチューブを入手した。データ形態上、および処理された血漿チューブ上の検査コードによってのみ参加者を識別した。多胎妊娠および現存する胎児死亡を伴う妊娠は、全ての胎児について診断検査が計画されていたのであれば適格であった。
この試験は、現行の実施を変化させるべきかを決定することを意図していた。したがって、検出率(検査陽性のダウン症候群妊娠の割合、または感度)および偽陽性率(検査陽性の影響を受けていない妊娠の割合、または1−特異度)のどちらの推定にも高信頼度の水準が必要とされた。偽陰性がないという仮定の下で、98%よりも有意に高い検出率を見いだすために検出力が少なくとも80%になるように十分な症例を含めるべきである。200症例を分析することにより、90%の検出力がもたらされ、この下限が棄却される。これらの症例のそれぞれに対して7例の正倍数性妊娠(対照)を選択して、偽陽性率の妥当な信頼度を確実にする。
試料/データ採取
羊水穿刺または絨毛採取の前に血漿試料を抜き取り、Ehrichら、(Am.J.Obstet.Gynecol.(2011年)204巻:205.e1−11頁)のプロトコールに従って処理した。簡単に述べると、10mLの血漿チューブ(EDTAを含有する、上部が紫色)を4℃、2,500×gで10分遠心分離し、血漿を50mLの遠心管にプールし、4℃、15,500×gで10分遠心分離した。次いで、血漿を2つ以上の15mLの円錐チューブに、チューブ1個当たり4mLで移し、最後のチューブは残りの体積全てを含有した。これらのチューブを、長期保管するために登録場所で−70℃以下の冷凍装置に入れた、または、コーディネートセンターへの1〜2日の配送のためにドライアイス輸送する前に24時間以下にわたって−20℃に置いた。−80℃で保管した場合、試料は、コーディネートセンターへの1〜2日の配送のために、通常は月に1回ベースで、バッチでドライアイス輸送した。場所特異的な試験IDを添えた予め印刷したバーコード標識を使用して全ての血漿チューブを識別した。国際輸送のためにQuick International Courier、Inc.を使用して、適切な追跡、パッケージ内のドライアイスの維持、および配送を確実にした。
選択の判断基準は、完全な4mLの処理された試料へのアクセス、女性の年齢が18歳以上であること、および重要なデータの欠けがないまたは限られていることを含んだ。最後にいくつか登録された第1三半期後期(14週以内の妊娠期間)および第2三半期初期(15〜22週の妊娠期間)からの症例は、三半期ごとに100症例の標的が妥当なクッションを伴って達せられたので含めなかった。マッチングは、妊娠期間、母体の人種、母体の民族、登録場所、および冷凍装置内にあった時間に基づいた。試料は、研究所で開発された検査(LDT)が最終的な内部検証、刊行物の提出、および監督委員会の同意を通った後のみに、処理および検査のためにドライアイス輸送した。選択状況(例えば、一定分量の破損、抽出失敗)では、第2の一定分量を要求することができた。第2の一定分量の数および送付の指標を追跡した。
ライブラリー調製
ライブラリーを調製するために、抽出された、循環している無細胞(ccf)DNAを、さらなる断片化またはサイズ選択をせずに使用した。ccf DNAは、一般に、アベレージの長さ約160塩基対に天然に断片化している。DNA溶出液55μLを、抽出後、ライブラリー調製を開始するまで、低結合性エッペンドルフチューブに入れ4℃で保管した。保管時間は24〜72時間にわたった。ライブラリー調製を製造者の仕様書(Illumina)に従い、本明細書に記載のいくつかの改変を伴って行った。酵素および緩衝液はEnzymatics、MA(End Repair Mix −LC;dNTP Mix(各25mM);Exo(−)Klenowポリメラーゼ;10×Blue Buffer;100mMのdATP;T4 DNA Ligase;2×Rapid Ligation Buffer)およびNew England Biolabs、MA(Phusion PCR MM)から供給された。アダプターオリゴヌクレオチド、指標オリゴヌクレオチド、およびPCRプライマーはIllumina Inc、CAから入手した。
マイクロフルイディクスプラットフォームにおける電気泳動による分離によってライブラリーを定量した。各ライブラリーを1:100希釈し、Caliper LabChip GX instrumentを用い、HT DNA1K LabChip、v2およびHiSens Reagent kit(Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)を用いて3連で分析した。Caliper LabChip GXソフトウェアv2.2により、200〜400bpからのスメア分析を用いて濃度を算出した。
標準のIlluminaプロトコールに従ってクラスタリングおよび配列決定を実施した。個々のライブラリーを、2nMの濃度に対して正規化し、次いで、4プレックス形式で試料1つ当たり1.2pMまたはフローセル1レーン当たり4.8pMの最終的なフローセルローディング濃度にクラスタリングした。cBOT計器およびv4Single−Read cBOT試薬キットを使用した。HiSeq 2000において、v1HiSeq Sequencing Reagentキットおよび補足的なMultiplex Sequencing Primerキットを使用して単一読み取り多重化配列決定を36サイクル実施した。IlluminaのRTA1.7/HCS1.1ソフトウェアを用いて画像解析および塩基呼び出しを実施した。CASAVAバージョン1.6を使用して配列をUCSChg19ヒト参照ゲノム(反復マスキングしていない)に対してアラインメントした。クラスタリングおよび配列決定は、独特の指標プライマーの利用可能性に応じて、8プレックス、12プレックス、16プレックス、24プレックス、48プレックス、96プレックス、またはそれ以上を用いて実施することもできる。
試料を第21染色体トリソミーと二染色体に分類するために、その内容が参照により本明細書に組み込まれるChiuら、(BMJ(2011年)342巻:c7401頁)およびEhrichら、(Am.J.Obstet.Gynecol.(2011年)204巻:205.e1−11頁)に記載されている方法と同様の方法を利用した。これらの試験に使用された方法とは異なり、本明細書で適用する分類は、臨床診察をシミュレートするために、「オンライン」様式で行った。1つのフローセルが処理されたらすぐに試料を呼び出した。この「オンライン」バージョンの分類予測では、ロバストな位置の推定値および染色体表示の尺度を使用することによって、標準化された染色体表示(例えば、フローセルに対してロバストなzスコア、またはFCに対してロバストなzスコア)を確立するために、フローセルに関連する全てのデータを使用した。染色体iについての染色体表示を示すchri、
(式中、カウントjは染色体j上のアラインメントされた読み取りの数である)を用いて、染色体iを伴う試料NについてのFCに対してロバストな染色体のzスコアの方程式は、
ヒトゲノムでは、現行の検出方法を用いて推定することができる反復ゲノム配列は、最大でゲノム全体の半分を表す。これらの反復性の領域は、単純な反復、またはタンデムな反復(例えば、大部分は染色体のセントロメアおよびテロメアにおいて見いだされるサテライトDNA、ミニサテライトDNA、マイクロサテライトDNA)、またはセグメント重複および分散反復(例えば、SINES、LINES、DNAトランスポゾン)の形態をとり得る。そのような重複のサイズは、数塩基対(bp)から、数百bpまで、およびはるか10〜300キロベース対までにわたり得る。これらの領域の反復性は、次世代シークエンシング技法のいくつか、例えば大規模並列処理ショットガン配列決定に存在するPCR増幅ステップの変動性の原因であると考えられている。
本明細書の図4〜図19に示されている表にしたグラフデータは、212例のダウン症候群妊娠および1,484例の正倍数性妊娠の全てについての胎児分率の共変量分析(胎児に由来する遊離型の循環しているDNAの百分率)を含む。データの可視性を改善するために、カテゴリーデータを標識した目盛の左側および右側に「ディザー処理」した。試験された妊娠の全てについて試料採取時に生育可能であり、また、全てが、診断検査結果(例えば、核型)が入手可能な単胎児妊娠であることが検証された。ディザー処理は、多くの場合、オーバープロットを回避するためにデータ点をランダムにジッタリングするまたはわずかにシフトさせることである。X軸座標をわずかに変動させて、プロットの全体的な見え方は変化させずに、そのカテゴリーについての個々の点を可視化することを可能にした。配列決定の前に胎児分率の検査結果が入手可能であったので、それらを使用して、試料の妥当性を決定した。許容できる胎児分率は両端を含めて4%から50%の間であった(グラフの薄い横破線)。臨床診察では、この範囲の外側の試料を、配列決定するために許容されないとみなすことができる。全体的な胎児分率中央値14.0%(幾何平均13.4%、算術平均15.0%)が図1〜図3に薄い横の実線として示されている。胎児分率が4%未満の場合、ダウン症候群由来の循環しているDNAと正倍数性妊娠由来の循環しているDNAの間の小さな差異を分解することが難しい。より高レベルでは、試料の取扱いの潜在的な問題が示される。胎児分率の分布は右側に歪んでいる。このような理由で、表示および分析は対数変換後に行う。回帰分析を用いて探究される共変量については、結果が統計的有意性に達しなかった場合は回帰直線のみが示されている。他の点では、95%予測限界も示されている。
(実施例3)
循環している無細胞DNAを利用した微小欠失の検出
出生前診断の分野は、母体の血漿から単離された循環している無細胞(ccf)胎児DNAの分子キャラクタリゼーションを可能にする技法を実行することを通じて進歩してきた。次世代シークエンシング方法体系を使用して、染色体異常を検出することができることが示されている。21トリソミーの検出は、分析的に、および大規模臨床試験においての両方で検証されている。13トリソミーおよび18トリソミー、性異数性、および他の稀な染色体異常に関する同様の検証がおそらく近い将来後に続くであろう。
試料の獲得
2つの別々の治験審査委員会(Investigational Review Board)(IRB)に認可された臨床試験実施計画書(Western Institutional Review Board ID 20091396およびCompass IRB 00462)の下で試料を採取した。侵襲的手段の前に、2つの影響を受けた血液試料を採取した。これらの試料に22q11.2微小欠失が存在することを、非経胎盤羊水穿刺によって得られた材料に対する核型分析によって確認した。14の対照試料を、その後の侵襲的手順を伴わずに採取し、したがって、対照試料については核型情報が利用不可能であった。全ての被験体は、EDTA−K2噴霧乾燥10mLバキュテナー(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)中に全血30〜50mLを採取するための静脈穿刺を含めた試験に関連するいずれの手順も書面のインフォームドコンセントをもたらされた後に受けた。試料を、処理するまで冷蔵した、または湿った氷上で保管した。採血の6時間以内に、母体の全血をEppendorf 5810Rプラススイングローターを使用して4℃、2500gで10分遠心分離し、血漿を採取した(例えば、約4mL)。血漿について、Eppendorf5810Rプラス固定角ローターを使用して、4℃、15,000gで10分、2回目の遠心分離を行った。2回目の回転後、血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、4mLの血漿バーコード一定分量に分配し、すぐに−80℃で凍結して DNA抽出まで保管した。
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kitを製造者のプロトコール(Qiagen)に従って使用して、ccfDNAを母体の血漿から抽出し、Buffer AVE(Qiagen)55μL中に溶出させた。
ccfDNAの相対的な品質および量を、当技術分野で公知の方法に従って胎児定量器アッセイ(FQA)によって評価した。FQAでは、母体のccfDNAおよび胎児のccfDNAの間のDNAのメチル化の差異を、定量するための基礎として用いる。16の分析された試料のそれぞれに対して、これによりその全体が参照により組み込まれるEhrichらおよびPalomakiら(Genet Med.(2011年)13巻(11号):913〜20頁およびGenetics in Medicine(2012年)14巻:296〜305頁)において以前に記載されている通りFQA分析を実施した。
TruSeqライブラリー調製(Illumina)用の推奨される製造者のプロトコールの改変バージョンを使用してライブラリーを創出した。抽出されたccfDNA(例えば、約40μL)をライブラリー調製用の鋳型として使用した。全てのライブラリーを、液体ハンドリング装置使用(liquid handler instrumentation)(Caliper Zephyr;Caliper LifeSciences)を使用し、末端修復、ライゲーション、およびPCR生化学的プロセスの後に磁気ビーズに基づく(Beckman Coulter)浄化ステップを伴う半自動化プロセスを用いて創出した。ccfDNAは、母体の血漿中に小さな範囲内の断片サイズで存在することがよく特徴付けられているので、抽出されたccfDNAまたは調製されたライブラリーのいずれに対してもサイズ選択は実施しなかった。各ライブラリーのサイズ分布および量を、キャピラリー電気泳動(Caliper LabChip GX;Caliper)を用いて測定し、各ライブラリーを約2nMの標準濃度に対して正規化した後に、CBot計器(Illumina)を使用してクラスタリングした。各試料を、HiSeq2000v3フローセル(Illumina)の2つのレーンを使用した合成による配列決定36サイクルに供した。
配列決定データの解析を、これによりその全体が参照により組み込まれるPalomakiら(Genet Med.(2011年)13巻(11号):913〜20頁およびGenetics in Medicine(2012年)14巻:296〜305頁)に記載の通り実施した。簡単に述べると、HiSeq2000計器からの全てのアウトプットファイル(例えば、.bcl files)をfastq形式に変換し、2009年2月に築かれたヒトゲノム(hg19)に対してCASAVA v1.7(Illumina)を使用してアラインメントした。その後の算出に対する反復配列の影響を最小限にするために、アラインメントした後、Repeat Library20090604(Universal Resource Locator(URL)ワールドワイドウェブrepeatmasker.org)に含有される情報に基づいてゲノムの反復性の領域とオーバーラップしている読み取りを全て除去した。解析のために、各染色体を別個の50kbのビンに分け、これらのビンのそれぞれにマッピングされた読み取りの数を合計した。その後の算出に対するG/C含量の偏りの影響を最小限にするために、各ビン内の読み取りを当技術分野で公知のLOESS法を使用してビンに特異的なGC含量に関して正規化した。次いで、ビンによる反復マスキングされ、GCについて正規化された読み取りカウントを、統計的有意性およびカバレッジを算出するために使用する。
妊婦16人の血漿から単離されたccf DNAに対して次世代シークエンシングを実施した。16人のうちの2人については、羊水穿刺後の核型分析により、染色体22q11.2欠失症候群の影響を受けた胎児を有することが確認された。14の対照試料の胎児の核型情報は入手不可能であった。影響を受けた試料2つから、対照試料と比較して同様の妊娠期間(19週および20週)に血漿を採取した(中央値=20週間;下の表6参照)。配列決定の前に、総ccfDNAに対する胎児の寄与を当技術分野で公知の通り測定した。全ての試料が10%超の胎児DNAを含有し、寄与の中央値は18%であり、胎児の微小欠失を有する2つの試料は17%および18%の胎児DNAを含有した(下の表6参照)。
各試料について、HiSeq2000フローセルの2つのレーンを使用して配列決定し、約3.1×から約4.4×の間のゲノムのカバレッジがもたらされた(上の表6参照)。50kbのビンサイズを使用して読み取りをビンに入れ、影響を受けた微小欠失試料について第22染色体にわたってビンを可視化して、影響を受けた試料について微小欠失の位置を同定した。確認された22q11.2微小欠失を保有する試料はどちらも、このゲノムの領域の表示の減少を示した(図47を参照されたい)。各試料について、第22染色体上の影響を受けた領域について、全ての試料の中央値と比較してZスコアを算出した。リスクが低い女性由来の血漿に対応する値は黒色で示されており、既知の22q11.2欠失症候群の症例を示す値は灰色で示されている。−3における破線は、分析された試料全てにわたるこの領域についての中央値表示よりも低い中央絶対偏差の3倍であるzスコアを表し、胎児の異数性の検出において伝統的に使用される分類カットオフである。
非侵襲的な出生前診断の分野における最近の進歩により、母体の血漿中に存在するccfDNAについて配列決定することによって胎児の異数性を検出することが可能になった。異数性を検出するために使用するものと同様の手法を使用して、本明細書で示されている結果により、発達中の胎児における染色体領域内レベルのCNVを、母体の血漿中の対応するccfDNAについて配列決定することによって非侵襲的に検出することの実現性が確認される。少数の症例ではあるが、本明細書で示されているデータにより、単一の染色体よりも小さな領域、この場合は22q11.2の欠失を母体の血漿から確実に検出することができることが示されている。Petersら(2011年)により、同様の方法体系を使用して検出された第12染色体の4.2Mbの欠失が報告された。Petersらは、妊娠期間の後期(35週)に検出された胎児の微小欠失の単一の症例を検査し、それを、第12染色体および第14染色体について二倍体であることが分かっている7つの試料と比較した。対照的に、上記の試験が公開される前に得られた、より早い妊娠期間(19週および20週)において影響を受けた試料を検査したものである本明細書で示されている結果では、利用した影響を受けた試料および影響を受けていない試料の数が2倍であり、上記よりも28%小さな(3Mb)微小欠失が検出された。さらに、本明細書で示されている結果では、4×ゲノムのカバレッジを利用して3Mbの胎児の欠失が首尾よく検出されており、これは、現行の標準の異数性検出に対しておよそ20倍のカバレッジの増加である。潜在的に0.5Mbに至るまでのより小さな欠失、または含有する胎児のccfDNAが少ない試料には、さらに高いカバレッジが必要になり得る。
ライブラリー調製の自動化、多重化レベルの増加およびバイオインフォマティクス
臨床的な正確度を維持しながら、処理量を3倍に増加させ、実践時間を4分の1に低下させるプロセスの変化のセットの実行が以下に提供される。この改変アッセイの3つの主要な変化は、多重化レベルがより高くなったこと(4プレックスから12プレックスへ)、配列決定ライブラリー調製が自動化されたこと、および新規のバイオインフォマティクス方法を実行することを含む。結果により、このプロトコールにより、21トリソミー、18トリソミーおよび13トリソミーを検出するための高い感度および特異度を維持しながら、より多くの処理量に適したより簡易化されたワークフローがもたらされることが確認される。
試料の獲得および血液の処理
3つの別々の治験審査委員会(Investigational Review Board)(IRB)に認可された臨床試験実施計画書(BioMed IRB 301−01、Western IRB 20091396、およびCompass IRB 00462)の下で、ハイスループットなアッセイの最初の評価(ライブラリー調製の開発およびアッセイの検証)のための試料を採取した。全ての被験体は、EDTA−K2噴霧乾燥10mLバキュテナー(EDTAチューブ;Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)中に最大20mLの全血、およびCell−Free DNA BCT10mLバキュテナー(BCTチューブ;Streck、Omaha、NE)中に30mLの全血を採取するための静脈穿刺を含めた試験に関連するいずれの手順も、書面のインフォームドコンセントをもたらされた後に受けた。EDTAチューブ中に採取された試料を、冷蔵、または湿った氷上で保管し、採血の6時間以内に血漿を処理した。BCTチューブ中に採取された試料を外界温度で保管し、採血の72時間以内に血漿を処理した。EDTAチューブ中の母体の全血を遠心分離し(Eppendorf5810Rプラススイングローター)、2500gで10分冷却し(4℃)、血漿を採取した。EDTA血漿について、4℃、15,500gで10分、2回目の遠心分離を行った(Eppendorf5810Rプラス固定角ローター)。2回目の回転後、EDTA血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、4mLのバーコード付けした血漿一定分量に分配し、すぐに−70℃以下で凍結してDNA抽出まで保管した。BCTチューブ中の母体の全血を遠心分離し(Eppendorf5810Rプラススイングローター)、1600gで15分温め(25℃)、血漿を採取した。BCT血漿について、25℃、2,500gで10分、2回目の遠心分離を行った(Eppendorf5810Rプラススイングローター)。2回目の回転後、BCT血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、4mLのバーコード付けした血漿一定分量に分配し、すぐに凍結して−70℃以下でDNA抽出まで保管した。
HiSeq2000からのBCL(塩基呼び出し)アウトプットファイルの全てを、FASTQ形式に変換し、2009年2月に築かれたヒトゲノム(hg19)に対してアラインメントした。マルチプレックス展開のためのライブラリーを以前のバージョンの生化学を用いて手動で調製したので、分析方法を以前に記載されている通り適用した(Palomakiら、2012年および本明細書)。その後の試験の全てについて、Bowtie2(Langmead B、Salzberg SL(2012年)Nat. Methods 9巻:357〜359頁)を使用して読み取りをhg19に対してアラインメントし、シード配列内の完全な一致のみを可能にした。解析のために、近接する、オーバーラップしていない50kbp長のゲノムのセグメントを含む標準のヒストグラムを使用して各染色体にマッピングされた読み取りを定量した。ビニング(binning)後、含まれた50kbpのゲノムのセグメントの選択を、以前に記載されている交差検証方法(Brunger AT(1992年)Nature 355巻:472〜475頁)を使用して決定した。高い試料間の分散、低いマッピング可能性(Derrien Tら(2012年)PLoS one 7:e30377頁)、または高い反復エレメントの百分率(Repeat Library 20090604;http://www.repeatmasker.org)を示すことに基づいて領域をさらなる解析から排除した。最後に、残りの50kbpのゲノムのセグメントに対応するアラインメントされた読み取りを正規化してGCの偏りを考慮に入れ(Alkan Cら(2009年)Nat Genet 41巻:1061〜1067頁)、各染色体に由来するアラインメントされた読み取りの分率を算出するために使用した。ロバストなzスコアを、記載の通り、式、Z染色体=(染色体分率試料−染色体分率フローセル中央値)/絶対偏差中央値を使用して算出した。染色体分率中央値は、各フローセルに特異的に算出され、中央絶対偏差(MAD)は静的MADに由来する定数値であった。
非侵襲的に胎児の異数性を検出するためのMPSSを使用したいくつかの臨床試験により、92〜100%の範囲の検出率が示され、同時に偽陽性率が1%未満に維持された。我々の目標は、プロトコールを合理化し、試料の処理量を増加させながら、この性能を維持または改善することであった。改善は、3つの態様に焦点を合わせた:I)ロバストな収率が可能になり、処理量が増加するようにライブラリー調製を最適化すること、II)単一のフローセルレーンに一緒にプールされる個別に分子的に指標された試料の数を増加させること(マルチプレックスレベル)、およびIII)異数性を分類するための分析的方法を改善すること。
本明細書に示されている開発には研究活動が先行し、その後に、CLIAによって認定された研究所において追加的な検証および検証試験が行われた。全体で、新しい研究所検査をもたらす研究から検証までのプロセス全体は、5000を超える試験試料によって支持される。この試験では、研究、最適化、開発の間に3400を超える試料について配列決定した。次いで、1269の試料を利用して臨床評価試験を実施し、その中で、各トリソミーについて0.08%以下の偽陽性率を維持しながら176の異数性試料全てを検出した。
A1. 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(g)正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(c)正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を検出するステップとを含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(g)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)(c)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(e)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(d)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(g)(f)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)(b)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(c)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(f)(e)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)(a)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(e)(d)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)(c)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(e)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(d)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(f)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(g)(f)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)(b)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(d)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(c)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(f)(e)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)(a)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(e)(d)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)各試料について(i)参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと(ii)部分のそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした関係から、複数の試料について参照ゲノムの部分のそれぞれについてのグアニンおよびシトシン(GC)の偏りを決定することと、
(b)(i)GCの偏りと(ii)参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係から参照ゲノムの部分のそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度をもたらし、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度における参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントの偏りが減少することと
を含む、実施形態E29からE40のいずれか1つに記載の方法。
Li=(mi−GiS)I−1 方程式α
(式中、GiはGCの偏りであり、Iは(b)のフィッティングした関係の切片であり、Sは(b)の関係の傾きであり、miは測定された、参照ゲノムの各部分にマッピングされたカウントであり、iは試料である)
に従って決定される、実施形態E41からE57のいずれか1つに記載の方法。
(a)配列受信モジュールによって、試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(b)論理処理モジュールによって、ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(c)論理処理モジュールによって、各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(d)論理処理モジュールによって、1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)論理処理モジュールによって、正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムを生成するステップと、
(f)データディスプレイ編成モジュールによって、論理処理モジュールによって決定されるのに応じて試料核酸における遺伝的変異の有無を示すデータディスプレイを編成するステップと
を含む方法の実行が遂行されるように適合されている、コンピュータプログラム製品。
(a)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(b)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(d)正規化された試料カウントに基づいて試料核酸における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む方法が実施されるシステム。
(a)試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
(b)試料から試料核酸を単離するステップと、
(c)試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
(d)ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
(e)各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
(f)(e)のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
(g)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って(f)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(h)第22染色体のヌクレオチド19,000,000位と22,000,000位の間に対応する1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
(i)(h)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(b)正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されているシステム。
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(b)正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている装置。
(a)参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(b)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されているシステム。
(a)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(b)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている装置。
(a)参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
(a)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(a)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
(d)(c)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されているシステム。
(a)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(b)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(a)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(c)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
(d)(c)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている装置。
(a)参照ゲノムの部分にマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
(b)反復配列および/または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
(c)1つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、(b)で残ったカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
(d)1つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
(e)(d)における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
Claims (15)
- 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
(a)参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦から得られた循環している無細胞核酸を含む試験試料から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
(b)グアニンおよびシトシンの含量に従って(a)における前記カウントを補正し、それによって補正されたカウントを提供するステップであって、前記補正は、
(i)(1)前記試験試料について前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントと(2)前記セクションのそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした線形関係に基づいて、前記試験試料についてのグアニンおよびシトシン(GC)の偏り係数を決定することであって、前記試験試料についての前記GCの偏り係数が、(i)(1)と(i)(2)との間のフィッティングした線形関係の傾きである、ことと、
(ii)方程式α:
Li=(m i−GiS)/I 方程式α
(式中、Liが前記試験試料についての前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションの高度であり、m iが前記試験試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントであり、iが前記試験試料であり、Giが(i)で決定された前記試験試料についてのGCの偏り係数であり、Iが、(1)(i)複数の試料のそれぞれについての前記セクションのそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと(ii)前記セクションのそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした線形関係に基づく、前記複数の試料のそれぞれについてのGCの偏り係数であって、前記複数の試料のそれぞれについての前記GCの偏り係数が、(ii)(1)(i)と(ii)(1)(ii)との間のフィッティングした線形関係についての傾きである、GCの偏り係数と(2)前記複数の試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントとの間の、前記セクションのそれぞれについてのフィッティングした線形関係の切片であり、Sが前記セクションのそれぞれについての(ii)(1)と(ii)(2)との間のフィッティングした線形関係の傾きである)
に従って前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それによって、前記補正されたカウントであるゲノミックセクションの高度を提供することと
を含むステップと、
(c)参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦の群から得られた循環している無細胞核酸を含む試料の群における各試料から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップであって、(a)における前記試験試料と(c)における前記試料の群は、共通のフローセルユニット、同じコンテナに由来するフローセル、同じロットに由来するフローセルまたは同じ製造運転で製造されたフローセル、共通の試薬プレートユニット、同じコンテナに由来する試薬プレート、あるいは同じロットに由来する試薬プレートまたは同じ製造運転で製造された試薬プレートから選択される1つまたは複数の共通の実験条件に曝露される、ステップであって、(c)において得られる前記カウントが、グアニンおよびシトシンの含量に従って補正され、それによって補正されたカウントが提供され、ここで、(c)において得られる前記カウントが、以下:
(i)(1)前記試料の群における各試料について前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントと(2)前記セクションのそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした線形関係に基づいて、前記試料の群における各試料についてのグアニンおよびシトシン(GC)の偏り係数を決定することであって、前記試料の群における各試料についての前記GCの偏り係数が、(i)(1)と(i)(2)との間のフィッティングした線形関係の傾きである、ことと、
(ii)方程式α:
Li=(m i−GiS)/I 方程式α
(式中、Liが前記試料の群における各試料についての前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションの高度であり、m iが前記試料の群における各試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントであり、iが前記試料の群における各試料であり、Giが(i)で決定された前記試料の群における各試料についてのGCの偏り係数であり、Iが、(1)(i)前記複数の試料のそれぞれについての前記セクションのそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと(ii)前記セクションのそれぞれについてのGC含量との間のフィッティングした線形関係に基づく、前記複数の試料のそれぞれについてのGCの偏り係数であって、前記複数の試料のそれぞれについての前記GCの偏り係数が、(ii)(1)(i)と(ii)(1)(ii)との間のフィッティングした線形関係についての傾きである、GCの偏り係数と(2)前記複数の試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントとの間の、前記セクションのそれぞれについてのフィッティングした線形関係の切片であり、Sが前記セクションのそれぞれについての(ii)(1)と(ii)(2)との間のフィッティングした線形関係の傾きである)
に従って前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それによって、前記補正されたカウントであるゲノミックセクションの高度を提供することと
によって補正される、ステップと、
(d)(c)における前記試料の群から得られる前記補正されたカウントに従って得られる予測カウントまたは前記予測カウントの誘導値に従って、(b)における前記補正されたカウントを第1のゲノムセクションについて正規化、または(b)における前記補正されたカウントの誘導値を前記第1のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
(e)前記正規化された試料カウントに基づいて、前記試験試料について胎児の異数性の有無を検出するステップと
を含む、方法。 - 前記試料核酸が前記妊婦由来の血漿由来のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記試料核酸が前記妊婦由来の血清由来のものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記胎児の異数性が13トリソミーである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記胎児の異数性が18トリソミーである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記胎児の異数性が21トリソミーである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記予測カウントがカウント中央値である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カウントを正規化する前記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化されたカウントがzスコアである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化されたカウントがロバストなzスコアである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のゲノミックセクションについての前記カウントの前記誘導値が前記第1のゲノミックセクションのパーセント表示である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中央値がパーセント表示の中央値である、請求項7に記載の方法。
- 前記パーセント表示が染色体表示である、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸を配列決定し、それによって、核酸配列読み取りを提供するステップ、および前記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングするステップを含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
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