CN102666946B - 用于聚合物分析的纳米通道阵列和近场照射装置以及相关方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于聚合物分析的装置和方法，其中将标记的聚合物沿着内部具有照射检测区域的纳米通道转移。当标记的化合物沿纳米通道转移并且该标记经过照射检测区域时，该标记变为可检测的(例如，其中不同的标记对在不同的照射区域存在的不同波长做出反应而发荧光)，并且使用者产生沿聚合物长度的多种标记位置的空间图像。然后使标记位置与聚合物的一个或多个结构特性相关联。

Description

用于聚合物分析的纳米通道阵列和近场照射装置以及相关 方法

相关申请

本申请要求2009年9月28日提交的第61/246,251号美国申请的权益，其整体并入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及纳米流体学领域并且涉及大分子分析领域。

背景

对基因材料(例如，核酸聚合物)结构和与该结构有关的生理学特性表达(或可能的表达)之间的关系的兴趣日益增加。因此，本领域亟需能够快速且有效地聚集这类结构信息的装置和方法。若能够有效地比较多个样品的结构，则这些装置和方法的价值将进一步增加。

概述

在遇到所述挑战时，本发明首选提供了分析装置，其包括：沿第一基板表面安装的多个纳米通道，每一纳米通道由侧壁和底板界定；以及布置在第二基板上的至少一个纳米缝隙，布置所述纳米缝隙以使在至少一个所述纳米通道内通过所述纳米缝隙的至少第一波长的电磁辐射界定横截面尺寸小于所述第一波长的照射区域。

本发明还提供了分析装置，其包括：沿第一基板表面安装的多个纳米通道，每一纳米通道由侧壁和底板限定，布置在至少一个纳米通道周围的相位掩模板，以使在至少一个所述纳米通道中通过相移掩模板的至少第一波长的电磁辐射界定了在至少一个所述纳米通道内的照射区域，所述照射区域的横截面尺寸小于所述第一波长。

还提供了分析方法，其包括使包含两个或多个标记的大分子沿一个或多个纳米通道移动经过两个或多个激发区域；使用电磁辐射激发在所述激发区域内的所述标记以产生一个或多个信号，所述激发区域的特征在于横截面尺寸小于所述电磁辐射的波长；以及使所述一个或多个信号沿所述大分子与所述标记的相对位置相关联。

附图简述

当参考随附的附图进行阅读时，能进一步理解概述以及下列详细的描述。为了示例可能性实施方案的目的，在附图中示出多种示例性实施方案，然而，可能的实施方案并不限于公开的具体方法、组合物以及装置。此外，不必要按比例绘制附图。在附图中：

图1描述了在近场照射器阵列上/下装配的纳米通道阵列，在它们的交叉处产生了多个矩阵检测位置-即由荧光体标记的聚合物流经纳米通道，荧光体将由在矩阵检测位置的照射器激发，并且将检测到该信号；

图2描述了近场照射器阵列的非限制性的基于纳米缝隙的实施方案，其包括5个缝隙，除了蓝色具有两个缝隙外，一个缝隙用于一种颜色，即两个蓝色缝隙用于检测聚合物分子当流经通道和流过缝隙时的速率，并且缝隙将近场照射限制于纳米通道的窄(亚-100nm级)区域。在该实施方案中，聚合物为由4种不同颜色的荧光团标记的DNA分子，并且当合适的荧光团经过照射的缝隙(矩阵检测区域)时，其变成激发的并发射荧光信号，并且能通过使用测量速率的软件测定荧光标记沿DNA的空间图像；

图3描述了装配纳米缝隙装置的示例性方案；

图4描述了通过并入纳米通道顶部的相移掩模板产生近场照射的样品实施方案；

图5描述了将相移掩模板装在基板外部的实施方案；

图6描述了相移装置的装配；

图7示出示例性信号检测和分析，其中将激光在片的纳米缝隙底部上聚集为线，当DNA流经一个纳米通道而经过纳米缝隙时，荧光激发在DNA上的探针，并且检测激发的荧光信号，对DNA流经的每一矩阵检测区域产生时间条形码信号，将该信号翻译为DNA的空间条形码；

图8描述了在3个不同的依次时间间隔t0、t1和t2下显示的具有两个照射波长的矩阵装置，即每一检测区域及时产生表示通过该区域的具体荧光团的标记的时间信号；以及

图9描述了将本发明的条形码用于鉴定核酸生物聚合物(DNA)的结构变体。

示例性实施方案的详述

可能性实施方案不限于本文描述和/或显示的具体装置、方法、应用、条件或参数，并且本文使用的术语为仅通过实施例来描述特定实施方案的目的，并且不旨在受到限制。此外，除非上下面明确地另有所指，如在包括随附的权利要求的本说明书中所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“一(the)”包括复数，并且指代特定数值时至少包括该特定值。如本文所用，术语“多个”是指大于一个。当表达数值范围时，其它实施方案包括从一个特定值和/或至其它特定值。类似地，当通过使用前缀“约”来将值表达为近似值时，则应理解该特定值形成另一实施方案。所有范围为包含的且可组合的。

为了清楚而在单独实施方案的上下文中描述的可能性实施方案的特征还可以组合形式提供在单一实施方案中。相反，为了简洁而在单一实施方案的上下文中描述的可能性实施方案的多种特征还可分别地或以任何亚组合的形式提供。此外，提及范围内给出的数值时其包括该范围内的每一和各个值。

尤其地，本发明提供了基于纳米通道阵列和近场照射器阵列矩阵装置的聚合物分析系统和方法。纳米通道阵列(例如，以整体形式通过引入并入本文的美国专利申请10/484,793)适于纳米通道的阵列，其中聚合物分子线性流动以使每次仅有一个聚合物分子占据纳米通道部分。纳米通道适于被度量，从而通过例如熵限制至少部分地延长在纳米通道内移动的大分子。

在一个实施方案中，本发明包括在纳米管道上/下产生近场照射器阵列的其它装置，如在非限制性的图1中所示，该图描述了纳米通道和对应的近场照射器组，其产生在纳米管内布置的检测区域矩阵。位于接近(例如，在下面、上面或二者)近场照射器的纳米通道阵列部分形成了检测区域矩阵。

将检测区域进行界定，以便在纳米管道中，目标物体的照射发生在这些区域内，并且区域为适当的且空间纵向小于所使用的光的波长。优选地，照射区域小于所使用的光的波长的衍射极限。这例如在图1中所示，其在本文其它部分更详细地描述。

在一个实施方案中，如非限制性的图2、7、8和9中所示，当它们聚合物分子近场照射器下面/上面时由发荧光的物体标记该聚合物分子。

实际上，荧光体能为当暴露于特定波长的光时为可检测的任何物质。荧光团(荧光素、德克萨斯红、YOYO、BODIPY-FL等)为特别合适的。适当地设置标记以特定结合至在聚合物/大分子上的特定结构基元，从而允许使用者将具有确定自由度的基元放置在大分子上或不同的大分子上。

作为一个非限制性实例，使用者可选择当暴露于示例性波长X的光时发荧光的第一标记。还设置第一标记使其特定地结合于核酸的特定的第一序列。这可通过将该标记结合至与核酸第一序列互补的一个或多个核酸或其它物质来完成。这样，荧光团能通过选择与荧光团连接的一个或多个“连接子”基团来用于检测存在于聚合物样品内特定序列中的一种、两种或多种核酸(或其它单元)的存在。

使用者还能选择当暴露于示例性波长Y的光时发荧光的第二标记。还设置第二标记使其特定地结合于核酸的特定第二序列。这可以通过将标记结合至与核酸第二序列互补的一个或多个核酸或其它物质来完成。这样，使用者因此能标记包含核酸第一和第二序列的大分子的那些区域，然后当标记暴露于波长X和Y的照射时，使这些标记可视化，如图2、7和8中所示。

检测所示标记信号并使其与处于研究中的大分子的一个或多个特性相关联。在每一物体/标记通过多个近场照射器时，将其检测多次，这要考虑到待测定的荧光物体的运送速率。这样，用荧光标记来标记的聚合物具有通过监测源自矩阵检测区域的时间信号而产生的聚合物上的标记的空间图像(“条形图”)，并随后使用软件重组图像，如非限制性的图7所示。当近场照射器仅照射通道的窄区域时，条形码图像的空间分辨率能小于照射光的衍射极限。这具有许多有用的应用，如本文其它方面所示。

近场照射器阵列能由多于一个波长的电磁辐射组成。选择这些波长以便每一波长激发特定的荧光团(参见图2、7和8)。这样，对于在分析中的给定大分子，能产生多颜色条形码空间图像，如图9所示。

在该图中所示，使用本方法，使用者能生成大分子上目标区域(或多个区域)的参考图像。该目标图像可能涉及例如与特定蛋白表达有关的基因(或其部分)，或者可能以其它方式为特定生理特性的标示。一旦已经获得参考图像，则使用者可鉴定在大分子上的参考图像的两个/多个位置、参考图像的删除、参考图像的倒置或参考图像的易位。这样，使用者能分析和相互比较多个样品，从而确定样品群的特定成员是否具有目标区域，或某些成员是否具有该区域的某些变体。这些变体、删除、倒置乃至易位能证明生理或疾病状态或者甚至易患这类状态，如本文其它方面所述。

示例实施方案：纳米缝隙近场照射器

在一个实施方案中，近场照射器的阵列通过使纳米缝隙在纳米通道下/上图形化而产生，如图2所示。这些缝隙适当地由金属制成。缝隙开口优选为1nm至500nm宽，但还能为1nm至约300nm，10nm至约100nm，或甚至为约15nm。

如图2所示，样品阵列包括5个缝隙，除了蓝色具有两个缝隙外(图的最左和最右处所示)一个用于一种颜色。(两个蓝色缝隙用于测定聚合物分子当其流经通道和流过缝隙时的速率)

缝隙将近场照射限制于纳米通道的窄(亚-100nm级)区域。在本图中，大分子为由4个不同颜色的荧光团标记的DNA分子。当合适的荧光团经过照射的缝隙(矩阵检测区域)时，荧光团变为激发的并发射荧光信号。通过使用经过装置检测区域的DNA的测量速率的软件来适当地产生荧光标记沿DNA的空间图像。

该实施方案的概念为通过使由不透明材料组成的缝隙具有远小于照射光波长的开口而限制通过窄缝隙的光透射(图2)。照射光渐逝场将在缝隙上从缝隙开口仅直接侧向延伸几十纳米，因此提供了存在照射光的纳米通道的非常窄的区域(＜100nm)。

在非限制性图中所示，将具有荧光探针的DNA聚合物片段延伸并流经纳米通道以及流过纳米缝隙。窄的纳米通道高度(例如，在一些实施方案中为约50nm)确保当探针/荧光团经过缝隙时大分子探针足以接近于纳米缝隙开口而被激发。因为激发光被物理限制于小区域(＜100nm)，所以在长度尺寸上单独地检测荧光团，因此克服已限制了其它检测装置的衍射分辨率极限。在某些实施方案中，通道可以具有的高度为10nm、50nm、100nm、200nm、500nm或甚至为1微米。

在该特定实施方案中，至少一个波长的光适当地具有至少2个与该光有关的缝隙，以便两个缝隙能用于测定标记速率和DNA分子的速率。每一波长与多个缝隙有关，以便各个标记具有多于一次的被检测到的机会。多个相同标记的测定考虑到对假阴性和假阳性读数的矫正的可能性。实施方案的纳米缝隙装置的装配

在图3中所示的一个可能的装配方案为装配纳米缝隙实施方案，其将纳米通道阵列蚀刻在诸如熔融石英的透明基板或本文其它方面描述的其它材料的表面中。实例过程包括使抗蚀剂膜在基板表面上图形化、通过等离子蚀刻将图形转移至基板中、然后除去抗蚀剂的光刻法。

然后，使由金属组成的纳米缝隙的阵列在其它透明基板上图形化。示例性过程包括将金属膜沉积在基板上，然后使用光刻法使抗蚀剂膜在金属上图形化。将抗蚀剂用作掩模板以蚀刻去暴露的金属，随后在金属蚀刻之后除去抗蚀剂。通过将通道阵列与缝隙阵列结合在一起、彼此正交定向而完成矩阵装置。结合方法包括例如熔融结合、阳极结合、等离子活化结合、金属结合、接触结合等。

实施方案：相移掩模板照射

在由图4和5所示的该样品实施方案中，采用相移掩模板以在纳米通道阵列内产生小于所用光的波长的照射区域。照射区域的宽度随所用波长和相移掩模板拓扑学而变化，如本领域普通技术人员所公知的。根据构造，大小为λ/4的照射区域是可能的。

相移掩模板为公知的，并在半导体工业中用于使光抗蚀剂图形化以具有小于光的波长的特征。如本领域所知，这类相移掩模板利用由相位差产生的干涉以改善光刻法中的图像分辨率。

在另一变化中，能通过近场全息(NFH)掩模板来产生纳米通道内的近场照射。一个实施方案使用45度的NFH光栅照射。在一定角度入射的光部分衍射为负一(-1)级，并且在负一级和未衍射零级间的自干涉产生了干涉图形，其具有的间距等于相位掩模板间距。通过使用相移掩模板(不论是标准掩模板或NFH掩模板)，使用者能将掩模板用于界定检测荧光团用的纳米通道内的检测区域。这由非限制性图4和5示出，其各自示出不同构造的相移掩模板。在本发明的一些实施方案中，相移掩模板能在纳米缝隙的位置使用或者甚至与纳米缝隙相结合地使用。

实施方案的相移的装配

如图6所示，能通过将由纳米通道阵列图形化的基板结合(例如正交地结合)至由相移掩模板阵列图形化的基板来装配相移掩模板实施方案。装配相移掩模板的一个方法为将光刻用于使抗蚀剂膜在基板上图形化，然后通过等离子蚀刻将该图形转移至基板中，然后除去抗蚀剂。然后，通过熔融结合、阳极结合、金属结合、等离子活化结合、粘合等将相移掩模板结合于纳米通道基板。

实施方案：信号检测和分析

在一个示例性实施方案(图7)中，当具有荧光标记的聚合物(例如，DNA)经过纳米通道的矩阵检测区域时，将合适的荧光标记激发并发荧光。例如，这还由图2所示，其中当经过第一纳米缝隙时仅有“蓝”荧光团发荧光(其允许仅激发“蓝”荧光团的照射进入)，当经过第二纳米缝隙时，仅有“绿”荧光团发荧光(其允许仅激发“绿”荧光团的照射进入)，等。

如图7所示，将一个或多个激光(或其它辐射源)聚集在片的纳米缝隙的底部，从而当DNA流经纳米通道时随该DNA流过纳米缝隙而荧光激发DNA上的探针。检测激发的荧光信号，对于DNA流经的每一矩阵检测区域产生时间条形码信号。使用合适的算法(例如，由软件生成的)，然后将这些信号翻译为DNA的空间条形码。条形码说明了DNA上多种荧光团的位置，然后，使用者反过来能将其用于得到与多种荧光团连接的多种核酸序列的位置图像。多种序列的位置(或仅为多种序列的存在)的这种知识产生了关于样品总结构的信息，该样品结构能与患者/个体的疾病状态(或甚至为疾病状态的可能性)相关联。

这将导致在每一矩阵位置产生时间依赖性的信号，然后通过诸如具有图像传感器/像素矩阵的CCD相机的光传感器来单独地监测该信号。

通过监测沿相同通道由相同波长的矩阵检测区域产生的信号图形，能将图形进行比较以确定那种信号对应于聚合物样品上的相同荧光团标记(图7，插图)。这样，能测定聚合物速率。此外，通过测定多个矩阵检测区域中的相同荧光团标记，能实现充足的冗余度，从而能将假阴性和假阳性误差校正并入软件。

通过非限制性图8示出其它细节。该图描述了具有多个通过两种波长的照射而照射的纳米通道的矩阵装置，以及在3个不同的、依次的时间间隔(即，t0，t1和t2)下显示的所得荧光。每一矩阵检测区域产生时间信号，其即时地表示通过该区域的具体荧光团的标记。一旦已测定DNA片段的标记序列，则其能用于分析DNA。DNA分析的实例包括结构变体图像。

在一方面中，本发明提供了分析装置。这类分析装置适当地包括沿第一基板表面安装的多个纳米通道，每一纳米通道由侧壁和底板界定；以及布置在第二底板上的至少一个纳米缝隙，布置所述纳米缝隙以便在至少一个纳米通道内经过纳米缝隙的至少第一波长的电磁辐射界定了横截面尺寸小于第一波长的照射区域。

可以以多种方式装配纳米通道；美国专利申请10/484,793(其整体以引用方式并入本文)描述了合适的纳米通道和装配方法。

在装置中，合适的第一基板包括二氧化硅或硅，这两种材料在本领域中被充分表征。其它合适的材料包括，例如，电介质、绝缘体、玻璃、高硼硅玻璃、钠钙玻璃、氧氮化硅，SiO_xN_y、氢化二氧化硅、氢化氮化硅、氢化氧氮化硅、高K电介质、含钛的化合物：TiSiO、TiO、TiN、氧化钛、氢化氧化钛、氮化钛、氢化氮化钛，TaO、TaSiO、TaO_xN_y、Ta₂O₅、TaCN、氧化钽、氢化氧化钽、氮化钽、氢化氮化钽，含铪的化合物：例如HfO₂、HfSiO₂、HfZrO_x、HfN、HfON、HfSiN、HfSiON、氧化铪、氢化氧化铪、氮化铪、氢化氮化铪，ZrO₂、ZrSiO₂、ZrN、ZrSiN、ZrON、ZrSiON、氧化锆、氢化氧化锆、氮化锆、氢化氮化锆、Al₂O₃、AlN、TiAlN、TaAlN、WAlN、氧化铝、氢化氧化铝、氮化铝、氢化氮化铝、SiN、WN、低K电介质、掺氟的二氧化硅、掺碳的二氧化硅、多孔二氧化硅、多孔掺碳的二氧化硅、旋压的有机聚合物电介质、石墨、石墨烯、碳纳米管、塑料、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)，环烯烃共聚物(COC)，任意前述的化学计量的变体或其任意的组合。本领域技术人员在鉴定用于特定应用的最佳材料时将会很少遇到困难。

适当地，至少一个纳米通道的特征至少为包括的侧壁间的宽度为约10nm至约1000nm。纳米通道可具有的这类宽度为约50nm至约750nm，或约100nm至约500nm，或约200nm至约400nm，或者甚至为约300nm。根据使用者的需求，纳米通道为适当地彼此平行，但还可正交或接枝。

在合适的装置中，至少一个纳米通道的特征为包括从纳米通道的侧壁顶部至底板的深度为约10nm至约1000nm。深度还可以为约50nm至约750nm，或约100nm至约500nm，或约200nm至约400nm，或者甚至约300nm。

至少两个邻近纳米通道的最接近的侧壁被适当地分开为至少约150nm、或约200nm、约400nm、约500nm、约1微米、约5微米、或者甚至为约50微米或约100微米。根据使用者的需求，邻近的纳米管甚至可以进一步彼此分开。

在对至少第一波长的电磁辐射为不透明的第二基板中适当地布置至少一个纳米缝隙。纳米缝隙适当地为与第二底板不同的材料，因为电磁辐射适当地通过第二基板，然后通过纳米缝隙。纳米缝隙材料适当地包括对目标电磁辐射不透明的材料，其包括金属(例如，铝、金、银、铂、铬、钛、镍、钨、铜、钴、Pd、Ir、Fe、Ru、Mn、Mo、V、Nb、Ta、Zr、Hf、La、Y、Sc、Mg、Ca、Sr、Ba等)。聚合物、碳纳米管、石墨、石墨烯以及任意的前述材料的组合也为适当的。

纳米缝隙适当地是特征为横截面尺寸小于第一波长的孔。纳米缝隙可以为槽形，但还可以为卵形或弧形，并且不需要必须具有直的边缘。纳米缝隙孔适当地具有的横截面尺寸为约1nm至约300nm、或约10nm至约100nm、或约20nm至约70nm。

第一和第二基板适当地彼此结合，并且可以为相同材料、或更适当地为不同的材料。第二基板可包含二氧化硅、硅、电介质、绝缘体、玻璃、高硼硅玻璃、钠钙玻璃、氧氮化硅、SiO_xN_y、氢化二氧化硅、氢化氮化硅、氢化氧氮化硅、高K电介质、含钛的化合物：TiSiO、TiO、TiN、氧化钛、氢化氧化钛、氮化钛、氢化氮化钛，TaO、TaSiO、TaO_xN_y、Ta₂O₅、TaCN、氧化钽、氢化氧化钽、氮化钽、氢化氮化钽、含铪的化合物：例如HfO₂、HfSiO₂、HfZrO_x、HfN、HfON、HfSiN、HfSiON、氧化铪、氢化氧化铪、氮化铪、氢化氮化铪，ZrO₂、ZrSiO₂、ZrN、ZrSiN、ZrON、ZrSiON、氧化锆、氢化氧化锆、氮化锆、氢化氮化锆、Al₂O₃、AlN、TiAlN、TaAlN、WAlN、氧化铝、氢化氧化铝、氮化铝、氢化氮化铝、SiN、WN、低K电介质、掺氟的二氧化硅、掺碳的二氧化硅、多孔二氧化硅、多孔掺碳的二氧化硅、旋压的有机聚合物电介质、石墨、石墨烯、碳纳米管、塑料、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)，任意前述的化学计量的变体，或其任意的组合。

第二基板对所应用的电磁辐射适当地为透明的；不总是需要第一基板材料必为类似透明的。基板的透明度可以由装置构造而决定，即，辐射探测器是否收集经过第一或第二基板的光。在一个适当的设计中，探测器收集通过第一基板的光。

装置适当地包括能够发射至少第一波长的电磁辐射的源。激光器为一种这样的合适的辐射源。

辐射源适当地为能够发射至少一个频率分量为约100nm至约20,000nm、或约500nm至约10,000nm、或约1000nm至约5000nm的电磁辐射的装置。为约350nm至约1500nm的频率被认为是特别合适的。辐射源适当地发射在可见光或甚至在红外范围中的辐射。然而，公开的装置可以适当地基于辐射发挥作用，所述辐射的范围为从远-UV(即，约300nm或以下)至约示例性CO₂激光器能力(约10微米)。

在另一方面，本发明提供了分析装置。这些装置适当地包括：沿第一基板表面安装的多个纳米通道，每一纳米通道由侧壁和底板界定，布置在至少一个纳米通道周围的相位掩模板，以便在至少一个纳米通道中经过相移掩模板的至少第一波长的电磁辐射界定了至少一个纳米通道内的照射区域，该照射区域的横截面尺寸小于第一波长。

基板材料包括本文其它方面所述的那些。硅和硅被认为是特别合适的材料。纳米通道适当地具有在本文其它方面所述的尺寸，并且如本文其它方面所述而适当地分开。

相位掩膜板适当地包括特征为对至少第一波长的电磁辐射为基本透明的材料。在一些实施方案中，相位掩模板包括近场全息掩模板。这类掩模板对于本领域技术人员是已知的，并且通过将光束分为两个以便彼此干涉而适当地操作。近场掩模板被认为是相位掩模板的亚组。在技术上，NFH掩模板为相位掩模板的亚组。相位掩模板适当地与第一基板结合。

装置适当地包括能够发射至少第一波长的电磁辐射的源。这类源包括激光器，并且合适的波长在本文其它方面描述。除激光器之外的其它辐射源也被认为是合适的。

还提供了分析方法。这些方法适当地包括：使包含两个或多个标记的大分子沿一个或多个纳米通道移动经过两个或多个激发区域；使用电磁辐射激发在激发区域内的标记以产生一个或多个信号，激发区域的特征为横截面尺寸小于所述电磁辐射的波长；以及使一个或多个信号沿大分子与标记的对应位置相关联。

使用通过诸如纳米缝隙的辐射限定器或其它限定装置传送的电磁辐射来适当地激发标记。标记包括荧光燃料、放射性颗粒、磁性颗粒等；本文描述了适当的标记。标记适当地与一个或多个大分子的特定区域互补，这反过来能让使用者使用标记区分两个或多个区域。作为一个非限制性实例，标记可以与自身与目标序列互补的核酸序列结合。

在一些实施方案中，通过相同波长的电磁辐射激发两个或多个标记。在其它实施方案中，通过不同波长的电磁辐射激发两个或多个标记。

可以在不同激发区域激发两个或多个标记。在其它实施方案中，在相同的激发区域激发两个或多个标记。

方法包括使源自两个或多个大分子上的两个或多个标记的信号相关联，并且还包括使一个或多个标记的相对位置与生理学状态、疾病状态或其任意组合相关联。例如，使用者可以确定样品上两个区域(例如，区域x1和x2)间的间距；若间距超过那两个区域间的正常间距，则使用者可以推断个体具有特定生理状态。作为其它实例，使用者可以发现特定靶序列的探针与源自个体的DNA结合五次；若正常个体仅表现出零个或一个拷贝的该序列，则使用者可具有个体携带过度拷贝的序列的现象。该拷贝数可以反过来表明个体患有特定疾病状态或为未特定疾病的携带者。使用者还可以使标志的数量和图形与生理状态相关联，因此让使用者建立与标记/标志存在相关的生理状态库，针对该库，使用者能对来自未来个体的结果进行比较。

Claims (59)

1.分析装置，其包括：

沿第一基板表面安装的多个纳米通道，

每一所述纳米通道由侧壁和底板界定；以及

布置在第二基板中的至少一个纳米缝隙，布置所述纳米缝隙以使在至少一个所述纳米通道内，经过所述纳米缝隙的至少第一波长的电磁辐射界定了横截面尺寸小于所述电磁辐射的第一波长的照射区域。

2.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板包含二氧化硅、硅、玻璃、氢化氮化硅、氢化氧氮化硅、含钛的化合物、TaSiO、TaO_xN_y、TaCN、氧化钽、氮化钽、含铪的化合物、TaAlN、WAlN、氧化铝、氮化铝、SiN、WN、石墨、石墨烯、碳纳米管、塑料、任意前述化合物的化学计量变体，或所述化合物的任意组合。

3.如权利要求2所述的分析装置，其中所述含钛的化合物为TiAlN。

4.如权利要求1所述的分析装置，其中至少一个所述纳米通道的特征为所述侧壁之间的宽度为10nm至1000nm。

5.如权利要求1所述的分析装置，其中至少一个所述纳米通道的特征为从所述纳米通道的侧壁顶部至所述纳米通道的底板的深度为10nm至1000nm。

6.如权利要求1所述的分析装置，其中至少两个邻近的所述纳米通道的最接近侧壁相隔至少150nm。

7.如权利要求1所述的分析装置，其中至少两个邻近的所述纳米通道的最接近侧壁相隔至少400nm。

8.如权利要求1所述的分析装置，其中将至少一个所述纳米缝隙布置在对至少第一波长的电磁辐射不透明的第二基板中。

9.如权利要求1所述的分析装置，其中至少一个所述纳米缝隙包含特征为横截面尺寸小于所述第一波长的横截面尺寸的孔。

10.如权利要求1所述的分析装置，其中至少一个所述纳米缝隙包含特征为横截面尺寸为1nm至300nm的孔。

11.如权利要求10所述的分析装置，其中至少一个所述纳米缝隙包含特征为横截面尺寸为10nm至100nm的孔。

12.如权利要求10所述的分析装置，其中至少一个所述纳米缝隙包含特征为横截面尺寸为20nm至70nm的孔。

13.如权利要求8所述的分析装置，其中所述第一基板和第二基板彼此结合。

14.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第二基板包含二氧化硅、硅、玻璃、氢化氮化硅、氢化氧氮化硅、含钛的化合物、TaSiO、TaO_xN_y、TaCN、氧化钽、氮化钽、TaAlN、WAlN、氧化铝、氮化铝、SiN、WN、石墨、石墨烯、碳纳米管、塑料、任意前述化合物的化学计量变体，或所述化合物的任意组合。

15.如权利要求14所述的分析装置，其中所述含钛的化合物为TiAlN。

16.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含氢化二氧化硅、掺氟的二氧化硅、掺碳的二氧化硅、多孔二氧化硅、多孔掺碳的二氧化硅或它们的任意组合。

17.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含电介质。

18.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含高K电介质、低K电介质、旋压的有机聚合物电介质或它们的任意组合。

19.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含绝缘体。

20.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含聚合物。

21.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含共聚物。

22.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含嵌段共聚物。

23.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃共聚物或它们的任意组合。

24.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含氧化钛、氮化钛、氧化铪、氮化铪、氧化锆、氮化锆或它们的任意组合。

25.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含氢化氧化钛、氢化氮化钛或它们的任意组合。

26.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含HfSiO₂、HfZrO_x、HfON、HfSiN、HfSiON、ZrSiO₂、ZrN、ZrSiN、ZrON、ZrSiON、Ta₂O₅或它们的任意组合。

27.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含氢化氧化钽、氢化氮化钽、氢化氧化铪、氢化氮化铪、氢化氧化锆、氢化氮化锆、氢化氧化铝、氢化氮化铝或它们的任意组合。

28.如权利要求1所述的分析装置，其中所述第一基板或所述第二基板包含高硼硅玻璃、钠钙玻璃、氧氮化硅或它们的任意组合。

29.如权利要求1所述的分析装置，其还包括能发射至少第一波长的电磁辐射的源。

30.如权利要求29所述的分析装置，其中所述源包括激光器。

31.如权利要求29所述的分析装置，其中所述源包括能发射至少一个频率分量为100nm至20,000nm的电磁辐射的装置。

32.如权利要求31所述的分析装置，其中所述源包括能发射至少一个频率分量为350nm至1500nm的电磁辐射的装置。

33.分析装置，其包括：

沿第一基板表面安装的多个纳米通道，

每一所述纳米通道由侧壁和底板界定，以及

布置在至少一个所述纳米通道中的相移掩模板，以使在至少一个所述纳米通道内，经过所述相移掩模板的至少第一波长的电磁辐射界定了在至少一个所述纳米通道内的照射区域，所述照射区域的横截面尺寸小于所述电磁辐射的第一波长。

34.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含二氧化硅、硅、玻璃、氢化氮化硅、氢化氧氮化硅、含钛的化合物、TaSiO、TaO_xN_y、TaCN、氧化钽、氮化钽、TaAlN、WAlN、氧化铝、氮化铝、SiN、WN、石墨、石墨烯、碳纳米管、塑料、任意前述化合物的化学计量变体，或所述化合物的任意组合。

35.如权利要求34所述的分析装置，其中所述含钛的化合物为TiAlN。

36.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含氢化二氧化硅、掺氟的二氧化硅、掺碳的二氧化硅、多孔二氧化硅、多孔掺碳的二氧化硅或它们的任意组合。

37.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含电介质。

38.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含高K电介质、低K电介质、旋压的有机聚合物电介质或它们的任意组合。

39.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含绝缘体。

40.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含聚合物。

41.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含共聚物。

42.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含嵌段共聚物。

43.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、环烯烃共聚物或它们的任意组合。

44.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含氧化钛、氮化钛、氧化铪、氮化铪、氧化锆、氮化锆或它们的任意组合。

45.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含氢化氧化钛、氢化氮化钛或它们的任意组合。

46.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含HfSiO₂、HfZrO_x、HfON、HfSiN、HfSiON、ZrSiO₂、ZrN、ZrSiN、ZrON、ZrSiON、Ta₂O₅或它们的任意组合。

47.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含氢化氧化钽、氢化氮化钽、氢化氧化铪、氢化氮化铪、氢化氧化锆、氢化氮化锆、氢化氧化铝、氢化氮化铝或它们的任意组合。

48.如权利要求33所述的分析装置，其中所述第一基板包含高硼硅玻璃、钠钙玻璃、氧氮化硅或它们的任意组合。

49.如权利要求33所述的分析装置，其中至少一个所述纳米通道的特征为所述侧壁之间的宽度为10nm至300nm。

50.如权利要求33所述的分析装置，其中至少一个所述纳米通道的特征为从所述纳米通道的侧壁顶部至所述纳米通道的底板的深度为10nm至1000nm。

51.如权利要求33所述的分析装置，其中至少两个邻近的所述纳米通道的侧壁相隔至少300nm。

52.如权利要求33所述的分析装置，其中至少两个邻近的所述纳米通道的侧壁相隔至少400nm。

53.如权利要求33所述的分析装置，其中所述相移掩模板包括对至少第一波长的电磁辐射基本透明的材料。

54.如权利要求33所述的分析装置，其还包括能发射至少第一波长的电磁辐射的源。

55.如权利要求54所述的分析装置，其中所述源包括激光器。

56.如权利要求54所述的分析装置，其中所述源包括能发射至少一个频率分量为100nm至20,000nm的电磁辐射的装置。

57.如权利要求33所述的分析装置，其中所述相移掩模板包括近场全息掩模板。

58.如权利要求33所述的分析装置，其中所述相移掩模板与所述第一基板结合。

59.如权利要求1所述的分析装置，其包括至少两个纳米缝隙，每个纳米缝隙在所述至少一个纳米通道内界定了横截面尺寸小于所述第一波长的照射区域。