CN107614675B - 用于单分子dna分析的纳米通道的动态形成 - Google Patents

用于单分子dna分析的纳米通道的动态形成 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有适合于约束并线性排列DNA分子的纳米通道的装置，制备所述装置的方法，以及利用所述装置进行DNA分析的方法。装置可包括适用于约束并线性排列DNA分子的、动态控制的、平滑连接的微米通道‑纳米通道平台。纳米通道可以在可变形基底或基础层内形成的纳米缝中可逆地形成。

Description

用于单分子DNA分析的纳米通道的动态形成
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月16日提交的美国临时申请系列号62/193,542的利益，此临时申请的全部内容通过引用并入本文。
发明背景
DNA包含着几乎所有有机体的基本蓝图，并且理解DNA分子上的信息对于生物学研究以及生物医学工程是一个重要课题。然而，在较大体积溶液中，DNA分子通常会卷曲，使得分析变得困难。为了揭示DNA分子上的基因组信息，已经研究了多种方法用来使卷曲的DNA分子伸展，例如光学镊子、磁性镊子、分子梳以及水力拉伸。
DNA线性化拉伸是单分子DNA分析的首要的、关键的步骤。当被约束在纳米通道中时，由于其弹性性能以及已占体积效应的共同结果，卷曲的DNA分子会根据纳米通道的维度而自然地伸展开。与其它竞争方法相比，通过纳米约束的DNA伸展可允许其中受约束的DNA分子暴露于相同约束力的均匀伸长，并提供针对解开状态下的DNA的长的观察时间。用于操控DNA的纳米流体装置的特征尺寸通常需要与双链DNA的恒定长度近似或小于这个长度(也就是在10到100纳米的量级上)，并且需要在数十至数百微米甚至数十至数百厘米内均匀。用于制备亚100纳米级通道的传统方法使用扫描式射束刻蚀，其中例如以电子束刻蚀(EBL)以及聚焦离子束刻蚀(FIB)使射束扫描过基底。然而，传统纳米刻蚀技术往往非常昂贵并且耗时，装置一旦被污染通常无法再次使用。另一些基于纳米破裂的非刻蚀方法可以降低装置的成本，但所得到的纳米通道阵列的均匀性相对较差。此外，在传统纳米流体装置中，加载微米通道与伸展纳米通道之间的阶梯界面造成很大的熵屏障，其中卷曲的DNA分子堵塞在衔接处。虽然灰度刻蚀可以通过在界面处产生梯度来控制该熵力，但是掩模设计过程很复杂，并且制备精细的梯度结构仍然是个挑战。基于凸透镜-诱导约束(CLIC)平台能够利用凸透镜的弯曲表面使位于微纳结构表面上方的柔性盖玻片局部变形，但仍需昂贵的EBL以便在CLIC平台的玻璃表面上产生纳米通道，并且所产生的纳米通道深度不均匀。另外，传统纳米流体装置中的纳米通道基本上都是直接结合的。由于纳米通道的流阻很大，需要利用高压力或高电场来进行表面钝化、样品传输以及缓冲液的更新。
现有的DNA分析方法以及装置存在很多问题以及一些挑战亟待解决，以便降低纳米流体装置的成本，并且提高这些装置对DNA分析的性能。
概述
本发明的实施方案提供了具有适合于约束并线性排列DNA分子(例如适合于单分子分析)的纳米通道的新型且具有优势的装置，以及制备所述装置的方法和利用所述装置进行DNA分析的方法。装置可包括适合于约束并线性排列DNA分子的、动态控制的、平滑连接的微米通道-纳米通道平台。所述装置可包括：(1)具有几何特征(例如半圆形的横截面)和刚度特征(例如可塌陷的材料)的样品微米通道，这些特征可以促使期望频率的微米通道塌陷和产生的均匀闭合；(2)一个或多个位于样品微米通道的顶部或底部表面的纳米结构(例如深度小于或等于100纳米的开放结构)；以及(3)位于样品微米通道顶部或底部的控制纳米通道，用于控制夹层的塌陷，并产生由塌陷的夹层的一部分和样品微米通道底部所包围的纳米通道。
纳米通道可以在基底中形成的纳米缝之内形成，所述基底可以是可变形的，如可变形的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))。气动控制(例如气动微型阀控制)以及基底(例如PDMS)的变形可以导致均匀的纳米通道(例如均匀的三角形纳米通道)的产生，所述纳米通道具有数十纳米的尺寸和亚毫米级的长度。纳米缝可以利用刻蚀(例如低成本的软刻蚀)来形成。纳米通道的有效尺寸可以通过所施加的压力进行连续调节。微型阀的变形可以自然形成深度上的梯度，并且平滑地连接所形成的纳米通道和用于DNA加载的微米通道，这有效地消除了DNA堆积在纳米通道入口处的问题，并且避免了在DNA引入过程中对高压力和高电场的需求。不同于传统的直接结合的纳米通道，样品通道可以在压力释放时恢复到微米级别，这促进了缓冲液的置换、样品加载以及表面钝化。本发明的实施方案可用于低成本的DNA图谱分析和/或谱型分析仪器，例如用于遗传/表观遗传研究、临床诊断和法医学鉴定等。
快速发展的纳米制造技术为操控和分析单个DNA分子提供了新的途径。当被约束在纳米通道中时，由于其弹性性能以及已占体积效应的共同结果，卷曲的DNA分子会根据纳米通道的维度而自然地伸展开。与其它竞争方法相比，通过纳米约束的DNA伸展可允许其中受约束的DNA分子暴露于相同约束力的均匀伸长，并提供针对解开状态下的DNA的长的观察时间。通过将纳米通道平行排布并将它们与完备的微流体相结合，数十数百条拉伸的DNA分子可以同时被分析，这允许快速获取统计数据、高度的重复性且易于自动化。
在一个实施方案中，用于大分子(例如DNA或蛋白质)分析的装置可包括：具有被配置为允许微米通道塌陷和均匀(或近似均匀)的闭合的横截面与刚度的样品微米通道；形成于样品微米通道顶部或底部表面上的至少一个开放的纳米结构，其中至少一个开放的纳米结构的深度等于或小于100纳米；以及位于样品微米通道上方或下方，被配置为控制样品微米通道塌陷的控制微层(例如气动微型阀)，样品微米通道的夹层被置于控制微米通道与样品微米通道开放部分之间。所述装置可以被配置为使得当通过控制微米通道向夹层施加压力时，夹层被压入至少一个纳米结构中并与其底部表面接触，由此在纳米结构中形成纳米通道。
在另一个实施方案中，用于DNA分析的装置可包括：可变形的基础层，其具有在其中形成的、位于其通道区的至少一条深度为900纳米(nm)或更小(以及任选地，长度为小于1毫米(mm)和/或宽度为1微米或更大)的纳米缝；以及位于基础层上方的夹层，使得在夹层的一部分与基础层的通道区之间形成样品微米通道。所述装置可以被配置为使得当向夹层施加压力时，夹层被压入至少一条纳米缝中并与其底部表面接触，由此在纳米缝中形成纳米通道。纵向观测时，每条纳米通道可以具有三角形的横截面。
在另一个实施方案中，利用本文所述的装置来分析DNA的方法可以包括如下步骤：向至少一条纳米缝(或开放的纳米结构)提供DNA分子；向夹层上表面施加压力，使得样品微米通道塌陷，并且夹层被压入纳米缝(或开放的纳米结构)中，由此在其中形成纳米通道。当微米通道因施加于夹层上的压力而塌陷时，DNA分子可在纳米缝(或开放的纳米结构)的纳米通道中伸展并线性化。施加于夹层上表面的压力可以包括以气动方式向夹层的上表面施加压力(例如利用微型阀)。
在另一个实施方案中，DNA分析装置的制备方法可以包括如下步骤：形成用于纳米结构表面的第一主模板，所述第一主模板具有在其中形成的至少一条纳米缝；形成用于样品微米通道的第二主模板；在第二主模板上沉积光刻胶材料；在第一主模板上沉积第一可变形材料；从第一可变形材料移除第一主模板，由此形成第一可变形材料的基础层，所述基础层具有在其中形成的、位于其通道区的至少一条纳米通道；在第二主模板及光刻胶材料上沉积第二可变形材料；从第二可变形材料上移除第二主模板及光刻胶材料，由此形成第二可变形材料的夹层，所述夹层具有在其中形成的、具有光刻胶材料形状的样品微米通道；以及将夹层置于基础层上，使得基础层的至少有一条纳米缝面向夹层，并且样品微米通道被设置为面向基础层并且位于基础层的通道区上方。所产生的装置可以被配置为使得当向夹层施加压力时，夹层被压入至少一条纳米缝中并与其所在底部表面接触，由此在纳米缝中形成纳米通道。
附图简述
图1A显示了根据本发明的实施方案，当夹层没有变形时，DNA溶液在恢复的微米通道中传输的示意图。
图1B显示了根据本发明的实施方案，当施加压力时动态形成的纳米通道的示意图。DNA分子可以在所产生的纳米通道中伸展，并且在纳米通道与相邻的微米通道之间可产生平滑的梯度界面。
图1C显示了根据本发明的实施方案，由夹层的顶部塌陷所形成的三角形纳米通道的剖视图。
图2A显示了根据本发明的实施方案的装置的横截面的扫瞄式电子显微镜(SEM)图像。
图2B显示了根据本发明的实施方案的变形的夹层的横截面的SEM图像。
图2C显示了纳米缝在压缩前的显微图像。
图2D显示了图2C所示的纳米缝在压缩过程中的显微图像，其展现了根据本发明实施方案的塌陷过程。
图2E显示了图2C和2D所示的纳米缝在压缩后的显微图像，其(与图2C和图2D一起)展现了根据本发明实施方案的塌陷过程。微型阀的弯曲边缘指示纳米通道与相邻的微米通道之间的逐渐的高度变化。
图2F显示了根据本发明的实施方案的基底上的纳米缝的原子力显微镜(AFM)图像。
图2G显示了根据本发明的实施方案的装置的所形成的纳米通道的荧光图像，其显示了均匀性。
图3显示了根据本发明的实施方案的纳米流体芯片的图像；为了比较大小，显示了约为美国25分硬币大小的硬币。
图4显示了根据本发明的实施方案，利用多层软刻蚀制备纳米流体装置的的工艺流程剖视图。
图5A显示了根据本发明的实施方案，用于将DNA引入纳米通道的顶部加载。在图5A底部还展示了λ-DNA在不同控制压力(0psi、5psi、10psi、15psi、20psi和25psi)之下的构象变化。左下部的比例尺为5微米。
图5B显示了根据本发明的实施方案，用于将DNA引入纳米通道的侧面记载。图5B底部还展示了当施加控制压力时，λ-DNA通过电脉冲从微米通道移动，并在纳米通道中伸展的实时轨迹。左下部的比例尺为5微米。
图6显示了根据本发明的实施方案，控制DNA在单个纳米通道中移动的装置的示意图(左图)。该系统可包括微型阀和样品微米通道，其在底部表面具有单个纳米槽。一个或多个(例如两个)电极可被插入储液槽中以施加电压并收集离子电流。右边的剖视图还显示了，所产生的纳米槽的有效尺寸可以通过增加在控制微米通道中施加的压力来减小，从而减慢DNA的移动。
图7A显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，T4GT7DNA热解旋光学图谱分析的理论热解旋图谱。
图7B显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，T4GT7DNA序列的DNA热解旋光学图谱分析的螺旋度图谱。
图7C显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，T4GT7DNA热解旋光学图谱分析的实验波动曲线和实验平均波动曲线，以及理论热解旋图谱(kbp＝千碱基对)。比例尺为5μm。
图7D显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，DNA热解旋光学图谱分析的实验(实线)和理论(虚线)归一化荧光强度对比序列位置的图。
图8A显示了在根据本发明的实施方案的装置中，盘绕的纳米通道用于超长DNA分析的示意图。
图8B显示了在根据本发明的实施方案的装置中，在边缘处盘绕的纳米缝变形形成两个盘绕的纳米通道的顶视图。伸展的长DNA分子可以在单个视场中利用二维区域探测器(例如电荷耦合装置(CCD))直接进行分析。
图9显示了根据本发明的实施方案，用于单细胞全基因组分析的混合微米/纳米流体平台的示意图。特定的目的细胞可以通过微流体方式从群体中分离出来并被捕获在捕获室里。接下来，完整的DNA分子可以被提取、纯化并标记。然后，DNA分子可被引入到动态纳米通道中进行光学图谱分析。随后，DNA分子可被回收并收集，用于测序或FISH(荧光原位杂交)检测。
图10显示了根据本发明的实施方案，上推式阀(左图)与下压式阀(右图)的示意图。上推式阀可以在样品微米通道的半圆形顶部产生纳米通道。下压式阀可以在样品微米通道平坦的底部产生纳米通道，这有利于在平面上观测平行分布的DNA分子。
图11显示了利用有限元建模(FEM)模建的，根据本发明的实施方案的装置的高弹性变形的微型阀与底面上的纳米缝的剖视图。
图12显示了图11所示的模建装置的冯米斯应力。
图13显示了图11所示的模建装置的水力直径DH＝(4A)/P(以纳米计)对比控制压力(以psi计)的图。
图14显示了根据本发明的实施方案，在1伏(V)，控制压力变化(图中标示了不同的压力)时，纳米通道的离子电流(以纳安计)对比时间(以秒计)的图。可以看出更高的压力会导致更低的离子电流。
图15显示了在压力为5psi(上图)、10psi(中图)和20psi(下图)时，根据本发明的实施方案的装置的纳米通道的荧光强度图。
详细说明
本发明的实施方案提供了具有适合于约束并线性排列DNA分子(例如适合于单分子分析)的纳米通道的新型且具有优势的装置，以及制备所述装置的方法和利用所述装置进行DNA分析的方法。装置可包括适合于约束并线性排列DNA分子的动态控制的、平滑连接的微米通道-纳米通道平台。一个或多个纳米通道可以在基底中形成，所述基底可以是可变形的，如可变形的聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS))。气动控制(例如气动微型阀控制)以及基底(例如PDMS)的变形可以导致一个或多个均匀的纳米通道(例如均匀的三角形纳米通道)的产生，所述纳米通道具有数十纳米的宽度和亚毫米级的长度。这可以利用刻蚀(例如低成本的软刻蚀)实现。一个或多个纳米通道的有效尺寸(例如宽度)可以通过所施加的压力进行连续调节。微型阀的变形可以自然形成深度上的梯度，并且平滑连接所形成的纳米通道和用于DNA加载的微米通道，这有效地消除了DNA堆积在纳米通道入口处的问题，并且避免了在DNA引入过程中对高压力和高电场的需求。不同于传统的直接结合的纳米通道，样品通道可以在压力释放时恢复到微米级别，这促进了缓冲液的置换、样品加载以及表面钝化。本发明的实施方案可用于低成本的DNA图谱分析和/或谱型分析仪器，例如用于遗传/表观遗传研究、临床诊断和法医学鉴定等。
术语“纳米缝”指的是具有等于或小于100纳米的一个物理维度(如深度)的通道；纳米缝的宽度可以是微米量级(也就是说比100纳米宽)。术语“纳米通道”指的是具有等于或小于100纳米的两维物理维度(宽度与深度)的通道。
在多个实施方案中，宽度为数十纳米、长度为亚毫米级的均匀三角形纳米通道可被动态地形成，并且通过气动微型阀控制可变形的基底(例如聚合物，如PDMS)来调节。与通过电子束刻蚀或离子束研磨所制备的纳米通道相比，本发明实施方案的制备方法可以降低纳米通道的成本与复杂度。所形成的纳米通道尺寸可调、高度均匀并且足够长。它们很适合于跨越数百kbp(千碱基对,或数以千计的碱基对)直至Mbp(兆碱基对或数以百万计的碱基对)范围的DNA分子的线性化拉伸。变形的基底可以自然地形成深度上的梯度，并平滑地连接所形成的纳米通道与用于DNA加载的微米通道。这可以有效抑制甚至防止DNA堆积在纳米通道入口处，这是大部分传统纳米通道装置所面对的主要挑战。此外，本发明实施方案的纳米通道的制备可以与用于上游样品制备和下游样品提取的微流体相兼容，容易适用于自动高通量分析。
按照惯例，为了实现小于微米的维度，通道的宽度通过昂贵的纳米刻蚀技术来界定，例如电子束刻蚀或聚焦离子束刻蚀，并且深度可以通过控制蚀刻时间来界定(例如用反应离子蚀刻(RIE))。当制备纳米缝时，宽度可以通过传统的低成本刻蚀来界定，而深度可以通过控制蚀刻时间来界定。因此，纳米缝的制备成本比纳米通道的制备成本低得多。在本发明的多个实施方案中，可以先制备低成本的纳米缝。然后，通过闭合通道的顶层，可以在每条纳米缝的边缘处产生一对纳米通道。所产生纳米通道的宽度与深度是由纳米缝的深度以及控制压力所决定的，与纳米缝的宽度无关。然后，所产生的纳米通道可用来分析DNA。
与利用昂贵的刻蚀方法在硅或石英上制备的传统纳米通道相比，本发明实施方案的装置(例如PDMS芯片)可以大大降低制备成本。纳米通道的均匀性可以确保DNA分子均匀伸展和纳米通道中DNA分析的精确的图谱分析结果。与传统高成本纳米刻蚀制备方法相比，本发明实施方案的纳米通道展现出相同的良好均匀性。对于在纳米流体装置中的DNA加载，需要克服微米通道与纳米通道间的界面处的陡峭的熵屏障。在根据本发明实施方案的平滑连接的微米-纳米通道设计中，所形成的纳米通道与相邻的微米通道之间的深度差可以被微型阀的弯曲边缘平滑地衔接，这有助于DNA分子进入到纳米通道中。这样的设计与用于上游样品制备和下游样品提取的微流体相兼容，使其容易与自动高通量分析相兼容。
图1A显示了根据本发明的实施方案，当夹层没有变形时，DNA溶液在恢复的微米通道中传输的示意图；图1B显示了根据本发明的实施方案，当施加压力时动态形成的纳米通道的示意图；以及图1C显示了根据本发明的实施方案，由夹层的顶部塌陷所形成的三角形纳米通道的剖视图。参见图1B，DNA分子可以在所产生的纳米通道中伸展，并且在纳米通道与相邻的微米通道之间可产生平滑的梯度界面。参见图1A和1B，通过施加控制压力7(例如通过一个或多个气动阀，如气动微型阀)，卷曲的DNA 4可在纳米通道中伸展并线性化，产生伸展的DNA分子8。图1A和1B还显示了控制微米通道1、夹层2、样品微米通道4、纳米缝5、基底6(例如刚性基底)、塌陷的纳米缝9、微米通道3与纳米通道之间的梯度10。
当被约束在纳米通道中时，由于已占体积效应以及其弹性性能的共同结果，卷曲的DNA分子能根据纳米通道的维度而伸展开。与其它方法相比，通过纳米约束的DNA伸展可允许其中受约束的DNA分子暴露于相同约束力的均匀伸展，并提供针对伸展状态下的DNA的长的观察时间。通过将纳米通道平行排布并将它们与微流体相结合，数十数百条拉伸的DNA分子可以同时被分析，这允许快速获取统计数据、高度的重复性和易于自动化。
参见图1C，控制压力15可以施加在一条或多条纳米缝14上，产生用于DNA伸展的塌陷后的纳米缝16，塌陷后的纳米缝各自均可具有三角形的横截面(参见图1C右部)。图1C还显示了控制微米通道11、夹层12以及样品微米通道13。
图2A显示了根据本发明的实施方案的装置的横截面的扫瞄式电子显微镜(SEM)图像，并且在底部可以看到纳米缝；图2B显示了根据本发明的实施方案的变形的夹层的横截面的SEM图像。图2C显示了纳米缝在压缩前的显微图像；图2D显示了图2C所示的纳米缝在压缩过程中的显微图像，其展现了根据本发明实施方案的塌陷过程；以及图2E显示了图2C和2D所示的纳米缝在压缩后的显微图像，其(与图2C和图2D一起)展现了根据本发明的实施方案的塌陷过程。微型阀的弯曲边缘指示纳米通道与相邻的微米通道之间的逐渐的高度变化。图2F显示了根据本发明实施方案的基底上的纳米缝的原子力显微镜(AFM)图像。以及图2G显示了根据本发明实施方案的装置的所形成的纳米通道的荧光图像，其显示了均匀性。
本发明的实施方案可用于如基于生物芯片的诊断仪器，用于遗传/表观遗传研究、疾病快速筛查和法医学犯罪侦察等。不同于DNA测序或聚合酶链式反应(PCR)扩增，单分子DNA谱型分析提供了对生物标记物如DNA甲基化模式和大基因组重排(重复或缺失模式)的快速检测，用于诊断遗传病症和疾病、监测对药物治疗的反应以及法医学鉴定等。
在一些实施方案中，可对基底(例如可变形的聚合物，如PDMS)进行表面处理以增强基底的长期稳定性。
在某些实施方案中，本文所述的纳米流体装置可以与单分子操控模块相结合，作为用于单细胞全基因组分析的平台。该平台可以与本文所述的任何其它特征相组合。在一些实施方案中，本文所述的纳米流体装置可以与超分辨率显微镜相结合，以实现100bp(碱基对)的光学图谱分析分辨率。其可以与本文所述的任何其它特征相组合。
本发明的实施方案包括在动态形成的纳米通道中约束并线性排列DNA分子以进行光学分析的新型平台。通过巧妙地使用微型阀控制以及由可变形基底(例如可变形的聚合物，如PDMS)制备的纳米缝的变形，利用低成本的软刻蚀，可以形成具有低至10纳米或20纳米的有效约束维度的亚毫米级长度的均匀的纳米通道。再次参见图1A-1C，DNA分子4首先可以被加载至底部具有纳米缝5的样品微米通道3中。为了形成纳米约束环境，通过在上部的控制微米通道1增加压力7来将夹层2逐渐压入与纳米结构的底层相接触。DNA分子的拉伸可以通过调节从其上方施加的约束来调整。当所施加的压力7足够强时，变形的夹层2将完全塌陷到每条纳米缝5的中心，由此产生三角形的塌陷了的纳米缝9或纳米通道。与具有相同有效尺寸的传统圆形或矩形纳米通道相比，三角形的纳米缝/纳米通道由于拐角处的熵损耗而增强了DNA的拉伸程度，并因此抑制了热扰动和反向折叠。微型阀的弯曲边缘能够平滑地衔接伸展纳米通道与相邻的微米通道之间相差大于3个数量级的不同的长度级别，促进了DNA被引入到纳米通道中，并且避免了对高压力或高电场的需求(还参见图2A-2G)。不同于相关领域的直接结合的纳米通道，样品通道可以在压力释放时恢复到微米级别。因此，该装置容易冲洗、不易堵塞。此外，可以方便地进行表面钝化，从而抑制通道表面上的非特异性相互作用。
细菌感染是疾病的常见原因，例如肺结核和脑膜炎。在早期阶段鉴定传染病的病原体十分重要。当使用抗生素时，准确的诊断显得尤为重要，因为抗生素的不恰当的使用已经帮助产生了耐抗生素的细菌菌株。除了基于症状的诊断之外，鉴定细菌的传统方法包括利用PCR对细菌DNA的体外扩增以及生化检查，这些方法价格昂贵且耗费时间。根据本发明实施方案的在纳米通道中的DNA光学图谱分析有加速诊断并提高灵敏度，同时保持低成本的潜力。
逐个碱基地进行测序，作为DNA分析的黄金标准，其能够提供基因组规模上的单个核苷酸的分辨率，但是相关领域的测序技术却无法检测重复序列，因为DNA被片段化成较小的片段。荧光原位杂交(FISH)可以在完整的染色体上分辨出大规模的遗传信息。然而，分辨率局限于压缩状态的DNA所设定的1-10Mb。另一方面，根据本发明实施方案的单分子DNA的光学图谱分析缩小了细胞遗传学的俯视视角与新一代测序的仰视视角之间的差距。通过将光学图谱分析与包括DNA测序和FISH的传统基因组分析技术相结合，可以实现全面的单细胞基因组分析。在一个实施方案中，芯片实验室(lab-on-a-chip)单细胞装置可以包括用于细胞捕获、裂解、DNA提取和纯化的细胞操控模块以及用于DNA光学图谱分析的动态纳米流体模块。其如图9所示。首先将细胞加载到微米/纳米流体芯片实验室装置中，并原位裂解。DNA分子可以被提取、纯化并预伸展。然后，DNA分子可以在动态形成的纳米通道中被伸展，准备用于光学图谱分析。在收集被回收的DNA之后，样品可以被扩增以进行进一步的补充性分析，包括测序和FISH。这项技术允许对从单细胞内提取出来的分子进行直接分析。所有长度级别的遗传变异都可以被检测出来。
许多癌症都表现出大的基因组重排，包括如肺癌、卵巢癌和乳腺癌。对基因组突变的早期检测允许在肿瘤真正出现之前进行有效治疗。虽然新一代测序可以检测单核苷酸变体(SNV)，但目前的测序技术对大的基因组重排可能无能为力。作为临床癌症诊断的常用工具，FISH可以检测到大的基因组重排，但是由于DNA处于压缩状态，其分辨率局限于1-10Mb。在本发明的实施方案中，通过在纳米流体平台中拉伸DNA并将光学图谱分析条形码与标准数据库相比较，可以以更高分辨率检测出包括插入、缺失和重复的基因组重排。这样，癌症预测和评估的效率和灵敏度都可以被大大提高。
图4显示了根据本发明的实施方案，通过多层软刻蚀制备纳米流体装置的工艺流程剖视图。参见图4，可以利用用于纳米结构表面的主模板、用于控制微米通道的主模板和/或用于样品微米通道的主模板。可以使用基底层，其可以是可变形的基底(例如可变形的聚合物，如PDMS)。盖玻片也可以作为另一个不可变形的基底而存在。需要注意的是，虽然“光刻胶”、“盖玻片”、“PDMS”和“硅”用作图4中的各层的标记，但是这样做仅仅是为了示例性的目的，并且这些层也可以是其它材料。“盖玻片”可以是任何刚性基底，“PDMS”可以是任何可变形的基底或层，并且“硅”可以是任何的半导体材料或金属。如图4底部所示，“盖玻片”是底层，然后三层“PDMS”堆积在“盖玻片”的上面。控制微米通道在顶层的下方，样品微米通道位于从顶部数第二层的下方，并且纳米缝形成于基础层(在本文也称为可变形基底或基底层)中。如图4所示，右上方的横截面及其下方包括弯曲截面的截面是“光刻胶”。每个“主模板”部分可以是“硅”或等同的材料。图4中所示的七个横截面(上面三个、第二行三个以及从顶部数第三行右边的一个)的底部材料是“硅”。图4所示的第二、第三行最左边的截面显示了“盖玻片”，并且这些截面的每一个的阶梯层是“PDMS”。图6显示了根据本发明的实施方案，控制DNA在单个纳米通道中移动的装置的示意图(左图)。该系统可包括微型阀和样品微米通道，其在底部表面上具有单个纳米槽。一个或多个(例如两个)电极可被插入储液槽中以施加电压并收集离子电流。右边的剖视图还显示了，所产生的纳米槽的有效尺寸可以通过增加在控制微米通道中所施加的压力来减小，从而减慢DNA的移动。
图7A显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，DNA热解旋光学图谱分析的理论热解旋图谱。图7B显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，T4GT7DNA序列的DNA热解旋光学图谱分析的螺旋度图谱。图7C显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，DNA热解旋光学图谱分析的实验波动曲线和实验平均波动曲线，以及理论热解旋图谱(kbp＝千碱基对)。比例尺为5μm。图7D显示了在根据本发明实施方案的动态纳米流体装置中，DNA热解旋光学图谱分析的实验(实线)和理论(虚线)归一化荧光强度对比序列位置的图。图8A显示了在根据本发明的实施方案的装置中，盘绕的动态纳米通道用于超长DNA分析的示意图；图8B显示了在根据本发明的实施方案的装置中，在边缘处盘绕的纳米缝变形形成两个盘绕的纳米通道的顶视图。伸展的长DNA分子可以在单个视场中利用二维区域探测器(例如电荷耦合装置(CCD))直接进行分析。
图9显示了根据本发明的实施方案，用于单细胞全基因组分析的混合微米/纳米流体平台的示意图。参见图9，特定的目的细胞可以通过微流体方式从群体中分离出来并被捕获在捕获室里。接下来，完整的DNA分子可以被提取、纯化并标记。然后，DNA分子可被引入到动态纳米通道中进行光学图谱分析。随后，DNA分子可被回收并收集，用于扩增和/或测序。
图10显示了根据本发明的实施方案，上推式阀(左图)与下压式阀(右图)的示意图。如果控制压力足够高，上推式阀可以被完全封闭。对于下压式阀，膜必须被优化；如果膜太薄或太软，中间部分会先塌陷，并且在边缘处无法关闭；如果膜太厚或太硬，需要非常高的压力来封闭。
本发明包括但不局限于下列示例性的实施方案。
实施方案1.用于DNA分析的装置，包括：
可变形的基础层，其具有在其中形成的、位于其通道区的至少一条深度为900纳米或更小(以及任选地，长度为小于1毫米和/或宽度为1微米或更大)的纳米缝；
置于基础层之上的夹层，使得在夹层的一部分与基础层的通道区之间形成样品微米通道，
其中所述装置被配置为使得，当向夹层施加压力时，夹层被压入至少一条纳米缝中并与其底部表面接触，由此在所述纳米缝中形成纳米通道。
实施方案2.如实施方案1所述的装置，其中每条纳米通道从纵向观测时具有三角形横截面。
实施方案3.如实施方案1-2中任一项所述的装置，其中所述基础层是可变形的聚合物。
实施方案4.如实施方案3所述的装置，其中所述基础层是聚二甲基硅氧烷。
实施方案5.如实施方案1-4中任何一项所述的装置，其中所述夹层是可变形的聚合物。
实施方案6.如实施方案5所述的装置，其中所述夹层是聚二甲基硅氧烷。
实施方案7.如实施方案1-6中任何一项所述的装置，其还包括置于夹层上方的控制层，其中所述控制层具有在其中形成的、位于控制层的一部分与夹层的一部分之间的控制微米通道。
实施方案8.如实施方案7所述的装置，其中所述控制层是可变形的聚合物。
实施方案9.如实施方案8所述的装置，其中所述控制层是聚二甲基硅氧烷。
实施方案10.如实施方案1-9中任何一项所述的装置，其还包括置于基础层下方的刚性基底。
实施方案11.如实施方案10所述的装置，其中所述刚性基底是盖玻片。
实施方案12.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为100纳米或更小。
实施方案13.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为50纳米或更小。
实施方案14.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为30纳米或更小。
实施方案15.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为20纳米或更小。
实施方案16.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
实施方案17.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中至少一条纳米缝的深度为20纳米。
实施方案18.如实施方案1-11中任何一项所述的装置，其中所述基础层包括在其中形成的、位于其通道区的多条纳米缝，每条纳米缝的深度为900纳米或更小(以及任选地，长度为小于1毫米和/或宽度为1微米或更大)。
实施方案19.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为100纳米或更小。
实施方案20.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为50纳米或更小。
实施方案21.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为30纳米或更小。
实施方案22.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为20纳米或更小。
实施方案23.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
实施方案24.如实施方案18所述的装置，其中每条纳米缝的深度为20纳米。
实施方案25.如实施方案18-24中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度是相同的，深度均是相同的。
实施方案26.如实施方案1-25中任何一项所述的装置，其中所述样品微米通道呈圆顶形。
实施方案27.如实施方案7-26中任何一项所述的装置，其中所述控制微米通道从纵向观测时具有矩形的横截面。
实施方案28.如实施方案7-27中任何一项所述的装置，其中所述控制微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
实施方案29.如实施方案1-28中任何一项所述的装置，其中所述样品微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
实施方案30.利用实施方案1-29中任何一项所述的装置来分析DNA的方法，所述方法包括：
向至少一条纳米缝提供DNA分子；
向夹层上表面施加压力，使得样品微米通道塌陷，并且夹层被压入纳米缝中，由此在其中形成纳米通道(这些步骤并非必须以该顺序进行)，
其中当微米通道由于施加在夹层上的压力而塌陷时，DNA分子在纳米缝的纳米通道中伸展并线性化。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中向夹层上表面施加压力包括以气动方式向夹层上表面施加压力。
实施方案32.如实施方案31所述的方法，其中以气动方式向夹层上表面施加压力包括利用微型阀以气动方式施加压力。
实施方案33.如实施方案30-32中任何一项所述的方法，其还包括对纳米通道中的线性化拉伸的DNA分子进行光学图谱分析。
实施方案34.如实施方案30-33中任何一项所述的方法，其还包括获取DNA分子的热解旋条形码。
实施方案35.如实施方案34所述的方法，其还包括将所获取的热解旋条形码与已知的热解旋条形码进行比较，以确定DNA分子的序列。
实施方案36.制备DNA分析装置的方法，所述方法包括：
形成用于纳米结构表面的第一主模板，所述第一主模板具有在其中形成的至少一条纳米缝；
形成用于样品微米通道的第二主模板；
在第二主模板上沉积光刻胶材料；
在第一主模板上沉积第一可变形材料；
从第一可变形材料移除第一主模板，由此形成第一可变形材料的基础层，所述基础层具有在其中形成的、位于其通道区的至少一条纳米缝；
在第二主模板及光刻胶材料上沉积第二可变形材料；
从第二可变形材料移除第二主模板及光刻胶材料，由此形成第二可变形材料的夹层，所述夹层具有在其中形成的、具有光刻胶材料形状的样品微米通道；
将夹层置于基础层上，使得基础层的至少一条纳米缝面向夹层，并且样品微米通道被设置为面向基础层并且位于基础层的通道区上方，
其中所述装置被配置为使得，当向夹层施加压力时，夹层被压入至少一条纳米缝中并与其底部表面接触，由此在所述纳米缝中形成纳米通道。
实施方案37.如实施方案36所述的方法，其中每条纳米缝的深度为900纳米或更小(以及任选地，每条纳米缝的长度为小于1毫米和/或每条纳米缝的宽度为1微米或更大)。
实施方案38.如实施方案36-37中任何一项所述的方法，其中每条纳米通道从纵向观测时具有三角形横截面。
实施方案39.如实施方案36-38中任何一项所述的方法，其还包括：
形成用于控制微米通道的第三主模板，所述第三主模板在其上具有突出部；
在第三主模板上沉积第三可变形材料；
从第三可变形材料移除第三主模板，由此形成第三可变形材料的控制层，所述控制层具有在其中形成的、具有突出部形状的控制微米通道；
将控制层置于夹层上，使得控制微米通道形成于控制层与夹层之间。
实施方案40.如实施方案36-39中任何一项所述的方法，其中第一可变形材料是可变形的聚合物。
实施方案41.如实施方案40所述的方法，其中第一可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
实施方案42.如实施方案36-41中任何一项所述的方法，其中第二可变形材料是可变形的聚合物。
实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中第二可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
实施方案44.如实施方案39-43中任何一项所述的方法，其中第三可变形材料是可变形的聚合物。
实施方案45.如实施方案44所述的方法，其中第三可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
实施方案46.如实施方案36-45中任何一项所述的方法，其中第一可变形材料与第二可变形材料相同。
实施方案47.如实施方案39-46中任何一项所述的方法，其中第一可变形材料与第三可变形材料相同。
实施方案48.如实施方案39-47中任何一项所述的方法，其中第二可变形材料与第三可变形材料相同。
实施方案49.如实施方案36-48中任何一项所述的方法，其还包括在从第一可变形材料移除第一主模板之前，在第一可变形材料上放置刚性基底，其中在将夹层置于基础层上之后，刚性基底保持在基础层的下方。
实施方案50.如实施方案49所述的方法，其中所述刚性基底是盖玻片。
实施方案51.如实施方案36-50中任何一项所述的方法，其中所述第一主模板包括硅。
实施方案52.如实施方案36-51中任何一项所述的方法，其中所述第二主模板包括硅。
实施方案53.如实施方案39-52中任何一项所述的方法，其中所述第三主模板包括硅。
实施方案54.如实施方案36-53中任何一项所述的方法，其中所述第一主模板的材料与所述第二主模板的材料相同。
实施方案55.如实施方案39-54中任何一项所述的方法，其中所述第一主模板的材料与所述第三主模板的材料相同。
实施方案56.如实施方案39-55中任何一项所述的方法，其中所述第二主模板的材料与所述第三主模板的材料相同。
实施方案57.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为100纳米或更小。
实施方案58.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为50纳米或更小。
实施方案59.如实施方案36-56任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为30纳米或更小。
实施方案60.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为20纳米或更小。
实施方案61.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
实施方案62.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中至少一条纳米缝的深度为20纳米。
实施方案63.如实施方案36-56中任何一项所述的方法，其中所述基础层包括在其中形成的、位于其通道区的多条纳米缝，每条缝的深度为900纳米或更小(以及任选地，长度为小于1毫米和/或宽度为1微米或更大)。
实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为100纳米或更小。
实施方案65.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为50纳米或更小。
实施方案66.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为30纳米或更小。
实施方案67.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为20纳米或更小。
实施方案68.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
实施方案69.如实施方案63所述的方法，其中每条纳米缝的深度为20纳米。
实施方案70.如实施方案63-69中任何一项所述的方法，其中每条纳米通道的宽度是相同的，深度是相同的。
实施方案71.如实施方案36-70中任何一项所述的方法，其中光刻胶材料被沉积成圆顶形，并且其中样品微米通道呈圆顶形。
实施方案72.如实施方案39-71中任何一项所述的方法，其中所述突出部具有矩形的横截面，并且其中控制微米通道从纵向观测时具有矩形的横截面。
实施方案73.如实施方案39-72中任何一项所述的方法，其中所述控制微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
实施方案74.如实施方案36-73中任何一项所述的方法，其中所述样品微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
实施方案75.用于大分子分析的装置，其包括：
样品微米通道，其具有被配置为允许微米通道塌陷和均匀(或近似均匀)的闭合的横截面与刚度；
在样品微米通道顶部或底部表面上形成的至少一个开放的纳米结构，其中至少一个开放的纳米结构的深度等于或小于100纳米；
控制微米层(例如气动微型阀)，其位于样品微米通道上方或下方并且被配置用于控制样品微米通道的塌陷，夹层位于控制微米通道与样品微米通道的开放部分之间；
其中所述装置被配置为使得，当通过控制微米通道向夹层施加压力时，夹层被压入至少一个纳米结构中并与其底部表面接触，由此在所述纳米结构中形成纳米通道。
实施方案76.如实施方案75所述的装置，其中每个纳米结构的宽度为1微米或更大。
实施方案77.如实施方案75-76中任何一项所述的装置，其中样品微米通道的高度为5微米至50微米。
实施方案78.如实施方案75-77中任何一项所述的装置，其中存在的每个纳米结构是直的纳米缝、弯曲的纳米缝或纳米凹陷。
实施方案79.如实施方案75-78中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度为100纳米或更小，并且每条纳米通道的深度为100纳米或更小。
实施方案80.如实施方案75-78中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度为10纳米至100纳米，并且每条纳米通道的深度为10纳米至100纳米。
实施方案81.如实施方案75-80中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道从纵向观测时具有三角形的横截面。
实施方案82.如实施方案75-81中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道能够通过改变施加于夹层的压力来进行调节。
实施方案83.如实施方案75-82中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的长度为10微米至10毫米。
实施方案84.如实施方案75-83中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道被配置为处理伸直长度为50kbp(千碱基对)至1000Mbp(兆碱基对)的双链DNA。
实施方案85.如实施方案75-83中任何一项所述的装置，其中所述装置被配置为用于DNA分析或蛋白质分析。
实施方案86.如实施方案75-85中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道不是直接结合的(即不是通过纳米结构的任何一部分与纳米结构的任何其它部分结合形成的)，并且当释放所施加的压力时能够恢复至微米级别。
实施方案87.利用实施方案75-86中任何一项所述的装置分析DNA或蛋白质的方法，所述方法包括：
向至少一个纳米结构提供大分子(例如DNA或蛋白质)；以及
通过控制微米通道向夹层施加压力，使得样品微米通道塌陷，并且夹层被压入至少一个纳米结构中，由此在其中形成纳米通道(这些步骤并非必须以该顺序进行)。
其中当微米通道由于施加于夹层的压力而塌陷时，大分子在纳米结构的纳米通道中伸展并线性化。
实施方案88.如实施方案87所述的方法，其中当样品微米通道塌陷时，夹层的弯曲边缘平滑地衔接用于大分子伸展的纳米通道与样品微米通道之间的相差大于3个数量级的不同的长度级别(由此促进大分子被引入到纳米通道中，并且避免了对高压力或高电场的需求；这种平滑过渡能够在很大程度上降低微米通道与纳米通道之间的熵屏障)。
实施方案89.如实施方案88所述的方法，其中夹层弯曲边缘的梯度被配置为能够控制微米通道所施加的压力来调节，并且当压力释放时所述梯度也是可逆的。
实施方案90.如实施方案88-89中任何一项所述的方法，其中所述的平滑过渡衔接从单细胞(约10微米)到基因组DNA(约50纳米)的长度级别(由此允许所述方法的装置用于有效的芯片上的细胞裂解以及下游的DNA分析)。
实施方案91.如实施方案87-90中任何一项所述的方法，其中所述方法用于芯片上的细胞裂解或下游的DNA分析。
通过以示例方式给出的以下实施例，可以更好地理解本发明及其诸多优势。以下实施例示例了本发明的一些方法、应用、实施方案和变型。当然，它们不被视为对发明的限制。可以依据本发明进行多种变动和修改。
实施例1
在本文所述的装置上运行有限元建模(FEM)模拟，该装置包括通过夹层压缩在纳米缝中形成的纳米通道。纳米通道在PDMS中形成，并且每条纳米通道的宽度为约60纳米、长度为亚毫米级。图11显示了利用FEM模建的，高弹性变形的微型阀与装置底面上的纳米缝的剖视图。图12显示了图11所示的模建装置的冯米斯应力。图13显示了图11所示的模建装置的水力直径DH＝(4A)/P(以纳米计)对比控制压力(以psi计)的图。参见图13，水力直径通常随控制压力的增加而减小。
实施例2
在PDMS中产生纳米通道，各纳米通道的宽度约20纳米、长度为亚毫米级。以5psi的增量增加压力，并测量纳米通道之一当中不同时间/压力时的离子电流。图14显示了根据本发明的实施方案，在电压为1伏(V)，控制压力变化(图中标示了不同的压力)时，纳米通道的离子电流(以纳安计)对比时间(以秒计)的图。可以看出更高的压力会导致更低的离子电流。图15显示了在压力为5psi(上图)、10psi(中图)和20psi(下图)时，装置的纳米通道的荧光强度图。
实施例3
在本文所述的装置中进行DNA伸展，该装置在底层具有60纳米深的纳米缝。在传统的纳米流体装置中，DNA通常通过高电压或高压力从相邻的微米通道移动到纳米通道。在本文所述的装置中，可以通过顶部加载或侧面加载将DNA引入纳米约束的维度中。对于顶部加载，首先将DNA样品加载到样品微米通道中。然后，逐渐调节控制压力使PDMS膜变形。由此，卷曲的DNA分子会随着渐小的纳米约束而逐渐伸展开，如图5A所示。当控制压力为25psi时，λ-DNA在纳米通道中的拉伸程度是16.7微米，达到其伸直长度的约78％。与具有相同有效横截面积的传统矩形或圆形纳米通道相比，本文所述装置中形成的三角形纳米通道由于拐角处的熵损耗而增强了DNA的拉伸程度，并因此抑制了热扰动和反向折叠。
DNA分子还可以通过侧面加载被引入到纳米通道中。首先施加控制压力Pc＝15psi以形成纳米通道，然后施加电压脉冲V＝500mV引导DNA从微米通道移动到纳米通道中。如图5B所示，微型阀的弯曲边缘平滑地衔接了微米通道与纳米通道之间的大的熵屏障，据此，卷曲的DNA分子逐渐移动到纳米通道中并伸展。通过利用微型阀控制所产生的固有弯曲结构，DNA分子容易被加载，而不会在入口处堆积。
实施例4
在本文所述的装置中进行T4GT7的热解旋图谱分析，该装置在底层具有60纳米深的纳米缝。沿着DNA分子，相比富含GC的区域，富含AT的区域在较低的温度下热解旋。当溶液温度上升时，YOYO-1分子会从热解旋的区域脱落，沿着DNA分子产生暗区域，而双链区仍保持明亮。根据T4GT7DNA在具有1毫摩尔离子强度的溶液中的热解旋可能性，通过利用标准偏差为约400纳米的高斯卷积，从计算的螺旋度曲线获得不同热解旋温度的理论条形码以模拟光学衍射。图7A和7B分别显示了40℃到50℃情况下的变化的热解旋条形码和螺旋度曲线。图7A和7B中曲线的变化定量地说明了热解旋过程中的热解旋结构以及温度依赖性。
在热解旋实验中，芯片中的DNA样品在水浴中加热15分钟，然后保存在冰上以减小游离YOYO-1分子在光学检测之前的扩散和再结合。虽然很难测量芯片的纳米通道中的准确温度，但由于加热时间足够长，可以认为实验热解旋温度与水浴温度接近。利用最小二乘定位程序，将实验强度曲线与不同温度下的理论热解旋图谱相比较以确定最佳拟合。如图7C和7D所示，实验热解旋条形码与表现出理论计算吻合较好。
应当理解，本文所描述的实施例及实施方案仅用于示例性目的，鉴于此的多种修改或变动将会对本领域技术人员有所启示，并且应当包括在本申请的精神和范畴中。
本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请及出版物(包括“参考文献”部分中的那些)都通过引用全文(包括所有附图和表格)并入，至它们不会不符合本说明书的明确教导的程度。
参考文献
1.Eriksson,E.,et al.,A microfluidic system in combination withoptical tweezers for analyzing rapid and reversible cytological alterationsin single cells upon environmental changes.Lab Chip,2006.7(1):p.71-76.
2.Heller,I.,et al.,STED nanoscopy combined with optical tweezersreveals protein dynamics on densely covered DNA.nAture methods,2013.10(9):p.910-916.
3.Chan,T.-F.,et al.,A simple DNA stretching method for fluorescenceimaging of single DNA molecules.Nucleic acids research,2006.34(17):p.e113-e113.
4.Otobe,K.and T.Ohtani,Behavior of DNA fibers stretched by precisemeniscus motion control.Nucleic acids research,2001.29(22):p.e109-e109.
5.Labit,H.,et al.,A simple and optimized method of producingsilanized surfaces for FISH and replication mapping on combed DNAfibers.BioTechniques,2009(45):p.649-52,654,656-8.
6.Bakajin,O.,et al.,Electrohydrodynamic stretching of DNA in confinedenvironments.Physical review letters,1998.80(12):p.2737.
7.Perkins,T.T.,D.E.Smith,and S.Chu,Single polymer dynamics in anelongational flow.Science,1997.276(5321):p.2016-2021.
8.Reisner,W.,J.N.Pedersen,and R.H.Austin,DNA confinement innanochannels:physics and biological applications.Reports on Progress inPhysics,2012.75(10):p.106601.
9.Persson,F.,et al.,Confinement spectroscopy:probing single DNAmolecules with tapered nanochannels.Nano letters,2009.9(4):p.1382-1385.
10.Reisner,W.,et al.,Statics and dynamics of single DNA moleculesconfined in nanochannels.Physical Review Letters,2005.94(19):p.196101.
11.Huh,D.,et al.,Tuneable elastomeric nanochannels for nanofluidicmanipulation.Nature materials,2007.6(6):p.424-428.
12.Xu,B.-Y.,et al.,Large scale lithography-free nano channel array onpolystyrene.Lab on a Chip,2010.10(21):p.2894-2901.
13.Waits,C.M.,A.Modafe,and R.Ghodssi,Investigation of gray-scaletechnology for large area 3D silicon MEMS structures.Journal ofMicromechanics and Microengineering,2003.13(2):p.170.
14.Berard,D.,et al.,Convex Lens-Induced Nanoscale Templating.Bulletinof the American Physical Society,2014.
15.Reinhart,W.F.,D.R.Tree,and K.D.Dorfman,Entropic depletion of DNAin triangular nanochannels.Biomicrofluidics,2013.7(2):p.024102.
16.Min,S.K.,et al.,Fast DNA sequencing with a graphene-basednanochannel device.Nature nanotechnology,2011.6(3):p.162-165.
17.Shendure,J.and H.Ji,Next-generation DNA sequencing.Naturebiotechnology,2008.26(10):p.1135-1145.
18.Treangen,T.J.and S.L.Salzberg,Repetitive DNA and next-generationsequencing:computational challenges and solutions.Nature Reviews Genetics,2012.13(1):p.36-46.
19.Ley,T.J.,et al.,DNA sequencing of a cytogenetically normal acutemyeloid leukaemia genome.Nature,2008.456(7218):p.66-72.
20.Levy-Sakin,M.and Y.Ebenstein,Beyond sequencing:optical mapping ofDNA in the age of nanotechnology and nanoscopy.Current opinion inbiotechnology,2013.24(4):p.690-698.
21.Cheeseman,K.,et al.,A diagnostic genetic test for the physicalmapping of germline rearrangements in the susceptibility breast cancer genesBRCA1 and BRCA2.Human mutation,2012.33(6):p.998-1009.
22.Lam,E.T.,et al.,Genome mapping on nanochannel arrays forstructural variation analysis and sequence assembly.Nature biotechnology,2012.30(8):p.771-776.
23.Persson,F.and J.O.Tegenfeldt,DNA in nanochannels—directlyvisualizing genomic information.Chemical Society Reviews,2010.39(3):p.985-999.
24.Reisner,W.,et al.,Single-molecule denaturation mapping of DNA innanofluidic channels.Proceedings of the National Academy of Sciences,2010.107(30):p.13294-13299.
25.Park,S.-m.,et al.,A method for nanofluidic device prototypingusing elastomeric collapse.Proceedings of the National Academy of Sciences,2009.106(37):p.15549-15554.
26.Matsuoka,T.,et al.,Nanoscale squeezing in elastomeric nanochannelsfor single chromatin linearization.Nano letters,2012.12(12):p.6480-6484.
27.Reisner,W.,et al.,Single-molecule denaturation mapping of DNA innanofluidic channels.Proceedings of the National Academy of Sciences,2010.107(30):p.13294-13299.
28.Jo,K.,et al.,A single-molecule barcoding system using nanoslitsfor DNA analysis.Proceedings of the National Academy of Sciences,2007.104(8):p.2673-2678.
29.Mak,A.C.,et al.,Genome-Wide Structural Variation Detection byGenome Mapping on Nanochannel Arrays.Genetics,2016.202(1):p.351-362.
30.Freitag,C.,et al.,Visualizing the entire DNA from a chromosome ina single frame.Biomicrofluidics,2015.9(4):p.044114.
31.Marie,R.,et al.,Integrated view of genome structure and sequenceof a single DNA molecule in a nanofluidic device.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,2013.110(13):p.4893-4898.
32.Lam,E.T.,et al.,Genome mapping on nanochannel arrays forstructural variation analysis and sequence assembly.Nature biotechnology,2012.30(8):p.771-776.
33.Mahshid,S.,et al.,Development of a platform for single cellgenomics using convex lens-induced confinement.Lab on a Chip,2015.15(14):p.3013-3020.
34.
Figure BDA0001477294410000241
P.F.,et al.,DNA barcoding via counterstaining with AT/GCsensitive ligands in injection-molded all-polymer nanochanneldevices.Analyst,2013.138(4):p.1249-1255.
35.US20100159462,WO2008134363 Tunable elastomeric nanochannels fornanofluidic manipulation
36.US20120196376,WO2011022650
Nanofilter devices using elastomeric micro to nanochannel interfacesand methods based thereon
37.US20110201509,WO2010042007
Method for the mapping of the local AT/GC ratio along DNA
38.US20110275066,WO2007065025
Method of DNA analysis using micro/nanochannel
39.CA2482566,EP1572860,EP2484751,US7217562,US8333934,US20140030811,WO2003106693
Gradient structures interfacing microfluidics and nanofluidics,methods for fabrication and uses thereof
40.WO2013088098
Efficient ultra-long DNA analysis in compact nanofluidic channels
41.EP2444157,EP2632592,US20130224736,WO2012055415
Preparation and analysis of samples in micro-/nano-fluidic devices
42.US20140272958,CA2903481,WO2014164739
Nanofluidic devices for the rapid mapping of whole genomes andrelated systems and methods of analysis
43.US20140206555,CA2454570,EP1417474,WO2003010289
Nanochannel arrays and their preparation and use for high throughputmacromolecular analysis.
44.F Persson,et al.,Nano Lett,9(4),2009.
45.L Menard,et al.,Nano Lett,11(2),2011.
46.Mills et al.,Lab Chip,10,1627,2010.
47.H.Cao.et al.,Appl.Phys.Lett.,81(16),(2002).
48.D.J.Berard,et al.,PNAS,111(37),(2014).
49.B.Kim,et al.,PhD Thesis,Univ of Mich(2014).
50.U.S.Patent No.8,945,909.
51.U.S.Patent Application Publication No.2010/0159462.
52.E.Angeli,et al.,Edorium J Nanotechnol,1,(2014).
53.I.Fernandez-Cuesta,,et al.,JVSTB,29(06F801),(2011).
54.U.S.Patent Application Publication No.2013/0170026.
55.CA2787242A1.
56.U.S.Patent Application Publication No.2007/0161028.
57.M.Napoli.et al.,Lab.Chip.10,2010.

Claims (79)

1.用于DNA分析的装置，包括：
可变形的基础层，其包括通道区，所述基础层之上设置有样品微米通道；
在所述基础层的通道区内形成的深度为100纳米或更小的一条或多条纳米缝，所述纳米缝设置在所述装置的纵向方向上；和
置于基础层之上的夹层，使得在所述夹层的中央部分和所述基础层之间形成所述样品微米通道，所述一条或多条纳米缝朝向所述微米通道开放，
其中所述夹层包括面向所述纳米缝的下表面和与所述下表面相对的上表面，
其中所述装置被配置为使得，当向夹层的上表面施加压力时，夹层的下表面被压入所述纳米缝中并与其底部表面接触，由此在所述纳米缝中形成纳米通道。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述纳米通道从纵向观测时具有三角形的横截面。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述基础层是可变形的聚合物。
4.如权利要求3所述的装置，其中所述基础层是聚二甲基硅氧烷。
5.如权利要求1所述的装置，其中所述夹层是可变形的聚合物。
6.如权利要求5所述的装置，其中所述夹层是聚二甲基硅氧烷。
7.如权利要求1所述的装置，其还包括置于夹层上方的控制层，其中所述控制层具有在其中形成的、位于控制层的一部分与夹层的一部分之间的控制微米通道。
8.如权利要求7所述的装置，其中所述控制层是可变形的聚合物。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述控制层是聚二甲基硅氧烷。
10.如权利要求1所述的装置，其还包括置于基础层下方的刚性基底。
11.如权利要求10所述的装置，其中所述刚性基底是盖玻片。
12.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的宽度为1微米或更大。
13.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的深度为50纳米或更小。
14.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的深度为30纳米或更小。
15.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的深度为20纳米或更小。
16.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
17.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的深度为20纳米。
18.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述纳米缝的长度为10微米至10毫米。
19.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度是相同的，深度是相同的。
20.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述样品微米通道呈圆顶形。
21.如权利要求7-9中任何一项所述的装置，其中所述控制微米通道从纵向观测时具有矩形的横截面。
22.如权利要求7-9中任何一项所述的装置，其中所述控制微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
23.如权利要求1-11中任何一项所述的装置，其中所述样品微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
24.利用权利要求1-23中任何一项所述的装置来分析DNA的方法，所述方法包括：
向至少一条纳米缝提供DNA分子；以及
向夹层上表面施加压力，使得样品微米通道塌陷，并且夹层被压入纳米缝中，由此在其中形成纳米通道，
其中当微米通道由于施加在夹层上的压力而塌陷时，DNA分子在纳米缝的纳米通道中伸展并线性化。
25.如权利要求24所述的方法，其中向夹层上表面施加压力包括以气动方式向夹层上表面施加压力。
26.如权利要求25所述的方法，其中以气动方式向夹层上表面施加压力包括利用微型阀以气动方式施加压力。
27.如权利要求24-26中任何一项所述的方法，其还包括对纳米通道中的线性化拉伸的DNA分子进行光学图谱分析。
28.如权利要求24-26中任何一项所述的方法，其还包括获取DNA分子的热解旋条形码。
29.如权利要求28所述的方法，其还包括将所获取的热解旋条形码与已知的热解旋条形码进行比较，以确定DNA分子的序列。
30.制备DNA分析装置的方法，所述方法包括：
形成用于纳米结构表面的第一主模板，所述第一主模板具有在其中形成的一条 或多条纳米缝；
形成用于样品微米通道的第二主模板；
在第二主模板上沉积光刻胶材料；
在第一主模板上沉积第一可变形材料；
从第一可变形材料移除第一主模板，由此形成第一可变形材料的基础层，所述基础层包括通道区和在所述通道区内形成的深度为100纳米或更小的一条或多条纳米缝，所述纳米缝设置在所述装置的纵向方向上；
在第二主模板及光刻胶材料上沉积第二可变形材料；
从第二可变形材料移除第二主模板及光刻胶材料，由此形成第二可变形材料的夹层；
将夹层置于基础层上，使得在所述夹层的中央部分和所述基础层之间形成所述样品微米通道，所述一条或多条纳米缝朝向所述微米通道开放，
其中所述夹层包括面向所述纳米缝的下表面和与所述下表面相对的上表面，
其中所述装置被配置为使得，当向夹层的上表面施加压力时，夹层的下表面被压入所述纳米缝中并与其底部表面接触，由此在所述纳米缝中形成纳米通道。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述纳米缝的深度为100纳米或更小，并且所述纳米通道的长度为10微米至10毫米。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述纳米通道从纵向观测时具有三角形的横截面。
33.如权利要求30所述的方法，其还包括：
形成用于控制微米通道的第三主模板，所述第三主模板在其上具有突出部；
在第三主模板上沉积第三可变形材料；
从第三可变形材料移除第三主模板，由此形成第三可变形材料的控制层，所述控制层具有在其中形成的、具有突出部形状的控制微米通道；
将控制层置于夹层上，使得控制微米通道形成于控制层与夹层之间。
34.如权利要求30所述的方法，其中第一可变形材料是可变形的聚合物。
35.如权利要求34所述的方法，其中第一可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
36.如权利要求30所述的方法，其中第二可变形材料是可变形的聚合物。
37.如权利要求36所述的方法，其中第二可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
38.如权利要求33所述的方法，其中第三可变形材料是可变形的聚合物。
39.如权利要求38所述的方法，其中第三可变形材料是聚二甲基硅氧烷。
40.如权利要求30所述的方法，其中第一可变形材料与第二可变形材料相同。
41.如权利要求33所述的方法，其中第一可变形材料与第三可变形材料相同。
42.如权利要求33所述的方法，其中第二可变形材料与第三可变形材料相同。
43.如权利要求30所述的方法，其还包括在从第一可变形材料移除第一主模板之前，在第一可变形材料上放置刚性基底，其中在将夹层放置在基础层上之后，刚性基底保持在基础层的下方。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述刚性基底是盖玻片。
45.如权利要求30所述的方法，其中所述第一主模板包括硅。
46.如权利要求30所述的方法，其中所述第二主模板包括硅。
47.如权利要求33所述的方法，其中所述第三主模板包括硅。
48.如权利要求30所述的方法，其中所述第一主模板的材料与所述第二主模板的材料相同。
49.如权利要求33所述的方法，其中所述第一主模板的材料与所述第三主模板的材料相同。
50.如权利要求33所述的方法，其中所述第二主模板的材料与所述第三主模板的材料相同。
51.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的宽度为1微米或更大。
52.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的深度为50纳米或更小。
53.如权利要求30-50任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的深度为30纳米或更小。
54.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的深度为20纳米或更小。
55.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的深度为10纳米至20纳米。
56.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的深度为20纳米。
57.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述纳米缝的长度为10微米至10毫米。
58.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中每条纳米通道的宽度是相同的，深度是相同的。
59.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中光刻胶材料被沉积成圆顶形，并且其中样品微米通道呈圆顶形。
60.如权利要求33所述的方法，其中所述突出部具有矩形的横截面，并且其中控制微米通道从纵向观测时具有矩形的横截面。
61.如权利要求33所述的方法，其中所述控制微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
62.如权利要求30-50中任何一项所述的方法，其中所述样品微米通道的长度与每条纳米缝的长度相同，并且宽度为1微米至900微米。
63.用于大分子分析的装置，其包括：
样品微米通道，其具有被配置为允许微米通道塌陷和均匀的闭合的横截面与刚度；
在样品微米通道顶部或底部表面上形成的至少一个开放的纳米结构，其中至少一个开放的纳米结构的深度等于或小于100纳米；
控制微米层，其位于样品微米通道上方或下方并且被配置用于控制样品微米通道的塌陷，所述样品微米通道的夹层位于控制微米通道与样品微米通道的开放部分之间；
其中所述装置被配置为使得，当通过控制微米通道向夹层施加压力时，夹层被压入至少一个纳米结构中并与其底部表面接触，由此在所述纳米结构中形成纳米通道。
64.如权利要求63所述的装置，其中每个纳米结构的宽度为1微米或更大。
65.如权利要求63所述的装置，其中样品微米通道的高度为5微米至50微米。
66.如权利要求63所述的装置，其中存在的每个纳米结构是直的纳米缝、弯曲的纳米缝或纳米凹陷。
67.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度为100纳米或更小，并且每条纳米通道的深度为100纳米或更小。
68.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的宽度为10纳米至100纳米，并且每条纳米通道的深度为10纳米至100纳米。
69.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道从纵向观测时具有三角形的横截面。
70.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道能够通过改变施加于夹层的压力来进行调节。
71.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道的长度为10微米至10毫米。
72.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道被配置为处理伸直长度为50kbp(千碱基对)至1000Mbp(兆碱基对)的双链DNA。
73.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中所述装置被配置为用于DNA分析或蛋白质分析。
74.如权利要求63-66中任何一项所述的装置，其中每条纳米通道不是直接结合的，并且当释放所施加的压力时能够恢复至微米级别。
75.利用权利要求63-74中任何一项所述的装置分析DNA或蛋白质的方法，所述方法包括：
向至少一个纳米结构提供大分子；以及
通过控制微米通道向夹层施加压力，使得样品微米通道塌陷，并且夹层被压入至少一个纳米结构中，由此在其中形成纳米通道，
其中当微米通道由于施加于夹层的压力而塌陷时，大分子在纳米结构的纳米通道中伸展并线性化。
76.如权利要求75所述的方法，其中当样品微米通道塌陷时，夹层的弯曲边缘平滑地衔接相差大于3个数量级的不同长度级别的用于大分子伸展的纳米通道与样品微米通道。
77.如权利要求76所述的方法，其中夹层弯曲边缘的梯度被配置为能够被控制微米通道所施加的压力来调节，并且当压力释放时所述梯度也是可逆的。
78.如权利要求76-77中任何一项所述的方法，其中所述平滑过渡衔接从单细胞到基因组DNA的长度级别。
79.如权利要求75-77中任何一项所述的方法，其中所述方法用于芯片上的细胞裂解或下游的DNA分析。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018174899A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 Zs Genetics, Inc. Continuous confinement fluidics
WO2018174903A1 (en) * 2017-03-24 2018-09-27 Zs Genetics, Inc. Methods and devices for analysis of biological analytes
US10365564B2 (en) 2017-08-09 2019-07-30 Saudi Arabian Oil Company Calcite channel nanofluidics
US11614395B2 (en) 2017-10-16 2023-03-28 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Miniaturized flow cell and system for single-molecule nanoconfinement and imaging
WO2019113024A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Systems and methods for identifying sequence information from single nucleic acid molecule measurements
US20190210020A1 (en) * 2018-01-05 2019-07-11 Genturi, Inc. High density nanofluidics
US10761428B2 (en) 2018-08-28 2020-09-01 Saudi Arabian Oil Company Fabricating calcite nanofluidic channels
US10926227B2 (en) 2018-12-03 2021-02-23 Saudi Arabian Oil Company Fabricating calcite nanofluidic channels
US11300554B2 (en) 2020-01-14 2022-04-12 Saudi Arabian Oil Company Calcite channel structures with heterogeneous wettability
US20230321653A1 (en) 2020-06-01 2023-10-12 Dimensiongen Devices and methods for cytogenetic analysis
US11454097B2 (en) 2021-01-04 2022-09-27 Saudi Arabian Oil Company Artificial rain to enhance hydrocarbon recovery
US11961702B2 (en) 2021-12-09 2024-04-16 Saudi Arabian Oil Company Fabrication of in situ HR-LCTEM nanofluidic cell for nanobubble interactions during EOR processes in carbonate rocks
US11787993B1 (en) 2022-03-28 2023-10-17 Saudi Arabian Oil Company In-situ foamed gel for lost circulation
US11913319B2 (en) 2022-06-21 2024-02-27 Saudi Arabian Oil Company Sandstone stimulation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1511569A1 (en) * 2002-06-13 2005-03-09 Millenium Biologix AG Reaction chamber
JP2005331365A (ja) * 2004-05-20 2005-12-02 Matsushita Electric Ind Co Ltd Ｄｎａ診断装置およびｄｎａ判別方法
CN102666946A (zh) * 2009-09-28 2012-09-12 生物纳米基因组公司 用于聚合物分析的纳米通道阵列和近场照射装置以及相关方法
CN103305402A (zh) * 2007-03-28 2013-09-18 博纳基因技术有限公司 使用纳米通道阵列的大分子分析方法
CN104312914A (zh) * 2014-10-23 2015-01-28 北京大学 一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020022261A1 (en) * 1995-06-29 2002-02-21 Anderson Rolfe C. Miniaturized genetic analysis systems and methods
AU2002211389A1 (en) * 2000-10-03 2002-04-15 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
IL159865A0 (en) 2001-07-25 2004-06-20 Univ Princeton Nanochannel arrays and their preparation and use for high throughput macromolecular analysis
EP1572860B1 (en) 2002-04-16 2018-12-05 Princeton University Gradient structures interfacing microfluidics and nanofluidics, methods for fabrication and uses thereof
WO2007065025A2 (en) 2005-11-29 2007-06-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of dna analysis using micro/nanochannel
SG173398A1 (en) * 2006-07-19 2011-08-29 Bionanomatrix Inc Nanonozzle device arrays: their preparation and use for macromolecular analysis
WO2008134363A1 (en) 2007-04-25 2008-11-06 The Regents Of The University Of Michigan Tunable elastomeric nanochannels for nanofluidic manipulation
US9597687B2 (en) 2008-10-10 2017-03-21 Jonas Tegenfeldt Method for the mapping of the local AT/GC ratio along DNA
GB0901593D0 (en) * 2009-01-30 2009-03-11 Touchlight Genetics Ltd Production of closed linear DNA
US8691588B2 (en) 2009-08-21 2014-04-08 Cornell University Nanofilter devices using elastomeric micro to nanochannel interfaces and methods based thereon
WO2011088398A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 President And Fellows Of Harvard College Convex lens-induced confinement for measuring distributions of molecular size
GB201017905D0 (en) 2010-10-25 2010-12-01 Mir Kalim U Preparation and analysis of samples
GB201111237D0 (en) 2011-06-30 2011-08-17 Isis Innovation Nanochip
EP2962117B1 (en) 2013-02-28 2019-10-09 The University of North Carolina At Chapel Hill Nanofluidic devices with integrated components for the controlled capture, trapping, and transport of macromolecules and related methods of analysis
JP6499638B2 (ja) 2013-03-13 2019-04-10 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 全ゲノムの高速マッピング用ナノ流体デバイス、並びに関連する分析システム及び分析方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1511569A1 (en) * 2002-06-13 2005-03-09 Millenium Biologix AG Reaction chamber
JP2005331365A (ja) * 2004-05-20 2005-12-02 Matsushita Electric Ind Co Ltd Ｄｎａ診断装置およびｄｎａ判別方法
CN103305402A (zh) * 2007-03-28 2013-09-18 博纳基因技术有限公司 使用纳米通道阵列的大分子分析方法
CN102666946A (zh) * 2009-09-28 2012-09-12 生物纳米基因组公司 用于聚合物分析的纳米通道阵列和近场照射装置以及相关方法
CN104312914A (zh) * 2014-10-23 2015-01-28 北京大学 一种基于纳米孔结构的蛋白质分子电子器件

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种基于单分子纳米操纵的有序化测序策略;吕鸣等;《生物化学与生物物理进展》;20060720;第33卷(第07期);第660-664页 *
纳米通道单分子检测P53蛋白与DNA的弱相互作用;应佚伦等;《化学学报》;20130115;第71卷(第01期);第44-50页 *

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