KR20150130314A - 전체 게놈의 신속한 맵핑을 위한 나노유체 장치 및 관련 시스템 및 분석 방법 - Google Patents

전체 게놈의 신속한 맵핑을 위한 나노유체 장치 및 관련 시스템 및 분석 방법 Download PDF

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KR20150130314A
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존 마이클 람제이
로랑 메나드
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더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
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Abstract

장치 및 방법은 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원으로부터 추출된 게놈 DNA의 순서화된 제한효소 맵을 작성한다. 장치는 나노채널 직경의 크기가 50% 내지 99% 감소하는 계면에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널을 갖는다. DNA의 온전한 분자가 반응 나노채널에 수송된 후에, 제한 엔도뉴클레아제 효소를 사용하여 반응 나노채널에서 단편화된다. 반응 나노채널은 단편이 검출 나노채널에 주입될 때까지 원래의 순서를 유지하도록 하는 크기 및 구성을 갖는다. 검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 신호를 검출하여 단편이 긴 DNA 분자를 따라 발생하는 순서대로 단편의 맵을 작성한다.
[대표도]
도 1a

Description

전체 게놈의 신속한 맵핑을 위한 나노유체 장치 및 관련 시스템 및 분석 방법 {NANOFLUIDIC DEVICES FOR THE RAPID MAPPING OF WHOLE GENOMES AND RELATED SYSTEMS AND METHODS OF ANALYSIS}
관련 출원
본 출원은 2013년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 61/778,746의 이익 및 우선권을 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
미국 연방정부 지원의 선언
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 승인번호 HG002647의 정부 지원하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 다중핵산의 게놈 특징화에 관한 것이다.
최근에 랩온어칩(lab-on-a-chip) 유체 장치에 나노규모의 구성요소를 혼입하는 것에 대한 상당한 관심이 있어 왔다. 이러한 관심은 마이크로미터 규모에서 나노규모로 달라짐으로 인한 다수의 장점 (및 그에 유리하게 영향받을 수 있는 차이)에서 유래한다. 이러한 차이는 예를 들어, 이중층 오버랩 (DLO) 및 전기-삼투 및 전하 선택투과성에 있어서의 그의 효과, 전기장의 국한된 증강, 보다 높은 표면적 대 체적비, 거대 합성 및 생체-고분자에 있어서의 구속 효과, 및 엔트로피 효과의 새로운 중요성을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Yuan et al., Electrophoresis 2007, 28, 595-610]; [Schoch et al., Rev. Mod. Phys. 2008, 80, 839-883]; 및 [Kovarik et al., Anal. Chem . 2009, 81, 7133-7140]을 참조한다. 과거 나노규모 장치의 중요한 예는 나노규모의 세공을 갖는 크로마토그래피 분리 및 여과 막에 다공성 매체 및 겔을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Lerman et al., Biopolymers 1982, 21, 995-997]; 및 [Tong et al., M. Nano Lett . 2004, 4, 283-287]을 참조한다. 그러나, 최근의 연구는 유체 및 분석물질의 수송을 위한 기하학적으로 잘 한정된 도관의 가공 및 이음매 없이 이들 도관을 장치에 통합시키는 것에 집중해 왔다. 예를 들어, 문헌 [Volkmuth et al., Nature 1992, 358, 600-602]; 및 [Striemer et al., Nature 2007, 445, 749-753]을 참조한다. 이러한 규칙적인 구조의 장점은 그 안에 포함된 압력 및 전기장 구배, 유체 흐름, 및 분자 운동이, 보다 복잡한 네트워크에서의 이러한 특징들과 비교하여 상대적으로 단순하다는 것이다. 이러한 시스템을 한정하고, 특징화하고, 또한 용이하게 모델링할 수 있게 됨으로써, 예를 들어 분리 메카니즘 및 단일 분자 물리학을 더욱 잘 이해할 수 있게 되었다. 예를 들어, 문헌 [Volkmuth et al., Nature 1992, 358, 600-602]; [Reisner et al., Phys. Rev. Lett . 2005, 94, 196101]; 및 [Salieb-Beugelaar et al., Lab Chip 2009, 9, 2508-2523]을 참조한다.
최근에, 나노유체 장치를 형성하는 FIB 밀링 기술이 개시되었다. 문헌 [Menard et al., Fabrication of Sub-5 nm Nanochannels in Insulating Substrates Using Focused Ion Beam Milling, Nano Lett. 2011, 11, 512-517] (2010년 12월 20일 공개); 및 미국 특허 가출원 61/384,738 (및 관련 PCT 출원 PCT/US2011/052127) (출원일: 2010년 9월 21일, 발명의 명칭: Methods, Systems And Devices For Forming Nanochannels)을 참조하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. FIB 밀링 이외에도, 예를 들어 전자빔 리소그래피, 나노임프린트 리소그래피, 포토리소그래피, 템플레이팅(templating) 또는 몰딩(molding) 방법, 및 통상의 기술자에게 이해되는 다른 방법을 포함하는, 나노채널의 제작에 적합한 다양한 다른 방법이 사용될 수 있다.
단일 분자 감지 및/또는 핵산 서열분석을 위한 통합 미니어처 전극 (나노- 또는 마이크로- 규모)을 갖는 장치를 포함하여, 다수의 나노유체 장치가 제시되었다. 그렇지 않으면, 유체 구성요소만으로 이루어진 통합 장치가 단일 분자 수송 및 검출의 우수한 조절을 제공할 수 있다. 문헌 [Menard et al., A Device for Performing Lateral Conductance Measurements on Individual Double-Stranded DNA Molecules, ACS Nano 2012, 12, 9087-9094] (2012년 9월 5일 공개); 미국 특허 가출원 61/533,523 (및 계류 중인 대응 출원 PCT/US13/054128) (출원일: 2011년 9월 12일, 발명의 명칭: Devices with a Fluid Transport Nanochannel Intersected by a Fluid Sensing Nanochannel and Related Methods); 및 미국 특허 가출원 61/770,586 (출원일: 2013년 2월 28일, 발명의 명칭: Nanofluidic Devices with Integrated Components for the Controlled Capture, Trapping, and Transport of Macromolecules and Related Methods of Analysis)을 참조하며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 단일 모노리식(monolithic) 장치에서의 구성요소의 이러한 통합으로 DNA 서열분석 및 의료 진단과 같은 분야에서 통용되는 분석에서의 요구를 해결하는 신규한 방법 및 시스템이 가능해질 수 있다.
본 발명의 실시양태는 염색체 DNA의 고효율 제한효소 맵핑을 용이하게 하는 장치를 제공하기 위해 구성되었다.
본 발명의 실시양태는 나노유체 분석 시스템을 포함한다. 상기 시스템은 (a) 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm이고 검출 나노채널의 크기가 반응 나노채널보다 감소하는 그 사이의 계면 위치에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널; (b) 반응 나노채널의 입구 부분과 연통되는 마이크로유체 채널; (c) 마이크로유체 채널과 연통되는 제1 전극; (d) 반응 나노채널로부터 이격되어 있지만 그의 입구 부분에 근접한 위치에서 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제1 횡방향 유체 채널; (e) 제1 횡방향 유체 채널과 연통되는 제2 전극; (f) 제1 횡방향 유체 채널의 하류에서 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제2 횡방향 유체 채널; (g) 제2 횡방향 유체 채널과 연통되는 제3 전극; (h) 검출 나노채널과 연통되는 제4 전극; (i) 단편 무질서화를 방지하는 반응 나노채널 내에서 DNA가 조절가능하게 가닥화, 로딩 및 소화되도록 (예를 들어, DNA가 순서화된 단편을 생성하는 반응 나노채널에서 반응함) 제1, 제2, 제3 및 제4 전극의 작동을 조절하도록 구성된 회로; 및 (j) 단편 크기를 시공간적으로 소화시킴으로써 실시간으로 또는 근실시간으로 염색체 DNA의 순서화된 제한효소 맵을 가능하게 하도록 구성된 검출 나노채널과 연통되는 전기적 또는 광학 검출기를 포함한다.
마이크로유체 채널은 마이크로유체 유로를 부분적으로 폐색시키도록 구성된 이격되어 있는 기둥의 어레이를 포함할 수 있다.
시스템은 마이크로유체 채널을 유체 수송 나노채널의 입구 부분과 연결하는 나노연통을 포함할 수 있다.
나노유체 반응 채널은 "U자형" 세그먼트에 의해 연결된 복수 개의 밀접 배치된, 실질적으로 평행한 세그먼트를 갖는 사형(serpentine) 형상을 가질 수 있다.
마이크로유체 채널, 반응 나노채널, 검출 나노채널, 및 제1 및 제2 유체 횡방향 채널은 유체 칩 상의 모노리식 통합형일 수 있다.
제1 및/또는 제2 횡방향 유체 채널은 약 1 nm 내지 약 100 nm의 깊이 및 약 20 nm 내지 약 2000 nm의 너비를 갖는 유체 나노채널일 수 있다.
반응 나노채널은 검출 나노채널과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 10 내지 1000배 더 길고 2 내지 10배 더 클 수 있다.
마이크로유체 채널은 하나 이상의 저장소와 유체 연통될 수 있고, 이들 저장소 중 적어도 하나는 DNA 분석용 전체 세포를 포함한다.
분석용 전체 세포는 게놈 DNA의 추출을 위해 겔 매트릭스에 의해 저지될 수 있다.
분석용 전체 세포는 게놈 DNA의 추출을 용이하게 하기 위해 마이크로유체 채널에서 하나 이상의 고밀도 및/또는 저밀도 기둥 어레이에 의해 저지될 수 있다.
마이크로유체 입구 채널은 DNA를 갖는 전체 세포를 포함한다. 제2 횡방향 유체 채널은 반응 나노채널로부터 떨어져 있는 말단부에서 제2 유체 저장소로 병합된다. 제2 유체 저장소는 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자의 용액을 보유한다.
반응 나노채널은 직선형일 수 있고, 약 500 ㎛ 내지 약 2 cm의 길이를 가질 수 있다. 반응 나노채널은 검출 나노채널과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 약 10 내지 약 1000배 더 길고 약 2 내지 약 10배 더 클 수 있다.
시스템은 제2 반응 나노채널의 입구 말단에서 유체 마이크로채널과 유체 연통되고, 제2 반응 나노채널의 반대편의 출구 말단에서 각각의 제2 검출 나노채널로 병합되는 제2 반응 나노채널을 포함할 수 있다.
다른 실시양태는 나노유체 분석 칩에 관한 것이다. 상기 칩은 (a) 기둥 어레이를 갖는 마이크로유체 채널과 함께 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원으로부터 게놈 DNA를 추출하도록 적합화된 마이크로유체 유입구; (b) 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm이고, 마이크로유체 유입구와 연결된 입구 부분을 갖는 반응 나노채널; (c) 나노채널 크기의 감소에 의해 한정된 교차점에서 반응 나노채널의 출구 말단과 병합되는 검출 나노채널; (d) 반응 나노채널로부터 이격되었지만 그의 입구 부분에 근접해 있는 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제1 횡방향 나노채널; 및 (e) 제1 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제2 횡방향 유체 나노채널을 포함한다.
칩은 또한 반응 나노채널과 마이크로유체 유입구의 사이에 위치하고 이들을 연결하는 나노연통을 포함할 수 있다.
칩은 마이크로유체 유입구와 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 제1 횡방향 나노채널과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 제2 횡방향 나노채널과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 및 검출 나노채널의 말단과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소를 포함하여, 복수 개의 저장소를 포함할 수 있다.
마이크로유체 채널에서 기둥 어레이는 축방향으로 이격된 어레이의 다수의 세그먼트를 포함할 수 있다.
기둥 어레이는 마이크로유체 채널의 실질적으로 전체 너비에 걸쳐서 연장되도록 구성될 수 있다.
또 다른 실시양태는 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원으로부터 추출된 게놈 DNA의 순서화된 제한효소 맵핑 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 나노채널 직경의 크기가 감소하는 계면에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널을 갖는 장치를 제공하고; (b) 마이크로채널에서 전체 세포를 용해시키고 최소한으로 단편화하면서 DNA를 탈염색질화(dechromatinizing)하고; 이어서 (c) DNA의 온전한 분자를 반응 나노채널에 도입하고; 그 후에 (d) 반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 효소를 사용하여 온전한 DNA를 단편화하는 것을 포함한다. 반응 나노채널은 단편이 검출 나노채널에 주입될 때까지 원래의 순서를 유지하도록 하는 크기 및 구성을 갖는다. 상기 방법은 (e) 검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 신호를 검출하여 긴 DNA 분자를 따라 발생하는 순서대로 단편의 맵을 작성하는 것을 추가로 포함한다.
장치는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널과 유체 연통되는 하나 이상의 저장소를 포함할 수 있다. 도입 단계는 분석용 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원을 저장소를 사용하여 도입함으로써 수행될 수 있다. 방법은 또한 전체 세포를 고정시키기 위한 겔 매트릭스 및/또는 고밀도 기둥 어레이를 제공하고, 이어서 세포를 용해시키고, DNA를 추출한 다음, 임의로 DNA를 염색한 후에, DNA의 온전한 분자를 반응 나노채널에 도입하는 것을 포함할 수 있다.
장치는 반응 나노채널의 입구 말단 및 마이크로유체 채널의 하류에서 반응 채널과 유체 연통되는 제1 횡방향 채널과 유체 연통되는, 기둥 어레이를 갖는 마이크로유체 채널을 포함할 수 있다.
방법은 마이크로유체 및 횡방향 채널에 전압을 인가하여 반응 나노채널의 입구 영역에 바이어스를 생성함으로써 샘플을 가닥화 및 로딩하는 것을 포함할 수 있다.
가닥화 단계는 DNA 분자가 초기에는 DNA 인장 강도를 초과하는 변형율에 적용되지 않고 기계적으로 절단되지 않도록 하는 조절된 전압 또는 농도 분극 구배를 사용하여 반응 채널의 입구에 근접한 곳에서 수행될 수 있다.
가닥화 단계 후에, 로딩은 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜, DNA 분자의 끝부분이 기둥 뒤엉킴 및 기계적 절단을 피하면서 확산성으로 풀리는 충분한 시간을 갖도록, 전장 DNA 분자를 약 1 ㎛/s 내지 약 1 mm/s의 속도로 반응 나노채널로 견인함으로써 수행될 수 있다.
제한효소 소화 반응은 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜 반응 나노채널에 함유된 DNA에 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자를 도입한 후에, 모든 제한효소 인식부위가 소화될 때까지 반응을 진행시킴으로써 수행될 수 있다.
반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압은 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자의 마이크로유체 채널에의 도입을 억제하거나 방지함으로써, 반응 나노채널 밖에서의 DNA 분자의 소화를 방지할 수 있다.
순서화된 제한 단편의 검출은 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜 반응 나노채널과 검출 나노채널 사이의 계면으로 단편의 이동을 추진함으로써 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가닥화, 로딩, 제한효소 소화, 및 제한 단편 크기의 순서화된 검출은 연속적으로 인가되는 정전압을 사용하여 실현될 수 있다.
검출 나노채널 직경의 크기는 반응 나노채널과 비교하여 50% 내지 99% 감소할 수 있으므로, 각각의 단편이 교차점에 도달하는 수송 속도 및 각각의 이웃하는 단편의 분리를 증가시킨다. 후속 검출 단계는 분리된 단편의 검출 나노채널을 통한 수송을 검출함으로써 수행될 수 있다.
검출 단계는 검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 단편을 광학적으로 또는 전기적으로 검출함으로써 수행될 수 있다.
방법은 검출 신호 지속시간 또는 통합 진폭을 분석함으로써 단편 크기를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
장치는 유체 분석 칩일 수 있다.
칩은 칩과 연통되는 수송 시스템과 함께 사용될 수 있고, 여기서 수송 시스템은 게놈 DNA 및 그의 단편을 반응 나노채널을 경유하여 검출 나노채널로 수송시키는 동전기, 압력 또는 구심력 중 하나 이상을 인가하도록 구성된다.
또 다른 실시양태는 유체 분석 칩과의 접속 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 샘플 도입, 세포 용해 및 DNA 추출, 및 염색을 조절하고; (b) 추출된 DNA를 DNA 가닥화하고 반응 나노채널에 로딩하고, 반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자로 제한효소 소화시키고, 제한 단편을 검출 나노채널을 통해 순서대로 수송시키고; (c) 제한 단편을 검출 나노채널을 통한 수송 동안에 전자적으로 검출하고; (d) DNA 분자로부터의 제한 단편 크기를 실시간 또는 근실시간 분석법을 사용하여 전자적으로 분석하고; (e) 다수의 DNA 분자로부터 공통 제한효소 맵을 전자적으로 작성하고 맵의 품질을 평가하여 추가 샘플링이 필요한지를 평가하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 유체 분석 칩과의 접속 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 (a) 샘플 도입, 세포 용해 및 DNA 추출, 및 염색을 조절하는 수단; (b) DNA 가닥화 및 반응 나노채널에의 로딩, 반응 나노채널에서의 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자로의 제한효소 소화, 및 검출 나노채널을 통한 제한 단편의 순서화된 수송을 조절하는 수단; (c) 검출 나노채널을 통한 수송 동안에 제한 단편을 검출하는 수단; (d) 실시간 또는 근실시간 분석법을 사용하여 DNA 분자로부터의 제한 단편 크기를 분석하는 수단; 및 (e) 다수의 DNA 분자로부터 공통 제한효소 맵을 작성하고, 맵 품질을 평가하여 추가 샘플링이 필요한지를 평가하는 수단을 포함한다.
또 다른 실시양태는 유체 분석 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 반응 나노채널로 병합되는 유로를 갖는 마이크로유체 채널; 반응 나노채널의 상류에서 마이크로유체 채널과 유체 연통되는 DNA 저장소; 반응 나노채널의 유입구에 근접한 곳에 위치하는 반응 나노채널과 유체 연통되는 가닥 저장소; 반응 나노채널보다 작은 직경 및/또는 작은 너비 및 깊이를 갖는, 반응 나노채널의 출구 말단에 연결된 검출 나노채널; 및 검출 나노채널에 근접한 곳에 위치하는, 반응 나노채널과 유체 연통되는 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자를 포함하는 저장소를 포함한다.
장치는 제1 반응 나노채널의 하류에서 제2 횡방향 유체 나노채널 다음에 위치하고 제1 반응 나노채널과 유체 연통되는, 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm인 제2 반응 나노채널을 임의로 포함할 수 있다. 칩은 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 유체로 폐기물 배출로에 들어가거나 또는 유체로 제2 반응 나노채널에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통될 수 있다.
칩은 제2 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 연장되는 결합된 배출 채널을 갖는 복수 개의 수집 저장소 및 폐기물 배출로를 포함할 수 있다. 칩은 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 폐기물 배출로 또는 수집 저장소 중 어느 하나에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통될 수 있다.
칩은 제1 반응 나노채널의 하류에서 제2 횡방향 유체 나노채널 다음에 위치하고 제1 반응 나노채널과 유체 연통되는, 길이가 약 500 ㎛ 내지 10 cm인 제2 반응 나노채널을 포함할 수 있다. 칩은 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 유체로 폐기물 배출로에 들어가거나 또는 유체로 제2 반응 나노채널에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통될 수 있다.
칩은 제2 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 연장되는 결합된 배출 채널을 갖는 복수 개의 수집 저장소 및 폐기물 배출로를 포함할 수 있다. 칩은 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 폐기물 배출로 또는 수집 저장소 중 어느 하나에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통될 수 있다.
방법은 관심 영역이 맵핑되는 시점을 실시간으로 또는 근실시간으로 전자적으로 또는 광학적으로 확인하고, 관심 영역이 된맵핑 것으로 검출될 때 제한 단편을 유체로 제2 나노반응 채널로 선택적 및 자동적으로 수송하는 것을 포함할 수 있다.
방법은 관심 영역이 맵핑되는 시점을 실시간으로 또는 근실시간으로 전자적으로 또는 광학적으로 확인하고, 자동적 및 선택적으로 관심 제한 단편을 유체로 후속 분석을 위한 각각의 수집 저장소로의 각각의 배출 채널로 수송하고 다른 제한 단편을 유체로 폐기물 배출 채널로 수송하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태와 관련하여 기재된 본 발명의 측면이 상이한 실시양태에 포함될 수 있지만, 그와 관련하여 구체적으로 기재되지는 않음을 주목한다. 즉, 모든 실시양태 및/또는 임의의 실시양태의 특징은 어떠한 방식 및/또는 어떠한 조합으로도 조합될 수 있다. 본 출원인은 최초 출원된 청구항을, 그러한 방식으로 최초 청구되지 않았더라도 임의의 다른 청구항 또는 청구항들에 종속시키고/거나 그의 특징을 포함하도록 보정할 수 있는 권리를 포함하여, 최초 출원된 청구항을 변화시키고/거나 그에 따라 새로운 청구항을 출원할 권리를 갖는다. 본 발명의 상기 및 기타 목적 및/또는 측면은 하기 상술된 명세서에서 상세히 설명된다. 본 발명의 추가 특징, 장점 및 상세한 내용은 이어지는 도면 및 바람직한 실시양태의 상세한 설명을 정독시 통상의 기술자에게 이해될 것이고, 이러한 기재내용은 단지 본 발명을 예시하는 것이다.
도 1a는 본 발명의 실시양태에 따른 유체 분석 장치의 개략도이다.
도 1b는 본 발명의 실시양태에 따른 도 1a에 도시된 장치에 결합될 수 있는 덮개 플레이트를 도해한다.
도 1c는 저장소가 본 발명의 일부 실시양태에 따라 도 1b에 도시된 장치에 부착될 수 있음을 도해한다.
도 2a-2d는 본 발명의 실시양태에 따른 DNA 추출의 온칩(on-chip) 공정을 도해한다.
도 3a-3c는 본 발명의 실시양태에 따른 전체 세포의 포착, 용해 및 탈염색질화된 DNA의 염색을 도시하는 장치의 확대된 마이크로유체 부분의 개략도이다.
도 4a는 본 발명의 실시양태에 따른 나노유체 반응 채널로 이어지는 예시 패턴의 샘플 유입구를 갖는 유체 분석 장치의 개략도이다.
도 4b는 본 발명의 일부 실시양태에 따른 샘플 DNA 분자가 도입되는 공동의 마이크로채널과 유체 연통되는 다수의 반응 나노채널 및 각각의 검출 나노채널을 갖는 유체 분석 장치의 개략도이다.
도 5는 본 발명의 실시양태에 따른 마이크로유체 채널과 나노유체 반응 채널 사이 계면의 "일정한 비율로" 크게 확대된 도면이다.
도 6a-6d는 본 발명의 실시양태에 따른 유체 분석 장치의 예시 전압 및 작업 순서를 나타내는 개략도이다.
도 6e는 본 발명의 실시양태에 따른 다중점 검출 회로 (도 6d의 단일점 회로 대신)를 갖는 검출 나노채널의 확대도이다.
도 6f는 본 발명의 대안적의 실시양태에 따른 전압 구동 시스템 대신에 압력 수송 시스템을 이용하는 도 6a-6e에 도시된 장치와 유사한 분석 장치의 개략도이다.
도 6g는 본 발명의 실시양태에 따른 임의의 적합한 구동 ("D") 수송 시스템 또는 구동 수송 시스템의 조합의 사용을 개략적으로 도해하는, 도 6a-6f에 도시된 장치와 유사한 분석 장치의 개략도이다.
도 7a-7d는 본 발명의 실시양태에 따른 대안적의 검출 회로를 제외하고는, 도 6a-6d와 유사한 유체 분석 장치의 예시 전압 및 작업 순서를 나타내는 개략도이다.
도 7e는 본 발명의 실시양태에 따른 다중점 검출 회로 (도 7d의 단일점 회로 대신)를 갖는 검출 나노채널의 확대도이다.
도 8은 본 발명의 실시양태에 따른 유체 구조를 도해하는 FIB 밀링을 사용하여 제작된 모형 유체 장치의 이미지이다 (확대 삽입도는 반응 및 검출 나노채널 사이의 교차점임).
도 9a는 본 발명의 실시양태에 따른 Mg2 +를 도입하기 위한 나노채널과 반응 나노채널의 교차점의 명시야 광학 이미지이다.
도 9b는 본 발명의 실시양태에 따른 Mg2 + 이온의 전압-개폐 도입시 마그네슘 그린 형광의 증가를 보여주는, 도 9a에 도시된 장치 부분의 상이한 이미지이다.
도 9c는 본 발명의 실시양태에 따른 개방 게이트 전압이 인가되었지만, Mg2 +가 사이드 나노채널에 존재하지 않을 때의 마그네슘 그린 형광의 최소한의 변화를 보여주는, 도 9a에 도시된 장치 부분의 상이한 이미지이다.
도 10a는 반응 나노채널에서의 λ-DNA의 확산을 보여주는 일련의 형광 이미지이다.
도 10b는 Mg2 +의 존재하에 제한 엔도뉴클레아제에 의한 약 1.5분의 소화 후에 3개의 단편이 관찰가능함을 보여주는 일련의 형광 이미지이다. 단편의 높은 확산성에도 불구하고 단편의 순서가 유지되었다.
도 11은 400 nm x 400 nm의 반응 나노채널에서 단편화되고 단편이 수송 중에 공간적으로 잘 소화되는 200 nm x 200 nm의 검출 채널에 주입된, 형광 염색된 T4-파지 DNA 분자를 보여주는 일련의 프레임 이미지이다 (하단부 2개의 확대 프레임 c 및 d). 중간 삽입도는 반응 및 검출 나노채널 세그먼트 사이 계면의 SEM 이미지를 나타낸다. 화살표는 시간을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시양태에 따른 염색체 DNA의 제한효소 맵핑 시스템의 개략도이다.
도 13a는 반응 나노채널로 가닥화 도입되는 DNA의 광학 검출의 개략도이다.
도 13b는 반응 나노채널로 가닥화 도입되는 DNA의 전기적 검출의 개략도이다.
도 13c는 가닥 검출 회로 및 단편 검출 회로에 의해 트리거(trigger) 개시되는, DNA 분자의 가닥화, 로딩, 반응, 및 검출을 위한 대표적인 전압 프로그램이다.
도 13d는 수송 구동 입력값 (예를 들어, 전압 및/또는 압력과 같은 구동력)이 일정한 연속 작동 모드를 도해한다.
도 14는 본 발명의 실시양태에 따라 DNA 단편의 맵핑을 위해 수행될 수 있는 예시 작업 흐름도이다.
도 15, 16, 18 및 19는 본 발명의 실시양태에 따른 복수 개의 직렬 배열된 반응 나노채널을 갖는 장치의 개략도이다.
도 17은 본 발명의 실시양태에 따른, 예를 들어 도 15, 16, 18 및 19에 도시된 장치를 사용하여 단편에 대하여 수행가능한 (전형적으로 선택적인) 추가 가공의 흐름도이다.
도 20은 본 발명의 실시양태에 따른 추가 후속 가공을 위한 제한 단편의 선택적 수집의 흐름도이다.
도 21은 본 발명에 실시양태에 따라 도 20에 도시된 방법을 수행하는데 사용가능한 장치의 예이다.
본 발명은 이제부터 본 발명의 실시양태가 도시된 첨부 도면을 참조하여 하기에서 더욱 자세히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고 본원에 상술된 실시양태로 제한되는 것으로 해석해서는 안된다. 유사 부호는 본 명세서 전체에서 유사 요소를 나타낸다. 도면에서, 특정 층, 구성요소 또는 특징이 명확성을 위해 과장될 수 있고, 파선은 달리 특정되지 않는 한, 임의적 특징 또는 작업을 도해한다. 또한, 작업 (또는 단계) 순서는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 도면 및/또는 청구범위에서 제시된 순서로 제한되지 않는다. 도면에서, 선의 두께, 층, 특징, 구성요소 및/또는 영역은 명확성을 위해 과장될 수 있고, 파선은 달리 특정되지 않는 한, 임의적 특징 또는 작업을 도해한다.
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 사용된 단수형은 문맥에서 명확하게 달리 나타내지 않는 한, 복수형 또한 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함한다", "포함하는", "포함된다" 및/또는 "포함되는"은 명시된 특징, 영역, 단계, 작업, 요소, 및/또는 구성요소의 존재를 특정하나, 하나 이상의 다른 특징, 영역, 단계, 작업, 요소, 구성요소, 및/또는 이들의 군의 존재 또는 첨가를 제외하지는 않는다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 관련된 나열 항목 중 하나 이상의 임의의 조합 및 모든 조합을 포함한다. 본원에서 사용된, "X 내지 Y" 및 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석해야 한다. 본원에서 사용된, "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미한다. 본원에서 사용된, "약 X부터 Y까지"와 같은 어구는 "약 X부터 약 Y까지"를 의미한다.
층, 영역 또는 기재와 같은 특징이 또 다른 특징 또는 요소 "상에" 있는 것으로 지칭되면, 이는 다른 특징 또는 요소 바로 위에 있을 수 있거나 또는 개재된 특징 및/또는 요소가 또한 존재할 수도 있는 것으로 이해될 것이다. 이와 달리, 요소가 또 다른 특징 또는 요소 "바로 위에" 있는 것으로 지칭되면, 개재된 요소가 존재하지 않는다. 또한, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소에 "연결", "부착" 또는 "커플링"되는 것으로 지칭되면, 이는 다른 요소에 직접적으로 연결, 부착 또는 커플링될 수 있거나 또는 개재된 요소가 존재할 수도 있는 것으로 이해될 것이다. 이와 달리, 특징 또는 요소가 또 다른 요소에 "직접적으로 연결", "직접적으로 부착" 또는 "직접적으로 커플링"되는 것으로 지칭되면, 개재된 요소가 존재하지 않는다. 하나의 실시양태와 관련하여 기재되거나 도시되더라도, 그렇게 기재되거나 도시된 특징은 다른 실시양태에도 적용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 (기술 용어 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 본 출원의 문맥 및 관련 기술분야에서의 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석해야 하고, 본원에서 명백하게 그렇게 정의되지 않는 한, 이상적인 또는 지나치게 정형적인 의미로 해석해서는 안된다는 것이 추가로 이해될 것이다. 널리 공지된 기능 또는 구성은 간결성 및/또는 명확성을 위해 상세히 기재되지 않을 수 있다.
"아래", "밑", "하부", "위", "상부" 등과 같은 공간적 상대어는 기술의 용이함을 위해 도면에서 도해된 하나의 요소 또는 특징의 또 다른 요소(들) 또는 특징(들)과의 관계를 기술하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 공간적 상대어는 도면에서 묘사된 배향 이외에도, 사용시 또는 작업시의 장치의 상이한 배향도 포함하기 위한 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 도면의 장치가 전도되었다면, 다른 요소 또는 특징의 "아래" 또는 "밑"으로 기술된 요소는 다른 요소 또는 특징의 "위"로 배향될 것이다. 따라서, 예시 용어 "아래"는 위 및 아래의 배향을 둘다 포함할 수 있다. 장치는 달리 배향될 수 있고 (90도 또는 다른 방향으로 회전), 본원에서 사용된 공간적 상대어는 그에 따라 해석된다. 마찬가지로, "상향으로", "하향으로", "수직으로", "수평으로" 등과 같은 용어는 구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 단지 설명의 목적으로 본원에서 사용된다.
제1, 제2 등과 같은 용어가 다양한 요소, 구성요소, 영역, 층 및/또는 구역을 기술하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 요소, 구성요소, 영역, 층 및/또는 구역은 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 용어는 단지 하나의 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 구역을 또 다른 영역, 층 또는 구역과 구분하기 위해 사용된다. 따라서, 하기에서 논의된 제1 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 구역은 본 발명의 교시내용으로부터 벗어나지 않으면서 제2 요소, 구성요소, 영역, 층 또는 구역으로 명명될 수도 있다.
용어 "나노채널"은 나노미터 규모의 임계 치수를 갖는 채널 또는 트렌치(trench)를 나타낸다. 나노채널은 측벽 및 바닥을 갖는다. 나노채널은 개방된 상단 표면 및 폐쇄된 바닥 표면과 함께 그 사이에서 연장되는 측벽을 갖는 고형 기재로 형성될 수 있다. 덮개는 나노채널(들)의 상단 표면을 밀봉 또는 폐쇄시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 "1차 치수"는 너비 및/또는 깊이 치수를 나타낸다. 유체 수송 나노채널의 1차 치수는 약 1 nm 내지 약 500 nm일 수 있다. 상이한 나노채널은 상이한 1차 치수를 가질 수 있다. 반응 나노채널의 1차 ("임계"라고도 함) 치수는 약 300-400 nm일 수 있고, 반응 나노채널은 약 10 nm 내지 약 300 nm일 수 있다.
용어 "약"은 +/- 20% 이하로, 예컨대 +/- 10%로 달라질 수 있는 파라미터를 나타낸다.
용어 "횡방향" 나노채널은 각각의 유체 수송 나노채널과 교차하는 유체 나노채널을 나타낸다.
용어 "유체 수송 나노채널"은 그것을 통해 분석용 분석물질이 흐르는 나노채널을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 유체 수송 나노채널은 2개의 주요 세그먼트, 반응 나노채널 및 검출 나노채널을 가질 수 있다. 분석물질은, 예를 들어 단일 분석물질 분자, 예컨대 합성 및 생물학적 거대분자, 나노입자, 소분자, DNA, 핵산/다중핵산, 펩티드, 단백질 등을 포함하는 임의의 관심 분석물질일 수 있다. 나노채널을 통한 수송은 동전기, 농도 분극 및/또는 수압 (인공 압력 또는 압력 구배)을 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "상류"는 유체 수송 나노채널 또는 반응 채널 입구에 보다 근접한 상대적 위치를 나타낸다. 용어 "하류"는 유체 수송 나노채널 또는 반응 채널 출구에 보다 근접한 상대적 위치를 나타낸다.
용어 "쉘로우(shallow)"는 수송 나노채널보다 얕은 깊이를 가지며 분석물질 거대분자의 유체역학적 크기보다 작은 나노채널 깊이를 나타낸다. 반응 나노채널의 깊이에 대하여, 쉘로우 나노채널은 전형적으로 2배 이상, 예컨대 2-100X 얕은 깊이를 갖는다. 따라서, 예를 들어, 쉘로우 나노채널 세그먼트는 10 nm 이하, 전형적으로는 약 0.1 nm 내지 9 nm일 수 있고, 반면에 수송 나노채널은 20 nm 이상, 예컨대 20-100 nm의 깊이 (적어도 쉘로우 세그먼트와 인접한 곳에서)를 가질 수 있다.
반응 나노채널(20)과 관련하여 "길다"는 용어는 반응 나노채널이 검출 나노채널(40) 길이의 10 내지 1000배라는 것을 의미한다. 반응 나노채널(20)은 검출 나노채널(40)과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 더 길고 2 내지 10배 더 클 수 있다. 반응 나노채널(20)은 일부 실시양태에서 약 500 ㎛ 내지 10 cm의 길이를 가질 수 있다.
"넓다"는 용어는 나노채널이 분석을 수행하기 위해 공조하는 (예를 들어, 구동 전압을 제공함) 수송 나노채널 너비의 적어도 2X (2배, "X"는 "배율" 또는 "배"를 의미함), 또한 보다 전형적으로는 인접한 공조 반응 나노채널 너비의 3X-100X, 예컨대 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 약 10X, 약 20X, 약 40X, 약 50X, 약 60X, 약 70X, 약 80X, 약 90X, 또는 약 100X의 너비를 갖는 것을 의미한다.
용어 "회로"는 하드웨어만의 실시양태 또는 소프트웨어 및 하드웨어의 조합 실시양태를 나타낸다.
기둥과 관련하여 용어 "고밀도"는 어레이가 마이크로채널의 전체 너비에 걸쳐서 연장되고 기둥이 약 10 ㎛ 미만의 에지-대-에지(edge-to-edge) 간격으로 배열되는 것을 의미한다. 용어 "저밀도"는 기둥이 전형적으로 약 50 ㎛를 초과하는 에지-대-에지 간격으로 배열되는 것을 의미한다.
용어 "저속"은 거대분자가 나노채널을 통해 약 1 ㎛/s 내지 약 1 mm/s의 속도로 이동하는 것을 의미한다.
용어 "유의하게 상이한 전기장 강도"는 유체 수송 나노채널의 어느 한 쪽이 동일한 채널의 제2 세그먼트와 비교하여 10X-1000X, 전형적으로는 100X-200X 더 크거나 작은 전압/cm 전기장 강도를 가질 수 있는 것을 의미한다.
용어 "가닥화" 및 그의 파생어는 분석물질 분자가 마이크로채널 또는 저장소에서 실현되는 랜덤 코일 입체형태로부터의 거대분자의 선형화를 제공하면서, 반응 나노채널(20)에 초기에 도입되는 공정을 의미한다. 용어 "로딩"은 반응 나노채널(20)의 입구(들)에 접근하는, 마이크로채널 또는 저장소에 존재하는 분석물질 분자가 전부 선형의, 후속-가닥 구성으로 반응 나노채널에 성공적으로 도입되는 것을 의미한다.
용어 "반응" 및 그의 파생어는 DNA가 제한 엔도뉴클레아제 효소 및 임의적 보조인자를 사용하여 단편화되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 반응 나노채널 내에서의 DNA의 제한효소 소화는 단편 무질서화를 방지한다 (예를 들어, DNA는 순서화된 단편을 생성하는 반응 나노채널에서 반응함). 예를 들어, Mg2 +은 본 발명의 실시양태에 특히 적합할 수 있는 II형 클래스의 제한 엔도뉴클레아제를 위한 보조인자이다. 보조인자가 하전되었다는 사실은 제2 횡방향 채널(32)의 전압 개폐를 용이하게 할 수 있다. 이용가능한 제한 엔도뉴클레아제의 대부분은 II형이다. 다른 유형 (I형, III형, IV형)이 또한 적합할 수 있고 유사한 방식으로 조절가능한 상이한 보조인자 (ATP, S-아데노실-L-메티오닌)를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 Mg2+ 보조인자를 갖는 II형으로 제한되지는 않지만, 이것이 바람직하다.
용어 "사이징"은 단편이 검출 나노채널로 견인되어, 전기적 또는 광학 신호 지속시간 또는 진폭의 검출에 의해 단편의 크기를 결정하기 위해 이웃으로부터의 분리를 초래하는 것을 의미한다.
용어 "염색체 DNA"는 DNA 또는 그의 단편의 전체 염색체 조성을 의미한다.
본 발명의 실시양태는 나노유체 장치에서의 DNA의 게놈 맵핑에 관한 것이다.
도 1a-1c는 예시적 나노유체 분석 장치(10)를 도해한다. 이 실시양태에서, 장치(10)는 일정 패턴의 마이크로채널(15) 및 나노채널(20, 30, 32 및 40)을 갖는 칩일 수 있다. 도 1b는 일정 패턴의 채널을 갖는 기재(12)에 부착 (전형적으로는 결합)될 수 있는 덮개(11)를 도해한다. 도 1c는 저장소(50) 또는 "R"이 장치(10)에 부착될 수 있음을 도해한다. 도시된 바와 같이, 장치(10)는 (긴) 반응 나노채널(20)의 입구 말단에 연결된 마이크로유체 채널(15)을 포함한다. 검출 나노채널(40)은 반응 채널(20)과 인라인(inline)일 필요는 없으며, 반응 나노채널로부터 멀어지는 각도를 갖거나 또는 그로부터 연장될 수 있다. 반응 채널(20)의 다른 말단은 크기, 예를 들어 나노채널의 너비/깊이 및/또는 직경의 감소에 의해 한정되는 계면(I)에서 검출 나노채널(40)로 병합된다. 제1 횡방향 채널(30)은 반응 나노채널의 입구 말단에 근접한 곳에서, 전형적으로는 나노연통(17) (사용되는 경우)의 약 10-500 ㎛ 하류 이내 및/또는 반응 나노채널의 입구 부분(15e)에서 반응 나노채널(20)로부터 연장된다.
제2 횡방향 채널(32)은 제1 횡방향 채널(30)의 하류에서 계면(I)보다 먼저 반응 나노채널(20)로부터 연장된다.
일부 실시양태에서, 다수의 나노유체 구성요소의 모노리식 통합으로 나노유체 장치(10)를 사용하여 전체 세포로부터 추출된 DNA의 게놈 수준 맵을 신속히 작성할 수 있게 된다.
일반적으로 말해서, 전체 세포의 현탁물이 장치(10) 상의 마이크로유체 입력장치 (저장소(50) 중 하나 이상)에 도입될 수 있다. 세포가 용해되고 DNA가 탈염색질화되며, 또한 일부 실시양태에서는 형광 염색된다. 일부 실시양태에서, 형광 염색제는 DNA 추출 요소의 하류에 위치하는 마이크로유체 또는 나노유체 요소 및/또는 반응 나노채널을 사용하여, 제한효소 소화 전에 온전한 DNA에 도입되거나 또는 제한효소 소화 후에 순서화된 단편에 도입될 수 있다. 그 후에, 염색체 DNA는 분자를 연장시키고 후속 단계에서 발생하는 단편의 확산성 혼합을 방지하는, 긴 반응 나노채널(20)에 도입된다. 그 후에, 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자의 용액이 반응 나노채널(20)에 도입되어, 서열 특이적 제한효소 인식부위에서 DNA의 소화를 초래한다. 이어서, 이들 단편의 길이를, 반응 나노채널(20)에 함유된 순서화된 단편을 반응 나노채널(20)이 검출 나노채널(40)과 접속되는 교차점 (I)으로 수송하여 분석한다. 강제 구동 수송 (예를 들어, 정전기, 압력, 또는 구심력)은 반응 나노채널(20)에서보다 검출 나노채널(40)에서 더욱 강력하므로, 각각의 단편이 교차점에 도달할 때의 수송 속도 및 각각의 단편의 그의 이웃으로부터의 분리의 증가가 초래된다. 시공간적으로 소화된 단편을 검출 나노채널(40)의 하류에서 이미지화 또는 단일점 또는 다중점 검출 (전기적 또는 광학)을 사용하여 검출하고, 생성 신호를 분석하여 단편 크기를 결정한다. 이러한 방식으로, 염색체 DNA의 순서화된 제한효소 맵이 실시간으로 또는 근실시간으로 작성될 수 있다. 용어 "근실시간"은 작동 시스템 또는 다른 분석-관련 컴퓨테이션의 대역폭 또는 지연 시간으로 인해 실시간의 약 1분 이내에 있는 시간을 의미한다.
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 장치의 작동은 다양한 유체 유입구에서 인가된 전압을 사용하여 주로 정전기적으로 조절되지만, 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이 다른 구동력 (예를 들어, 압력 또는 구심력)이 또한 사용될 수 있다.
장치 제작
유체 장치는 실리콘, 유리 (실리카), 석영, 플라스틱, 열가소성 물질, 및 엘라스토머 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 기재에 제작될 수 있다. 도 1a-1c는 예시적인 장치 제작의 작업흐름을 도시한다. DNA 추출을 촉진하고 장치의 나노유체 요소와의 계면을 제공하는, 보다 굵은/보다 넓은/보다 진한 선으로 도시된 마이크로유체 구성요소(25)는 확립된 방법, 예컨대 포토리소그래피 및 습식 또는 건식 에칭, 몰딩, 엠보싱(embossing), 또는 기계가공을 사용하여 패턴화될 수 있다. 나노유체 요소(20, 30, 32, 40)는 포토리소그래피, 전자빔 리소그래피, 또는 나노임프린트 리소그래피 후에 이어지는 에칭; 집속 이온빔 밀링; 전자빔 밀링; 몰딩; 또는 엠보싱을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 제작될 수 있다. 유체 요소가 기재(12)의 상단 표면에서 제작되었으면, 덮개 플레이트(11)가, 예를 들어 퓨전 결합, 애노드 결합, 또는 바닥 기재와 덮개 플레이트 사이에 접착 필름을 이용하는 결합을 사용하여 기재에 부착, 전형적으로는 결합되어 봉입된 유체 네트워크를 형성할 수 있다. 마이크로채널은 바닥 기재 및/또는 상단 덮개 플레이트를 관통하는 구멍(vias)을 통해 접근가능하다. 저장소(50)는 구멍(50v) 위로 장치에 부착되어 액체 관리를 용이하게 할 수 있다. 전극(50e)은 모든 또는 선택된 저장소(50)에 삽입될 수 있다. 저장소(50)는 구멍(50v)을 갖는다. 전극(50e)은 다양한 유체 요소 전체에 걸쳐 전압을 인가한다. 공기 또는 진공 라인이 저장소 또는 구멍에 커플링되어 양압 또는 진공을 유체 요소에 인가하고 압력-구동 유체 흐름을 추진할 수 있다.
DNA 추출
세포의 유체 장치에의 도입 전에 또는 도입 동안에, 또는 나노미터 또는 마이크로미터-규모로 제작된 구조의 네트워크에서의 세포의 포착 전에 또는 포착 동안에 겔화 매체에서의 세포의 캡슐화는 거의 또는 전혀 단편화 없이 세포로부터 염색체 DNA의 추출을 가능하게 한다. 예를 들어, 세포의 조작을 위해 저융점 아가로스 겔을 사용하는 것이 도 2a-2d에 도시되어 있다. 저융점 아가로스 중의 세포가 마이크로유체 저장소에 도입된 후에 (도 2a), 채널 배출구로부터 취출하는 시린지 펌프를 사용하여, 아가로스가 여전히 용융된 상태인 동안에 유입 마이크로유체 채널로 견인된다 (도 2b). 아가로스는 겔화되어, 후속 처리 동안에 DNA를 캡슐화하고 보호한다. 세포 벽 (미생물 및 식물 세포의 경우)을 소화시키는 용액이 도입되고, 이어서 천연 뉴클레아제 활성을 저해하는 프로테이나제 K와 같은 작용제가 혼입된 디터전트 용액을 사용하여 세포를 화학적으로 용해시킨다 (도 2c). 겔을 완충제로 철저히 세정한 후에, 인터칼레이션 염료 용액을 첨가한다. 칩 상에서의 이러한 작업의 포함은 유량의 정밀한 조절을 가능하게 하고 DNA 절삭에 기여할 수 있는 난류를 제거한다. 겔은 장치의 가열에 의해 용융되고 (효소 아가라제의 첨가에 의해 추가로 파쇄될 수 있음) 탈염색질화된 DNA가 전기영동에 의해 매트릭스로부터 추출된다 (도 2d). 비하전 아가로스는 전기삼투 흐름에 의해 장치의 나노유체 영역으로부터 배제된다. 제한 엔도뉴클레아제는 별도의 유입 마이크로채널 (도시되지 않음)을 통해 나노유체 채널과 만나기 전에 DNA에 첨가될 수 있다.
본원에 지시된 아가로스 캡슐화의 대안적은 마이크로제작된 고밀도 기둥 어레이(16)를 사용하여 장치에 도입된 세포를 압력-구동 흐름을 사용하여 구속시키고, 세포를 용해시킨 후에, 기둥 어레이에서의 뒤엉킴에 의해 DNA를 포착하는 것을 포함한다 (도 3a-3c). 도 3a는 전체 세포의 포착을 도시한다. 도 3b는 시약의 저유량 및/또는 확산성 혼합을 사용하는 세포의 용해 및 탈염색질화된 DNA의 염색을 도시한다. 도 3c는 인가된 전압을 사용하는 기둥 어레이(16)로부터의 DNA 추출을 도해한다. 기둥(16)은 원형일 수 있거나 또는 전형적으로는 날카로운 에지가 없는 다른 기하구조를 가질 수 있다. 기둥(16)은 유체 마이크로채널(15)의 깊이와 동일한 높이를 가질 수 있다. 기둥은 DNA의 비코일 길이가 그 사이를 이동하는 그 사이의 작은 공간을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기둥(16)은 기둥의 너비보다 크거나 작은, 전형적으로 약 2-50 ㎛, 예컨대 약 10 ㎛의 기둥 사이의 간격을 갖는, 약 1-10 ㎛, 전형적으로는 약 5 ㎛의 너비를 가질 수 있다.
마이크로유체 채널(15c)의 일정 패턴의 다수의 유체 입력장치(15a) 및 저장소(50)는 또한 보다 다량의 물질을 필요로 하는 분석을 위한 샘플의 도입 및 DNA 추출을 위해 사용될 수 있다 (도 4a).
도 4b는 장치(10)가 가공 속도를 증가시키기 위해 단일 마이크로채널(15)로부터의 DNA가 공급되는 복수 개의 반응 나노채널을 포함할 수 있음을 도해한다. 각각의 검출 나노채널(401, 402)로 병합되고 각각의 횡방향 채널(301, 302, 321, 322)과 연통되는 2개의 반응 나노채널(201, 202)로서 도시되었지만, 2개 초과의 수송 나노채널 및 결합된 요소, 예를 들어 2-100개가 단일 칩 상에 사용될 수 있다.
긴 게놈 DNA 분자의 반응 나노채널에의 도입
DNA 구속에 대한 엔트로피-기반 에너지 장벽을 극복하기 위해, 상당한 힘이 거대 DNA 분자에 부여되어 이들 분자를 나노채널에 도입할 수 있다. 절삭 없이 반응 나노채널(20)로의 DNA 가닥화 도입을 촉진하는 방법은 분자에 대한 응력을 감소시키기 위해 가닥화가 개시된 후 전기장 강도를 급속히 감소시키는 구배 구조 및/또는 수단의 혼입을 포함한다. 하나의 예를 들면, 집속 이온빔 (FIB) 밀링을 사용하여 점진적으로 감소하는 너비 및 깊이 (나노연통)를 갖는 구조가 제작되어, 이음매 없이 접속되는 나노채널에 DNA를 도입하기 위한 도관으로서 작용할 수 있다. 나노연통에 관한 추가 개시내용은 미국 가출원 61/597,364 및 PCT/US2013/025078에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 또 다른 예를 들면, 미국 특허 가출원 61/770,586에 개시되어 있는 바와 같이 교차하는 나노유체 요소가 DNA 수송의 보다 강력한 조절을 달성하는데 사용될 수 있고, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 도 5는 DNA의 선형화를 조장하는 기둥(16)의 저밀도 어레이와 함께, 단일 장치에 상기 기술이 둘다 포함된 것을 도시한다. 이러한 기둥(16)은 복수 개의 축방향으로 이격된 기둥 어레이 세그먼트 또는 그룹(161-164)으로 제공될 수 있지만, 동일하거나 상이한 기둥 어레이 크기 및/또는 구성의 보다 많거나 적은 세그먼트가 사용되어 이동 경로를 부분적으로 폐색시키고 DNA가 인접한 기둥 사이로 이동하도록 인도하는데 사용될 수 있다. 기둥 세그먼트 사이의 축방향 거리 또는 간격은 20-200 ㎛, 전형적으로는 약 100 ㎛일 수 있다. 도 5에 도시된 나노채널(20)의 고전기장 구역(FH)의 길이가 분자에 대한 힘을 결정하고 이는 DNA에 대한 과도한 응력을 방지하기 위해 상대적으로 짧다. 마찬가지로, 마지막 기둥 열과 나노채널 입구 사이의 거리는 DNA를 팽팽하게 당기지 않으면서 DNA의 초기 가닥화가 발생할 수 있을 정도로 충분히 크다. 전장 DNA 분자의 로딩은 저속으로 발생하므로, 분자의 끝부분이 임의의 기둥 뒤엉킴으로부터 확산성으로 풀리는 충분한 시간을 갖는다. 그러나, 전기장 강도는 탈-가닥화에 유리한 확산 및 엔트로피 리코일에 대응하기 위해 충분히 높아야 한다. 도 5에 도시된 마이크로유체/나노유체 계면은 DNA의 반응 나노채널에의 조절된 도입을 위해 가공될 수 있는 수많은 구조의 하나의 예일 뿐이다.
제한 단편화 및 단편 사이징
도 6a-6e는 상기에 기재된 게놈 DNA의 가닥화 및 로딩으로 시작하는 (도 6a-6b), 순서화된 제한효소 맵핑을 초래하는 장치(10)의 나노유체 채널(20, 30, 32, 40)에서 수행되는 예시적 분석 단계를 도시한다. 연장된 DNA 분자의 단편으로의 제한효소 소화가 후속된다 (도 6c). DNA 분자를 소화시키는 제한 엔도뉴클레아제 효소는 도 6c에서 제2 횡방향 채널(32)에 접속되는 바닥 마이크로채널에 함유되고 (단지 예로서 "Mg2 +"으로 표시됨), 또한 도 6c의 좌측에 도시된 반응 나노채널의 입구를 통해 DNA와 함께 도입될 수 있다. 보조인자 (예를 들어, Mg2 + 이온)를 필요로 하는 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 단편화가 반응 나노채널에 완전히 구속된 평형화 DNA 분자에서만 발생하도록 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이는 제한효소 소화에 영향을 미치는 적절한 시점에서의 보조인자의 조절된 도입에 의해, 가장 용이하게는 도 6a-6e 및 7a-7e에 도시된 4개의 채널 유입구(V0, V1, V2, V3)에서의 적절한 전압의 인가에 의해 달성된다. 각각의 작동 모드 동안에 각각의 채널에서의 전기장의 극성 및 세기는 도 6a-6e에서 화살표로 나타낸다. 이러한 예에서, 보조인자는 양으로 하전된 이온이므로, 전기영동에 의해 반응 나노채널(20)로부터 배제되거나 그에 도입될 수 있다. 도 6d는 기둥(16) 어레이 및 나노연통(17)의 보조하에서의 검출 나노채널(40)에의 DNA 단편의 주입을 도시한다. 이러한 예에서, 검출 나노채널(40)의 유효 직경은 반응 나노채널(20)보다 작다. 반응 나노채널(20)은 검출 나노채널(40)과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 10 내지 1000배 더 길고 2 내지 100배 더 클 수 있다. 예를 들어, 반응 나노채널(20)은 약 300 nm의 너비 및 깊이를 가질 수 있고, 반면에 검출 나노채널은 그 보다 작은 너비 및 깊이, 예를 들어 약 100 nm의 너비 및 깊이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 나노채널(40)은 반응 나노채널(20)의 크기보다 50% 내지 99% 감소한 직경을 가짐으로써, 각각의 단편이 교차점에 도달하는 수송 속도 및 각각의 이웃하는 단편의 분리를 증가시킨다.
이러한 채널 수축의 결과로, 검출 나노채널(40)에서의 전기장은 반응 나노채널(20)에서의 전기장보다 크고, DNA 제한 단편은 교차점에 도달하였을 때 신속히 검출 나노채널로 견인된다. 다음 단편이 교차점으로 이동하고 검출 나노채널(40)로 견인되기 전까지 단편 사이에(inter-fragment) 시간이 존재한다. 단편이 검출 나노채널(40)을 통해 이동할 때, 이들 단편이 하류에서 검출되고 신호 지속시간 또는 통합 강도가 분석되어 단편 크기가 결정된다. 도 6a-6d에서, 이는, 예를 들어 단일 대물 렌즈를 통과하는 2개의 레이저(103) (레이저 1 및 레이저 2)를 사용하거나 또는 추가 대물 렌즈 (레이저 3)를 사용하는 애벌란시(avalanche) 포토다이오드(102) (도 6d) 또는 다중점 검출 (도 6e)을 사용하여 레이저 집광점을 통과하는 염색된 DNA 단편의 형광을 검출하는 회로(100)에 의해 달성된다. 검출은 또한 형광 이미지화 회로(100')를 사용하여 달성될 수 있다.
도 7a-7e에서, 전기적 단일점 (도 7d) 및 다중점 (도 7e) 검출이 도해된다 (예를 들어, 검출 나노채널과 통합된 대향하는 한 쌍의 전극 및 전도도의 단편-유래 변화를 검출하는 전류계(101)를 사용함).
도 6f는 본 발명의 대안적의 실시양태에 따라 장치(10)가 DNA 분자 및 단편의 가닥화, 로딩 및/또는 수송을 초래하는, 저장소(50)를 통한 압력/진공의 압력 구동 수송 시스템 (50p)을 사용하여 작동되도록 구성될 수 있음을 도해한다. 장치는 압력원에 연결된 도관 또는 튜브를 포함할 수 있고 동전기 또는 전압 시스템에 대하여 언급된 라인을 따라 자동화된 작동을 허용할 수 있다. 도 7a에 도시된 장치의 작동은 다른 실시양태를 도해하는 도면에서 도시된 바와 같이, 이 또한 압력 또는 다른 수송 시스템으로 작동될 수 있다. 따라서, 장치(10)는 도 6g에 도시된 바와 같이 상이한 수송 구동 시스템 "D" 또는 상이한 수송 구동 시스템의 조합으로, 예컨대 게놈 DNA 및 그의 단편의 반응 나노채널을 경유하여 검출 나노채널로의 수송을 초래하도록 인가될 수 있는 동전기, 압력, 또는 구심력 중 하나 이상에 의해 작동될 수 있다.
도 6a-6e 및 7a-7e에 도시된 반응 나노채널과 검출 나노채널 사이의 계면은 또한 단편 수송 구동력의 돌연한 변화가 단편의 공간적 및/또는 시간적 소화를 초래하는 구조 부류의 하나의 예로서 간주되어야 한다.
도 6a-6d 및 7a-7d에 도시된 반응 나노채널(20)은 "U자형" 세그먼트에 의해 연결된 다수의 평행한 구간을 갖는 사형 형상을 갖는 것으로 도해된다. 그러나, 전형적으로 약 500 ㎛ 내지 2 cm의 보다 짧은 채널일 경우의 직선형 길이를 포함하여, 다른 나노채널 형상이 사용될 수도 있다. 사형 형상은 모노리식 칩 상의 보다 긴 채널의 경우에 특히 적합할 수 있다.
도 6c-6d에 도해된 제한효소 소화, 검출 나노채널에의 주입을 통한 단편 소화, 및 단편 사이징 요소가 모형 장치 (도 8) 상에서 예증되었다. 이러한 모형 장치는 집속 이온빔 밀링을 사용하여 제작되었고 바이러스성 또는 박테리아성 염색체 DNA의 분석에 적합한 상대적으로 짧은 반응 나노채널을 갖는다.
단일 입력 및 단일 출력을 갖는 나노채널과 비교한 통합 나노유체 네트워크의 장점은 다양한 위치에서 전압을 사용하여 유체의 흐름을 조절하는 능력이다. 제한 엔도뉴클레아제에 의한 DNA의 소화에서, 반응 나노채널에 도입되어야 하는 DNA의 소화를 방지하면서, 구속된 DNA의 소화를 보장하도록 보조인자 (예를 들어, Mg2+ 이온)의 농도 및 위치를 조절하는 것이 중요할 수 있다. 이러한 능력을 입증하기 위해, 전기영동 완충제 중의 Mg2 + 감수성 염료 (마그네슘 그린)가 모형 장치의 나노유체 반응 및 검출 채널에 도입되었다. 마그네슘 클로라이드 (10 mM)를 갖는 완충제가 도 9에 도시된 바와 같이, 바닥 채널에 첨가되었다. "마그네슘 게이트"는 Mg2+ 저장소에 낮은 음의 전압 또는 양의 전압을 인가함으로써 각각 폐쇄 상태와 개방 상태 사이에서 스위칭되고, 그 동안에 반응 나노채널은 접지 상태가 유지된다. 형광 이미지는 마그네슘 게이트가 폐쇄되었을 때 2-s 노출을 사용하여 수집된 후에, 게이트가 개방되었을 때의 이미지가 수집된다. 마그네슘 그린의 강도는 Mg2 + 이온이 반응 나노채널을 따라 하류로 이동할 때 증가하였다. 도 9b는 실험 동안의 형광의 증가를 도시한다. 이 패널은 기록된 일련의 초기 프레임 (마그네슘 게이트가 폐쇄되었을 때 수집된 것)을 게이트가 개방되었을 때의 최종 프레임으로부터 추출함으로써 작성되었다. 형광의 증가가 염료의 농도 분극 (나노유체 실험에서 관찰되는 현상) 때문이 아님을 확인하기 위해, 바닥 채널의 완충제에 Mg2 + 이온이 존재하지 않는 대조 실험을 수행하였다. 도 9c는 전압이 "개방" 상태로 스위칭되었을 때 약간만 변화한 형광 강도가 관찰되었음을 보여준다. 맵핑 실험에서 공급원 DNA 저장소로서 작용하는 마이크로채널에의 도입을 방지하면서, 제1 횡방향 채널(30)을 통해 반응 채널의 다른 말단에서 Mg2 +의 흐름을 상단 "가닥 저장소"로 인도하는 것도 가능하다.
모형 장치의 반응 나노채널에서의 제한 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 분자의 소화가 또한 예증되었다. 람다 파지 DNA (λ-DNA)는 제한 엔도뉴클레아제 HindIII을 사용하는 소화에 적합한 완충제 중의 인터칼레이션 염료 YOYO-1 (5:1의 염기 쌍:염료 분자)로 염색된다. 완충제는 또한 DNA-함유 마이크로채널을 오염시킬 수 있는 임의의 Mg2 +을 격리시키는 EDTA (2 mM) 및 라디칼 스캐빈저로서의 메르캅토에탄올 (4 부피%)을 함유한다. 그 후에, HindIII이 DNA 용액에 첨가되고, 이 용액은 반응 나노채널 입구에 접근하는 DNA 저장소에 로딩된다. EDTA 없이, 10 mM 마그네슘 클로라이드, 4% 메르캅토에탄올, 및 HindIII을 갖는 반응 완충제를 함유하는 제2 용액이 Mg2 + 저장소에 첨가된다. 나머지 저장소 (도 8에서 "가닥" 및 "배출구"로 표시됨)는 4% 메르캅토에탄올을 함유하는 완충제 (즉, Mg2 +, EDTA, 또는 HindIII 무함유)가 충전된다. 백금 전극이 저장소에 침지되어, 도 8에 도시된 4개의 유입구에서의 전압의 독립적인 조절을 가능하게 한다. DNA 분자는 Mg2 + 전압 게이트가 폐쇄된 동안에, 고 전기장 강도를 사용하여 반응 나노채널에 도입된다. λ-DNA 분자가 현미경의 시야 안에 들어갈 때, 전압은 낮은 값으로 스위칭되어 DNA 이동이 느려지고 Mg2 + 이온이 DNA 분자를 지나가도록 Mg2 + 전압 게이트가 개방된다. 수초 후에, 전압은 반응 나노채널에서의 전기장 강도가 대략 0이도록 조정된다. 이미지는 200 ms마다 수집된다. 10-15초의 초기 이미지화 기간 후에, 형광 여기원의 셔터(shutter)가 폐쇄되어 광-유래 단편화가 발생하지 않도록 보장한다. 약 1분의 반응 후에, 소화 정도를 측정하기 위해 셔터는 개방된다. 도 10은 Mg2 +에의 1.5분의 노출 후에 λ-DNA의 소화를 나타내는 대표적인 일련의 프레임을 보여준다. 이러한 경우에, 3개의 단편이 관찰되었고, 이는 HindIII에 의한 DNA 분자의 부분 소화를 시사한다.
검출 나노채널에의 순서화된 주입을 통한 DNA 단편의 그의 이웃으로부터의 공간적 및 시간적 소화가 또한 모형 장치에서 예증되었다. 형광 염색된 T4-파지 DNA 분자가 400 nm x 400 nm에서 200 nm x 200 nm로 감소한 치수 (너비 x 깊이)를 갖는 나노채널로 주입된다. 두 세그먼트의 등가 길이를 고려하면, 이는 보다 작은 나노채널에서의 전기장의 4배 증가에 상응한다. 도 11은 보다 긴 반응 나노채널에서의 단일 파지 분자의 다수의 단편의 확산을 보여준다. (이러한 상대적으로 작은 DNA 분자의 경우에는, 단편이 도면에 표시된 관찰 기간 동안에 소화될 수 있다. 그러나, 보다 넓은 시야에 걸쳐서 다수의 거대 제한 단편을 소화시키기 위해서는 연장된 관찰 기간이 필요할 것이고 증가한 불확실성을 갖게 된다.) 이러한 관찰 기간 후에, 검출 채널에의 단편의 주입이 이어진다. 이러한 동적 공정은 효과적으로 각각의 단편을 그의 이웃으로부터 완전히 소화시킨다.
게놈 수준의 제한효소 맵핑
도 12는 저비용의, 일회용 장치(들)(10)를 순차적으로 또는 동시에 테스트할 수 있는 컴퓨터 제어(90)와 함께 실험실용 기구(150)를 사용하여 다양한 장치 작동이 수행될 수 있는 방식의 예를 제공하는 시스템(200)을 도시한다. 전형적으로, 전체 세포 샘플이 장치(10)에 도입된 후에, 이것이 기구(150)에 삽입된다. 그러나, 장치(10)는 기구(150) 안에 위치한 후에 세포가 로딩될 수도 있다. 시간 프로그램이 개시될 수 있고, 여기서 시약이 장치(10)에서 세포를 흘러 지나가면서 DNA 추출 및 염색을 달성한다. 미리 한정된 전압 프로그램(90p)이 개시되어 염색체 DNA의 제1 조각을 가닥화한다. 가닥화된 DNA의 존재 (광학적으로 또는 전기적으로 검출됨)는 DNA 분자를 반응 나노채널(20)에 충분히 로딩하기 위해 전압 프로그램의 변화를 트리거링한다. 이것이 달성되었으면 (광학 또는 전기적 검출을 사용하여 결정됨), 전압 프로그램(90p)이 엔도뉴클레아제 소화 반응을 개시하도록 다시 변화한다. 이 단계 동안에, 장치(10)는 반응 속도론을 향상시키기 위해 기구(150)에서 가열될 수 있다. 규정된 반응 시간 후에, 전압은 단편의 검출 나노채널(40)에의 순서화된 주입을 추진하기 위해 사용되는 값으로 자동 변화한다. 측정된 신호는 회로(100, 100')를 통해 수집되는 대로 분석될 수 있고 (도 6d, 6e, 7d, 7e), 이는 실시간으로 또는 근실시간으로 제한효소 인식부위의 맵을 작성한다. 단편의 검출이 중단되면, 회로(100, 100')는 전체 DNA 분자가 샘플링되었고 "판독"이 완료되었음을 컴퓨터(90)에 나타낼 수 있다. 전압은 염색체 DNA의 다음 조각을 판독하기 위해 전압 프로그램(90p)을 통해 그의 "가닥화" 값으로 변화한다.
도 13a-13b는 DNA 분자의 가닥화를 검출하는데 사용가능한 예시적 요소 및 회로(105, 105')를 도해하고, 도 13c는 100, 100', 105 및/또는 105'와 같은 하나 이상의 조절 회로로부터의 입력값에 의해 지시되는 전압 프로그램(90p)에 의해 트리거링되는 시간/전압 조절 프로그램을 도시한다. 전압 프로그램에서의 트리거 변화는 세로 화살표로 나타낸다. 지연 (예를 들어, 제한효소 소화 반응을 완료하는 충분한 시간을 제공하기 위한 것)은 가로 화살표로 나타낸다. 장치에 초기에 도입된 다수의 세포로부터 기원하는 염색체 DNA의 다수의 카피를 판독하기 위해 과정을 수차례 반복할 수 있다. 대안적으로, 장치는 도 13d에 도시된 바와 같이, 정전압, 압력, 또는 다른 구동력 또는 이들의 조합을 사용하여 작동될 수 있다. 도 13d의 상단 그래프는 검출된 신호를 도해하고, 반면에 하단 그래프는 상단 그래프의 검출 시간에 상응하는 시간에 걸쳐서 4개의 일정한 입력값을 도해한다. 각각의 구동력 입력값과 관련하여 사용된 용어 "일정한"은 한정된 시간에 걸쳐서 평균 값이 +/- 10% 이내에서 일정하다는 것을 의미한다 (예를 들어, 전압 및/또는 압력이 분석 기간 동안에 값의 +/- 10% 이내에 포함됨). 달리 말하면, 구동력 입력값은 중지되는 흐름과 대조적으로 연속 흐름을 가질 정도로 충분히 일정하지만, 연속적인 동안에 유량은 시간에 따라 달라질 수 있다. 일련의 제한 단편은 검출가능한 신호의 부재 또는 감소에 의해 지시되는 분자 분리에 의한 클러스터링으로 단일 DNA 분자로부터 기원하는 것으로 확인된다. 클러스터 사이의 지연은 염색체 DNA 분자 사이의 샘플링 지연으로부터 초래되고, 각각의 클러스터가 각각의 분자에 대하여 특이한 리드(read)로서 특징화된다는 것을 나타낸다. 도 13d는 분자 1을 제1 클러스터로, 이어서 분자 2를 제2 클러스터로 확인하는 연속 흐름 검출을 도해하고, 이들 2개의 인접한 클러스터는, 예를 들어 검출 신호 시간이 부재할 때 (또는 매우 짧을 때) 분리된다. 각각의 리드가 완성되면, 그 리드는 컴퓨터에 의해 특이한 것으로 결정되거나 (즉, 실험 전개 동안에 염색체가 최초로 맵핑되었음) 또는 기존의 맵 데이터 또는 "리드"(160)에 정렬되어 리드 범위를 증가시킬 수 있다 (즉, 염색체의 다른 카피가 실험 전개에서 이미 판독되었음). 이러한 기술에 의해 생성되는 긴 리드 길이는 이 과정이 맵핑 실험 동안에 완료되도록 한다. 그에 따라, 연속적으로 업데이트된 품질 등급이 초래될 수 있고, 분석은 맵 범위 및 품질의 사용자-한정 기준이 달성된 후에 종료될 수 있다. 대안적으로, 추가 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 제한효소 맵핑이 개시되어 다양한 제한효소 인식부위의 대용량 정보 맵을 작성할 수 있다.
도 12는 전력원(150p), 유체 연결부, 및 저장소(50)를 위한 다양한 화학물질 (예를 들어, 용해 시약, 세정 완충제, 탈염색질화 시약, DNA 염색액 (필요에 따라))을 포함할 수 있는 조절된 환경 하우징(150)을 갖는 자동 분석 시스템(200)을 도해한다. 시스템은 유체 연결부를 통해 유체를 주입 및 취출함으로써, 또한 채널(20, 30, 32 및 40)과 연통되는 전극에 전기 바이어스, 예를 들어 전압 (예를 들어, 도 6a-6d 및 도 7a-7d에서의 V0, V1, V2, V3)을 전기적으로 인가함으로써 조절 작동될 수 있다. 마이크로유체 채널(15), 유체 교차 채널(30, 32) 및 검출 나노채널(40)은 유동성 물질, 예컨대 유체 (전해질)를 보유하도록 구성된 저장소(50)와 병합될 수 있다. 저장소 유체는 전해질 용액, 예를 들어 고 이온 강도 전해질 용액을 포함할 수 있다. 적합한 용액의 예는 약 35 mM 내지 약 1 M의 농도를 갖는 포타슘 클로라이드 용액을 포함하나, 이것으로 제한되지는 않는다.
도 12를 참조하면, 시스템(200)은 V0, V1, V2, V3을 조절가능하게 인가하기 위해 전극(50e) (도 1c)에 대한 전압 입력값 (251-254)을 포함할 수 있다. 시스템(200)은 검출 회로(100, 100') (도 6d, 6e, 7d, 7e) 및 가닥 검출 회로(105, 105') (도 13a, 13b)와 연통되고 이들을 포함하는 회로(90c)와 함께, 바람직한 전압 시간 프로그램 또는 알고리즘(90p)을 갖는 하나 이상의 프로세서(90p)의 지시하에 전기 바이어스를 인가할 수 있는 전력원(150p) (예를 들어, 전압원 및/또는 전류원)을 포함할 수 있다. 시스템(200)은 분석 중인 분자를 가닥화, 로딩, 반응 및 수송하고 검출하기 위해 적절한 시간에 전압 V0, V1, V2, V3을 인가하고 조절할 수 있거나 또는 도 13d와 관련하여 상기에 언급된 바와 같이 전압이 일정하게 유지되는 모드로 작동될 수 있다. 대안적으로, 일부 기능은 시간 프로그램 또는 알고리즘(90p)에 따라 유체 연결부를 통해 용액을 장치(10)에 주입하거나 취출함으로써 압력 구동 흐름을 사용하여 달성될 수 있다.
도 7a-7d는 전압 변화를 전기적 트리거링하고 전류계 (101)를 사용하여 횡방향 전도도를 측정하는 회로(100')를 사용하는 검출 시스템을 도해하고, 도 6a-6d는 애벌란시 포토다이오드(102) 및 레이저(103)를 사용하고 전압 변화를 전기적 트리거링하는 검출 시스템(100)을 도해한다.
도 12는 시스템(200)이 검출 나노채널(40)에서의 DNA 단편에 대한 분석 데이터를 얻을 수 있는, 회로 및/또는 하나 이상의 프로세서(90p)를 갖는 컴퓨터(90)를 포함할 수 있음을 도시한다. 용어 "컴퓨터"는 작동을 조절하기 위해 회로(100, 100') 및/또는 장치(150)의 조절 및 그와의 통신을 허용하는, 하나 이상의 디지털 신호 프로세서를 전형적으로 포함하는 임의의 전자 장치를 포함하도록 광범위하게 사용된다. 컴퓨터는 장치(150)의 위치로부터 근거리 또는 원거리에 있을 수 있다.
시스템은 검출 채널(40)에서 분석물질 분자의 일련의 이미지를 촬영할 수 있는, 검출기(102) 및 여기원(103) (도 6d)을 갖는 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 이미지화 시스템은 임의의 적합한 이미지화 시스템일 수 있다. 도시된 바와 같이, 시스템(100)은 여기 광원(103) (전형적으로 형광 표지된 분자를 여기시키는 광을 발생시키기 위한 것) (거울, 빔 스플리터, 편광자, 렌즈, 및/또는 다른 광학 요소를 임의로 포함할 수 있음) 및 이미지 생성 장치 또는 검출기(102), 예컨대 카메라, 광전자증배관 또는 포토다이오드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 대물/렌즈는 사용될 경우에, 장치(10)의 주요 표면 아래에 또는 그 위에 위치할 수 있다. 전기적 입력장치/출력장치 및 흐름 작동기는 장치(10)의 반대편 쪽에 위치할 수 있다. 장치(10)는 또한 실질적인 수평 방향보다는 그의 측면으로 (편평한 주요 표면이 직립되어 있거나 일정 각도를 이룰 경우) 작동되도록 회전(flipped)될 수 있다.
도 14는 본 발명의 실시양태에 따라 전체 세포로부터 추출된 게놈 DNA의 DNA 순서화 제한효소 맵을 제공하는데 사용가능한 예시적 작업을 도해한다. 나노채널 직경의 크기가 감소하는 계면에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널을 갖는 장치가 제공된다 (블록 300). 임의로, 크기는 반응 나노채널 크기보다 50% 내지 99% 감소할 수 있다 (블록 302). 전체 세포는 마이크로채널에서 용해되고 탈염색질화되어 최소한으로 단편화된 DNA를 생성할 수 있다 (블록 310). 그 후에, DNA의 온전한 분자가 반응 나노채널에 도입될 수 있다 (블록 315). 이어서, 온전한 DNA는 반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 효소를 사용하여 단편화될 수 있다. 반응 나노채널은 단편이 검출 나노채널에 주입될 때까지 원래의 순서를 유지하도록 하는 크기 및 구성을 갖는다 (블록 320). 검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 신호를 검출하여 긴 DNA 분자를 따라 발생하는 순서대로 단편의 맵을 작성할 수 있다 (블록 325).
장치는 장치와 연통되는 수송 시스템과 함께 사용될 수 있으므로, 수송 시스템은 게놈 DNA 및 그의 단편을 반응 나노채널을 경유하여 검출 나노채널로 수송시키는 동전기, 압력 또는 구심력 중 하나 이상을 인가하도록 구성된다 (블록 321).
이러한 기술은 전장 염색체로부터의 DNA의 나노채널에의 조절된 도입, 제한 효소에 의한 그의 소화, 및 제한 단편의 순서화된 맵핑을 가능하게 한다. 단편을 이웃하는 단편으로부터 소화시키기 위한 주입-기반 분리는 확산으로 인한 분해능의 손실을 최소화할 수 있고, 나노제작 방법의 현재의 한계값에 근접하거나 그를 초과하는 임계 치수 (너비 및 깊이)를 갖는 나노채널에 대한 의존성을 감소시키거나 제거할 수 있다.
유리하게도, 요구되는 최소 나노채널 너비는 전형적으로 약 100 nm이다. 따라서, 장치는 다양한 기재에서 다양한 일상적인 방법을 사용하여 제작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mijatovic, D.; Eijkel, J. C. T.; van den Berg, A. Technologies for nanofluidic systems: top-down vs. bottom-up - a review. Lab Chip 2005, 5, 492-500]; [Perry, J. L.; Kandlikar, S. G. Review of fabrication of nanochannels for single phase liquid flow. Microfluid . Nanofluid . 2006, 2, 185-193]; [Chantiwas, R. et al. Flexible fabrication and applications of polymer nanochannels and nanoslits. Chem . Soc . Rev. 2011, 40, 3677-3702]; 및 [Utko, P.; and Persson, F.; Kristensen, A.; Larson, N. B. Injection molded nanofluidic chips: Fabrication method and functional tests using single-molecule DNA experiments. Lab Chip 2011, 11, 303-308]을 참조한다. 이들의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 웨이퍼-규모의 가공을 사용하는 능력이 혁신적인 저비용 기술을 제공할 수 있다.
염색체 DNA는 칩 상에서 세포로부터 추출될 수 있고 제한효소 소화 및 단편 사이징을 위해 나노채널로 분자간 뒤엉킴 없이 도입될 수 있다. 이는 최소한의 DNA 절삭을 보장하여, 다수의 작은 중첩 콘티그(contig) (DNA의 연속적인 공통 영역)로부터 시각적 맵을 조립할 필요성이 감소한다. 온칩 관리의 결과로서 절삭이 발생하면, 정보를 얻은 염색체 DNA 분자는 50만개 초과의 염기쌍 길이, 또한 보다 전형적으로는 5,000만개 초과의 염기쌍 길이를 가질 수 있다. 이는 처리량을 증가시키고, 계산적 비용을 감소시키며, 또한 낮은 입력 물질 요건으로 광범위 맵을 가능하게 할 것으로 예상된다.
단편 크기는 신호의 지속시간 또는 통합 진폭을 사용하는 이미지화 또는 단일점 검출에 의해 측정될 수 있다. DNA 속도는 이러한 측정에 있어서 길이 의존성일 수 있고, 이는 이론상으로 예상되고 이러한 크기의 채널에서 실험적으로 확인되었다. 데이터 분석은 실시간으로 또는 근실시간으로 진행될 수 있어, 바람직한 범위 및 맵 품질이 달성될 때까지 단일 전개로 데이터가 수집될 수 있도록 보장한다. 넓은 시야의 이미지 저장 및 분석의 제거가 계산적 비용을 감소시킬 수 있다.
추가 기능성의 통합이 가능하다. 예를 들어, 선택된 단편은 추가 분석을 위해 검출 후에 선별될 수 있다. DNA는 제한효소 소화 및 제2 분석법, 예컨대 표지된 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 또는 펩티드와의 반응 둘다에 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lim, S. F.; Karpusenko, A.; Sakon, J. J.; Hook, J. A.; Lamar, T. A.; Riehn, R. DNA methylation profiling in nanochannels. Biomicrofluidics 2011, 5, 034106]을 참조하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 2색 검출이 서열 컨텍스트의 단일 분자 후생적 분석을 제공할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 실시양태는 관심 단편을 확인하고 이들 단편을 추가 분석을 위해 하류 채널로 선별하기 위해 구성될 수 있다. 이러한 구성은 게놈의 특정 영역에서의 후생적 개질의 표적 분석에 있어서 또는 탐색 및 진단 잠재력이 증가한, DNA의 선택 단편의 서열분석에 있어서 관심을 받을 수 있다. 도 15-21은 온보드(onboard) 또는 원격 저장소 (R)를 갖는 분석 구성 및 관련 방법의 예를 도해한다. 이러한 도면은 장치를 통한 다양한 성분의 동전기 구동의 영향을 받는 분자 수송을 도시하지만, 예를 들어 도 6f 및 6g에 도시된 바와 같이, 압력, 유전영동력, 구심력 등 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 구동 시스템 (D)을 예를 들어 포함하는, 다른 수송력이 단독으로 또는 조합되어 이미 서술된 바와 같이 사용될 수 있다.
도 15는 하나가 다른 하나의 하류에 위치하는 2개의 상이한 반응 나노채널(201, 202)을 사용하여 연속으로 2차례의 제한효소 소화를 수행할 수 있도록 구성된 장치(10)의 예이다. 1차 제한효소 소화로부터의 순서화된 단편 (전형적으로 모든 순서화된 단편)은 임의로 제2 제한 효소에 의한 소화를 위해 제2 반응 나노채널(202)에 도입될 수 있다. 제1 및 제2 검출 채널(각각 401 및 402)로부터의 데이터의 조합이 게놈 구조에 대하여 증가한 또는 추가의 정보를 제공한다.
대안적으로, 도 16에 도시된 바와 같이, 제2 반응 나노채널(202)은 표지된 프로브를 제1 검출 나노채널(401)에서 나오는 순서화된 단편에 결합시키도록 구성될 수 있다. 그 예로는 DNA의 메틸화된 영역 또는 손상된 영역에 결합할 수 있는 표지된 단백질이 있지만, 다른 실시양태도 가능하므로, DNA 샘플에 대한 추가 정보가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 장치, 시스템 및/또는 방법은 단편이 된맵핑 후에, 단편을 선택적으로 샘플링할 수 있다. 분석이 실시간으로 (또는 근실시간으로) 수행될 수 있으므로, 관찰되거나 검출되는 한정된 트리거링 사건, 예를 들어 한정된 패턴을 갖는 단편의 검출은 2개 이상의 한정된 작동 모드 (하나는 짧은 분석 시간을 사용하는 "정상" 모드를 위한 것이고, 또 다른 하나는 제2 반응 나노채널을 사용하여 추가 분석되는 특별한 관심 단편을 위한 것임)를 가질 수 있는 수송 시스템의 작동 파라미터, 예를 들어 전압, 압력 등의 1차 작동 모드로부터의 변화를 자동적으로 트리거링할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 디폴트에 의해, 초기 제한효소 소화로부터의 단편은 "폐기물" (W)로 간주되어 배출 저장소로 수송될 수 있다 (즉, DNA에 대한 추가 분석이 수행되지 않을 것임). 그러나, 시스템 및 방법은, 트리거링될 때, 게놈에서 관심 영역을 나타내는 일련의 단편이 제2 반응 나노채널(202) 로 재인도될 수 있고, 저장소(R) (V4로도 표시됨)가 2차 반응을 위한 물질을 제공할 수 있도록 구성될 수 있다.
도 17은 예시적 트리거링 과정을 도해한다. 2가지의 예시적인 선택적 트리거링 시스템/구성이 도 18 및 19에 도시되어 있다.
도 17에 도시된 바와 같이, 순서화된 단편은 실시간으로 (또는 근실시간으로) 분석될 수 있다 (블록 350). 관심 영역이 맵핑되는 시점을 확인하기 위해 패턴 인식이 사용될 수 있다 (블록 355). 과정은 결정 마디를 가질 수 있다 (블록 360). 추가 분석이 바람직하다면, 한정된 트리거링 사건 또는 검출에 기초하여, 단편(들)이 후속 반응 나노채널 (202)에 유체로 전송/수송될 수 있다 (블록 370). 추가 분석이 바람직하지 않다면, 단편(들)은 폐기물 저장소(W)로 수송될 수 있다 (블록 365).
도 18은 대부분의 제한 단편이 폐기물 저장소(W) ("V6"으로도 표시됨)로 수송되고, 반면에 선택된 단편은 전압 (또는 다른 구동력)의 적절한 트리거링에 의해 제2 반응 나노채널(202)에서의 제2 제한효소 소화에 도입되는 장치(10)의 예를 도시한다. 폐기물 저장소(W)는 도시된 바와 같이 제2 나노채널(202) 직전의 상류에 또는 다른 위치에 위치할 수 있다.
도 19는 대부분의 제한 단편이 전형적으로 폐기물 저장소(W) ("V6"으로도 표시됨)로 수송되고, 반면에 선택된 단편은 전압 (또는 다른 구동력)의 적절한 조정에 의해 제2 반응 나노채널(202)에 도입되고, 여기서 이들 단편이 표지된 프로브, 예컨대 DNA의 메틸화된 영역 또는 손상된 영역에 결합할 수 있는 저장소(R) (V4로도 표시됨)로부터의 단백질과 결합하는 장치(10)의 예이다.
장치(10) (예를 들어, 칩)에서 온보드 수행되는 2차 반응에 대하여 추가적으로 또는 선택적으로, 게놈의 선택된 영역으로부터의 단편은 후속 수집 및 오프칩(off chip) 분석 (예를 들어, 서열분석)을 위해 색인 저장소로 선택적으로 수송될 수 있다. 다수의 표적 단편은 각각이 그들의 배출 채널로, 선별될 수 있다. 표적 염색체의 다수의 카피의 맵핑 및 선별이 분석하기 위한 충분한 물질의 수집을 허용할 것이다. 일부 실시양태에서, 충분한 물질이 수집된 후에, 고유의 바코드(barcode)를 갖는 어댑터(adaptor)가 각각의 배출 저장소에 첨가되고 그에 함유된 단편의 말단에 부착될 수 있다. 그 후에, 단편은 풀링되고 (또한 잠재적으로 증폭됨), 라이브러리 구축을 위해 제공되며, 서열분석된다. 도 20은 예시적 단편 분석, 확인, 및 트리거링 과정을 도시하고, 도 21은 다수의 수집 저장소 "C" (V7, V8, V9...Vn으로 표시됨)를 나타내는 상기 과정이 수행 및/또는 실행될 수 있는 예시적 장치(10)를 도시한다. 순서화된 단편의 크기는 실시간으로 (또는 근실시간으로) 분석될 수 있다 (블록 375). 한정된 트리거링 사건 또는 검토되는 단편의 확인, 예를 들어 패턴 인식으로 관심 영역이 맵핑되는 시점을 확인할 수 있다 (블록 377). 과정 결정 마디 (블록 380)는 제한 단편의 서열분석이 바람직한지, 또한 단편을 폐기물 저장소(W)로 수송하거나 (블록 382) 또는 선택된 단편(들)을 풀링 저장소, 전형적으로는 후속 분석을 위한 색인 풀링 저장소로 수송하기 위해 (블록 385) 관련된 수송 작용을 수행할지를 자동적으로 평가할 수 있다.
도 21은 제한 단편은 디폴트에 의해 "폐기물" 저장소 ("V3"으로 표시됨)로 수송되지만, 확인된 관심 단편은 배출 채널(41)로 인도되어 각각의 수집 저장소(C) (V7, V8, V9,...,Vn)에서 수집되는 장치(10)의 예를 도해한다.
본 발명의 실시양태는 주로 구조적 변이체의 유전형질 분석 및 드노보(de novo) 서열 조립 분야에서 혁신의 잠재력을 갖는다. 현재, 증가한 질환 감수성을 평가하는데 이용가능한 유전자 검사는, 전형적으로 단일유전자성 코딩 에러인, 희귀한, 큰 영향력의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 일반적으로 확인한다. 그러나, SNP가 병원성의 유일한 변이체인 것은 아니며, 구조적 변이체 (새로운 삽입, 결실, 중복, 역위, 및 전좌)를 포함시킴으로써 유전자 평가가 유익해질 것이다. 구조적 변이체 (SV)의 질환 표현형에의 기여는 SNP와 비교하여 이해도가 부족하다. 공지된 예는 SV와 정신분열증, 자폐증, 및 크론병 사이의 연관성을 포함한다. 따라서, SV를 확인할 수 있는 고효율의 저비용 방법은 SNP-기반의 연관성 연구를 위한 중요한 보완물이 된다. 현재 통용되는 SV의 확인 방법 (예를 들어, 차세대 서열분석 데이터를 분석하기 위한 혼성화-기반의 어레이 방법 및 계산적 방법)은 검출된 변이체의 크기 및 클래스에 있어서 편차를 나타내어, 포괄적인 탐색을 방해한다. 각 방법 고유의 편차 이외에도, 약 300 내지 약 10,000개의 염기쌍을 갖는 SV의 검출에서 큰 차이가 있다. 염색체 DNA의 고분해능 제한효소 맵은 개체의 게놈에 존재하는 모든 클래스의 SV를 확인하는 간단한 방법을 제공한다.
시각적 맵은 SV의 검출에 있어서의 그의 유용성 이외에도, 또한 차세대 서열분석 콘티그의 조립을 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lam et al, Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat. Biotech. 2012, 30, 771-776]; [Zhou et al., Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 2003, 13, 2142-2151]; 및 [Zhou et al, A whole-genome shotgun optical map of Yersinia pestis strain KIM. Appl . Environ. Microbiol . 2002, 68, 6321-6331]을 참조한다. 이들의 내용은 그 전문이 본원에 인용되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
제한효소 인식부위 맵핑의 처리량을 증가시키고 비용을 감소시키는 전략은 비교 유전체학 연구에 있어서 중대한 가치가 있을 수 있다. 또한, 제한효소 맵핑이 거대 고반복 영역을 포괄할 수 있게 됨으로써 이질염색질 DNA 및 식물 게놈과 같은 어려운 조립을 보조하는데 있어서 유용할 것이다.
본 발명의 실시양태는 거대 DNA 분자를 따라 단편이 발생하는 순서대로 단편의 맵을 정확하게 작성할 수 있다. 이는 채널 직경이 검출 나노채널에서 유의하게 감소하는 나노채널 구조에 의해 가능해진다 (도 11). 도 11에서, 이는 이미지의 좌측에 있는 일련의 프레임에 의해 확인된다. 일련의 프레임 중 상단에 있는 일부 프레임에서는 분명하게 4개의 단편이 존재하지만, 다른 프레임에서는 명백하지 않다. 따라서, 단편 크기의 추정값을 얻을 수는 있지만, 정확하지 않다. 이것을 일련의 프레임의 하단 2/3의 프레임과 비교하면, 단편 사이의 유의한 분리 및 단편 크기의 결정에 있어서 증가한 정확성을 나타낸다.
본 발명의 실시양태는 또한 DNA 분자에서 단편이 발생하는 것과 동일한 순서대로 일련의 단편을 검출 구조에 도입하기 위해 구성된다. 이를 달성하기 위해, DNA의 온전한 스트레치가 반응 나노채널(20)에 도입된 후에, 그 반응 나노채널 내에서 제한 엔도뉴클레아제 효소를 사용하여 DNA가 단편화될 수 있다. 이러한 효소는 특이적 서열을 갖는 부위에서만 DNA를 단편화하여 (예를 들어, HindIII 효소는 염기 서열 AAGCTT를 인식하고 두 A 사이의 DNA를 절단함), DNA 분자를 따라 이들 부위의 맵을 작성한다. 반응 나노채널은 단편이 혼합되지 않도록 충분히 작은 직경을 가지고 - 이들 단편은 검출 나노채널(40)에 주입될 때까지 원래의 순서를 유지한다.
상기는, 예를 들어 약 50만개의 염기쌍 길이를 갖는 DNA 분자를 도입하는데 있어서 특히 적합할 수 있다. 2억 5천만개의 염기쌍 길이를 갖는 온전한 DNA (즉, 인간의 전체 염색체 가치에 해당하는 DNA)가 반응 나노채널(20)에 도입될 수 있다면, 이는 분석 시간, 필요한 샘플, 및 맵핑 에러를 현저히 감소시킬 것이라고 생각된다. 그러나, 본 발명의 실시양태는 혁신적 진단 및 연구 도구와 같은 다른 용도에도 유익할 수 있다.
FIB 밀링이 완전성 때문에 기재되었고 나노채널의 형성에 특히 적합한 것으로 생각되지만, 다른 실시양태는 상기에 기재된 바와 같이, 예를 들어 전자빔 리소그래피, 나노임프린트 리소그래피, 포토리소그래피, 템플레이팅 또는 몰딩 방법, 및 통상의 기술자에게 이해되는 다른 방법을 포함하는 다른 형성 기술에 관한 것이다.
상기는 본 발명을 예시하는 것이며, 이를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 본 발명의 일부 예시적 실시양태가 기재되었지만, 통상의 기술자라면 본 발명의 신규한 교시내용 및 장점으로부터 실질적으로 벗어나지 않으면서 예시적 실시양태의 다양한 수정이 가능함을 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 이러한 수정은 모두 청구범위에서 정의된 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 한다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되고, 청구범위의 등가물이 그에 포함되어야 한다.

Claims (44)

  1. 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm이고 검출 나노채널의 크기가 반응 나노채널보다 감소하는 그 사이의 계면 위치에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널;
    반응 나노채널의 입구 부분과 연통되는 마이크로유체 채널;
    마이크로유체 채널과 연통되는 제1 전극;
    반응 나노채널로부터 이격되어 있지만 그의 입구 부분에 근접한 위치에서 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제1 횡방향 유체 채널;
    제1 횡방향 유체 채널과 연통되는 제2 전극;
    제1 횡방향 유체 채널의 하류에서 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제2 횡방향 유체 채널;
    제2 횡방향 유체 채널과 연통되는 제3 전극;
    검출 나노채널과 연통되는 제4 전극;
    반응 나노채널 내에서 DNA가 조절가능하게 가닥화, 로딩 및 소화됨으로써 그에 의해 단편 무질서화를 방지하도록 제1, 제2, 제3 및 제4 전극의 작동을 조절하도록 구성된 회로; 및
    단편 크기를 시공간적으로 소화시킴으로써 그에 의해 실시간으로 또는 근실시간으로 염색체 DNA의 순서화된 제한효소 맵을 가능하게 하도록 구성된 검출 나노채널과 연통되는 하나 이상의 전기적 또는 광학 검출기
    를 포함하는 나노유체 분석 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 마이크로유체 채널이, 마이크로유체 유로를 부분적으로 폐색시키도록 구성된, 이격되어 있는 기둥의 어레이를 포함하는 것인 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 마이크로유체 채널을 유체 수송 나노채널의 입구 부분과 연결하는 나노연통을 추가로 포함하는 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노유체 반응 채널이 "U자형" 세그먼트에 의해 연결된 복수 개의 밀접 배치된, 실질적으로 평행한 세그먼트를 갖는 사형(serpentine) 형상을 갖는 것인 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 채널, 반응 나노채널, 검출 나노채널, 및 제1 및 제2 유체 횡방향 채널이 유체 칩 상에 모노리식(monolithic) 통합되는 것인 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 횡방향 유체 채널이 약 1 nm 내지 약 100 nm의 깊이 및 약 20 nm 내지 약 2000 nm의 너비를 갖는 유체 나노채널이고, 반응 나노채널이 검출 나노채널과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 10 내지 1000배 더 길고 2 내지 10배 더 큰 것인 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 횡방향 유체 채널이 마이크로채널 또는 나노유체 채널이거나 또는 이들 두 채널의 세그먼트를 포함하고, 반응 나노채널이 검출 나노채널과 비교하여 10 내지 1000배 더 긴 것인 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 반응 나노채널의 입구 말단에서 유체 마이크로채널과 유체 연통되고, 제2 반응 나노채널의 반대편의 출구 말단에서 각각의 제2 검출 나노채널로 병합되는 제2 반응 나노채널을 포함하는 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개로 밀봉된 기재 상에 반응 나노채널, 검출 나노채널, 및 제1 및 제2 횡방향 유체 채널을 다수 가지며, 구멍(vias)을 통해 각각의 유체 채널을 채우는 외부에서 접근가능한 복수 개의 저장소를 갖도록 구성된 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 채널이 하나 이상의 저장소와 유체 연통되고, 이들 저장소 중 적어도 하나는 분석용 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원을 포함하는 것인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 분석용 전체 세포가 게놈 DNA의 추출을 위해 겔 매트릭스에 의해 저지되는 것인 시스템.
  12. 제10항에 있어서, 분석용 전체 세포가 게놈 DNA의 추출을 위해 하나 이상의 고밀도 및/또는 저밀도 기둥 어레이에 의해 저지되는 것인 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 입구 채널이 DNA를 갖는 전체 세포를 포함하고, 제2 횡방향 유체 채널이 반응 나노채널로부터 떨어져 있는 말단부에서 제2 유체 저장소로 병합되고, 제2 유체 저장소가 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자의 용액을 포함하는 것인 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 나노채널이 직선형이고, 약 500 ㎛ 내지 약 2 cm의 길이를 가지며, 반응 나노채널이 검출 나노채널과 비교하여 깊이 및/또는 너비에 있어서 10 내지 1000배 더 길고 2 내지 10배 더 큰 것인 시스템.
  15. 기둥 어레이를 갖는 마이크로유체 채널과 함께 전체 세포, 핵, 전체 염색체, 또는 긴 DNA 분자의 다른 공급원으로부터 게놈 DNA를 추출하도록 적합화된 마이크로유체 유입구;
    길이가 500 ㎛ 내지 10 cm이고, 마이크로유체 유입구와 연결된 입구 부분을 갖는 제1 반응 나노채널;
    나노채널 크기의 감소에 의해 한정된 교차점에서 제1 반응 나노채널의 출구 말단과 병합되는 제1 검출 나노채널;
    제1 반응 나노채널로부터 이격되었지만 그의 입구 부분에 근접해 있는 제1 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제1 횡방향 나노채널; 및
    제1 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 제1 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제2 횡방향 유체 나노채널
    을 포함하는 분석 칩.
  16. 제15항에 있어서, 반응 나노채널과 마이크로유체 유입구의 사이에 위치하고 이들을 연결하는 나노연통을 추가로 포함하는 칩.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 마이크로유체 유입구와 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 제1 횡방향 나노채널과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 제2 횡방향 나노채널과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소, 및 검출 나노채널의 말단과 유체 연통되는 적어도 하나의 저장소를 포함하여, 칩에 의해 보유되는 복수 개의 저장소를 추가로 포함하는 칩.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 채널에서 기둥 어레이가 축방향으로 이격된 어레이의 다수의 세그먼트를 포함하는 것인 칩.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 기둥 어레이가 마이크로유체 채널의 실질적으로 전체 너비에 걸쳐서 연장되도록 구성된 것인 칩.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 칩과 연통되는 수송 시스템과 조합되고, 여기서 수송 시스템은 게놈 DNA 분자 및 그의 단편을 반응 나노채널을 경유하여 검출 나노채널로 수송시키는 동전기, 압력 또는 구심력 중 하나 이상을 인가하도록 구성된 것인 칩.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    길이가 500 ㎛ 내지 10 cm이고, 마이크로유체 유입구와 연결된 입구 부분을 갖는 제2 반응 나노채널;
    나노채널 크기의 감소에 의해 한정된 교차점에서 제2 반응 나노채널의 출구 말단과 병합되는 제2 검출 나노채널;
    제2 반응 나노채널로부터 이격되었지만 그의 입구 부분에 근접해 있는 제2 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제3 횡방향 나노채널; 및
    제3 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 제2 반응 나노채널로부터 연장되고 그와 유체 연통되는 제4 횡방향 유체 나노채널
    을 추가로 포함하는 칩.
  22. 나노채널 직경의 크기가 50% 내지 99% 감소하는 계면에서 검출 나노채널로 병합되는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널을 갖는 장치를 제공하고;
    마이크로채널에서 전체 세포를 용해시키고 최소한으로 단편화하면서 DNA를 탈염색질화(dechromatinizing)하고; 그 후에
    DNA의 온전한 분자를 반응 나노채널에 도입하고; 그 후에
    반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 효소를 사용하여 온전한 DNA를 단편화하고, 여기서 반응 나노채널은 단편이 검출 나노채널에 주입될 때까지 원래의 순서를 유지하도록 하는 크기 및 구성을 갖는 것이고,
    검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 신호를 검출하여 긴 DNA 분자를 따라 발생하는 순서대로 단편의 맵을 작성하는 것
    을 포함하는, 전체 세포로부터 추출된 게놈 DNA의 순서화된 제한효소 맵을 작성하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 전체 세포를 고정시키기 위한 겔 매트릭스 및/또는 고밀도 기둥 어레이를 제공하고, 그 후에 세포를 용해시키고, DNA를 추출한 다음, 임의로 DNA를 염색한 후에, DNA의 온전한 분자를 반응 나노채널에 도입하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 장치는 반응 나노채널로 병합되는 유체 마이크로채널과 유체 연통되는 하나 이상의 저장소를 포함하고, 도입 단계는 분석용 전체 세포를 저장소를 사용하여 도입함으로써 수행되는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 마이크로유체 및 횡방향 채널에 전압을 인가하여 반응 나노채널의 입구 영역에 바이어스를 생성함으로써 샘플을 가닥화 및 로딩하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 장치는 반응 나노채널의 입구 말단 및 마이크로유체 채널의 하류에서 반응 채널과 유체 연통되는 제1 횡방향 채널과 유체 연통되는, 기둥 어레이를 갖는 마이크로유체 채널을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 가닥화 단계가, DNA 분자가 초기에는 DNA 인장 강도를 초과하는 변형율에 적용되지 않고 기계적으로 절단되지 않도록 하는 조절된 전압 또는 농도 분극 구배를 사용하여 반응 채널의 입구에 근접한 곳에서 수행되는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 로딩이 가닥화 단계 후에, 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜, DNA 분자의 끝부분이 기둥 뒤엉킴 및 기계적 절단을 피하면서 확산성으로 풀리는 충분한 시간을 갖도록, 전장 DNA 분자를 약 1 ㎛/s 내지 약 1 mm/s의 속도로 반응 나노채널로 견인함으로써 수행되는 것인 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제한효소 소화 반응이 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜 반응 나노채널에 함유된 DNA에 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 보조인자 분자를 도입한 후에, 모든 제한효소 인식부위가 소화될 때까지 반응을 진행시킴으로써 수행되는 것인 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압이 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 보조인자의 마이크로유체 채널에의 도입을 방지함으로써, 반응 나노채널 밖에서의 DNA 분자의 소화를 방지하는 것인 방법.
  29. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 순서화된 제한 단편의 검출이 반응 나노채널 및 횡방향 나노채널에 인가된 전압을 변화시켜 반응 나노채널과 검출 나노채널 사이의 계면으로 단편의 이동을 추진함으로써 수행되고, 여기서 검출 나노채널 직경의 크기는 반응 나노채널과 비교하여 50% 내지 99% 감소함으로써, 각각의 단편이 교차점에 도달하는 수송 속도 및 각각의 이웃하는 단편의 분리를 증가시키고, 그 후에 검출 단계가 분리된 단편의 검출 나노채널을 통한 수송을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 가닥화, 로딩, 제한효소 소화, 및 순서화된 제한 단편의 사이징 작업이 한정된 입력값으로 연속적으로 인가되는 정전압에 의해 복수 개의 분자를 순차적으로 분석함으로써 수행되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 검출 단계가 검출 나노채널을 따라 하나 이상의 위치에서 단편을 광학적으로 또는 전기적으로 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 검출 신호 지속시간 또는 통합 진폭을 분석함으로써 단편 크기를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 장치가 유체 분석 칩인 방법.
  34. 샘플 도입, 세포 용해 및 DNA 추출, 및 임의로 염색을 조절하고;
    추출된 DNA를 DNA 가닥화하고 반응 나노채널에 로딩하고, 반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자로 제한효소 소화시키고, 제한 단편을 검출 나노채널을 통해 순서대로 수송시키는 것을 전자적으로 조절하고;
    제한 단편을 검출 나노채널을 통한 수송 동안에 전자적으로 검출하고;
    DNA 분자로부터의 제한 단편 크기를 실시간 또는 근실시간 분석법을 사용하여 전자적으로 분석하고;
    전자적으로 다수의 DNA 분자로부터 공통 제한효소 맵을 작성하고 맵의 품질을 평가하여 추가 샘플링이 필요한지를 평가하는 것
    을 포함하는, 유체 분석 칩과의 접속 방법.
  35. 샘플 도입, 세포 용해 및 DNA 추출, 및 임의로 염색을 조절하는 수단;
    추출된 DNA를 DNA 가닥화하고 반응 나노채널에 로딩하고, 반응 나노채널에서 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자로 제한효소 소화시키고, 제한 단편을 검출 나노채널을 통해 순서대로 수송시키는 수단;
    검출 나노채널을 통한 수송 동안에 제한 단편을 검출하는 수단;
    실시간 또는 근실시간 분석법을 사용하여 DNA 분자로부터의 제한 단편 크기를 분석하는 수단; 및
    다수의 DNA 분자로부터 공통 제한효소 맵을 작성하고, 맵 품질을 평가하여 추가 샘플링이 필요한지를 평가하는 수단
    을 포함하는, 유체 분석 칩과의 접속 시스템.
  36. 하나 이상의 반응 나노채널로 병합되는 유로를 갖는 마이크로유체 채널;
    하나 이상의 반응 나노채널의 상류에서 마이크로유체 채널과 유체 연통되는 하나 이상의 DNA 저장소;
    하나 이상의 DNA 저장소 유입구와 하나 이상의 반응 나노채널 사이에 위치하는 마이크로유체 채널과 유체 연통되는 가닥 저장소;
    각각 상응하는 반응 나노채널보다 작은 직경 및/또는 작은 너비 및 깊이를 갖는, 하나 이상의 반응 나노채널 각각의 출구 말단에 연결된 하나 이상의 검출 나노채널; 및
    검출 나노채널에 근접한 곳에 위치하는, 하나 이상의 반응 나노채널과 유체 연통되는 제한 엔도뉴클레아제 및 보조인자를 포함하는 하나 이상의 저장소
    를 포함하는 유체 분석 장치.
  37. 제36항에 있어서, 각각의 검출 나노채널로 병합되는 복수 개의 이격된 반응 나노채널을 포함하는 장치.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 장치와 연통되는 수송 시스템과 조합되고, 여기서 수송 시스템은 게놈 DNA 및 그의 단편을 반응 나노채널을 경유하여 검출 나노채널로 수송시키는 동전기, 압력 또는 구심력 중 하나 이상을 인가하도록 구성된 것인 장치.
  39. 제1항에 있어서, 제1 반응 나노채널의 하류에 위치하고 제2 검출 나노채널의 크기가 제2 반응 나노채널보다 감소하는 그 사이의 제2 계면 위치에서 제2 검출 나노채널로 병합되는, 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm인 제2 반응 나노채널을 포함하는 장치.
  40. 제39항에 있어서, 제1 반응 나노채널과 유체 연통되는 폐기물 저장소를 추가로 포함하고, 제한 단편을 폐기물 저장소 또는 제2 반응 나노채널에 들어가도록 선택적으로 수송하도록 구성된 회로와 연통되는 장치.
  41. 제15항에 있어서, 제1 반응 나노채널의 하류에서 제2 횡방향 유체 나노채널 다음에 위치하고 제1 반응 나노채널과 유체 연통되는, 길이가 500 ㎛ 내지 10 cm인 제2 반응 나노채널을 추가로 포함하고, 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 유체로 폐기물 배출로에 들어가거나 또는 유체로 제2 반응 나노채널에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통되는 칩.
  42. 제15항에 있어서, 제2 횡방향 유체 나노채널의 하류에서 연장되는 결합된 배출 채널을 갖는 복수 개의 수집 저장소 및 폐기물 배출로를 추가로 포함하고, 제1 반응 나노채널로부터의 제한 단편이 폐기물 배출로 또는 수집 저장소 중 어느 하나에 들어가도록 선택적으로 인도하는 회로와 연통되는 칩.
  43. 제22항에 있어서, 관심 영역이 맵핑되는 시점을 실시간으로 또는 근실시간으로 전자적으로 또는 광학적으로 확인하고, 선택적 및 자동적으로 제한 단편을 유체로 이들 단편이 2차 반응, 예컨대 제한효소 소화 또는 프로브 결합에 적용되는 제2 나노반응 채널 및 후속 검출을 위한 제2 검출 나노채널로 수송하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제22항에 있어서, 관심 영역이 맵핑되는 시점을 실시간으로 또는 근실시간으로 전자적으로 또는 광학적으로 확인하고, 자동적 및 선택적으로 관심 제한 단편을 유체로 후속 분석을 위한 각각의 수집 저장소로의 각각의 배출 채널로 수송하고 다른 제한 단편을 유체로 폐기물 배출 채널로 수송하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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