JP2016512427A - 全ゲノムの高速マッピング用ナノ流体デバイス、並びに関連する分析システム及び分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年3月13日に出願された米国仮特許出願第61/778,746号の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、上記米国仮特許出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられる助成金番号第HG002647号の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
流体デバイスは、シリコン、ガラス(シリカ)、石英、プラスチック、熱可塑性物質及びエラストマ、又はこれらの組み合わせを含む様々な基板内で製作できる。図1A〜図1Cは、例示的なデバイス製作作業フローを示す。DNAの抽出を容易にし、デバイスのナノ流体要素に界面を提供する、より大きい/より幅広い/より太い線で示されるマイクロ流体構成要素25は、フォトリソグラフィ及びウェットエッチング若しくはドライエッチング、成形、エンボス加工、又は機械加工等の確立された方法を使用してパターン化できる。ナノ流体要素20、30、32、40は、エッチング、集束イオンビーム加工、電子ビーム加工、成形又はエンボス加工が後に続くフォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ又はナノインプリントリソグラフィを含む様々な方法を使用して製作できる。流体要素が基板12の上面に製作したら、カバープレート11を基板に取り付ける、典型的には接着することにより、例えば融着、陽極接合、又は下部基板とカバープレートとの間の接着膜との接合を使用して、封入された流体ネットワークを形成できる。マイクロチャネルは、底部の基板及び/又は上部のカバープレートを通過するビアを通ってアクセスできる。リザーバビア50vを覆うようにリザーバ50をデバイスに固着することにより、液体処理を促進できる。電極50eは、全ての又は選択されたリザーバ50の中に挿入できる。リザーバ50はビア50vを有する。電極50eは、様々な流体要素に電圧を印加する。送気管又は真空ラインはリザーバ又はビアに結合して、正の圧力又は真空を流体要素に印加し、圧力駆動の流体の流れを駆動できる。
細胞の流体デバイスへの導入の又はナノメートル若しくはマイクロメートルのスケールで製作された構造のネットワークの中での細胞の取り込みの前又は間の、ゲル化媒体中での細胞のカプセル化により、断片化が殆ど又は全く行われていない細胞からの染色体DNAの抽出が可能となる。例として、細胞の操作の為の低融点アガロースゲルの使用を図2A〜図2Dに示す。低融点アガロース中の細胞をマイクロ流体リザーバに導入し(図2A)、続いて、アガロースがまだ溶解状態である間に、チャネル出口から引き出すシリンジポンプを使用して入口マイクロ流体チャネルの中に引き入れる(図2B)。アガロースはゲル化し、後続のの処理の間にDNAをカプセル化し、保護できる。溶液を導入することにより、(微生物及び植物細胞の為の)細胞壁を消化し、次いでプロテイナーゼK等の作用物質を組み込んだ洗浄液を使用して細胞を化学的に溶解して、天然ヌクレアーゼ活性を阻止する(図2C)。ゲルをバッファで完全に濯ぎ、その後にはインタカレート染料の溶液が続く。これらのタスクをチップ上に組み込むことにより、流量の正確な制御を可能にし、そうでなければDNA剪断の一因となる可能性がある乱流を排除する。ゲルは、デバイスを加熱することによって溶解され(酵素アガラーゼを添加することによってゲルを更に破壊してよい)、染色質除去されたDNAがマトリックスから電気泳動的に抽出される(図2D)。帯電していないアガロースは、電気浸透流によってデバイスのナノ流体領域から排除される。制限エンドヌクレアーゼは、DNAが別個の入口マイクロチャネル(不図示)を通ってナノ流体チャネルに遭遇する前にDNAに添加できる。
DNA閉じ込めに対するエントロピーベースのエネルギ障壁を克服する為に、かなりの力を大きなDNA分子に印加して上記分子をナノチャネルの中に導入できる。剪断を用いずに反応ナノチャネル20の中へのDNAスレッディングを促進する為の戦略は、勾配構造及び/又は分子に対する応力を削減する為にスレッディングが開始された後に迅速に電界強度を削減する手段の組込みを含む。一例として、集束イオンビーム(FIB)切削を使用して、継ぎ目なく接続されるナノチャネルへのDNA導入用の導管として役立つ為の、幅及び深さが徐々に減少する構造(ナノファンネル)を製作できる。ナノファンネルの追加の説明は、米国仮特許出願第61/597,364号及びPCT/US2013/025078号に記載されており、上記米国仮特許出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。別の例では、米国仮特許出願第61/770,586号(この出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される)において説明されるように、ナノ流体要素に交差することがDNA輸送のより大きな制御を得る為に使用できる。図5は、DNA線形化を促すポスト16の低密度アレイと共に、単一のデバイスでのこれらの技術の両方の組込みを示す。同じ又は異なるポストアレイサイズ及び/又は構成のより多くの又はより少ないセグメントを使用して移動経路を部分的に塞ぎ、DNAを隣接するポスト間で強制的に移動させることができるが、これらのポスト16は、複数の軸に沿って離間されたアレイセグメント又はポストのグループ161〜164として設けることができる。ポストセグメント間の軸に沿った距離又は間隔は、20〜200μpm、通常は約100μmであってよい。図5に示すナノチャネル20の高電界セクションFHの長さが分子にかかる力を決定し、上記長さは、DNAにかかる不当な応力を防止する為に比較的短い。同様に、ポストの最後の列とナノチャネル出入口との間の距離は、DNAを強く引っ張ることなくDNAの初期スレッディングを実施できるよう十分に大きい。完全DNA分子の装填は、分子の終端があらゆるポストの絡み合いから拡散して係合解除するのに十分な時間を有するように、低速度で行われる。但し電界強度は、スレッディング解除(de−threading)に有利な拡散及びエントロピーリコイルを無効にできるよう、十分に高くなくてはならない。図5に示すマイクロ流体/ナノ流体界面は、反応ナノチャネルへのDNAの制御された導入の為に設計できる多くの構造のうちの一例にすぎない。
図6A〜図6Eは、規則正しい制限酵素マップの生成に繋がる、デバイス10のナノ流体チャネル20、30、32、40において実施される例示的な分析ステップを示し、上述のようにゲノムDNAのスレッディング及び装填で始まる(図6A〜図6B)。この後には、拡張されたDNA分子の断片への制限酵素消化が続く(図6C)。DNA分子を消化する制限エンドヌクレアーゼ酵素は、図6Cの第2の横向きチャネル32に接続される下部マイクロチャネルに含まれ(例として単に「Mg2+」として標識する)、図6Cの左側に示す反応ナノチャネルへの出入口を通してDNAと導入することもできる。補因子(例えばMg2+イオン)を必要とする制限エンドヌクレアーゼは、DNA断片化が、反応ナノチャネル内に完全に閉じ込められている平衡化されたDNA分子のみに起こることを保証する為に使用できる。これは、最も容易には図6A〜図6E及び図7A〜図7Eに示す4つのチャネル入口V0、V1、V2、V3内の適切な電圧の印加による、制限酵素消化に影響を及ぼす為に適切な時点における、補因子の制御下での導入によって実施される。各動作モード中の各チャネルにおける電界の極性及び大きさは、図6A〜図6Eでの矢印によって示される。この例では、補因子は正に帯電したイオンであるので、補因子は電気泳動的に反応ナノチャネル20から排除できるか又は反応ナノチャネル20へ導入できる。図6Dは、ポスト16のアレイ及びナノファンネル17を用いたDNA断片の検出ナノチャネル40への注入を示す。この例では、検出ナノチャネル40の有効径は反応ナノチャネル20の有効径よりも小さい。反応ナノチャネル20は、検出ナノチャネル40よりも10倍〜1000倍長く、深さ及び/又は幅で2倍〜100倍大きくてよい。例えば、反応ナノチャネル20は、約300nmの幅及び深さを有してよい。一方、検出ナノチャネルは、例えば約100nmの幅及び深さ等、より小さい幅及び深さを有してよい。幾つかの実施形態では、検出ナノチャネル40は、反応ナノチャネル20の直径から50%〜99%だけサイズが縮小した直径を有し、その結果、各断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び隣接する各断片の分離が得られる。
図12は、1つ又は複数の低コストの単回使用デバイス10を連続的に又は並列で試験できるコンピュータ制御90によるベンチトップ装置150を使用して、多様なデバイス動作を実施する方法の例を提供する、システム200を示す。通常、細胞全体の試料がデバイス10に導入されてから、上記デバイスが装置150の中に挿入される。但し、デバイス10は、装置150に置かれた後で細胞を装填されてよい。デバイス10でDNAの抽出及び染色を達成する為に細胞を越えて試薬が流される時限プログラムが開始できる。染色体DNAの第1の部分をスレッディングする為に、所定の電圧プログラム90pが開始される。(光学的に又は電気的に検出される)スレッディングされたDNAの存在が、反応ナノチャネル20にDNA分子を完全に装填する為に電圧プログラムの変化をトリガする。(光学的な検出又は電気的な検出を使用して決定されるように)これが達成されるとき、電圧プログラム90pはエンドヌクレアーゼ消化反応を開始する為に再び変更される。このステップの間、デバイス10は装置150内で加熱されて還元反応速度を強化してよい。所定の反応時間に続き、電圧は検出ナノチャネル40の中への断片の規則正しい注入を駆動する為に使用される値に自動的に変更される。測定された信号は、それが回路100、100’を介して収集されるにつれて分析でき(図6D、図6E、図7D、図7E)、これによってリアルタイムで又は略リアルタイムで制限酵素部位のマップが生成される。断片の検出が終わると、回路100、100’はコンピュータ90に対し、DNA分子全体がサンプリングされて「読取り」が完了したことを示すことができる。電圧は、電圧プログラム90pを介してその「スレッディング」値に変更されて、染色体DNAの次の部分を読み取る。
Claims (44)
- ナノ流体分析システムであって:
長さが500μm〜10cmの反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルと前記反応ナノチャネルとの間の界面位置において前記検出ナノチャネルにマージし、前記界面位置において前記検出ナノチャネルのサイズは前記反応ナノチャネルに比して縮小する、反応ナノチャネル;
前記反応ナノチャネルの進入部分と連通するマイクロ流体チャネル;
前記マイクロ流体チャネルと連通する第1の電極;
前記反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第1の横向き流体チャネル;
前記第1の横向き流体チャネルと連通する第2の電極;
前記第1の横向き流体チャネルの下流において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第2の横向き流体チャネル;
前記第2の横向き流体チャネルと連通する第3の電極;
前記検出ナノチャネルと連通する第4の電極;
前記第1の電極、前記第2の電極、前記第3の電極及び前記第4の電極の動作を制御して、断片の不規則化を防止する前記反応ナノチャネルの内部でDNAを制御自在にスレッディングし、装填し、消化するよう構成される、回路;並びに
断片サイズを空間的に且つ時間的に分解することによって、リアルタイムで又は略リアルタイムでの染色体DNAの規則正しい制限酵素マップを実現できるよう構成される、前記検出ナノチャネルと連通する少なくとも1つの電気的な又は光学的な検出器
を含む、ナノ流体分析システム。 - 前記マイクロ流体チャネルは、前記マイクロ流体流路を部分的に塞ぐよう構成される、離間した複数のポストのアレイを備える、請求項1に記載のシステム。
- 前記システムは、前記マイクロ流体チャネルを流体輸送ナノチャネルの進入部分と接続するナノファンネルを更に備える、請求項1又は2に記載のシステム。
- 前記ナノ流体反応チャネルは、「U」字型のセグメントにより接続される、狭い間隔の略平行な複数のセグメントを有する蛇行形状を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記マイクロ流体チャネル、前記反応ナノチャネル、前記検出ナノチャネル、並びに前記第1の流体横向きチャネル及び前記第2の流体横向きチャネルは、流体チップ上にモノリシックに集積される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第1の横向き流体チャネル及び前記第2の横向き流体チャネルは、深さ約1nm〜約100nm、幅約20nm〜約2000nmの流体ナノチャネルであり、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約10倍〜約1000倍、並びに深さ及び/又は幅が約2倍〜約10倍大きい、請求項1〜5のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記第1の横向き流体チャネルは、マイクロチャネル若しくはナノ流体チャネルであるか、又はマイクロチャネル及びナノ流体チャネルの両方のセグメントを含み、
前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルの約10倍〜約1000倍の長さである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記システムは第2の反応ナノチャネルを備え、
前記第2の反応ナノチャネルは、前記第2の反応ナノチャネルの進入端部において前記流体マイクロチャネルと流体連通し、前記第2の反応ナノチャネルの対向する放出端部においてそれぞれの前記第2の検出ナノチャネルにマージする、請求項1〜7のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記システムは、カバーで密封された、ビアを通して各前記流体チャネルへの供給を行う複数の外部アクセス可能なリザーバを有する基板上の、複数の前記反応ナノチャネル、前記検出ナノチャネル並びに前記第1の横向き流体チャネル及び前記第2の横向き流体チャネルで構成される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記マイクロ流体チャネルは、1つ又は複数のリザーバと流体連通し、
前記1つ又は複数のリザーバのうちの少なくとも1つは、分析用の細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖DNA分子の他のソースを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載のシステム。 - 分析用の前記細胞全体は、ゲノムDNAの抽出用のゲルマトリックスにより抑制される、請求項10に記載のシステム。
- 分析用の前記細胞全体は、ゲノムDNAの抽出用の少なくとも1つの高密度ポストアレイ及び/又は低密度ポストアレイにより抑制される、請求項10に記載のシステム。
- 前記マイクロ流体進入チャネルは、DNAを有する細胞全体を含み、
前記第2の横向き流体チャネルは、前記反応ナノチャネルから離間した端部において前記第2の流体リザーバにマージし、
前記第2の流体リザーバは、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の溶液を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記検出ナノチャネルは真っ直ぐであり、約500μm〜約2cmの長さを有し、
前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約10倍〜約1000倍、並びに深さ及び/又は幅が約2倍〜約10倍大きい、請求項1〜13のいずれか1項に記載のシステム。 - 分析チップであって:
ポストのアレイを有するマイクロ流体チャネルを用いて、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖DNA分子の他のソースからゲノムDNAを抽出するよう適合される、マイクロ流体入口;
長さ500μm〜10cmの第1の反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、第1の反応ナノチャネル;
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第1の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、第1の検出ナノチャネル;
前記第1の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第1の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第1の反応ナノチャネルと流体連通する、第1の横向きナノチャネル;並びに
前記第1の横向き流体ナノチャネルの下流において前記第1の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第1の反応ナノチャネルと流体連通する、第2の横向き流体ナノチャネル
を備える、分析チップ。 - 前記反応ナノチャネルと前記マイクロ流体入口との間に存在し、前記反応ナノチャネルを前記マイクロ流体入口と接続する、ナノファンネルを更に備える、請求項15に記載のチップ。
- 前記チップによって保持される複数のリザーバを更に備え、
前記複数のリザーバは、前記マイクロ流体入口と流体連通する少なくとも1つのリザーバ、前記第1の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも1つのリザーバ、前記第2の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも1つのリザーバ、及び前記検出ナノチャネルの端部と流体連通する少なくとも1つのリザーバを含む、請求項15又は16に記載のチップ。 - 前記マイクロ流体チャネル内のポストのアレイは、軸に沿って離間している前記アレイの複数のセグメントを備える、請求項15〜17のいずれか1項に記載のチップ。
- 前記ポストのアレイは、前記マイクロ流体チャネルの略全幅を横切って延在するよう構成される、請求項15〜18のいずれか1項に記載のチップ。
- 前記チップと連通する輸送システムと組み合わされ、
前記輸送システムは、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも1つを印加することによって、ゲノムDNA分子及び前記ゲノムDNA分子の断片の、前記検出ナノチャネルの中への前記反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成される、請求項15〜19のいずれか1項に記載のチップ。 - 長さ500μm〜10cmの第2の反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、第2の反応ナノチャネル;
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第2の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、第2の検出ナノチャネル;
前記第2の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第2の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第2の反応ナノチャネルと流体連通する、第3の横向きナノチャネル;並びに
前記第3の横向き流体ナノチャネルの下流において前記第2の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第2の反応ナノチャネルと流体連通する、第4の横向き流体ナノチャネル
を更に備える、請求項15〜20のいずれか1項に記載の分析チップ。 - 細胞全体から抽出されるゲノムDNAの規則正しい制限酵素マップを生成する方法であって:
反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルを有するデバイスを提供するステップであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルに、ナノチャネル直径のサイズが50〜99%だけ減少する界面においてマージする、ステップ;
細胞全体を溶解させ、前記マイクロチャネル内での最小の断片化でDNAを染色質除去するステップ;
続いて前記反応ナノチャネルにDNAの無傷分子を導入するステップ;
続いて制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して前記反応ナノチャネル内で前記無傷DNAを断片化するステップであって、前記反応ナノチャネルは、前記断片が前記検出ナノチャネルの中に注入されるまで元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される、ステップ;並びに
前記検出ナノチャネルに沿った1つ又は複数の場所で信号を検出して、長鎖DNA分子に沿って前記断片が発生する順序で前記断片をマッピングするステップ
を含む、方法。 - 前記デバイスは、前記反応ナノチャネルにマージする前記流体マイクロチャネルと流体連通する少なくとも1つのリザーバを備え、
前記導入するステップは、細胞全体を、前記リザーバを使用する分析のために導入することによって実施され、
前記方法は更に:
前記細胞全体を不動化するためのゲルマトリックス及び/又は高密度ポストアレイを提供するステップ;
続いて前記細胞を溶解するステップ;
DNAを抽出するステップ;
任意選択で前記DNAを染色するステップ;
続いて前記DNAの無傷分子を前記反応ナノチャネルの中に導入するステップ
を更に含む、請求項22に記載の方法。 - 前記デバイスは、前記反応ナノチャネルの進入端部と流体連通するポストのアレイを有するマイクロ流体チャネル、及び前記マイクロ流体チャネルの下流で前記反応チャネルと流体連通する第1の横向きチャネルを備え、
前記方法は、前記マイクロ流体チャネル及び前記横向きチャネルに電圧を印加して、前記反応ナノチャネルの前記進入領域でビアを生成することによって試料をスレッディングし、装填するステップを更に含む、請求項22又は23に記載の方法。 - 前記スレッディングステップは、前記反応チャネルの前記進入部分の近傍において、制御された電圧勾配又は濃度分極勾配を使用して実施され、これにより前記DNA分子は初め、DNA引張り強さを超える歪みに曝されず、機械的に破損しない、請求項24に記載の方法。
- 前記スレッディングステップの後、前記装填ステップは、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される電圧を変更して、毎秒約1μm〜毎秒約1mmの速度で前記反応ナノチャネルの中に完全な前記DNA分子を引き入れることによって実施され、これにより前記DNA分子の終端はいずれの前記ポストの絡み合いから拡散して係合解除するのに十分な時間を有し、機械的な破損が回避される、請求項24に記載の方法。
- 制限酵素消化の反応は、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧を変更して、前記反応ナノチャネル内に含まれる前記DNAに制限エンドヌクレアーゼ及び/又は補因子分子を導入することによって実施され、次いで反応を、全ての制限酵素部位が消化されるまで進行させることができる、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧は、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の前記マイクロ流体チャネルへの導入を防止し、従って前記反応ナノチャネル外部の前記DNA分子の消化を防止する、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 規則正しい制限酵素断片の検出は、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧を変更して、前記反応ナノチャネルと前記検出ナノチャネルとの間の界面へと前記断片を移行させることによって実施され、
前記検出ナノチャネルの直径は、前記反応ナノチャネルから50%〜99%だけサイズが減少され、これにより、各前記断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び各隣接する前記断片の分離が得られ、
分離された前記断片の、前記検出ナノチャネルを通した輸送を検出するために、検出ステップが実施される、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。 - 前記スレッディング、前記装填、前記制限酵素消化、及び前記規則正しい制限酵素断片のサイズ設定操作は、定義済みの入力で定常電圧を連続して印加することによって、複数の分子を連続して分析するために実施される、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出ステップは、前記検出ナノチャネルに沿った1つ又は複数の場所において光学的又は電気的に前記断片を検出することによって実施される、請求項29に記載の方法。
- 前記方法は、検出された信号持続時間又は統合された振幅を分析することによって前記断片のサイズを決定するステップを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記デバイスは流体分析チップである、請求項22〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 流体分析チップとインタフェース接続するための方法であって:
試料導入、細胞溶解、並びにDNA抽出及び任意選択で染色を制御するステップ;
DNAスレッディング及び抽出されたDNAの反応ナノチャネルへの装填、前記反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を用いた制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送を、電気的に制御するステップ;
前記検出ナノチャネルを通した輸送中に前記制限酵素断片を電気的に検出するステップ;
リアルタイム又は略リアルタイムの分析を使用してDNA分子からの前記制限酵素断片のサイズを電気的に分析するステップ;並びに
複数の前記DNA分子から共通制限酵素マップを電気的に生成し、前記マップの質を評価して、追加のサンプリングの必要を評価するステップ
を含む、方法。 - 流体分析チップとインタフェース接続するためのシステムであって:
試料導入、細胞溶解、並びにDNA抽出及び任意選択で染色を制御するための手段;
DNAスレッディング及び抽出したDNAの反応ナノチャネルへの装填、前記反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送のための手段;
前記検出ナノチャネルを通した輸送中に前記制限酵素断片を検出するための手段;
リアルタイムの又は略リアルタイムの分析を使用してDNA分子から前記制限酵素断片のサイズを分析するための手段;並びに
複数の前記DNA分子から共通制限酵素マップを生成し、前記マップの質を評価して追加のサンプリングの必要性を評価するための手段
を備える、システム。 - 流体分析デバイスであって:
少なくとも1つの反応ナノチャネルにマージする流路を有するマイクロ流体チャネル;
前記少なくとも1つの反応ナノチャネルの上流において前記マイクロ流体チャネルと流体連通する、少なくとも1つのDNAリザーバ;
前記少なくとも1つのDNAリザーバの入口と前記少なくとも1つの反応ナノチャネルとの間に存在する、前記マイクロ流体チャネルと流体連通するスレッディングリザーバ;
前記少なくとも1つの反応ナノチャネルそれぞれの放出端部に接続される、少なくとも1つの検出ナノチャネルであって、各前記検出ナノチャネルは、対応する前記反応ナノチャネルよりも小さい直径並びに/又は小さい幅及び深さを有する、検出ナノチャネル;並びに
前記検出ナノチャネルの近傍に存在する、前記少なくとも1つの反応ナノチャネルと流体連通する、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を含む少なくとも1つのリザーバを含む。 - 前記デバイスは、各前記検出ナノチャネルの中へとマージする、離間した複数の前記反応ナノチャネルを備える、請求項36に記載のデバイス。
- 前記デバイスと連通する輸送システムと組み合わされ、
前記輸送システムは、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも1つを印加することによって、ゲノムDNA及び前記ゲノムDNAの断片の、前記検出ナノチャネルの中への前記反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成される、請求項36又は37に記載のデバイス。 - 前記デバイスは、長さ500μm〜10cmの第2の反応ナノチャネルを備え、
前記第2の反応ナノチャネルは前記第1の反応ナノチャネルの下流に存在し、
前記第2の反応ナノチャネルは、前記第2の反応ナノチャネルと第2の検出ナノチャネルとの間の第2の界面位置において、前記第2の検出ナノチャネルにマージし、
前記第2の界面位置において、前記第2の検出ナノチャネルのサイズは前記第2の反応ナノチャネルに比して縮小する、請求項1に記載のデバイス。 - 前記第1の反応ナノチャネルと流体連通する廃棄物リザーバを更に備え、
前記デバイスは、制限酵素断片を、前記廃棄物リザーバに入るよう、又は前記第2の反応ナノチャネルに入るよう選択的に輸送する回路と連通する、請求項39に記載のデバイス。 - 第2の反応ナノチャネルを更に備える、請求項15に記載のチップであって、
前記第2の反応ナノチャネルは長さ約500μm〜10cmであり、前記第1の反応ナノチャネルと流体連通し、前記第1の反応ナノチャネルの下流において前記第2の横向き流体ナノチャネルの後に存在し、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第1の反応ナノチャネルから、流動的に廃棄物出口経路に入るよう、又は流動的に前記第2の反応ナノチャネルに入るよう選択的に配向する回路と連通する、請求項15に記載のチップ。 - 廃棄物出口経路と、前記第2の横向き流体ナノチャネルの下流に延在する関連付けられた出口チャネルを有する複数の収集リザーバとを更に備え、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第1の反応ナノチャネルから、前記廃棄物出口経路に又は前記収集リザーバのうちの1つに入るよう選択的に配向する回路と連通する、請求項15に記載のチップ。 - 関心対象の領域がリアルタイムで又は略リルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別するステップ、並びに
制限酵素断片を選択的に且つ自動的に第2のナノ反応チャネルに流動的に輸送するステップであって、前記第2のナノ反応チャネルにおいて、制限酵素断片は、制限酵素消化又はプローブ結合及び後続の第2の検出ナノチャネルにおける検出等の二次反応を受ける、ステップ
を更に含む、請求項22に記載の方法。 - 関心対象の領域がリアルタイムで又は略リアルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別し、後の分析のために関心対象の制限酵素断片を自動的且つ選択的に各収集リザーバ内への各出口チャネルに流動的に輸送し、他の制限酵素断片を廃棄物出口チャネルに流動的に輸送するステップを更に含む、請求項22に記載の方法。
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