JP2002521064A - アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用 - Google Patents

アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用

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シャンカー バラスブラマニアン，
デイヴィッド クレナーマン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明に従えば、固体表面に固定化した分子群のアレイを含む装置が開示され、該アレイは各分子を個別に（例えば、光学顕微鏡によって）解像可能にする表面密度を有する。従って、本発明のアレイは、従来技術のアレイよりもさらに空間的に区別される単一分子群から構成される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子群の組み立てアレイ、およびその分析的な応用に関する。特に
、本発明は組み立てアレイを、遺伝子配列情報を得る方法に使用することに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】
分子の研究における進歩は、部分的に分子またはその生物学的反応を特徴づけ
る（キャラクタリゼーション）のに使用する技術の改善によってもたらされた。
特に、核酸すなわちＤＮＡおよびＲＮＡの研究は、配列分析やハイブリダイゼー
ション事象の研究に使用する、進歩途上の技術から恩恵を受けてきた。
【０００３】 核酸の研究を向上させた技術の一例は、固定化核酸群の組み立てアレイの開発
である。典型的には、これらのアレイは固体支持材料に固定化したポリヌクレオ
チド群の高密度マトリックスからなる。Fodorら、Trends in Biotechnology (19
94) 12:19-26には、マスクによって保護されているが、適切に修飾されたヌクレ
オチド類の取りつけを可能ならしめるために定める範囲がむきだしになっている
、化学的に感受性を高めたガラス表面を用いて、核酸アレイを組み立てる方法が
記載されている。区別されうる領域が高密度の１つの特定タイプのポリヌクレオ
チドを含む固体支持体上に形成されるので、典型的には、前記アレイは「多分子
」アレイとして説明される。
【０００４】 別のアプローチは、Schenaら, Science (1995) 270: 467-470に記載されてい
るが、そこではＤＮＡ試料群が、ロボットを用いるマイクロピペッテング手法に
よって顕微鏡のガラススライド上の所定の部位に位置される。そのＤＮＡはガラ
ス表面の全長に沿って、非共有結合的な電気的相互作用で付着される。しかし、
相補的なＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションは起こり得るけれども、前記ア
プローチではＤＮＡを他の成分（例えば、ポリメラーゼ酵素、ＤＮＡ結合タンパ
ク質等）と自由に相互作用できるようにはしないかもしれない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
通常、アレイ類はハイブリダイゼーション事象を研究するか、またはＤＮＡ配
列を決定する(Mirzabekov, Trends in Biotechnology (1994) 12: 27-32)か、或
いは特定のＤＮＡ試料中の突然変異を検出するために提供される。これらのハイ
ブリダイゼーション事象の多くは、ヌクレオチドに取りつけられた蛍光標識を用
いて検出されるが、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）のような高感度蛍光検出器
を用いて前記標識が検出される。これらの方法の最大の欠点は、ＤＮＡの長いス
トレッチを配列決定（シークエンス）できないことであり、そして反復配列が不
確かな結果を導くことである。Automation Technologies for Genome Character
isation, Wiley-Interscience (1997), T.J.Beugelsdijk編, 第10章:205-225に
おいて、前記の問題が認識されている。
【０００６】 さらに、多段階分析手順で高密度アレイを使用すると、位相調整（フェージン
グ）の問題がもたらされ得る。位相調整問題は、アレイの異なる分子上で起きて
いる反応段階の同期化における損失に由来する。アレイされた（配列された）分
子の幾つかが、前記手順中の１つの段階を経ない場合、続いてこれらの分子につ
いて得られる結果は、その他のアレイ分子について得られる結果ともはや同期（
in step）しないことになる。位相がずれている分子の割合は、続く段階を経る
につれて増大し、したがって検出される結果は不確かなものとなる。この問題は
、米国特許第5302509号に記載されているシークエンシング法でも認識されてい
る。
【０００７】 別のシークエンシングアプローチが欧州特許公開0381693（EP-A-0381693）に
開示されており、これは蛍光標識したＤＮＡ鎖をフロー試料流中に懸濁した標的
ＤＮＡ試料にハイブリダイズさせ、そしてその後でエキソヌクレアーゼを用いて
該ハイブリダイズＤＮＡを繰り返し末端塩基から切ることからなる。切られた塩
基は、連続して検出器を通過するときに検出され、該ＤＮＡの塩基配列の再構築
が可能である。異なるヌクレオチドの各々は、取りつけられた区別できる蛍光標
識を有し、これがレーザー誘起蛍光法によって検出される。これは複雑な方法で
ある。というのは前記ＤＮＡ鎖のすべてのヌクレオチドを標識し、さらに元の配
列に対して高い忠実度でこれが達成されたことを確実にするのは困難であるから
である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
少なくとも部分的には、本発明は、分子アレイがはっきりした（区別できる）
光学的解像度を与えるのに充分な分子間における分離を持って製造できることを
実現したことに基づいている。各分子を光学的に解像可能にするのに充分な分子
間の分離を与えるような方法で、単に分子の混合物を固体表面に固定化すること
によって前記アレイが形成できる。
【０００９】 本発明に従えば、装置はインテロゲーションが可能であり、かつ固体表面に固
定化した分子群のアレイを含み、該アレイは各分子を個別に（例えば、光学顕微
鏡によって）解像可能にする表面密度を有し、そして各分子が前記表面との特異
的な相互作用によって、インテロゲートされうる各分子のその部分以外で、１つ
以上の箇所に固定化されている。従って、本発明のアレイは事実上、従来技術の
アレイ類よりもさらに空間的に区別されうる単一分子群であるものからなる。こ
れは分子や他の生体分子類とそれらとの相互作用を研究するのに多くの重要な恩
恵をもたらす。特に、各分子に起きている蛍光事象が、高感度検出器に接続され
ている光学顕微鏡を用いて、検出でき、各分子について明瞭な信号が結果として
得られる。
【００１０】 単一分子の集団の多段階分析に用いるとき、従来技術の高密度アレイの使用に
際して出くわす位相調整問題が取り除かれる。従って、前記の新規アレイは、分
子についての蛍光またはその他の事象をモニターするのに多数のパラレル（並列
）アプローチをも可能にする。このような多数のパラレルなデータ取得によって
、分子の不均質混合物のスクリーニング／特徴づけ（同定）を含む広範囲な分析
手法において前記アレイが非常に有用となる。そのアレイを用いて、例えば、コ
ンビナトリアル合成反応で製造された特定の分子を同定するスクリーニング手順
において特定の合成化学的な部分、または生物学的部分を特徴づけすることがで
きる。
【００１１】 前記アレイ分子は、固体支持体上にマイクロスフェアー（微小球体）を介して
固定化されうる。マイクロスフェアーは容易に視覚化でき、さらなる分析手順を
実行する前に、顕微鏡のはっきりと光学的に解像可能な領域内に配置することが
できる。
【００１２】 多数の異なる分析手法、またはキャラクタリゼーションに前記アレイを使用で
きる。１つの実施の形態において、分子（群）はポリヌクレオチドであり、アレ
イは配列決定を行うことを可能にする。
【００１３】 一般的に、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を同定するために蛍
光、もしくはその他の標識を利用するいかなるシークエンシング法でも使用する
ことができる。１つの好適な方法は、固定化した標的ポリヌクレオチドをプライ
マー、ポリメラーゼおよび異なるヌクレオチド三リン酸類と、ポリメラーゼ反応
が進行するのに充分な条件下、反応させるステップと、そこで各ヌクレオチド三
リン酸がその３'位で異なる蛍光標識にコンジュゲートされ、いずれの標識（す
なわち、いずれのヌクレオチド）が重合反応を受けるかを決定するステップと、
該標識を取り除くステップの繰り返しを含む。この方法は本発明のアレイを利用
するので、組み込まれたヌクレオチドの各々が蛍光測定によって疑う余地なく決
定されうる。さらに、該方法を用いて、何千という反応を同時に、しかも位相調
整問題なしに検出できる。
【００１４】 代わりに、前記アレイを、ある生物に遺伝学的な「バーコード」を与えるため
のゲノタイピング（Shalonら,Genome Research (1966) 639-645に開示されてい
るような）、マップピング研究、およびｍＲＮＡに基づく発現モニター（Wodick
aら,Nat. Biotechnol (1997) 15: 1359に開示されているような）に用いること
ができる。また、前記アレイはセンサーとして、Analytical Chemistry (1998)
70: 1242-1248に開示されているような様式で使用できる。
【００１５】 本発明の別の側面に従えば、方法は適当な条件下、本発明に係る所定の配列を
有するポリヌクレオチド群の固定化アレイを該アレイポリヌクレオチドに結合可
能な複数の標的分子と接触させること、そして結合事象を検出し、それによって
前記アレイ上で結合した分子の位置を決定することを含む。この方法によって、
コンビナトリアル化学反応で合成された分子の同定、および例えばポリヌクレオ
チド識別タグを組み込むことが可能である。
【００１６】 さらなる方法は、本発明に係るポリヌクレオチド群のアレイを検出可能なよう
に標識された複数の生物のゲノムＤＮＡ断片と、ハイブリダイゼーション条件下
接触させるステップと、ハイブリダイゼーション事象を検出するステップとを含
む。前記生物は、哺乳類（特にヒト）であってよく、或いは細菌またはウイルス
であってもよい。この方法は、ゲノタイピングを行うことを可能にする。
【００１７】 本発明のアレイを用いて、空間的にアドレス可能な単一ポリヌクレオチド分子
群のアレイを生成することができる。これは該アレイをシークエンシングした単
なる結果である。このような空間的にアドレス可能なアレイの注目される利点と
しては、以下のものが挙げられる。 （１） アレイ上のポリヌクレオチド分子は、識別タグとして働き、１０〜２０
塩基長でありさえあればよい、そしてシークエンシングステップで要求される効
率は９５％よりよければよい。 （２） アレイは、一旦作られ、シークエンスされると、スクリーニングに再使
用できる。全ての可能な配列が、例えばホトリチオグラフィーを用いて作られた
高密度ＤＮＡチップと比較すると非常に簡単な方法で、作成できる。
【００１８】
【発明の実施の形態】 本発明に従えば、固体支持体の表面に固定化した単一分子群は、個別に（例え
ば、光学的手段で）解像が可能でなければならない。これは、使用する特定の撮
像素子の解像可能な領域内において、夫々が１つの分子を代表する１つ以上の区
別できる画像が存在しなければならないことを意味する。典型的には、アレイの
分子は、高感度検出器（例えば、電荷結合素子ＣＣＤ）を備える単一分子蛍光顕
微鏡を用いて解像され、アレイの各分子が同時に分析される。
【００１９】 アレイの分子は、ペプチドやポリペプチドを含むいかなる生体分子であっても
よいが、特にＤＮＡやＲＮＡおよび核酸ミミック（模擬）体（例えば、ＰＮＡや
2'-O-methRNA）である。しかしながら、他の有機分子を用いてもよい。それらの
分子は、他の「コグニート（同種の）」分子との相互作用ができるようにアレイ
上に配列される。従って、分子を固定化するのに用いられていない該分子の部分
がコグニートによってインテロゲーションされることが可能であるように前記分
子群を固定化することが重要である。幾つかの応用例では、単一アレイの全ての
分子が同一であるだろう、そして大部分は区別できる分子をインテロゲーション
するのに用いられる。他の応用例では、アレイ上の分子群は、おおむね区別でき
うるだろう、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上の分子はその他の分子群
の５０％、または７０％と異なるであろう。
【００２０】 本発明のアレイは、単一分子アレイである。本明細書中「単一分子」という用
語は、近接する他の分子（各分子が同一のタイプであるか、異なるタイプである
かにかかわらず）とは独立して可視化される１つの分子を指すのに使用される。
【００２１】 本明細書中「個別に解像される」という用語は、可視化されるときアレイ上の
１つの分子をその近接する分子群から識別することが可能であることを明示する
のに使用される。可視化は、レポーター標識（例えば、発蛍光団）を使用するこ
とによって達成され、その信号は個別に分割される。
【００２２】 本明細書中「コグニート分子」という用語は、アレイ分子と相互作用、または
インテロゲートできるいかなる分子をも指すのに使用される。そのコグニートは
、前記アレイ分子に特異的に結合する分子、例えば、ハイブリダイゼーション反
応での相補的ポリヌクレオチドでありえる。或いは、コグニートは、非特異的に
アレイ分子と会合してもよい。そのような例は、相補的な鎖を合成する工程でア
レイポリヌクレオチドと会合するポリメラーゼ酵素である。
【００２３】 本明細書中「インテロゲート」という用語は、アレイ分子とその他のいかなる
分子との相互作用をも指すのに使用される。その相互作用は共有結合的であって
も、または非共有結合的であってもよい。
【００２４】 本明細書中「アレイポリヌクレオチド」および「ポリヌクレオチドアレイ」と
いう用語は、１つのポリヌクレオチド分子を含むことによって特徴づけられる単
一分子群のアレイを定義するのに使用される。その用語は他の分子の固体表面へ
の取りつけを含むことを意図する。前記分子はさらにインテロゲートされうる、
取りつけたポリヌクレオチドを有する。例えば、アレイは固体表面に固定化した
タンパク質分子からなってもよい。そのタンパク質分子は短いポリヌクレオチド
分子にコンジュゲートされているか、またはさもなければ結合されており、該ア
レイをアドレスするためにインテロゲートされうる。
【００２５】 アレイ上での個々の分子間の分離の程度は、部分的にはその個々の分子を解像
するのに使用する個別の手法によって決定されるだろう。分子アレイを撮像する
のに用いる装置類は、当業者にとって公知である。例えば、図１に示されるよう
に、共焦点走査顕微鏡を用いて、アレイの表面をレーザーでスキャンし、個々の
分子に組み込まれた発蛍光団を蛍光によって直接撮像することができる。図中、
１は検出器を、２は帯域フィルターを、３はピンホールを、４はミラーを、５は
レーザー・ビームを、６はダイクロイック・ミラーを、７は対物レンズを、８は
カバーガラスを、９は検査下の試料を表す。代わりに、高感度２−Ｄ検出器（例
えば、電荷結合素子）を用いて、アレイ上の個々の分子を表す２−Ｄ画像を提供
できる。この例では、分子が少なくとも約250nm x 250nm、好ましくは少なくと
も300nm x 300nm、より好ましくは少なくとも350nm x 350nmの距離で分離されて
いるならば、アレイ上単一分子を解像することが可能である。
【００２６】 しかしながら、走査型近地光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）等の他の手法も利用でき、
より小さい光学解像が可能となり、そのため「より密度の高い」アレイ類を用い
ることができる。具体的には、ＳＮＯＭを用いると、分子は100nm以下、例えば1
0nm x 10nmの距離で分離されていてもよい。走査型近地光学顕微鏡の解説につい
ては、Moyerら, Laser Focus World (1993) 29 (10)を参照。
【００２７】 さらに、走査型トンネル顕微鏡（Binnigら, Helvetica Physica Acta (1982) 55 : 726-735）および原子間力顕微鏡（Hanswaら, Annu. Rev. Biophys. Biomol.
Struct. (1994) 23: 115-139）の手法が、本発明のアレイを撮像するのに適し
ている。固体支持体上の区別されてうる領域内で撮像が可能であるならば、顕微
鏡に依存しない他の装置も使用できる。
【００２８】 単一分子群は、固体支持体の表面に固定化することによって、アレイ（配列）
できる。適当な条件を用いて分子の適切な分離が確かにされるならば、公知のい
かなる手法でこれを実行してもよい。一般的に、ランダムアレイを生成するには
、分子の混合物を含む少量の試料を適切に調製した固体表面に分配するか、また
は希薄溶液を該固体表面に塗る（接触させる）ことによって該アレイを製造する
。この様式で、異なる分子の混合物が簡単な手段でアレイできる。単一分子アレ
イの形成は、かくして各アレイ分子の同定を実行可能にする。
【００２９】 夾雑物の存在を最小にするか、または避ける条件下で、前記固体支持体を調製
することが重要である。塵や他の夾雑物を取り除くために、好ましくは適当な洗
剤（例えば、Decon-90）で固体支持体を徹底的にきれいにしなければならない。
【００３０】 固定化は、特異的な共有結合、または非共有結合的な相互作用による。分子が
ポリヌクレオチドである場合、固定化は、好ましくは５'位または３'位のいずれ
かであるだろう。その結果、該ポリヌクレオチドは、固体支持体に一端でのみ取
りつけられる。しかしながら、そのポリヌクレオチドは、固体支持体の長さに沿
ってどの位置で取りつけられてもよく、その取りつけは該ポリヌクレオチドを該
固体支持体に繋ぐ役割を果たす。このように、固定化ポリヌクレオチドは、固体
支持体から離れた位置において、他の分子またはコグニートとの相互作用を受け
ることができる。典型的には、前記相互作用は、非特異的な相互作用で固体支持
体に結合したいかなる分子をも、例えば、洗浄によって取り除くことが可能なよ
うなものであろう。このようにして、固定化はよく分離した単一分子群をもたら
す。これの利点は、アレイのインテロゲーションを妨げるかもしれない、該アレ
イ上の近接する分子間の相互作用を防ぐことである。
【００３１】 本発明の１つの実施の形態において、固体支持体の表面を、まずストレプトア
ビジン、またはアビジンで被覆し、それからビオチン化分子の希薄溶液を該表面
の区別されうる部位に、例えばナノリッター・デスペンザーを用いて、添加し、
各部位に平均１つの分子を送達する。その分子がポリヌクレオチドの場合、固定
化は固体支持体に既に取りつけられた相補的な核酸分子へのハイブリダイゼーシ
ョンによってである。例えば、固体支持体の表面を、まずその表面の区別されう
る部位においてプライマーポリヌクレオチドで被覆する。それから、１本鎖ポリ
ヌクレオチドをアレイ・プライマーと、ハイブリダイゼーション条件下、接触さ
せ、そしてアレイ上に「自己振り分け」させる。このようにして、前記アレイを
用いて、ポリヌクレオチド類の不均質試料から所望のポリヌクレオチドを分離で
きる。
【００３２】 代わりに、前記アレイ・プライマーは、１本鎖オーバハング（「粘着末端」）
を備える２本鎖ポリヌクレオチドから構成されていてもよい。標的ポリヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションが起こるようにされ、そしてＤＮＡリガーゼを
用いて該標的ＤＮＡを前記プライマーに共有結合させる。その後、第２のＤＮＡ
鎖を溶融(melting)条件下、取り除き、アレイ・ポリヌクレオチドを残すことが
できる。
【００３３】 本発明の１つの好適な実施の形態において、固体の表面を、エポキサイドで被
覆し、そして分子群をアミノ結合を介してカップリングさせる。アレイされる分
子を含む溶液に存在する塩を避けるか、または減らすことも好ましい。塩濃度を
減少させることは、アレイ上での配置に影響を及ぼし得る溶液中での分子の凝集
の可能性を最小にする。
【００３４】 本発明の１つの実施の形態において、標的分子群を非蛍光性のストレプトアビ
ジン、またはアビジンで官能基化されたポリスチレン・ラテックスのマイクロス
フェアー上へ固定化する。これは図２に示されるが、図中、１はマイクロスフェ
アーを、２はストレプトアビジン分子を、３はビオチン分子を、そして４は蛍光
標識されたポリヌクレオチドを表す。マイクロスフェアーは、続いて固体支持体
に固定化され、標的試料を顕微鏡分析のために固定する。本発明に使用するのに
適した別のマイクロスフェアー類は、当該技術で公知である。
【００３５】 前記単一分子アレイには、アレイ分子との生物学的または化学的相互作用の検
出に依存する方法において、多くの応用がある。例えば、アレイを使用して、コ
グニート分子の特性または素性を決定できる。典型的には、アレイとの生体的ま
たは化学分子の相互作用は、溶液中で起こる。
【００３６】 特に、蛍光標識の検出に依存する通常のアッセイ法に前記アレイを用いて、ア
レイ分子の情報をうることができる。アレイは、特に多段階アッセイに使用する
のに適している。そこでは、段階毎の同期の損失は、以前アレイの使用に対する
限界とみなされていた。アレイがポリヌクレオチド群からなるとき、遺伝子配列
情報をうる通常の手法に用いることができる。これらの手法の多くは、適切に標
識されたヌクレオチドの段階的な同定に頼っているが、それは米国特許第563441
3号で「単一塩基」シークエンシング法と称される。
【００３７】 本発明の１つの実施の形態においては、標的ポリヌクレオチドの配列を米国特
許第5634413号に記載されているのと同様な方法で決定する。これはヌクレオチ
ドを新生鎖に組み込み、組み込まれたヌクレオチドに取りつけられた蛍光標識を
検出することによってである。前記標的ポリヌクレオチドは、適当なプライマー
でプライムされ、そして新生鎖がポリメラーゼ反応で段階的に延長される。異な
るヌクレオチドの各々（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）が３'位にユニークな発蛍光団
を組み込み、それが制御なしの重合を防ぐための保護基として働く。ポリメラー
ゼ酵素は、ヌクレオチドを前記標的に相補的な新生鎖に組み込み、そして前記保
護基は、ヌクレオチド類のさらなる組み込みを防ぐ。その後、アレイの表面から
組み込まれていないヌクレオチドを取り去り、そして各組み込まれたヌクレオチ
ドをレーザー励起とフィルターを用いる電荷結合素子によって、光学的に読み取
る。前記３'保護基を続いて取り除き（脱保護基）、新生鎖をさらなるヌクレオ
チド組み込みに曝す。
【００３８】 前記アレイは、区別されうる、光学的に解像可能なポリヌクレオチド群からな
るので、各標的ポリヌクレオチドは蛍光事象が検出される度に一連の異なる信号
を発生することになる。その後全配列の詳細が決定される。
【００３９】 達成されうるサイクル数は、主に脱保護基反応サイクルの収率によって左右さ
れる。１つのサイクルで脱保護基反応がうまくゆかない場合、後の脱保護基反応
および続くヌクレオチドの組み込みが次ぎのサイクルで検出されうることが可能
である。シークエンシングが単一分子レベルで実施されるので、そのシークエン
シングは、それに先立ち異なる試料断片を分離する必要なく、１回に異なるポリ
ヌクレオチドの配列群について実行することができる。また、このシークエンシ
ングは、従来技術の方法に随伴する位相調整問題を回避する。
【００４０】 脱保護基反応は、化学的、光化学的、または酵素反応によって実行できる。
【００４１】 同様な、そして同等に利用可能なシークエンシング法が欧州特許公開0640146
に開示されている。
【００４２】 他の適当なシークエンシング手順は、当業者にとって明らかであろう。特に、
シークエンシング法は、アレイ・ポリヌクレオチドの分解に依存し、分解物が配
列を決定するために特徴づけされる。
【００４３】 適当な分解手法の１つの例がWO95/20053に開示されており、それによってポリ
ヌクレオチドの塩基類がそれらに特異的な、標識されたアダプターの使用および
決められたエキソヌクレアーゼ切断によって１回ごとに所定の数、連続的に取り
除かれる。
【００４４】 しかしながら、非破壊的な方法を使用するシークエンシングの結果は、さらな
るキャラクタリゼーション研究用の空間的にアドレス可能なアレイを形成するこ
とが可能であることである。従って、非破壊的シークエンシングが好ましいであ
ろう。この意味において、「空間的にアドレス可能」という用語は、本明細書中
、異なる分子群がアレイ上のそれらの位置に基づいて、いかにして同定されるか
説明するのに用いられる。
【００４５】 一旦シーエンクシングされると、前記空間的にアドレス可能なアレイは、様々
な手順に使用できる。これら手順は、不均質な集団から個々の分子を特徴づける
ことを要する。
【００４６】 １つの応用は、前記アレイを用いてコンビナトリアル化学反応において合成さ
れた生成物を同定することである。コンビナトリアル合成反応の間、タグまたは
ラベルを続く生成物の同定のために支持体床、または反応生成物に組み込むこと
は通常のことである。これを本発明に適合させる。それはポリヌクレオチド分子
をタグとして使用し（ここで各ポリヌクレオチドは特定の生成物に対して特異的
である）、そして該タグを空間的にアドレスされたアレイにハイブリダイズさせ
るのに使用することによってである。各アレイ・ポリヌクレオチドの配列は既に
決定されているので、アレイ上でのハイブリダイゼーション事象の検出によって
生成物の相補的タグの配列が明らかにされる。そのタグを特徴づけ終わると、こ
れがどの生成物に関連するか確認することが可能である。従って、全プロセスは
、速やかで簡単であり、しかもアレイは、高スループット・スクリーニングに再
使用できる。適当な標識（例えば、発蛍光団）を生成物に取りつけることによっ
て、検出を実施できる。
【００４７】 コンビナトリアル化学反応を使用して、多様な異なる分子を合成でき、その各
々は本発明のアドレスされたアレイを用いて同定できる。例えば、コンビナトリ
アル化学を使用して、標的タンパク質群のアドレスされたアレイを生成するため
に前記アレイに結合されうる治療用タンパク質、またはペプチドを製造できる。
その標的をその後活性についてスクリーニングし、そして活性を示すタンパク質
は上記のようにアレイ上のその位置によって確認できる。
【００４８】 同様な原理が、コンビナトリアル化学の他の生成物、例えばMwt<1000の非重合
性の分子の合成に適用される。コンビナトリアル法によってペプチド／タンパク
質を生成する方法は、米国特許第5643768号および第5658754号に開示されている
。また、Nielsenら,J.Am.Chem.Soc. (1993) 115: 9812-9813に記載されているよ
うに、スプリット・ミックス（切断および混合）アプローチも使用することがで
きる。
【００４９】 別のアプローチでは、コンビナトリアル化学反応の生成物がアレイに対するハ
イブリダイゼーションに関与しない第２のポリヌクレオチドタグを含んでもよい
。ハイブリダイゼーションによる配列の後、アレイを繰り返してポリヌクレオチ
ド・シークエンシングにかけ、遊離のままでいる第２のタグを同定する。該シー
クエンシングは、上記で説明したように実行される。
【００５０】 この応用例では、従ってアレイ上に空間的なアドレスを提供するのは前記タグ
である。そのタグを生成物から、例えば開裂しうるリンカーによって取り除くと
、タグされていない空間的にアドレスされたアレイが残される。
【００５１】 さらなる応用は、米国特許第5643768号および第5658754号に記載されているよ
うに、複合体中に取りこまれたポリヌクレオチドやタンパク質を含む、固定化ポ
リゾームによってタンパク質を表示することである。
【００５２】 本発明の別の実施の形態においては、前記アレイを用いて生物を特徴づけでき
る。例えば、生物のゲノムＤＮＡをアレイでスクリーニングすると、その個体に
ユニークな区別されうるハイブリダイゼーション・パターンが明らかになる。そ
こで、この実施の形態は、各生物についての「バーコード」に喩えられる。その
生物のゲノムＤＮＡは、まず断片化されそして検出できるように標識（例えば、
発蛍光団で）される。それから該断片化されたＤＮＡをハイブリダイゼーション
条件下、アレイに接触させ、そしてハイブリダイゼーション事象をモニターする
。
【００５３】 別法として、アレイ分子中に組み込まれた蛍光に基づく検出系を用いて、ハイ
ブリダイゼーションを検出できるが、これは例えば、Nature Biotechnology (19
66) 14: 303-308に記載された「分子ビーコン」を用いる。
【００５４】 生成されるハイブリダイゼーション・パターンがその生物にユニークであり、
それで個体の遺伝子の特徴についての貴重な情報を得るのに用いることができる
ように、アレイ類を設計することが可能である。このように、犯罪科学において
多くの有用な応用がある。別法として、本方法は生物のゲノムＤＮＡ内での突然
変異、またはアレレ変異体の検出のために実施できる。
【００５５】 ゲノタイピングのためには、ゲノム中に特定の配列が存在するかどうか確認す
ることが望ましい。可能な最小のユニークなオリゴマーは、ゲノム配列のランダ
ムさを仮定すると16-merであり、すなわちヒトゲノム（3x109塩基を有する）中
、いかなる特定の16塩基配列も１度だけおきる可能性がある。約4x109の可能な1
6-merがあり、それらは2cm x 2cmの領域内（単一コピーが250 nm x 250 nm平方
あたり１分子の密度であると仮定する）にはいるだろう。従って、特定の16-mer
が存在するかどうかだけを決定することが必要であり、そのため定量的な測定は
不必要である。特定の領域の突然変異および、その突然変異が何であるかの確認
は、前記16-merライブラリーを用いて実施できる。ヒトゲノムにかえってマップ
することは、公表されたデータを用いて可能であり、そして一旦全ゲノムが決定
されると、問題ではないだろう。単一点変異があれば、16の異なる16-mer群に現
れるように、特定の16-mer群へのハイブリダイゼーションを見ること、ゲノム中
に32塩基の領域を確認することによる、組み込まれた自発検証がある。前記突然
変異は、１つの16-merの先頭に起こり、次いで関連する16-merの第２の塩基にお
きることになる。このようにして、単一点変異は、前記16-mer群の16個がハイブ
リダイゼーションを示さず、そして新しい組の16個がハイブリダイゼーションを
示し、さらに相補的な鎖に対しても同様になるという結果がもたらすだろう。要
するに、ＤＮＡの両方の鎖を考慮すると、単一点変異は、前記16-mer群の32個が
ハイブリダイゼーションを示さず、新しい16-mer群の32個がハイブリダイゼーシ
ョンを示す、すなわち、アレイに対するハイブリダイゼーション・パターンに全
く大きな変化がもたらされことになる。
【００５６】 実例として、ヒトゲノムＤＮＡの試料を制限酵素で消化して、短い断片を生成
し、蛍光標識したモノマー、ＤＮＡポリメラーゼ、またはターミナル・トランス
フェラーゼを用いて標識する。これによって、発蛍光団を一端に備える試料ＤＮ
Ａの短い鎖長が生成される。溶融した断片をアレイに曝し、そしてハイブリダイ
ゼーションが起きた画素、起きなかった画素を同定する。これによって、約4x10 9 バイナリーコード要素（鎖長が16のオリゴヌクレオチドが使用されたならば）
を有する個体の遺伝子バーコードが生成される。これによって、ゲノム医薬用の
個人の遺伝子型が特定的に定義されることになる。アレイ類は再使用できるはず
であるので、同一のプロセスを別の個人に繰り返すことができるであろう。
【００５７】 ウイルスおよび細菌もまた研究され、そして核酸試料をスクリーニングすると
、疾病に存在する病原菌が明らかになり、または分析手法において微生物が同定
される。例えば、細菌の異なる株から製造された一連の単一分子ＤＮＡチップを
用いて、病原性の、または他の細菌を同定できる。ここでも、前記チップ類は、
作るのが簡単で、かつ再使用可能である。
【００５８】 さらに別の例では、蛍光標識されたタンパク質を用いて、タンパク質ライブラ
リーを結合についてスクリーニングするのに２本鎖アレイを使用することができ
る。これによって、特定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質、すなわち転写を制
御するタンパク質を判定できる。そのタンパク質が結合する短い配列が決定され
ると、該配列が作られ、そしてアフィニティー精製を用いて該タンパク質を単離
、同定できる。このような方法は、Nature Biotechnology (1999) 17: p573-577
に開示されている。
【００５９】 別の用途は、発現のモニターにある。このためには、各遺伝子に標識が必要で
ある。ヒトゲノムには、約100,000個の遺伝子がある。262,144個の可能な9-mer
があり、これが各遺伝子に対するユニークなタグを持つのに要するオリゴマーの
最小の長さである。前記9-mer標識は、ＤＮＡ中の特異的な点にある必要がある
が、最良の点は、おそらくｍＲＮＡのポリＡ尾部の直後（すなわち、9-merがポ
リＴガイド配列に結合される）である。これらの9-merの多コピーが、遺伝子発
現の定量化を可能にするために存在しなければならない。100コピーは、1〜100%
からの相対発現の決定を可能にする。10,000コピーは、01〜100%からの相対発現
の決定を可能にする。26144個の9-merの10,000コピーは、1 cm x 1cmの内部に、
ほとんど最大密度で入り込むだろう。
【００６０】 上記の方法のいずれかと組み合わせて、ナノバイアルを使用することにより、
分子を表面から開裂させ、にもかかわらずその空間的な一体性を保持させること
ができる。これによって、単一分子の空間的にアドレス可能なアレイを自由な溶
液中で生成することができ、これは表面に取りつけることが分析（例えば、薬剤
スクリーニング）の妨げとなる場合に好都合である。ナノバイアルとは、平坦な
ガラス表面の小さな穴（例えば、直径約20μmで深さ10μm）である。それらを50
μm毎に位置することができ、そうするとアレイは、表面取りつけ型のアレイよ
りも密度が低いことになる。しかしながら、これは撮像光学素子中の適当な調整
によって補償されうるだろう。
【００６１】 以下の実施例は、図面を参照して本発明を説明するものである。
【００６２】
【実施例】
（実施例１） 以下の例で用いた顕微鏡の組み立ては、図１に示した光電子検出器を用いる改
良共焦点蛍光系を基本とした。簡単には、空間的に狭くフィルターされたレーザ
ー・ビーム（CW Argon Ion Laser Technology RPC50）を高速光学スイッチとし
て働く音響光学変調器（AOM）（A.A.Opto-Electronic）を通過させた。その音響
光学変調器をオンにし、そしてレーザー・ビームをダイクロイック・ビーム分割
器（540DRLP02、または505DRLP02、Omega Optics Inc.）によって倒立光学顕微
鏡（Nikon Diaphot 200）の油入対物レンズを通るように指向させた。その対物
レンズは、薄いカバーガラスに固定化した標的試料上の回折限界点に光の焦点を
あわせる。該試料の蛍光を同一の対物レンズで収光し、ダイクロイック・ビーム
分割器を通過させ、そして顕微鏡の覗き窓の画像平面に位置する50μmのピンホ
ール（Newport Corp）を通るように指向させた。そのピンホールは、試料から出
てくる、レーザー焦点の面と外れる光をはねる。透過した蛍光をダイクロイック
・ビーム分割器でスペクトル的に赤および緑の成分に分離し、さらにフィルター
にかけ残余のレーザー分散を取り除いた。それから残った蛍光成分の焦点を別個
の単一光電子アバランシュ・ダイオード検出器にあわせ、そして信号を1〜10ms
の範囲の時間分解能を備えるマルチチャンネル・スカラー(MCS)(MCS-Plus、EG&G
Ortec)上に記録した。
【００６３】 標的試料は、通常のホスホアミダイト化学を用いて調製され、そして配列番号
１（配列表を参照）を有する5'-ビオチン修飾された13-merプライマー・オリゴ
ヌクレオチドであった。該オリゴヌクレオチドを合成後、そのウリジン塩基とテ
トラメチルローダミン(TMR)との反応によって修飾した。
【００６４】 カバーガラスをアセトンできれいにし、窒素下乾燥させることによって調製し
た。1mg/mlの濃度でPBSバッファ中に、再溶解させたビオチン-BSA(Sigma)の50μ
lアリコートをクリーンなカバーガラス上に添加した。MilliQ水で5回洗浄し、窒
素下乾燥させることによって過剰のビオチン-BSAを除去した。非蛍光性のストレ
プトアビジンで官能基化した、直径500nmのポリスチレン・ラテックスマイクロ
スフェアーを100mM NaCl中、0.1固体にまで希釈し、そして前記ビオチン化カバ
ーガラス上に1μl滴、落とした。そのマイクロスフェアーを１時間、乾燥させ、
そして結合していないビーズをMilliQ水で5回洗浄して除去した。この手順によ
って、約1小球/100μm x 100μmの表面被覆がもたらされた。
【００６５】 前記非蛍光性マイクロスフェアーは、514nmの励起波長でおそらくそのコロイ
ド性調製物中の少量の光活性な成分から生じる、幅広い残留蛍光を有することが
見出された。そのため、調製したカバーガラスを２倍周波数(532nm)Nd:YAGパル
ス色素レーザーのレーザー・ビーム中で１時間、処理することによってマイクロ
スフェアーを光退色した。
【００６６】 前記マイクロスフェアーの上にわたって沈積させた0.1pM DNA(100mM NaClと10
0mM Tris中に希釈)の50μl試料をインキュベートすることによって、ビオチン化
13-TMRssDNAを前記ストレプトアビジンで官能基化したマイクロスフェアーにカ
ップリングさせた。カバーガラスの表面をMilliQ水で5回洗浄することによって
未結合ＤＮＡを除去した。
【００６７】 レーザーのスイッチをいれたとき、マイクロスフェアーが回折限界焦点の中心
に位置されるように、顕微鏡集光レンズからの低光度レベルの照明を用いて、10
倍率でマイクロスフェアーを視覚的に位置付けた。その後、集光レンズを消し、
そして光路を蛍光検出口へとスイッチした。ＭＣＳを始動させ、ラテックス球か
ら出る蛍光を１つ、または両方のチャンネルで測定した。試料を514nmで励起し
、そして検出は600nmのチャンネルで行った。
【００６８】 図３は、スキャンの開始0.5秒後、AOMによって顕微鏡にレーザーが逸らされる
と、蛍光がオンになることを明らかに示している。蛍光強度は、短期間の間比較
的一定(100ms〜3s)のままであり、単一段階プロセスで消失する。これらの結果
は、単一分子の検出が起きていることを示すものである。この単一段階光退色は
、その蛍光が単一分子からのものであるという明白な証拠である。
【００６９】 （実施例２） ガラスへの直接共有結合による単一分子アレイの調製と、それに続く該アレイ
へのハイブリダイゼーションの実例を本実施例は示す。
【００７０】 共有結合的に修飾されたスライドを以下のようにして調製した。Spectrosil-2
000スライド(TSL,UK)をmilli-Q中でリンスし、塵埃を取り除き、そして純Decon-
9を含むビンの中に置き、室温で12時間放置した。そのスライドをmilli-Qでリン
スし、15%グリシドキシプロピルトリメトキシシランのmilli-Q溶液を含むビンの
中に置き、室温で4時間磁気的に攪拌し、milli-Qでリンスし、そして窒素中、乾
燥して、エポキシドで被覆した表面をあらわにした。
【００７１】 使用したＤＮＡは、配列番号２（配列表を参照）で表されるものであったが、
そこではｎによって、リンカーを介してｎ４位に結合したTMR基を有する５−メ
チルチトシン(Cy5)が示される。
【００７２】 この試料(5μl、450pM)を純milli-Q中の溶液として塗った。
【００７３】 ＤＮＡ溶液を湿った雰囲気下、室温で12時間放置して、前記エポキシド表面に
結合させた。スライドをmilli-Qでリンスし、そして窒素中で乾燥した。
【００７４】 調製されたスライド類は、フォイルに包んで乾燥器中、少なくとも１週間目立
つ汚染、または結合物質の損失が全くなしに貯蔵できる。同一配列と発蛍光団を
有するが、5'アミノ基のない対照ＤＮＡは、同一濃度で塗られたとき、安定な被
覆をほとんど示さない。
【００７５】 その後、TMRで標識したスライドを相補的ＤＮＡ（配列番号３）(5μM、10μl)
の100mM PBS溶液で処理した。その相補的ＤＮＡは、配列番号３で表される配列
を有し、そこでnはメチルシトシン基を示す。
【００７６】 室温で１時間後、前記スライドを4℃に冷却し、24時間放置した。最後に、ス
ライドをPBS(100mM、1mL)中、洗浄し、そして窒素下、乾燥した。
【００７７】 試料領域上のカバーガラスを両側から予め硬化させた顕微鏡封入剤(Eukitt,O.
Kindler GmbH&Co., Freibrg, Germany)で密封しながら、スライドとカバーガラ
スの間に200μm以下のギャプを維持して、該スライド上にチェンバーを構築した
。そのチェンバーを100μlのPBS(100mM NaCl)で３回流し、そして蛍光顕微鏡で
分析する前に、5分間安定化させた。
【００７８】 チェンバー・カバーガラスが油入インターフェイスを介して倒立顕微鏡(Nikon
TE200)の対物レンズに接触するようにスライドを倒立した。60°溶融シリカ分
散プリズムをスライドの裏面にグリセリンの薄膜を介して光学的につないだ。ガ
ラス／試料インターフェイスにおいてスライドの法線に対してレーザ光が約68度
の角度をなし、続いて全反射(TIR)を受けるようにプリズムに指向させた。ガラ
ス／水インターフェイスの臨界角は、66度である。
【００７９】 TIRに続く表面特異的なエバネッセント波での励起によって生成するDNA-TMRま
たはDNA-Cy5の単一分子からの蛍光を顕微鏡の対物レンズによって収光し、補力
電荷結合素子(CCD)カメラ(Pentamax,PrincetonInstruments,NJ)上に画像化する
。TMR用580nm蛍光フィルター(580DF30, Omega Optics, USA)を用いる532nm励起
（２倍周波数ソリッドステートNd:YAG, Antares, Coherent）と、Cy5用670nmフ
ィルター(670DF40, Omega Optics, USA)を用いる630nm励起（nd:YAGポンプ色素
レーザー, Coherent700）との組み合わせを用いて、２つの画像を記録した。画
像は、ICCD上最大増幅度10で、500msの露光時間を用いて、記録した。プリズム
へ入射するレーザー出力は、532nm、630nmにおいてそれぞれ50mWと40mWであった
。第３の画像を532nm励起と670nm検出で撮像し、TMRからCy5チャンネルへのクロ
ストークのレベルを測定した。
【００８０】 バックグランドの強度の３倍より大きい平均強度を有する蛍光の単一点によっ
て単一分子を確認した。単一分子の蛍光は、典型的に100x倍率で、3x3マトリッ
クスの数個の画素に局限され、そして狭いガウス様の強度プロフィールをもつ。
また、単一分子蛍光は、強度の時間経過のなかでの１段階の光退色プロセスによ
って特徴づけられ、多段階プロセスを示す２個以上の分子を含む画素領域の単一
分子から識別するのに用いられた。図4aおよび4bは、出発濃度45pmと450pmのDNA
-TMRで共有結合的に修飾したスライド60x60μm2の蛍光像を示す。図4cは、上記
のように、但し5'アミノ修飾を欠くDNA-TMRで処理した対照スライドを示す。
【００８１】 分子を計数するのに、まずバックグランド・ノイズを除くために蛍光強度の閾
値を設定する。対照試料について、そのバックグランドは実質的にICCDの熱ノイ
ズであり、それはわずか6カウントの標準偏差を有する76カウントと測定されて
いる。閾値を恣意的に前記バックグランド、１つの画像についての平均カウント
、および１つの画像についての標準偏差の線形結合として選択する。一般的に、
後２者の数値がバックグランド以上である画素の数の尺度と強度の範囲を提供す
る。この方法によって、ノイズが貢献しているのが144画素中1以下である確率を
有し、少なくともバックグランドより12標準偏差以上である閾値レベルをもたら
す。単一分子蛍光点を少なくとも2x2マトリックスの画素であり、7x7より大きく
ないと定義することによって、単一バックグランド画素が計数に貢献する可能性
を排除し、そしてクラスタを無視する。
【００８２】 このようにして、DNA-TMRの単一分子の表面密度が45pMと450pMのDNA-TMRカッ
プリング濃度で、2.9x106分子／cm2(図4a中、238分子)および5.8x106分子／cm2(
図4b中、469分子)と測定される。前記密度は、明らかにはDNA濃度に直接比例し
ないが、該濃度、添加した試料の容積、試料によって被覆される面積、インキュ
ベーション時間のある関数であろう。非特異的に結合したDNA-TMRおよび不純物
のパーセンテージが画像あたり3〜9%程度貢献する(図4c中、8個の非特異的に結
合した分子)。光退色プロフィールの分析によって、蛍光点の6%だけが1分子以上
含むと示される。
【００８３】 ２つの画像の重ね合わせに続いてTMRとCy-5の単一分子からの蛍光の別々の点
を共に局在化することによってハイブリダイゼーションを確認した。図5aおよび
5bは、TMRで標識され、表面に結合した20-merとCy5で標識され、溶液から沈殿し
たその相補的な20-merの画像を示す。図5dは、前記２つの画像上に共局在化され
た蛍光点を示す。ハイブリダイゼーションの程度は、表面結合DNAの7%と推定さ
れた（図5dと5aそれぞれからの141点中の10共局在化点）。ハイブリダイズしたD
NAのパーセンテージは、全ての表面吸着DNA-Cy5の37%（図5dと5bそれぞれからの
27点中の10共局在化点）と推定された。蛍光点の大きさと強度を、バックグラン
ドノイズおよび宇宙線から単一分子を分離する閾値の基準と対比することにより
単一分子群を計数した。図5dは、TMRからCy-5チャンネルへのクロストークのレ
ベルを示し、TMR単一分子蛍光を決定するための基準内（図5cと5aそれぞれから
の141点中の2蛍光点）に入る蛍光点のみを計数することによって決めると2%であ
る。
【００８４】 本実施例によって単一分子アレイが形成でき、そして本発明に従って、ハイブ
リダイゼーション事象を決定できることが実証される。プロセスの効率を改善す
るのに変更がなされうると、当業者が理解することは予期されることである。例
えば、改善された洗浄ステップ（すなわち、フローセルを用いる）は、バックグ
ランドノイズを減らし、より濃度の高い溶液が使用できるようにするだろう。さ
らに、温度、緩衝液、時間等のパラメータを変化させハイブリダイゼーション・
プロトコルを適合させることもできる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のアレイを撮像するのに用いる装置の模式図である。
【図２】 ポリヌクレオチドの固体表面への微小粒を介しての固定化を例示する図である
。
【図３】 ５１４ｎｍ励起と６００ｎｍ検出とを用いる発蛍光団で標識された単一オリゴ
ヌクレオチドの蛍光の経時図である。
【図４】 共有結合的に固体表面に取りつけられた、蛍光標識単一分子ＤＮＡを示す。
【図５】 相補的な配列とハイブリダイズした、表面結合オリゴヌクレオチドの画像であ
る。
【符号の説明】
１…検出器、２…帯域フィルター、３…ピンホール、４…ミラー、５…レーザ
ー・ビーム、６…ダイクロイック・ミラー、７…対物レンズ、８…カバーガラス
、９…試料
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 クレナーマン， デイヴィッド イギリス， ケンブリッジ シービー２ １イーダブリュー， レンスフィールド ロード （番地なし）， デパートメント オブ ケミストリー， ユニヴァーシテ ィ オブ ケンブリッジ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA12 HA13 4B029 AA23 BB20 CC03 4B063 QA01 QA13 QQ06 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR41 QR42 QR48 QR56 QR62 QR66 QR84 QS03 QS25 QS34 QS36 QS39 QX02

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インテロゲーションが可能であり、かつ固体表面に固定化さ
    れた分子群のアレイを含み、該アレイは該分子群を個別に解像可能にする表面密
    度を有し、そして各分子が前記表面との特異的な相互作用によって、インテロゲ
    トされうる各分子のその部分以外で、１つ以上の箇所に固定化されていることを
    特徴とする装置。
  2. 【請求項２】 少なくとも５０％の前記アレイ分子群は、個別に解像される
    ことが可能であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】 少なくとも９０％の前記アレイ分子群は、個別に解像される
    ことが可能であることを特徴とする、請求項２に記載の装置。
  4. 【請求項４】 ５０％以上のアレイ分子群が区別されうることを特徴とする
    、上記請求項のいずれか１項に記載の装置。
  5. 【請求項５】 アレイ分子群が光学顕微鏡によって解像可能であることを特
    徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
  6. 【請求項６】 アレイが少なくとも１０ｎｍｘ１０ｎｍ当たり１分子の表面
    密度を有することを特徴とする、上記の請求項のいずれか１項に記載の装置。
  7. 【請求項７】 前記表面密度が少なくとも１００ｎｍｘ１００ｎｍ当たり１
    分子であることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
  8. 【請求項８】 前記表面密度が少なくとも２５０ｎｍｘ２５０ｎｍ当たり１
    分子であることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
  9. 【請求項９】 各分子がビオチンにコンジュゲートされ、かつストレプトア
    ビジンまたはアビジンとの相互作用によって固定化されていることを特徴とする
    、上記の請求項のいずれか１項に記載の装置。
  10. 【請求項１０】 各分子がマイクロスフェアーを介して固定化されているこ
    とを特徴とする、上記の請求項のいずれか１項に記載の装置。
  11. 【請求項１１】 前記マイクロスフェアーが機能的なアビジンまたはストレ
    プトアビジンを持ち、そして固体表面がそれに結合したアビジンを有することを
    特徴とする、請求項１０に記載の装置。
  12. 【請求項１２】 分子群が共有結合を介して固定化されていることを特徴と
    する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置。
  13. 【請求項１３】 各分子が発蛍光団にコンジュゲートされていることを特徴
    とする、上記請求項のいずれか１項に記載の装置。
  14. 【請求項１４】 分子群が５'末端、３'末端、または内部ヌクレオチドを介
    して固体支持体に固定化たポリヌクレオチド群であることを特徴とする、上記請
    求項のいずれか１項に記載の装置。
  15. 【請求項１５】 少なくとも１つのアレイヌクレオチドがそれにハイブリダ
    イズした第２のヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項１４に記載の装
    置。
  16. 【請求項１６】 前記アレイポリヌクレオチドが既知の配列であることを特
    徴とする、請求項１４または１５に記載の装置。
  17. 【請求項１７】 アレイポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な第２のポ
    リヌクレオチド分子の捕捉のために、該第２のポリヌクレオチドを含むか、また
    は含むと疑われる試料をハイブリダイゼーション条件下、前記装置と接触させる
    ことからなることを特徴とする、請求項１４に記載の装置の使用。
  18. 【請求項１８】 前記試料が装置との接触を解除され、それによってアレイ
    ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記第２のポリヌクレオチドを試料から
    分離することを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
  19. 【請求項１９】 単一分子との相互作用をモニターするために、アレイ分子
    を画像素子で解像することからなる、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の
    装置の使用。
  20. 【請求項２０】 前記アレイ分子が繰り返し相互作用を受け、その各々の相
    互作用がモニターされることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
  21. 【請求項２１】 分子群の混合物を固体表面に固定化することを含み、そこ
    で該分子群を個別に解像可能にする表面密度を有するアレイを形成することを特
    徴とする、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の装置を製造する方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の装置上に固定化
    した複数のポリヌクレオチド分子の配列を決定することを含むことを特徴とする
    、空間的にアドレス可能なアレイを形成する方法。
  23. 【請求項２３】 さらにポリヌクレオチド分子を前記アレイ上の固定化した
    その相補体にハイブリダイズさせるステップを含むことを特徴とする、請求項２
    ２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記固定化したポリヌクレオチドをプライマー、ポリメラ
    ーゼおよび異なるヌクレオチド三リン酸類と、ポリメラーゼ反応が進行するのに
    充分な条件下、反応させるステップと、そこで各ヌクレオチド三リン酸がその３
    '位で光学的に特定可能な異なる標識にコンジュゲートされており、いずれの標
    識（すなわち、いずれのヌクレオチド）が重合反応を受けるかを決定するステッ
    プと、該標識を取り除くステップの繰り返し含むことを特徴とする、請求項２２
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 各標識が発蛍光団であることを特徴とする、請求項２４に
    記載の方法。
  26. 【請求項２６】 適当な条件下、第２分子群の空間的にアドレスされたアレ
    イを第１分子群と接触させること、そして結合事象を決定し、そこで前記アレイ
    が請求項１乃至１６のいずれか１項で定義されていることを含むことを特徴とす
    る複数の第１分子群を特徴づける方法。
  27. 【請求項２７】 前記第１の分子群が検出可能なタグを含むことを特徴とす
    る、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記タグが発蛍光団であることを特徴とする、請求項２７
    に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記タグがポリヌクレオチドであることを特徴とする、請
    求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ポリヌクレオチド配列が決定されることを特徴とする
    、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記ポリヌクレオチドタグは、前記配列が決定された後に
    取り除かれることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 生物を特徴づける方法であって、固体支持体に固定化した
    ポリヌクレオチド分子群の定義されたアレイを生物のゲノムＤＮＡの複数の断片
    と、ハイブリダイゼーション条件下接触させるステップと、いかなるハイブリダ
    イゼーション事象でも検出し、区別できるハイブリダイゼーションパターンを得
    るステップとを含み、さらに該アレイは、請求項１３乃至１５のいずれか１項に
    定義されていることを特徴とする方法。
  33. 【請求項３３】 前記生物がヒトであることを特徴とする、請求項３２に記
    載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記生物が細菌、またはウイルスであることを特徴とする
    、請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ゲノムＤＮＡの断片が検出できるように標識されてい
    ることを特徴とする、請求項３２乃至３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記標識が発蛍光団であることを特徴とする、請求項３５
    に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 アレイが複数の凹部を有し、その各凹部が１つのポリヌク
    レオチド分子を含む、固体支持体からなることを特徴とする、請求項２２乃至３
    ６のいずれか１項に記載の方法。
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