DE69928265T2

DE69928265T2 - Matrizen von biomolekülen und ihre verwendung in sequenzierung

Info

Publication number: DE69928265T2
Application number: DE69928265T
Authority: DE
Inventors: Shankar Balasubramanian; David Klenerman; Colin Barnes; Mark Allen Osborne
Original assignee: Solexa Ltd Great Britain
Current assignee: Solexa Ltd Great Britain
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: IL141148A0; AU770831B2; ATE309390T1; JP2002521064A; AU5178799A; CA2339121A1; WO2000006770A1; EP1105529A1; IS5831A; EP1105529B1; US20050042649A1; DE69928265T3; DE69928265D1; EP1105529B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf gefertigte Molekülarrays und ihre analytischen Anwendungsmöglichkeiten. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung gefertigter Arrays bei Verfahren zur Gewinnung genetischer Sequenzinformationen.
Stand der Technik
Fortschritte beim Studium von Molekülen ergaben sich teilweise aus Verbesserungen der zur Kennzeichnung der Moleküle oder ihrer biologischen Reaktionen angewandten Technologien. Insbesondere das Studium der Nukleinsäuren, DNA und RNA profitierte von der Entwicklung von Technologien für die Sequenzanalyse und das Studium von Hybridisierungsereignissen.
Ein Beispiel für die Technologien, die das Studium der Nukleinsäuren verbessert haben, ist die Entwicklung gefertigter Arrays immobilisierter Nukleinsäuren. Diese Arrays bestehen typischerweise aus einer hochdichten Matrix aus auf einem festen Trägermaterial immobilisierten Polynukleotiden. Fodor et al., Trends in Biotechnology (1994) 12:19–26 beschreiben Möglichkeiten zur Konstruktion von Nukleinsäurearrays mittels einer chemisch sensibilisierten Glasfläche, die zwar durch eine Maske geschützt ist, an bestimmten Stellen jedoch zur Befestigung geeignet modifizierter Nukleotide bloßliegt. Typischerweise können diese Arrays als „Vielmolekül"-Arrays beschrieben werden, da auf dem festen Träger eindeutige Bereiche mit einer hohen Dichte eines speziellen Polynukleotidtyps ausgebildet sind.
Ein alternativer Ansatz wird von Schena et al., Science (1995) 270:467–470 beschrieben; dabei werden DNA-Proben mit Hilfe von Robotermikropipettiertechniken an zuvor bestimmten Stellen auf einem gläsernen Mikroskopobjektträger positioniert. Die DNA wird mittels nicht-kovalenter elektrostatischer Wechselwirkungen entlang ihrer gesamten Länge an der Glasfläche befestigt. Zwar kann eine Hybridisierung mit komplementären DNA-Sequenzen erfolgen, dieser Ansatz darf jedoch nicht gestatten, dass die DNA für eine Wechselwirkung mit anderen Komponenten wie z.B. Polymeraseenzymen, DNA-Bindungsproteinen, usw. frei zur Verfügung steht.
Die Arrays dienen für gewöhnlich dem Studium von Hybridisierungsereignissen, der Bestimmung der DNA-Sequenz (Mirzabekov, Trends in Biotechnology (1994) 12:27–32) bzw. dem Nachweis von Mutationen in einer bestimmten DNA-Probe. Viele dieser Hybridisierungsereignisse werden mit Hilfe an Nukleotiden angebrachter fluoreszierender Markierungen nachgewiesen, wobei die Markierungen mittels eines empfindlichen Fluoreszenzdetektors, z.B. eines ladungsgekoppelten Detektors (CCD) nachgewiesen werden. Diese Verfahren haben vor allem den Nachteil, dass keine langen DNA-Abschnitte sequenziert werden und Wiederholungssequenzen zu nicht eindeutigen Ergebnissen führen können. Diese Probleme werden in Automation Technologies for Genome Characterisation, Wiley-Interscience (1997), Hrsg. T.J. Beugelsdijk, Kapitel 10: 205–225 erkannt.
Darüber hinaus kann die Verwendung hochdichter Arrays in einem mehrstufigen Analyseverfahren zu Problemen bei der Phasierung führen. Phasierungsprobleme entstehen, wenn ein Reaktionsschritt auf verschiedenen Molekülen des Arrays nicht synchron abläuft. Unterliegen im Array angeordnete Moleküle einem Verfahrensschritt nicht, stimmen die nachfolgenden Ergebnisse dieser Moleküle mit den Ergebnissen der anderen im Array angeordneten Moleküle nicht mehr überein. Der Anteil der nicht phasensynchronen Moleküle nimmt während der nachfolgenden Schritte zu, so dass die ermittelten Ergebnisse dementsprechend mehrdeutig werden. Dieses Problem wird in dem in der US-A-5302509 beschriebenen Sequenzierungsverfahren erkannt.
Ein alternativer Sequenzierungsansatz ist in der EP-A-0381693 offenbart und umfasst die Hybridisierung eines fluoreszierend markierten DNA-Strangs mit einer Target-DNA- Probe, die in einem fließenden Probenstrom suspendiert ist, sowie den anschließenden Einsatz einer Exonuklease zur wiederholten Spaltung der Endbase von der hybridisierten DNA. Die gespaltenen Basen werden beim nachfolgenden Fluss durch einen Detektor nachgewiesen, was eine Rekonstruktion der DNA-Basensequenz ermöglicht. An jedem der verschiedenen Nukleotide ist eine eindeutige fluoreszierende Markierung angebracht, die mittels laser-induzierter Fluoreszenz nachgewiesen wird. Dabei handelt es sich um ein komplexes Verfahren, hauptsächlich weil es schwierig ist sicherzustellen, dass alle Nukleotide des DNA-Stranges markiert sind und dies getreu der Originalsequenz erfolgt ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Erkenntnis, dass Molekülarrays mit einer für eine eindeutige optische Auflösung ausreichenden Trennung zwischen den Molekülen hergestellt werden können. Die Arrays können gebildet werden, indem ein Molekülgemisch so auf einer festen Fläche immobilisiert wird, dass die Moleküle ausreichend voneinander getrennt sind, so dass alle Moleküle optisch aufgelöst werden können.
Erfindungsgemäß umfasst eine Vorrichtung ein Array abrufbarer und auf einer festen Fläche immobilisierter Moleküle, wobei das Array eine Oberflächendichte besitzt, die eine Auflösung jedes einzelnen Moleküls z.B. durch Lichtmikroskopie erlaubt, und wobei jedes Molekül im Gegensatz zu demjenigen Teil des Moleküls, das abgerufen werden kann, durch eine spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche an einem oder mehreren Punkten immobilisiert ist. Daher umfassen die erfindungsgemäßen Arrays de facto räumlich eindeutigere Einzelmoleküle als die Arrays aus dem Stand der Technik. Dies hat für das Studium der Moleküle und ihrer Wechselwirkung mit anderen biologischen Molekülen viele bedeutende Vorteile. Insbesondere können Fluoreszenzereignisse jedes einzelnen Moleküls mit Hilfe eines mit einem empfindlichen Detektor verbundenen Lichtmikroskops nachgewiesen werden, was zu einem eindeutigen Signal für jedes Molekül führt.
Bei der mehrstufigen Analyse einer Einzelmolekülpopulation werden Phasierungsprobleme, wie sie bei hochdichten Arrays aus dem Stand der Technik auftreten, vermieden. Daher erlauben die neuartigen Arrays auch einen massiv parallelen Ansatz zur Überwachung von Fluoreszenz- oder anderen Ereignissen auf den Molekülen. Aufgrund dieser massiv parallelen Datensammlung sind die Arrays für eine breite Palette von Analyseverfahren äußerst nützlich, z.B. für das Durchsuchen/Kennzeichnen heterogener Molekülgemische. Die Arrays können zur Kennzeichnung einer bestimmten synthetischen chemischen oder biologischen Einheit verwendet werden, z.B. bei Durchsuchungsverfahren zur Identifizierung bestimmter, in kombinatorischen Synthesereaktionen erzeugter Moleküle.
Die im Array angeordneten Moleküle können mittels Mikrokugeln auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Mikrokugel kann leicht sichtbar gemacht werden, was ihre Positionierung in einem eindeutig optisch auflösbaren Bereich einer Mikrokugel vor der Durchführung weiterer Analyseverfahren erlaubt.
Die Arrays können bei vielen verschiedenen Analyseverfahren bzw. Kennzeichnungsstudien eingesetzt werden. In einer Ausführungsform sind die Moleküle Polynukleotide und die Arrays erlauben die Durchführung von Sequenzbestimmungen.
Allgemein kann jedes Sequenzierungsverfahren eingesetzt werden, das sich bei der Identifizierung bestimmter Nukleotide oder Nukleotidsequenzen fluoreszierender oder anderer Markierungen bedient. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst folgende Wiederholungsschritte: Umsetzen eines immobilisierten Target-Polynukleotids mit einem Primer, einer Polymerase und den verschiedenen Nukleosidtriphosphaten unter Bedingungen, die ausreichen, um die Polymerasereaktion vonstatten gehen zu lassen, wobei die einzelnen Nukleosidtriphosphate an ihrer 3'-Endstelle mit einer anderen fluoreszierenden Markierung konjugiert sind, um zu bestimmen, welche Markierung (und damit welches Nukleotid) der Polymerasereaktion unterzogen wurde, und Entfernen der Markierung. Da bei dem Verfahren die erfindungsgemäßen Arrays zur Anwendung kommen, kann jedes eingebaute Nukleotid eindeutig mittels Fluoreszenzmessungen bestimmt werden; darüber hinaus kann das Verfahren zum Nachweis Tausender von Reaktionen gleichzeitig ohne Phasierungsprobleme genutzt werden.
Alternativ können die Arrays bei Genotypisierungsverfahren (wie in Shalon et al., Genome Research (1996) 639–645 offenbart) eingesetzt werden, um einen genetischen „Strichcode" für einen Organismus, Kartographierungsstudien und mRNA-basierte Expressionsüberwachung (wie in Wodicka et al., Nat. Biotechnol. (1997) 15:1359 offenbart) zu erzeugen. Die Arrays können auch, wie in Analytical Chemistry (1998) 70:1242–1248 offenbart, als Sensor eingesetzt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren das Kontaktieren eines erfindungsgemäßen immobilisierten Polynukleotid-Arrays mit zuvor bestimmter Sequenz mit einer Mehrzahl von Target-Molekülen, die sich an die im Array angeordneten Polynukleotide binden können, unter geeigneten Bedingungen sowie den Nachweis eines Bindungsereignisses und damit die Bestimmung der Position eines gebundenen Moleküls auf dem Array. Dieses Verfahren erlaubt die Identifizierung von Molekülen, die durch kombinatorische chemische Reaktionen und den Einbau z.B. einer Polynukleotid-Identifizierungskennzeichnung synthetisiert wurden.
Ein weiteres Verfahren umfasst die Schritte des Kontaktierens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Arrays mit einer Mehrzahl nachweisbar markierter Fragmente der Genom-DNA eines Organismus unter Hybridisierungsbedingungen sowie des Nachweises von Hybridisierungsereignissen. Der Organismus kann ein Säugetier, insbesondere ein Mensch, oder alternativ eine Bakterie oder ein Virus sein. Dieses Verfahren erlaubt die Durchführung einer Genotypisierungsanalyse.
Ein erfindungsgemäßes Array kann zur Erzeugung eines räumlich adressierbaren Arrays aus einzelnen Polynukleotidmolekülen verwendet werden. Dies ist die einfache Folge der Array-Sequenzierung. Die Vorteile eines solchen räumlich adressierbaren Arrays sind insbesondere folgende:

1) Polynukleotidmoleküle auf dem Array können als Identifizierungskennzeichnungen dienen und nur 10–20 Basen lang sein; der für die Sequenzierungsschritte notwendige Wirkungsgrad muss nur mehr als 95% betragen.
2) Die Arrays können nach ihrer Herstellung und Sequenzierung für die Durchsuchung wiederverwendbar sein. Alle möglichen Sequenzen können auf ganz einfache Weise hergestellt werden, z.B. durch Vergleich mit einem mittels Photolithographie hergestellten hochdichten DNA-Chip.

Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zur Bildgebung der erfindungsgemäßen Arrays verwendet werden kann;
2 veranschaulicht die Immobilisierung eines Polynukleotids auf einer festen Fläche mittels einer Mikrokugel;
3 stellt ein Fluoreszenzzeitprofil eines einzelnen, mit einem Fluorophor markierten Oligonukleotids mit Anregung bei 514 nm und Nachweis bei 600 nm dar;
4 stellt die DNA eines fluoreszierend markierten, an einer festen Fläche kovalent befestigten einzelnen Moleküls dar; und
5 stellt Aufnahmen der an die Oberfläche gebundenen und mit der Komplementärsequenz hybridisierten Oligonukleotide dar.
Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß muss das auf der Oberfläche eines festen Trägers immobilisierte Einzelmolekül z.B. mit Hilfe optischer Mittel einzeln aufgelöst werden können. Das bedeutet, dass es innerhalb des auflösbaren Bereiches der speziell verwendeten Bildgebungsvorrichtung ein oder mehrere eindeutige, jeweils ein Molekül darstellende Bilder geben muss. Typischerweise werden die Moleküle des Arrays mit Hilfe eines Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops mit einem empfindlichen Detektor, z.B. einem ladungsgekoppelten Detektor (CCD) aufgelöst, wobei alle Moleküle des Arrays gleichzeitig analysiert werden.
Die Moleküle des Arrays können jedes Biomolekül inklusive Peptide und Polypeptide sein, insbesondere aber DNA-, RNA- und Nukleinsäuremimetika wie PNA und 2'-O-methRNA. Es können aber auch andere organische Moleküle verwendet werden. Die Moleküle werden auf dem Array ausgebildet, um eine Wechselwirkung mit anderen „verwandten" Molekülen zu erlauben. Es ist daher wichtig, die Moleküle so zu immobilisieren, dass der Anteil des Moleküls, der nicht zu dessen Immobilisierung verwendet wird, durch ein verwandtes Molekül abgefragt werden kann. Bei einigen Anwendungszwecken sind alle Moleküle eines einzelnen Arrays gleich und können Moleküle abfragen, die im Wesentlichen verschieden sind. Bei anderen Anwendungszwecken sind die Moleküle auf dem Array im Wesentlichen verschieden (die Moleküle unterscheiden sich z.B. um mehr als 50%, vorzugsweise um mehr als 70% voneinander).
Die erfindungsgemäßen Arrays sind Einzelmolekülarrays. Der Begriff „Einzelmolekül" wird hierin verwendet, um ein Molekül zu bezeichnen, das (ungeachtet dessen, ob die Moleküle gleich oder verschieden sind) separat von den Nachbarmolekülen sichtbar gemacht wird.
Der Begriff „einzeln aufgelöst" wird hierin verwendet, um zu spezifizieren, dass ein Molekül auf dem Array bei Sichtbarmachung von seinen Nachbarmolekülen unterschieden werden kann. Die Sichtbarmachung erfolgt mit Hilfe von Reportermarkierungen, z.B. Fluorophoren, deren Signal einzeln aufgelöst wird.
Der Begriff „verwandtes Molekül" wird hierin verwendet, um ein Molekül zu bezeichnen, das mit dem im Array angeordneten Molekül in Wechselwirkung treten und es abfragen kann. Das verwandte Molekül kann ein Molekül sein, das sich in einer Hybridisierungsreaktion spezifisch an das im Array angeordnete Molekül bindet, z.B. ein komplementäres Polynukleotid. Alternativ kann sich das verwandte Molekül unspezifisch an das im Array angeordnete Molekül binden, z.B. ein Polymeraseenzym, das sich bei der Synthese eines Komplementärstranges an ein im Array angeordnetes Polynukleotid bindet.
Der Begriff „abfragen" wird hierin verwendet, um eine Wechselwirkung des im Array angeordneten Moleküls mit einem anderen Molekül zu bezeichnen. Die Wechselwirkung kann kovalent oder nicht-kovalent sein.
Die Begriffe „im Array angeordnete Polynukleotide" und „Polynukleotid-Arrays" werden hierin verwendet, um ein Array aus Einzelmolekülen zu definieren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polynukleotidmolekül umfassen. Der Begriff soll die Befestigung anderer Moleküle an einer festen Fläche einschließen, wobei die Moleküle mit einem an ihnen befestigten Polynukleotid weiter abgefragt werden können. Die Arrays können beispielsweise auf einer festen Fläche immobilisierte Proteinmoleküle sein, wobei die Proteinmoleküle, die mit einem kurzen Polynukleotidmolekül konjugiert oder anderweitig verbunden sind, abgefragt werden können, um das Array zu adressieren.
Das Ausmaß der Trennung zwischen den einzelnen Molekülen auf dem Array wird teilweise mit Hilfe der für die Auflösung des Einzelmoleküls angewandten speziellen Technik bestimmt. Dem Fachmann sind Bildgebungsvorrichtungen für Molekülarrays bekannt. Zum Abtasten der Oberfläche des Arrays mit einem Laser zur direkten Bildgebung eines Fluorophors auf dem Einzelmolekül mittels Fluoreszenz kann beispielsweise, wie in 1 dargestellt, ein konfokales Rastermikroskop verwendet werden. In 1 ist (1) ein Detektor, (2) ein Bandfilter, (3) ein Pinhole, (4) ein Spiegel, (5) ein Laserstrahl, (6) ein doppelfarbiger Spiegel, (7) ein Objektiv, (8) ein Deckglas und (9) die zu untersuchende Probe. Alternativ kann ein empfindlicher 2-D-Detektor, z.B. ein ladungsgekoppelter Detektor eingesetzt werden, um ein 2-D-Bild zu erzeugen, das die einzelnen Moleküle auf dem Array darstellt. In diesem Beispiel ist die Auflösung einzelner Moleküle auf dem Array möglich, wenn die Moleküle durch einen Abstand von ungefähr mindestens 250 nm × 250 nm, vorzugsweise mindestens 300 nm × 300 nm und noch bevorzugter mindestens 350 nm × 350 nm getrennt sind.
Es sind jedoch andere Techniken wie z.B. die optische Nahfeldrastermiskroskopie (SNOM) verfügbar, die kleinere optische Auflösungen ermöglichen und so die Verwendung „dichterer" Arrays erlauben. Bei Anwendung von SNOM können die Moleküle z.B. durch einen Abstand von weniger als 100 nm, z.B. 10 nm × 10 nm getrennt sein (Beschreibung der optischen Nahfeldrastermikroskopie siehe Moyer et al., Laser Focus World (1993) 29(10)).
Darüber hinaus eignen sich die Techniken der Rastertunnelmikroskopie (Binnig et al., Helvetica Physica Acta (1982) 55:726–735) und der Atomkraftmikroskopie (Hanswa et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (1994) 23:115–139) zur Bildgebung der erfindungsgemäßen Arrays. Andere Vorrichtungen, die nicht auf Mikroskopie basieren, können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt sie können an einzelnen Stellen auf einem festen Träger ein Bild erzeugen.
Einzelne Moleküle können durch Immobilisierung auf der Oberfläche eines festen Trägers in einem Array angeordnet werden. Dies kann mittels bekannter Techniken erfolgen, vorausgesetzt es herrschen geeignete Bedingungen, um eine adäquate Trennung der Moleküle sicherzustellen. Allgemein wird das Array hergestellt, indem kleine Volumina einer ein Molekülgemisch enthaltenden Probe auf eine geeignet vorbereitete feste Fläche abgegeben werden oder eine verdünnte Lösung auf die feste Fläche aufgetragen wird, um ein Zufallsarray zu erzeugen. Auf diese Weise kann ein Gemisch verschiedener Moleküle mit Hilfe einfacher Mittel in einem Array angeordnet werden. Die Ausbildung des Einzelmolekülarrays erlaubt dann die Identifizierung der einzelnen im Array angeordneten Moleküle.
Es ist wichtig, den festen Träger unter Bedingungen herzustellen, die die Gegenwart von Verunreinigungen minimieren bzw. vermeiden. Der feste Träger muss, vorzugsweise mit einem geeigneten Reinigungsmittel wie Decon-90, gründlich gereinigt werden, um Staub und andere Verunreinigungen zu entfernen.
Die Immobilisierung kann mittels einer spezifischen kovalenten oder nicht-kovalenten Wechselwirkung erfolgen. Ist das Molekül ein Polynukleotid, erfolgt die Immobilisierung vorzugsweise entweder an der 5'-Position oder der 3'-Position, so dass das Polynukleotid nur an einem Ende an dem festen Träger befestigt ist. Das Polynukleotid kann jedoch in jeder Position entlang seiner Länge an dem festen Träger befestigt werden, wobei die Befestigung dazu dient, das Polynukleotid an den festen Träger zu binden. Das immobilisierte Polynukleotid kann dann an von dem festen Träger entfernten Positionen mit anderen Molekülen oder verwandten Molekülen in Wechselwirkung treten. Typischerweise erfolgt die Wechselwirkung so, dass durch unspezifische Wechselwirkung wie Waschen an den festen Träger gebundene Moleküle entfernt werden können. Auf diese Weise führt die Immobilisierung zu gut getrennten Einzelmolekülen. Der Vorteil dabei ist, dass eine Wechselwirkung zwischen Nachbarmolekülen auf dem Array, die ein Abfragen des Arrays behindern könnte, verhindert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Oberfläche eines festen Trägers zunächst mit Streptavidin oder Avidin beschichtet und anschließend an einzelnen Stellen auf der Oberfläche z.B. mit Hilfe einer Nanoliter-Abgabevorrichtung zur Abgabe von durchschnittlich einem Molekül pro Stelle mit einer verdünnten Lösung eines biotinylierten Moleküls versetzt. Ist das Molekül ein Polynukleotid, kann die Immobilisierung mittels Hybridisierung mit einem zuvor an dem festen Träger befestigten komplementären Nukleinsäuremolekül erfolgen. Die Oberfläche eines festen Trägers kann z.B. zunächst an einzelnen Stellen mit einem Primer-Polynukleotid beschichtet werden. Anschließend werden einsträngige Polynukleotide mit den im Array angeordneten Primern unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht; dann lässt man sie sich auf dem Array "selbst sortieren". Auf diese Weise können die Arrays zur Trennung der gewünschten Polynukleotide aus einer heterogenen Polynukleotidprobe eingesetzt werden.
Alternativ können die im Array angeordneten Primer aus doppelsträngigen Polynukleotiden mit einem einsträngigen Überhang ("klebrige Enden") bestehen. Dann erfolgt die Hybridisierung mit Target-Polynukleotiden und eine DNA-Ligase verbindet die Target-DNA kovalent mit dem Primer. Anschließend kann der zweite DNA-Strang unter Schmelzbedingungen entfernt werden, so dass ein im Array angeordnetes Polynukleotid zurückbleibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die feste Fläche mit einem Epoxid beschichtet und die Moleküle mit Hilfe einer Aminbindung gekoppelt. In der Lösung, die das im Array anzuordnende Molekül enthält, wird Salz vorzugsweise vermieden oder reduziert. Eine Reduktion der Salzkonzentration minimiert die Möglichkeit einer Aggregation der Moleküle in der Lösung, was die Positionierung auf dem Array beeinträchtigen kann.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Target-Moleküle, wie in 2 dargestellt, auf Latexmikrokugeln aus nicht-fluoreszierendem Streptavidin oder avidin funktionalisiertem Polystyrol immobilisiert. In 2 ist (1) die Mikrokugel, (2) ein Streptavidinmolekül, (3) ein Biotinmolekül und (4) ein fluoreszierend markiertes Polynukleotid. Die Mikrokugeln wiederum werden auf einem festen Träger immobilisiert, um die Target-Probe für die mikroskopische Analyse zu fixieren. Alternative, für die erfindungsgemäße Verwendung geeignete Mikrokugeln sind im Stand der Technik bekannt.
Die Einzelmolekülarrays haben zahlreiche Anwendungszwecke bei Verfahren, die auf dem Nachweis biologischer oder chemischer Wechselwirkungen mit den im Array angeordneten Molekülen basieren. Die Arrays können z.B. zur Bestimmung der Eigenschaften oder Identität verwandter Moleküle eingesetzt werden. Typischerweise erfolgt die Wechselwirkung biologischer oder chemischer Moleküle mit den Arrays in Lösung.
Insbesondere können die Arrays in herkömmlichen Tests, die auf dem Nachweis fluoreszierender Markierungen basieren, angewandt werden, um Informationen über die im Array angeordneten Molekülen zu gewinnen. Die Arrays eignen sich besonders für die Verwendung bei mehrstufigen Tests, bei denen die fehlende Synchronisation der Schritte zuvor als Einschränkung für den Einsatz der Arrays galt. Bestehen die Arrays aus Polynukleotiden, können sie bei herkömmlichen Techniken zur Gewinnung genetischer Sequenzinformationen verwendet werden. Viele dieser Techniken basieren auf der stufenweisen Identifizierung geeignet markierter Nukleotide, in der US-A-5634413 als "Einzelbasen"-Sequenzierungsverfahren bezeichnet.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Sequenz eines Target-Polynukleotids ähnlich wie in der US-A-5634413 beschrieben durch Nachweis des Einbaus von Nukleotiden in den naszierenden Strang mittels Nachweis einer an das eingebaute Nukleotid befestigten fluoreszierenden Markierung bestimmt. Das Target-Polynukleotid wird mittels eines geeigneten Primers geprimt und die naszierende Kette stufenweise durch die Polymerasereaktion verlängert. Die verschiedenen Nukleotide (A, T, G und C) besitzen jeweils ein einziges Fluorophor an der 3'-Position, das als Sperrgruppe zur Verhinderung einer unkontrollierten Polymerisation dient. Das Polymeraseenzym baut ein Nukleotid in die zu dem Target komplementäre naszierende Kette ein und die Sperrgruppe verhindert einen weiteren Einbau von Nukleotiden. Die Arrayoberfläche wird nun von nicht eingebauten Nukleotiden gereinigt und die eingebauten Nukleotide werden jeweils mit Hilfe eines ladungsgekoppelten Detektors mit Laseranregung und Filtern optisch "gelesen". Anschließend wird die 3'-Sperrgruppe entfernt (entschützt), um die naszierende Kette für den weiteren Nukleotideinbau freizulegen.
Da das Array aus eindeutigen, optisch auflösbaren Polynukleotiden besteht, erzeugt jedes Target-Polynukleotid eine Reihe von eindeutigen Signalen, die als Fluoreszenzereignisse nachgewiesen werden. Die Einzelheiten der vollständigen Sequenz werden dann ermittelt.
Die Anzahl der erreichbaren Zyklen hängt im Wesentlichen von der Ausbeute des Entschützungszyklus ab. Kommt es in einem Zyklus nicht zur Entschützung, können eine spätere Entschützung und der kontinuierliche Einbau von Nukleotiden während des nächsten Zyklus nachgewiesen werden. Da die Sequenzierung auf der Einzelmolekülebene erfolgt, kann sie auf verschiedenen Polynukleotidsequenzen gleichzeitig erfolgen, ohne dass die verschiedenen Probenfragmente vor der Sequenzierung getrennt werden müssen. Diese Sequenzierung vermeidet auch Phasierungsprobleme, die im Stand der Technik auftreten.
Die Entschützung kann durch chemische, photochemische oder enzymatische Reaktionen erfolgen.
Ein ähnliches und gleichermaßen anwendbares Sequenzierungsverfahren ist in der EP-A-0640146 offenbart.
Andere geeignete Sequenzierungsverfahren sind für den Fachmann offensichtlich. Insbesondere kann das Sequenzierungsverfahren auf der Zersetzung der im Array angeordneten Polynukleotide basieren, wobei die Zersetzungsprodukte zur Bestimmung der Sequenz gekennzeichnet werden.
Ein Beispiel für eine geeignete Zersetzungstechnik ist in der WO-A-95/20053 offenbart; dabei wird jeweils eine zuvor bestimmte Anzahl Basen auf einem Polynukleotid nacheinander mittels basenspezifischer markierter Adaptoren und definierter Exonuklasespaltung entfernt.
Eine Folge der Sequenzierung mit Hilfe nicht-destruktiver Verfahren ist jedoch, dass ein räumlich adressierbares Array für weitere Kennzeichnungsstudien gebildet werden kann und daher eine nicht-destruktive Sequenzierung unter Umständen bevorzugt wird. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "räumlich adressierbar" hierin verwendet, um zu beschreiben, wie die verschiedenen Moleküle auf Basis ihrer Position auf einem Array identifiziert werden können.
Sobald die räumlich adressierten Arrays sequenziert sind, können sie bei einer Vielzahl von Verfahren zum Einsatz kommen, die die Kennzeichnung einzelnen Moleküle aus heterogenen Populationen erfordern.
Ein Anwendungszweck ist die Verwendung der Arrays zur Kennzeichnung von Produkten, die bei kombinatorischen chemischen Reaktionen synthetisiert werden. Bei kombinatorischen chemischen Reaktionen wird für gewöhnlich für die nachfolgende Kennzeichnung des Produktes eine Identifizierungskennzeichnung oder Markierung in einen perlenförmigen Träger oder ein Reaktionsprodukt eingebaut. In der vorliegenden Erfindung dienen Polynukleotidmoleküle als Identifizierungskennzeichnungen – wobei die Polynukleotide jeweils für ein bestimmtes Produkt spezifisch sind – und die Identifizierungskennzeichnungen werden auf einem räumlich adressierten Array hybridisiert. Da die Sequenz des im Array angeordneten Polynukleotids zuvor bestimmt wurde, belegt der Nachweis eines Hybridisierungsereignisses auf dem Array die Sequenz der komplementären Identifizierungskennzeichnung auf dem Produkt. Nach Identifizierung der Identifizierungskennzeichnung lässt sich bestätigen, auf welches Produkt sie sich bezieht. Der gesamte Prozess ist daher schnell und einfach und die Arrays können für eine Hochdurchsatzdurchsuchung wiederverwendet werden. Der Nachweis kann durch Befestigung einer geeigneten Markierung an dem Produkt, z.B. eines Fluorophors erfolgen.
Kombinatorische chemische Reaktionen können zur Synthese einer breiten Palette verschiedener Moleküle eingesetzt werden, die jeweils mit Hilfe der adressierten erfindungsgemäßen Arrays identifiziert werden können. Mit Hilfe der kombinatorischen Chemie lassen sich z.B. therapeutische Proteine oder Peptide herstellen, die an die Arrays gebunden werden können, um ein adressiertes Target-Protein-Array zu erzeugen. Die Targets können dann auf ihre Aktivität hin getestet werden; die Proteine, die eine Aktivität aufweisen, können wie zuvor skizziert durch ihre Position auf dem Array identifiziert werden.
Ähnliche Prinzipien gelten für andere Produkte der kombinatorischen Chemie, z.B. für die Synthese von Nichtpolymermolekülen eines Molekulargewichts von < 1000. Verfahren zur Erzeugung von Peptiden/Proteinen mit Hilfe kombinatorischer Verfahren sind in der US-A-5643768 und der US-A-5658754 offenbart. Wie in Nielsen et al., J. Am. Chem. Soc. (1993) 115:9812-9813 beschrieben, können auch Spalt-und-Misch-Ansätze zur Anwendung kommen.
Bei einem alternativen Ansatz können die Produkte der kombinatorischen chemischen Reaktionen eine zweite Polynukleotid-Identifizierungskennzeichnung umfassen, die an der Hybridisierung auf dem Array nicht beteiligt ist. Nach Ausbildung durch Hybridisierung kann das Array zur Identifizierung der frei bleibenden zweiten Identifizierungskennzeichnung einer wiederholten Polynukleotidsequenzierung unterzogen werden. Diese Sequenzierung kann wie zuvor beschrieben durchgeführt werden.
Daher liefert bei diesem Anwendungszweck die Identifizierungskennzeichnung die räumliche Adresse auf dem Array. Die Identifizierungskennzeichnung kann anschließend z.B. mit Hilfe eines abspaltbaren Linkers aus dem Produkt entfernt werden, so dass ein räumlich adressiertes Array ohne Identifizierungskennzeichnung zurückbleibt.
Ein weiterer Anwendungszweck ist die Darstellung von Proteinen mittels eines immobilisierten Polysoms, das, wie in der US 5643768 und der US 5658754 beschrieben, eingefangene Polynukleotide und Protein in einem Komplex enthält.
In einer separaten Ausführungsform der Erfindung können die Arrays zur Kennzeichnung eines Organismus verwendet werden. Die Genom-DNA eines Organismus kann z.B. mittels der Arrays durchsucht werden, um einzelne Hybridisierungsmuster zu zeigen, die für ein Individuum einzigartig sind. Diese Ausführungsform kann daher mit einem "Strichcode" für den jeweiligen Organismus verglichen werden. Die Genom-DNA eines Organismus kann zunächst fragmentiert und z.B. mit einem Fluorophor nachweisbar markiert werden. Anschließend wird die fragmentierte DNA auf das Array unter Hybridisierungsbedingungen aufgetragen und alle Hybridisierungsereignisse überwacht.
Alternativ kann die Hybridisierung mittels eines Nachweissystems auf Basis einer eingebauten Fluoreszenz in dem im Array angeordneten Molekül, z.B. mittels der in Nature Biotechnology (1996) 14:303–308 beschriebenen "Molekülleuchtfeuer" nachgewiesen werden.
Die Arrays können so konzipiert werden, dass das erzeugte Hybridisierungsmuster für den Organismus einzigartig ist und dazu verwendet werden kann, wertvolle Informationen über den genetischen Charakter eines Individuums zu liefern. Dies findet zahlreiche nützliche Anwendungszwecke in der forensischen Wissenschaft. Alternativ können die Verfahren zum Nachweis von Mutationen oder Allelvarianten in der Genom-DNA eines Organismus eingesetzt werden.
Für die Genotypisierung ist es wünschenswert festzustellen, ob eine bestimmte Sequenz in dem Genom vorliegt. Das kleinstmögliche einzigartige Oligomer ist ein 16-mer (unter Annahme der Zufälligkeit der Genomsequenz), d.h. statistisch besteht die Wahrscheinlichkeit, dass eine 16-basige Sequenz im menschlichen Genom (das 3 × 10⁹ Basen umfasst) nur einmal vorkommt. Es gibt etwa 4 × 10⁹ mögliche 16-mere, die in einen Bereich von 2 cm × 2 cm passen (unter Annahme einer Einzelkopie mit einer Dichte von 1 Molekül pro 250 nm × 250 nm). Da auf diese Weise nur bestimmt werden muss, ob ein bestimmtes 16-mer vorliegt oder nicht, sind quantitative Messungen nicht nötig. Die Identifizierung einer Mutation in einem bestimmten Bereich und ihrer Natur kann mit Hilfe der 16-mer-Bibliothek erfolgen. Eine Rückkartierung auf das menschliche Genom wäre mittels veröffentlichter Daten möglich und kein Problem, sobald das gesamte Genom bestimmt ist. Es gibt einen eingebauten Selbsttest, indem bei der Hybridisierung nach bestimmten 16-meren gesucht wird, so dass bei Vorliegen einer einzelnen Punktmutation diese in 16 verschiedenen 16-meren auftaucht, und ein Bereich mit 32 Basen in dem Genom identifiziert wird (die Mutation würde ganz oben an einem 16-mer auftreten und anschließend an der zweiten Base eines verwandten 16-mers, usw.). Daher würde eine einzelne Punktmutation dazu führen, dass 16 der 16-mere keine Hybridisierung aufweisen und 16 neue eine Hybridisierung aufweisen (dasselbe gilt für den komplementären Strang). Zusammengefasst würde eine einzelne Punktmutation unter Berücksichtigung beider DNA-Stränge dazu führen, dass 32 der 16-mere keine Hybridisierung aufweisen und 32 neue 16-mere eine Hybridisierung aufweisen (d.h. relativ große Veränderungen des Hybridisierungsmusters auf dem Array).
Exemplarisch kann ein Probe menschlicher Genom-DNA zur Erzeugung kurzer Fragmente restriktionsverdaut und anschließend mit einem fluoreszierend markierten Monomer und einer DNA-Polymerase oder einem terminalen Transferaseenzym markiert werden. Dies führt zu einer kurzen Proben-DNA mit einem Fluorophor an einem Ende. Die geschmolzenen Fragmente können nun dem Array ausgesetzt und die Pixel, bei denen die Hybridisierung erfolgt, identifiziert werden. Dies führt zu einem genetischen Strichcode für das Individuum mit etwa 4 × 10⁹ binären Codierelementen (bei Verwendung von Oligonukleotiden der Länge 16). Dies würde den Genotyp einer Person für pharmakogenomische Anwendungszwecke einzigartig definieren. Da die Arrays wiederverwendbar sein sollten, kann derselbe Prozess bei einem anderen Individuum wiederholt werden.
Virale und bakterielle Organismen können ebenfalls untersucht werden; die Durchsuchung von Nukleinsäureproben kann Krankheitserreger bei einer Krankheit darstellen oder Mikroorganismen in Analysetechniken identifizieren. Pathogene oder andere Bakterien beispielsweise können mit Hilfe einer Reihe von aus verschiedenen Bakterienstämmen gewonnenen Einzelmolekül-DNA-Chips identifiziert werden. Auch diese Chips sind einfach herzustellen und wiederverwendbar.
In einem weiteren Beispiel können doppelsträngige Arrays für die Durchsuchung von Proteinbibliotheken zur Bindung mittels fluoreszierend markierter Proteine verwendet werden. Dadurch können Proteine bestimmt werden, die sich an eine bestimmte DNA-Sequenz binden, d.h. Proteine, die die Transkription steuern. Sobald die kurze Sequenz, an die sich das Protein bindet, bestimmt ist, kann eine Affinitätsreinigung erfolgen, um das Protein zu isolieren und zu identifizieren. Mit einem solchen Verfahren ließen sich sämtliche die Transkription steuernde Proteine finden. Ein solches Verfahren ist in Nature Biotechnology (1999) 17:p573-577 offenbart.
Ein weiterer Anwendungszweck ist die Expressionsüberwachung. Dafür benötigt jedes Gen eine Markierung. Das menschliche Genom besteht aus etwa 100.000 Genen. Es gibt 262.144 mögliche 9-mere; dies ist also die Mindestlänge, die ein Oligomer für eine einzigartige Identifizierungskennzeichnung eines Gens aufweisen muss. Diese 9-mer-Markierung muss sich an einer bestimmten Stelle der DNA befinden; der beste Punkt ist wahrscheinlich unmittelbar nach dem Poly-A-Schwanz in der mRNA (d.h. ein mit einer Poly-T-Guide-Sequenz verbundenes 9-mer). Es sollten mehrere Kopien dieser 9-mere vorliegen, um eine Quantifizierung der Genexpression zu erlauben. 100 Kopien würden die Bestimmung der relativen Genexpression von 1–100% ermöglichen. 10.000 Kopien würden die Bestimmung der relativen Genexpression von 0,01–100% erlauben. 10.000 Kopien der 262.144 9-mere würden in eine Fläche von 1 cm × 1 cm passen (fast maximale Dichte).
Durch Verwendung von Nanovials in Verbindung mit den zuvor beschriebenen Verfahren kann ein Molekül von de Oberfläche abgespalten werden und dennoch räumlich unversehrt bleiben. Dies erlaubt die Herstellung räumlich adressierbarer Einzelmolekülarrays in freier Lösung, was Vorteile haben kann, wenn die Befestigung an der Oberfläche die Analyse behindert (z.B. Drogen-Screening). Ein Nanovial ist ein kleiner Hohlraum in einer flachen Glasfläche mit einem Durchmesser von z.B. etwa 20 μm und einer Tiefe von 10 μm. Da Nanovials im Abstand von 50 μm positioniert werden können, ist das Array weniger dicht als ein an der Oberfläche befestigtes Array; dies könnte jedoch durch geeignete Einstellung der Bildgebungsoptik ausgeglichen werden.
Die folgenden Beispiel veranschaulichen die Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen.
Beispiel 1
Die in dem nachfolgenden Beispiel verwendete Mikroskopapparatur basierte, wie in 1 dargestellt, auf einem modifizierten konfokalen Fluoreszenzsystem mit einem Photonendetektor. Kurz gesagt wurde ein schmaler, räumlich gefilterter Laserstrahl (CW Argon Ion Laser Technology RPC50) durch einen akustisch-optischen Modulator (AOM) (A.A. Opto-Electronic) geleitet, der als schneller optischer Schalter dient. Der akustisch-optische Modulator wurde angeschaltet und der Laserstrahl mittels eines doppelfarbigen Strahlteilers (540DRLP02 oder 505DRLP02, Omega Optics Inc.) durch ein Ölimmersionsobjektiv (100 X, NA = 1,3) eines umgekehrten Lichtmikroskops (Nikon Diaphot 200) geleitet. Das Objektiv bündelt das Licht auf einen beugungsbeschränkten Punkt einer immobilisierten Target-Probe auf einem dünnen Deckglas. Die Fluoreszenz aus der Probe wurde mit Hilfe desselben Objektivs gesammelt und durch den doppelfarbigen Strahlteiler sowie ein 50 μm großes Pinhole (Newport Corp.) in der Bildebene der Mikroskopschauöffnung geleitet. Das Pinhole wirft das Licht, das aus der außerhalb der Laserfokusebene befindlichen Probe austritt, zurück. Die übertragene Fluoreszenz wurde spektral mittels eines doppelfarbigen Strahlteilers in rote und grüne Komponenten getrennt, die zur Entfernung restlicher Laserstreuung gefiltert wurden. Die verbleibenden Fluoreszenzkomponenten wurden anschließend auf separate Einzelphotonenlawinendiodendetektoren fokussiert und die Signale auf einem Mehrkanalskalar (MCS) (MCS-Plus, EG&G Ortec) mit einer zeitlichen Auflösung im Bereich von 1 bis 10 ms aufgezeichnet.
Die Target-Probe war ein mittels herkömmlicher Phosphoramiditchemie hergestelltes 5'-biotin-modifiziertes 13-mer-Primer-Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 1 (siehe Liste unten). Das Oligonukleotid wurde nach der Synthese durch Umsetzen der Uridinbase mit dem Succinimdylester von Tetramethylrhodamin (TMR) modifiziert.
Die Deckgläser wurden durch Reinigen mit Aceton und Trocknen unter Stickstoff vorbereitet. Eine 50 μl-Aliquote von in PBS-Puffer (0,01M, pH 7,4) erneut gelöstem Biotin-BSA (Sigma) in einer Konzentration von 1 mg/ml wurde auf das saubere Deckglas aufgebracht und 8 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Überschüssiges Biotin-BSA wurde durch 5-maliges Waschen mit MilliQ-Wasser und Trocknen unter Stickstoff entfernt. Latexmikrokugeln aus nicht-fluoreszierendem streptavidin-funktionalisiertem Polystyrol mit einem Durchmesser von 500 nm (Polysciences Inc.) wurden in 100 mM NaCl auf 0,1 Feststoffe verdünnt und als 1 μl-Tropfen auf der biotinylierten Oberfläche des Deckglases abgelagert. Man ließ die Kugeln 1 Stunde lang trocknen und entfernte die nicht gebundenen Perlen durch 5-maliges Waschen mit MilliQ-Wasser. Dieses Vorgehen führte dazu, dass die Oberfläche mit etwa 1 Kugel/100 μm × 100 μm bedeckt war.
Es stellte sich heraus, dass die nicht-fluoreszierenden Mikrokugeln bei einer Anregungswellenlänge von 514 nm eine breite Restfluoreszenz aufweisen, wahrscheinlich infolge kleiner Mengen bei der kolloidalen Herstellung der Mikrokugeln verwendeter photoaktiver Bestandteile. Die Mikrokugeln wurden daher durch 1-stündige Behandlung des vorbereiteten Deckglases in einem Laserstrahl eines frequenz-verdoppelten (532 nm) gepulsten Farblasers (Nd:YAG) einem Photobleaching unterzogen.
Die biotinylierte 13-TMR-ssDNA wurde durch Inkubieren einer auf den Mikrokugeln abgelagerten 50 μl-Probe von 0,1 pM DNA (mit 100 mM NaCl, 100 mM Tris verdünnt) mit den straptavidin-funktionalisierten Mikrokugeln gekoppelt. Nicht gebundene DNA wurde durch 5-maligies Waschen der Deckglasoberfläche mit MilliQ-Wasser entfernt.
Zur visuellen Positionierung einer Mikrokugel in 10-facher Vergrößerung wurde das Licht geringer Lichtstärke aus dem Mikroskopkondensor eingesetzt, so dass sich die Kugel bei Einschalten des Lasers im Zentrum des beugungsbeschränkten Fokus befand. Anschließend wurde der Kondensor abgeschaltet und der Lichtweg wechselte zur Fluoreszenzdetektoröffnung. Der MCS wurde initiiert und die von der Laterkugel ausgehende Fluoreszenz auf einem oder beiden Kanälen aufgezeichnet. Die Probe wurde mit 514 nm angeregt und es erfolgte ein Nachweis auf dem 600 nm-Kanal.
3 zeigt deutlich, dass die Fluoreszenz angeschaltet wird, wenn der Laser 0,5 Sekunden nach Beginn des Scans mittels AOM in das Mikroskop abgelenkt wird. Die Intensität der Fluoreszenz bleibt über einen kurzen Zeitraum (100 ms – 3 s) relativ konstant und verschwindet dann in einem einstufigen Prozess. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Einzelmolekülnachweis erfolgt. Das einstufige Photobleaching ist der eindeutige Beleg, dass die Fluoreszenz von einem einzelnen Molekül stammt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von Einzelmolekülarrays durch direkte kovalente Befestigung an Glas und die anschließende Demonstration einer Hybridisierung auf dem Array.
Kovalent modifizierte Objektträger wurden wie folgt hergestellt. Spectrosil-2000-Objektträger (TSL, Großbritannien) wurden zur Entfernung von Staub mit MilliQ gespült, nass in eine Flasche mit reinem Decon-90 gelegt und 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Objektträger wurden mit MilliQ gespült, in eine Flasche mit einer Lösung von 1,5% Glycidorypropyltrimethoxysilan in MilliQ gelegt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur magnetisch gerührt, mit MilliQ gespült und unter N₂ getrocknet, um eine epoxidbeschichtete Oberfläche freizulegen.
Die verwendete DNA war die in SEQ-ID-Nr. 2 dargestellte (siehe Sequenzliste unten), in der n ein 5-Methylcytosin (Cy5) mit einer mittels eines Linkers an die n4-Position gekoppelten TMR-Gruppe darstellt.
Eine Probe davon (5 μl, 450 pM) wurde als Lösung in reinem MilliQ aufgetragen.
Die DNA-Reaktion wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Atmosphäre zur Kopplung an die Epoxidoberfläche stehen gelassen. Anschließend wurde der Objektträger mit MilliQ gespült und unter N₂ getrocknet.
Die vorbereiteten Objektträger können in Folie gewickelt in einem Exsikkator mindestens eine Woche lang ohne merkbare Verunreinigung oder Verlust von gebundenem Material gelagert werden. Kontroll-DNA mit denselben Sequenzen und Fluorophor, jedoch ohne die 5'-Aminogruppe zeigt bei Beschichtung mit derselben Konzentration eine wenig stabile Bedeckung.
Die TMR-markierten Objektträger wurden nun mit einer Lösung der komplementären DNA (SEQ-ID-Nr. 3) (5 μM, 10 μl) in 100 mM PBS behandelt. Die komplementäre DNA besitzt die in SEQ-ID-Nr. 3 dargestellte Sequenz, in der n eine Methylcytosingruppe darstellt.
Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Objektträger auf 4 °C abgekühlt und 24 Stunden lang stehen gelassen. Schließlich wurden die Objektträger in PBS (100 mM, 1 ml) gewaschen und unter N₂ getrocknet.
Auf dem Objektträger wurde eine Kammer konstruiert, indem ein Deckglas (Nr. 0, 22 × 22 mm, Chance Propper Ltd., Großbritannien) über der Probenfläche an zwei Seiten nur mit zuvor gehärtetem Mikroskopfixiermedium (Eukitt, O. Kindler GmbH & Co., Freiburg, Deutschland) abgedichtet, zwischen dem Objektträger und dem Deckglas aber eine Lücke von weniger als 200 μm gelassen wurde. Die Kammer wurde 3 × mit 100 μl PBS (100 mM NaCl) gespült und vor der Analyse auf einem Fluoreszenzmikroskop 5 Minuten lang zur Stabilisierung stehen gelassen.
Der Objektträger wurde umgedreht, um das Kammerdeckglas mittels einer Immersionsölgrenzfläche mit der Objektivlinse eines umgekehrten Mikroskops (Nikon TE200) in Kontakt zu bringen. Ein 60°-Dispersionsprisma aus Quarzglas wurde mit Hilfe eines dünnen Glycerinfilms mit der Rückseite des Objektträgers optisch gekoppelt. Das Laserlicht wurde so auf das Prisma gerichtet, dass es an der Grenzfläche zwischen Glas und Probe einen Winkel von etwa 68° gegenüber der Normale des Objektträgers bildet und anschließend einer totalen internen Reflexion (TIR) unterzogen wird. Der kritische Winkel für die Grenzfläche zwischen Glas und Wasser beträgt 66°.
Die Fluoreszenz einzelner DNA-TMR- oder DNA-CyS-Moleküle, die durch Anregung mit der oberflächen-spezifischen evaneszenten Welle nach der TIR entsteht, wird von der Objektivlinse des Mikroskops gesammelt und auf eine ICCD-Kamera (Pentamax, Princeton Instruments, NJ) (ICCD = Intensified Charge Coupled Device) abgebildet. Mit Hilfe einer Kombination aus 1) 532 nm-Anregung (frequenz-verdoppelter Festkörper-Nd:YAG, Antares, Coherent) mit einem 580 nm-Fluoreszenzfilter (580DF30, Omega Optics, USA) für TMR und 2) 630 nm-Anregung (Nd:YAG-Pumpenfarblaser, Coherent 700) mit einem 670 nm-Filter (670DF40, Omega Optics, USA) für Cy5 wurden zwei Bilder aufgezeichnet. Die Bilder wurden mit einer Belichtungszeit von 500 ms bei maximaler Verstärkung von 10 auf der ICCD aufgezeichnet. Die Laserkräfte im Prisma betrugen 50 mW bzw. 40 mW bei 532 nm bzw. 630 nm. Ein drittes Bild wurde mit 532 nm-Anregung und Nachweis bei 670 nm zur Bestimmung des Crosstalk-Levels von TMR auf dem Cy5-Kanal aufgenommen.
Einzelne Moleküle wurden durch einzelne Fluoreszenzpunkte mit einer durchschnittlichen Intensität von mehr als dem Dreifachen des Hintergrunds identifiziert. Die Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls ist auf einige Pixel beschränkt – typischerweise eine 3 × 3-Matrix mit 100-facher Vergrößerung – und besitzt ein schmales Gauß'sches Intensitätsprofil. Die Einzelmolekülfluoreszenz ist außerdem durch einen einstufigen Photobleaching-Prozess im Verlauf der Intensität gekennzeichnet und wurde bei mehrstufigen Prozessen zur Unterscheidung einzelner Moleküle in Pixelbereichen mit zwei oder mehr Molekülen eingesetzt. Die 4a und 4b zeigen 60 × 60 μm² große Fluoreszenzbilder von kovalent modifizierten Objektträgern mit einer DNA-TMR-Anfangskonzentration von 45 pM bzw. 450 pM. 4c stellt einen Kontroll-Objektträger dar, der wie oben behandelt wurde, bei dem die DNA-TMR jedoch nicht 5'-amino-modifiziert war.
Zur Zählung von Molekülen wird zunächst eine Schwelle für die Fluoreszenzintensität gesetzt, um das Hintergrundrauschen auszuschließen. Für eine Kontrollprobe ist der Hintergrund im Wesentlichen das Wärmerauschen der ICCD (laut Messung 76 mit einer Standardabweichung von nur 6). Die Schwelle wird als lineare Kombination aus Hintergrund, mittlerer Anzahl über einem Bild und Standardabweichung über einem Bild frei gewählt. Allgemein stellen die beiden letzteren ein Maß für die Pixelzahl und den Intensitätsbereich über dem Hintergrund bereit. Dieses Verfahren führt zu Schwellenbereichen, die mindestens 12 Standardabweichungen über dem Hintergrund liegen, wobei wahrscheinlich weniger als 1 von 144 Pixeln vom Rauschen stammt. Indem definiert wird, dass ein Einzelmolekülfluoreszenzpunkt mindestens eine 2 × 2-Pixelmatrix ist und nicht größer als 7 × 7 sein darf, wird die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner Hintergrundpixel zu der Anzahl beiträgt, ausgeschlossen und Cluster ignoriert.
Auf diese Weise wird die Oberflächendichte der Einzelmoleküle der DNA-TMR mit 2,9 × 10⁶ Molekülen/cm² (238 Moleküle in 4a) bzw. 5,8 × 10⁶ Moleküle/cm² (469 Moleküle in 4b) bei einer DNA-TMR-Kopplungskonzentration von 45 pM bzw. 450 pM gemessen. Die Dichte ist eindeutig nicht direkt proportional zur DNA- Konzentration, ist aber eine Funktion der Konzentration, der aufgetragenen Probenmenge, der von der Probe bedeckten Fläche und der Inkubationszeit. Der Prozentsatz der nicht-spezifisch gebundenen DNA-TMR und der Verunreinigungen liegt in der Größenordnung von 3–9% pro Bild (8 nicht-spezifisch gebundene Moleküle in 4c). Die Analyse der Photobleaching-Profile zeigt, dass nur 6% der Fluoreszenzpunkte mehr als 1 Molekül enthalten.
Die Hybridisierung wurde durch Colokalisation einzelner Fluoreszenzpunkte von TMR- bzw. Cy5-Einzelmolekülen nach Überlagerung zweier Bilder identifiziert. Die 5a und 5b zeigen Bilder eines an die Oberfläche gebundenen, mit TMR markierten 20-mers und des aus der Lösung abgeschiedenen, mit Cy5 markierten komplementären 20-mers. 5d zeigt Fluoreszenzpunkte, die jeweils auf den beiden früheren Bildern lokalisiert wurden. Der Hybridisierungsgrad wurde auf 7% der oberflächengebundenen DNA (10 colokalisierte Punkte von 141 Punkten in 5d bzw. 5a) geschätzt. Der Prozentsatz der hybridisierten DNA wird auf 37% der gesamten, von der Oberfläche absorbierten DNA-Cy5 (10 colokalisierte Punkte von 27 Punkten in 5d bzw. 5b) geschätzt. Einzelne Moleküle wurde gezählt, indem die Größe und Intensität von Fluoreszenzpunkten mit den Schwellenkriterien abgeglichen wurden, die Einzelmoleküle vom Hintergrundrauschen und kosmischer Strahlung trennen. 5d zeigt das Crosstalk-Level von TMR auf dem Cy5-Kanal, das gemäß Bestimmung durch Zählung nur derjenigen Fluoreszenzpunkte, die in die Kriterien zur Bestimmung der TMR-Einzelmolekülfluoreszenz fallen (2 Fluoreszenzpunkte von 141 in 5c bzw. 5a), 2% betragen soll.
Dieses Beispiel belegt, dass erfindungsgemäß Einzelmolekülarrays gebildet und Hybridisierungsereignisse nachgewiesen werden können. Man erwartet, dass der Fachmann realisiert, dass zur Verbesserung des Wirkungsgrades des Prozesses Modifikationen erfolgen können. Eine Verbesserung der Waschschritte, z.B. mit Hilfe einer Fließzelle, würde beispielsweise das Hintergrundrauschen reduzieren und die Verwendung konzentrierterer Lösungen erlauben; die Hybridisierungsprotokolle könnten durch Variation der Parameter Temperatur, Puffer, Zeit, usw. angepasst werden.
Sequenzliste

Claims

Vorrichtung mit einem Array abrufbarer und auf einer festen, ebenen Fläche immobilisierter Moleküle, wobei jedes der Moleküle einzeln durch optische Mikroskopie auflösbar und als einzelner Molekülfluoreszenzpunkt erfassbar ist, und wobei jedes Molekül, im Gegensatz zu demjenigen Teil jedes Moleküls, das abgerufen werden kann, durch kovalente Bindung an der Fläche mit einer Dichte von einem Molekül pro ungefähr mindestens 250 nm² immobilisiert ist.
Vorrichtung mit einem Array abrufbarer und auf einer festen, ebenen Fläche immobilisierter Moleküle, wobei jedes der Moleküle einzeln durch optische Mikroskopie auflösbar und als einzelner Molekülfluoreszenzpunkt erfassbar ist, und wobei jedes Molekül, im Gegensatz zu demjenigen Teil jedes Moleküls, das abgerufen werden kann, durch kovalente Bindung an der Fläche immobilisiert ist, und wobei die Fluoreszenz aus dem Fluoreszenzpunkt einstufiges Photobleaching zeigt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die kovalente Bindung an die Fläche ohne eine dazwischen angeordnete Mikrokugel erfolgt.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, wobei jedes einzelne Molekül um einen Abstand von mindestens 250 nm getrennt ist.
Vorrichtung nach jedem vorhergehenden Anspruch, wobei die Moleküle Polynucleotide sind, die über die 5'-Endstelle, die 3'-Endstelle oder über ein inneres Nucleotid am festen Träger immobilisiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei mindestens ein im Array angeordnetes Polynucleotid ein daran hybridisiertes zweites Polynucleotid aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das im Array angeordnete Polynucleotid eine bekannte Sequenz umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Moleküle Peptide oder Proteine sind.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das das Abgeben einer ein Molekülgemisch umfassenden Lösung auf eine feste Fläche unter Bedingungen umfasst, die die Immobilisierung zulassen und eine Aggregation der in Lösung befindlichen Moleküle minimieren.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach Anspruch 5, umfassend (i) Primer-Polynucleotide an einzelnen Stellen auf der Fläche eines festen Trägers zu immobilisieren; und (ii) die immobilisierten Primer mit Target-Polynucleotiden unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt zu bringen.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach Anspruch 5, umfassend (i) erste Polynucleotide an einzelnen Stellen auf der Fläche eines festen Trägers zu immobilisieren und zweite Polynucleotide daran zu hybridisieren, die einsträngige Uberhänge bilden; (ii) das Produkt von Schritt (i) unter Hybridisierungsbedingungen mit Target-Polynucleotiden in Kontakt zu bringen; (iii) die Target-Polynucleotide mit einer DNA-Ligase an die ersten Polynucleotide zu binden, und wahlweise, (iv) die zweiten Polynucleotide zu entfernen.
Verfahren zum Ausbilden eines räumlich adressierbaren Arrays, welches umfasst, die Sequenzen einer Mehrzahl von Polynucleotidmolekülen zu bestimmen, die auf einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 12, darüber hinaus den Schritt umfassend, ein Polynucleotidmolekül an sein immobilisiertes Komplement auf dem Array zu hybridisieren.
Verfahren nach Anspruch 12, die Wiederholungsschritte umfassend: das immobilisierte Polynucleotid mit einem Primer, einer Polymerase und den unterschiedlichen Nucleotidtriphosphaten unter Bedingungen zur Reaktion zu bringen, die ausreichen, um die Polymerasereaktion vonstatten gehen zu lassen, wobei jedes Nucleotidtriphosphat an seiner 3'-Stelle mit einer Markierung, die optisch gekennzeichnet werden kann, konjugiert wird, wodurch bestimmt wird, welche Markierung (und somit welches Nucleotid) die Polymerisierungsreaktion durchgemacht hat, und die Markierung zu entfernen.
Verfahren zum Kennzeichnen einer Mehrzahl von ersten Molekülen, das umfasst, ein räumlich adressiertes Array von zweiten Molekülen unter geeigneten Bedingungen mit den ersten Molekülen in Kontakt zu bringen, und ein Bindungsereignis zu erfassen, wobei das Array so wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das erste Molekül eine erfassbare Identifizierungskennzeichnung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Identifizierungskennzeichnung ein Fluorophor ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Identifizierungskennzeichnung ein Polynucleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Polynucleotidsequenz bestimmt wird.
Verfahren zum Kennzeichnen eines Organismus, das die Schritte umfasst, ein bestimmtes Array von Polynucleotidmolekülen, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, mit einer Mehrzahl von Fragmenten der Gen-DNA des Organismus unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt zu bringen, und alle Hybridisierungsereignisse zu erfassen, um ein eindeutiges Hybridisierungsmuster zu erhalten, wobei das Array wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Organismus menschlich ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Organismus bakteriell oder vital ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die Fragmente der Gen-DNA erfassbar markiert sind.
Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 5 zum Einfangen eines zweiten Polynucleotidmoleküls, das zur Hybridisierung mit den in den Arrays angeordneten Polynucleotiden in der Lage ist, umfassend, eine, das zweite Polynucleotidmolekül enthaltende Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit der Vorrichtung in Kontakt zu bringen.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Probe außer Kontakt mit der Vorrichtung gebracht wird, wobei das zweite Polynucleotid, das an ein im Array angeordnetes Polynucleotid hybridisiert wurde, von der Probe getrennt wird.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die umfasst, jedes von unterschiedlichen Molekülen auf dem Array unter Verwendung optischer Mikroskopie zu identifizieren.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das im Array angeordnete Molekül wiederholte Wechselwirkungen durchmacht, wobei jede Wechselwirkung überwacht wird.