JP2015513392A5 - - Google Patents

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実験条件を要因として含める診断プロセス
関連特許出願
この特許出願は、２０１２年１月２０日に出願された表題「ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＴＨＡＴ ＦＡＣＴＯＲ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ」、発明者Ｃｏｓｍｉｎ Ｄｅｃｉｕの米国仮特許出願第６１／５８９，２０２号（代理人管理番号ＳＥＱ−６０４０−ＰＶと指定）の利益を主張し、２０１２年１０月５日に出願された表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＲＩＡＴＩＯＮＳ」、発明者Ｃｏｓｍｉｎ Ｄｅｃｉｕ、Ｚｅｌｊｋｏ Ｄｚａｋｕｌａ、Ｍａｔｈｉａｓ ＥｈｒｉｃｈおよびＳｕｎｇ Ｋｉｍの米国ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５９１２３号（代理人管理番号ＳＥＱ−６０３４−ＰＣと指定）の利益を主張し、２０１２年１０月４日に出願された表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＲＩＡＴＩＯＮＳ」、発明者Ｃｏｓｍｉｎ Ｄｅｃｉｕ、Ｚｅｌｊｋｏ Ｄｚａｋｕｌａ、Ｍａｔｈｉａｓ ＥｈｒｉｃｈおよびＳｕｎｇ Ｋｉｍの米国仮特許出願第６１／７０９，８９９号（代理人管理番号ＳＥＱ−６０３４−ＰＶ３と指定）の利益を主張し、そして２０１２年６月２２日に出願された表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＮＯＮ−ＩＮＶＡＳＩＶＥ ＡＳＳＥＳＳＭＥＮＴ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＲＩＡＴＩＯＮＳ」、発明者Ｚｅｌｊｋｏ ＤｚａｋｕｌａおよびＭａｔｈｉａｓ Ｅｈｒｉｃｈの米国仮特許出願第６１／６６３，４７７号（代理人管理番号ＳＥＱ−６０３４−ＰＶ２と指定）の利益を主張する。
分野
当該技術は、一部において、遺伝的変異を非侵襲的に評価するための方法、プロセスおよび装置に関する。
生きている生物体（例えば、動物、植物および微生物）の遺伝情報ならびに複製される遺伝情報の他の形態（例えば、ウイルス）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）にコードされている。遺伝情報とは、化学的または仮説的な核酸の一次構造を示すヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドの継承である。ヒトでは、完全なゲノムは２４の染色体に位置する約３０，０００遺伝子を含有する（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、Ｔ． Ｓｔｒａｃｈａｎ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９２年を参照されたい）。各遺伝子は特定のタンパク質をコードし、それが転写および翻訳によって発現されると、生細胞内の特定の生化学的機能が満たされる。
多くの医学的状態は、１つまたは複数の遺伝的変異によって引き起こされる。ある特定の遺伝的変異は、例えば、血友病、サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病および嚢胞性線維症（ＣＦ）を含む医学的状態を引き起こす（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｄ． Ｎ． ＣｏｏｐｅｒおよびＭ． Ｋｒａｗｃｚａｋ、ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９３年）。そのような遺伝病は、特定の遺伝子のＤＮＡにおける単一ヌクレオチドの付加、置換、または欠失によって生じる可能性がある。ある特定の先天性欠損は、異数性とも称される染色体異常によって引き起こされる。例えば、２１トリソミー（ダウン症候群）、１３トリソミー（パトー症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、Ｘモノソミー（ターナー症候群）など、およびある特定の性染色体異数性、例えば、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）など。いくつかの遺伝的変異により、例えば、糖尿病、動脈硬化症、肥満、種々の自己免疫疾患およびがん（例えば、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん）などのいくつもの疾患のいずれかに対する素因が個体に付される、またはそれらの疾患のいずれかが引き起こされる可能性がある。
Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、Ｔ． Ｓｔｒａｃｈａｎ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９２年 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ、Ｄ． Ｎ． ＣｏｏｐｅｒおよびＭ． Ｋｒａｗｃｚａｋ、ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９３年
１つまたは複数の遺伝的変異または遺伝分散を同定することが、特定の医学的状態の診断、またはそれに対する素因の決定につながる可能性がある。遺伝分散を同定することにより、医学的決定を容易にし、かつ／または有用な医学的手順を使用することができる。
本明細書では、胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、（ａ）妊婦由来の循環している無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｅ）正規化された試料カウントから、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、配列読み取りを参照ゲノムセクションの一部または全部にマッピングする。
本明細書では、胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｇ）正規化された試料カウントから、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｄ）正規化された試料カウントから、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｅ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｇ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｄ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｄ）（ｃ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｆ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｈ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｃ）（ｂ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｅ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、微小欠失の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｄ）（ｃ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｆ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
本明細書では、微小欠失の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｈ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法が提供される。
本明細書では、微小欠失の有無を検出するための方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｃ）（ｂ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｆ）正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
いくつかの実施形態では、補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、残ったカウントを正規化する。ある特定の実施形態では、遺伝的変異は微小欠失である。いくつかの実施形態では、微小欠失は第２２染色体上にある。ある特定の実施形態では、微小欠失は第２２染色体の領域２２ｑ１１．２において起こっている。いくつかの実施形態では、微小欠失は、参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間で起こっている。
いくつかの実施形態では、試料核酸は試験被験体由来の血漿由来であり、ある特定の実施形態では、試料核酸は試験被験体由来の血清由来である。いくつかの実施形態では、試験被験体は、ヒト、動物、および植物から選択される。ある特定の実施形態では、ヒト試験被験体は女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む。
いくつかの実施形態では、胎児の異数性は１３トリソミーである。ある特定の実施形態では、胎児の異数性は１８トリソミーである。いくつかの実施形態では、胎児の異数性は２１トリソミーである。
ある特定の実施形態では、遺伝的変異は医学的状態に関連付けられる。いくつかの実施形態では、医学的状態はがんである。ある特定の実施形態では、医学的状態は異数性である。
いくつかの実施形態では、無細胞試料核酸の配列読み取りはポリヌクレオチド断片の形態である。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド断片の長さは約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの長さは約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である。いくつかの実施形態では、「ポリヌクレオチド断片」という用語は、配列読み取りに関して「配列情報」という用語、または身体ＤＮＡのデジタル表示と同義またはそれと互換的であり得、または逆もまた同様である。
ある特定の実施形態では、予測カウントは、カウント中央値である。いくつかの実施形態では、予測カウントは、トリムもしくは刈り込み平均（ｔｒｉｍｍｅｄ ｏｒ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｍｅａｎ）、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である。ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントは、カウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化することを含むプロセスによって得られ、誘導値は、第１のゲノムセクションについてのカウントを第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについてのカウントで割ることによって決定される、第１のゲノムセクションカウント表示である。いくつかの実施形態では、第１のゲノムセクションについてのカウントの誘導値を予測カウントの誘導値に従って正規化し、予測カウントの誘導値は、第１のゲノムセクションについての予測カウントを第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについての予測カウントで割ることによって決定される、予測された第１のゲノムセクションカウント表示である。ある特定の実施形態では、第１のゲノムセクションは染色体または染色体の部分であり、複数のゲノムセクションは常染色体を含む。いくつかの実施形態では、染色体は第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体である。
ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントは、第１のゲノムセクションについてのカウントから予測カウントを引き算し、それにより減算値を生成し、減算値をカウントの変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントは、第１のゲノムセクションカウント表示から、予測された第１のゲノムセクションカウント表示を引き算し、それにより減算値を生成し、減算値を第１のゲノムセクションカウント表示の変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる。ある特定の実施形態では、予測カウントの変動性の推定値は、カウントの中央絶対偏差（ＭＡＤ）である。いくつかの実施形態では、カウントの変動性の推定値は、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値である。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件はフローセルを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件はフローセル内のチャネルを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件は試薬プレートを含む。ある特定の実施形態では、試薬プレートを使用して配列決定のために核酸を段階分けする。いくつかの実施形態では、試薬プレートを使用して配列決定のために核酸ライブラリーを調製する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件は同定タグ指標を含む。
ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、ヌクレオチド配列読み取りまたは試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、カウントまたは正規化された試料カウントを局所重み付け多項式回帰に供するステップを含む。ある特定の実施形態では、局所重み付け多項式回帰は、ＬＯＥＳＳ回帰またはＬＯＷＥＳＳ回帰である。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する。ある特定の実施形態では、カウントまたは正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する。いくつかの実施形態では、方法は、正規化された試料カウントを得る前にカウントをフィルタリングするステップを含む。
いくつかの実施形態では、試料核酸は一本鎖核酸を含む。ある特定の実施形態では、試料核酸は二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列読み取りを得るステップは、試料核酸を、配列決定デバイスを使用した配列決定プロセスに供することを含む。ある特定の実施形態では、アウトカムをもたらすステップは、試料核酸中の胎児核酸の分率をファクタリングするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試料核酸中の胎児核酸の分率を決定するステップを含む。
ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、ヌクレオチド配列読み取りまたは試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正せずに得る。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを１つの実験条件について得る。ある特定の実施形態では、実験条件はフローセルである。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを２つの実験条件について得る。ある特定の実施形態では、実験条件はフローセルおよび試薬プレートである。いくつかの実施形態では、実験条件はフローセルおよび同定タグ指標である。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを３つの実験条件について得る。ある特定の実施形態では、実験条件はフローセル、試薬プレートおよび同定タグ指標である。
いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを、（ｉ）グアニンおよびシトシンの含量に従って補正し、（ｉ）の後に、（ｉｉ）実験条件に従って補正した後に得る。ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、（ｉ）の前に参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正した後に得る。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は、フローセルに従って補正することからなる。ある特定の実施形態では、（ｉｉ）は、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる。いくつかの実施形態では、（ｉｉ）は、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる。ある特定の実施形態では、（ｉｉ）は、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる。
ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、フローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る。ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る。ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正し、その後に実験条件に従って補正した後に得る。
ある特定の実施形態では、いくつかの方法は、第１のゲノミックセクションについて、試験被験体についてと、他の試料、参照または試料および参照についての正規化された試料カウント、または正規化された試料カウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、特定の方法は、１つまたは複数のゲノミックセクションについて、試験被験体についてと、他の試料、参照または試料および参照についての正規化された試料カウント、または正規化された試料カウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、いくつかの方法は、評価に基づいて試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、微小欠失、重複、および異数性から選択される。
いくつかの実施形態では、コンピュータ可読プログラムコードが組み込まれたコンピュータで使用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、コンピュータ可読プログラムコードが、配列受信モジュール、論理処理モジュール、およびデータディスプレイ編成モジュールを含む別個のソフトウェアモジュールを含み、かつ、試料核酸における遺伝的変異の有無を同定するための方法であって、（ａ）配列受信モジュールによって、試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｂ）論理処理モジュールによって、ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｃ）論理処理モジュールによって、各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｄ）論理処理モジュールによって、１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｅ）論理処理モジュールによって、正規化された試料カウントから、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムを生成するステップと、（ｆ）データディスプレイ編成モジュールによって、論理処理モジュールによって決定されるのに応じて、試料核酸における遺伝的変異の有無を示すデータディスプレイを編成するステップとを含む方法の実行が遂行されるように適合されている、コンピュータプログラム製品も提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のコンピュータプログラム製品実施形態が記憶されたメモリを含む装置も提供される。いくつかの実施形態では、装置は、本明細書に記載のコンピュータプログラム製品実施形態の１つまたは複数の機能を実行するプロセッサを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において特定されたコンピュータプログラム製品の１つまたは複数の機能をウェブに基づく環境で実行する。
ある特定の実施形態では、本明細書において特定されたコンピュータプログラム製品が実行されるウェブに基づくシステムを含む装置も提供される。いくつかの実施形態では、ウェブに基づくシステムは、ウェブに基づく機能性のために十分なコンピュータ、ルーター、および通信機器を含む。ある特定の実施形態では、ウェブに基づくシステムは、ネットワーククラウドコンピューティング、ネットワーククラウドストレージまたはネットワーククラウドコンピューティングおよびネットワーククラウドストレージを含む。
いくつかの実施形態では、核酸配列決定装置および処理装置を含むシステムであって、配列決定装置によって試料核酸からヌクレオチド配列読み取りが得られ、処理装置によって配列決定装置からのヌクレオチド配列読み取りが得られ、かつ（ａ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｄ）正規化された試料カウントから、試料核酸における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法が実行されるシステムも提供される。
本明細書では、ヒト参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間の２２ｑ１１．２微小欠失の有無を同定する方法であって、（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）の後に残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、（ｈ）第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間に対応する１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体の間の正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、（ｉ）（ｈ）における評価から、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法も提供される。
ある特定の実施形態が以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図においてさらに記載されている。
図は、当該技術の実施形態を例示するものであり、限定するものではない。例示を明白かつ容易にするために、図は定数縮尺で作成されておらず、いくつかの場合には、種々の態様は、特定の実施形態の理解を容易にするために誇張または拡大して示されていることがある。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目２）
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）上記試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｇ）上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目３）
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）上記正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目４）
胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｃ）上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を検出するステップと
を含む、方法。
（項目５）
上記試料核酸が上記妊婦由来の血漿由来のものである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記試料核酸が上記妊婦由来の血清由来のものである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
上記胎児の異数性が１３トリソミーである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記胎児の異数性が１８トリソミーである、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
上記胎児の異数性が２１トリソミーである、項目１から３．１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記予測カウントがカウント中央値である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均（ｔｒｉｍｍｅｄ ｏｒ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｍｅａｎ）、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
上記カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。（項目２１）
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
上記正規化されたカウントがｚスコアである、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
上記正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
上記第１のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目１３から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
上記パーセント表示が染色体表示である、項目２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目３１）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）上記試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｇ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目３２）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目３３）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目３４）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
上記医学的状態ががんである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記医学的状態が異数性である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記予測カウントがカウント中央値である、項目３０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目３０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
上記カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、項目３０から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目３０から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目３０から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目３０から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目３０から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目５０または５１に記載の方法。
（項目５３）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目５１または５２に記載の方法。
（項目５４）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目５１から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目３０から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
上記正規化されたカウントがｚスコアである、項目３０から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
上記正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、項目３０から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
上記第１のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目３０から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目４４から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
上記パーセント表示が染色体表示である、項目５５から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）（ｃ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｇ）（ｆ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目６２）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）上記試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目６３）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）（ｂ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｆ）（ｅ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目６４）
遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）（ａ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と上記参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目６５）
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目６１から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
上記遺伝的変異が微小欠失である、項目６１から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
上記微小欠失が第２２染色体上にある、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
上記微小欠失が第２２染色体の領域２２ｑ１１．２において起こっている、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
上記微小欠失が、参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間で起こっている、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
上記正規化されたカウントの誘導値がＺスコアである、項目６１から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
上記ＺスコアがロバストなＺスコアである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目６１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目６１から７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目６１から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
上記医学的状態ががんである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
上記医学的状態が異数性である、項目７４に記載の方法。
（項目７７）
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目６１から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目６１から７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
上記ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
上記予測カウントがカウント中央値である、項目６１から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目６１から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
上記カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、項目６１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目６１から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目６１から８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目６１から８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目６１から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目８８または８９に記載の方法。
（項目９１）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目８９または９０に記載の方法。
（項目９２）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目８９から９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目６１から９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
上記正規化されたカウントがｚスコアである、項目６１から９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
上記正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、項目６１から９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
上記第１のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目６１から９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目８２から９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
上記パーセント表示が染色体表示である、項目９３から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）（ｃ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｇ）（ｆ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目１００）
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）上記試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目１０１）
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）（ｂ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｆ）（ｅ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目１０２）
微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）（ａ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目１０３）
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目９９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
上記微小欠失が第２２染色体上にある、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
上記微小欠失が第２２染色体の領域２２ｑ１１．２において起こっている、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
上記微小欠失が、参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間で起こっている、項目１０４に記載の方法。
（項目１０７）
上記正規化されたカウントの誘導値がＺスコアである、項目９９から１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
上記ＺスコアがロバストなＺスコアである、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血漿由来のものである、項目９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
上記試料核酸が上記試験被験体由来の血清由来のものである、項目９９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
上記遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、項目９９から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
上記医学的状態ががんである、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
上記医学的状態が異数性である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
上記試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、項目９９から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
上記無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、項目９９から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
上記ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
上記ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
上記予測カウントがカウント中央値である、項目９９から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
上記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、項目９９から１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
上記カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、項目９９から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
上記カウントを、正規化モジュールによって正規化する、項目９９から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
上記核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、項目９９から１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
上記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、項目９９から１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
上記核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、項目９９から１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
上記配列読み取りを上記配列決定モジュールから上記マッピングモジュールに移行する、項目１２５または１２６に記載の方法。
（項目１２８）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りを上記マッピングモジュールから上記カウントモジュールに移行する、項目１２６または１２７に記載の方法。
（項目１２９）
上記参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた上記核酸配列読み取りのカウントを、上記カウントモジュールから上記正規化モジュールに移行する、項目１２６から１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
上記カウントを正規化する上記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、項目９９から１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
上記正規化されたカウントがｚスコアである、項目９９から１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
上記正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、項目９９から１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
上記第１のゲノミックセクションについての上記カウントの上記誘導値が上記第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、項目９９から１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
上記中央値がパーセント表示の中央値である、項目１１９から１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
上記パーセント表示が染色体表示である、項目１３０から１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
上記正規化された試料カウントが、上記カウントの上記誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化することを含むプロセスによって得られ、上記誘導値が上記第１のゲノムセクションについてのカウントを上記第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについてのカウントで割ることによって決定される第１のゲノムセクションカウント表示である、項目１から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
上記第１のゲノムセクションについての上記カウントの上記誘導値を上記予測カウントの誘導値に従って正規化し、上記予測カウントの上記誘導値が、上記第１のゲノムセクションについての予測カウントを上記第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについての予測カウントで割ることによって決定される予測された第１のゲノムセクションカウント表示である、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
上記第１のゲノムセクションが染色体または染色体の部分であり、上記複数のゲノムセクションが常染色体を含む、項目１から１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
上記染色体が第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体である、項目１３８に記載の方法。
（項目１４０）
上記正規化された試料カウントが、上記第１のゲノムセクションについてのカウントから上記予測カウントを引き算し、それにより減算値を生成し、上記減算値を上記カウントの変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、項目１から１２０、項目１３８および項目１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
上記予測カウントの変動性の上記推定値が上記カウントの中央絶対偏差（ＭＡＤ）である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４２）
上記カウントの変動性の上記推定値が、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値である、項目１４０に記載の方法。
（項目１４３）
上記変動性の上記推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目１４０から１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
上記変動性の上記推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、項目１４０から１４２のいずれか一項に記載の方法。（項目１４５）
上記変動性の上記推定値および上記予測カウントが、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目１４０から１４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
上記正規化された試料カウントが、上記第１のゲノムセクションカウント表示から上記予測された第１のゲノムセクションカウント表示を引き算し、それにより減算値を生成し、上記減算値を上記第１のゲノムセクションカウント表示の変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、項目１から１３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が上記カウント表示の中央絶対偏差（ＭＡＤ）である、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
上記カウント表示の変動性の上記推定値が、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｓによって導入されるＭＡＤの代替値またはブートストラップ推定値である、項目１４６に記載の方法。
（項目１４９）
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目１４６から１４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５０）
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、項目１４６から１４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５１）
上記予測カウント表示の変動性の上記推定値および上記予測された第１のゲノムセクションカウント表示が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、項目１４６から１５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５２）
上記１つまたは複数の共通の実験条件がフローセルを含む、項目１から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
上記１つまたは複数の共通の実験条件がフローセル内のチャネルを含む、項目１から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５４）
上記１つまたは複数の共通の実験条件が試薬プレートを含む、項目１から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５５）
上記試薬プレートを使用して配列決定のために核酸を段階分けする、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
上記試薬プレートを使用して配列決定のために核酸ライブラリーを調製する、項目１５４に記載の方法。
（項目１５７）
上記１つまたは複数の共通の実験条件が同定タグ指標を含む、項目１から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５８）
上記正規化された試料カウントを、上記ヌクレオチド配列読み取りまたは上記試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正する、項目１から１５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５９）
上記カウントまたは上記正規化された試料カウントを局所重み付け多項式回帰に供するステップを含む、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
上記局所重み付け多項式回帰がＬＯＥＳＳ回帰である、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、項目１から１５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６２）
上記カウントまたは上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
上記正規化された試料カウントを得る前に上記カウントをフィルタリングするステップを含む、項目１から１６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６４）
上記試料核酸が一本鎖核酸を含む、項目１から１６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６５）
上記試料核酸が二本鎖核酸を含む、項目１から１６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６６）
上記ヌクレオチド配列読み取りを得るステップが、上記試料核酸を、配列決定デバイスを使用した配列決定プロセスに供することを含む、項目１から１６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６７）
アウトカムをもたらすステップが、上記試料核酸中の胎児核酸の分率をファクタリングすることを含む、項目１から１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
上記試料核酸中の胎児核酸の分率を決定するステップを含む、項目１から１６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６９）
上記正規化された試料カウントを、上記ヌクレオチド配列読み取りまたは上記試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正せずに得る、項目１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
上記正規化された試料カウントを１つの実験条件について得る、項目１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
上記実験条件がフローセルである、項目１７０に記載の方法。
（項目１７２）
上記正規化された試料カウントを２つの実験条件について得る、項目１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
上記実験条件がフローセルおよび試薬プレートである、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
上記実験条件がフローセルおよび同定タグ指標である、項目１７２に記載の方法。
（項目１７５）
上記正規化された試料カウントを３つの実験条件について得る、項目１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７６）
上記実験条件がフローセル、試薬プレートおよび同定タグ指標である、項目１７５に記載の方法。
（項目１７７）
上記正規化された試料カウントを、（ｉ）グアニンおよびシトシンの含量に従って補正し、（ｉ）の後に、（ｉｉ）実験条件に従って補正した後に得る項目１から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７８）
上記正規化された試料カウントを、（ｉ）の前に上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正した後に得る、項目１７７に記載の方法。
（項目１７９）
（ｉｉ）が、フローセルに従って補正することからなる、項目１７７または１７５に記載の方法。
（項目１８０）
（ｉｉ）が、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目１７７または１７５に記載の方法。
（項目１８１）
（ｉｉ）が、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目１７７または１７５に記載の方法。
（項目１８２）
（ｉｉ）が、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、項目１７７または１７５に記載の方法。
（項目１８３）
上記正規化された試料カウントを、フローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目１６９に記載の方法。
（項目１８４）
上記正規化された試料カウントを、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目１６９に記載の方法。
（項目１８５）
上記正規化された試料カウントを、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目１６９に記載の方法。
（項目１８６）
上記正規化された試料カウントを、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、項目１６９に記載の方法。
（項目１８７）
上記正規化された試料カウントを、上記参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正し、その後に上記実験条件に従って補正した後に得る、項目１８０から１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８８）
上記正規化された試料カウントがＺスコアである、項目１３６から１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
（ｉ）が、
（ａ）各試料について（ｉ）上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）上記部分のそれぞれについてのＧＣ含量との間のフィッティングした関係から、複数の試料について上記参照ゲノムの部分のそれぞれについてのグアニンおよびシトシン（ＧＣ）の偏りを決定することと、
（ｂ）（ｉ）上記ＧＣの偏りと（ｉｉ）上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係から上記参照ゲノムの部分のそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度をもたらし、それにより、上記算出されたゲノミックセクションの高度において、上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントの偏りが減少することと
を含む、項目１７７から１８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９０）
上記参照ゲノムの部分が染色体内にある、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
上記参照ゲノムの部分が染色体の部分内にある、項目１８９に記載の方法。
（項目１９２）
上記染色体が第２１染色体である、項目１８９から１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９３）
上記染色体が第１８染色体である、項目１８９から１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９４）
上記染色体が第１３染色体である、項目１８９から１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９５）
（ｂ）の前に、上記参照ゲノムの部分のいくつかまたは全部にマッピングされた配列読み取りのカウントについて誤差の尺度を算出し、上記参照ゲノムの特定の部分についての配列読み取りのカウントを上記誤差の尺度の閾値に従って除去または重み付けすることを含む、項目１８９から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９６）
上記閾値を、第１のゲノミックセクションの高度と第２のゲノミックセクションの高度との間の標準偏差ギャップ３．５以上に応じて選択する、項目１９５に記載の方法。
（項目１９７）
上記誤差の尺度がＲ因子である、項目１９５または１９６に記載の方法。
（項目１９８）
Ｒ因子が約７％〜約１０％である上記参照ゲノムの部分についての配列読み取りのカウントを（ｂ）の前に除去する、項目１９７に記載の方法。
（項目１９９）
（ｂ）の上記フィッティングした関係がフィッティングした線形関係である、項目１８９から１９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２００）
上記関係の傾きを線形回帰によって決定する、項目１９９に記載の方法。
（項目２０１）
各ＧＣの偏りがＧＣの偏り係数であり、上記ＧＣの偏り係数が（ｉ）上記参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）上記部分のそれぞれについてのＧＣ含量との間の線形関係の傾きである、項目１９９または２００に記載の方法。
（項目２０２）
（ｂ）の上記フィッティングした関係がフィッティングした非線形関係である、項目１８９から１９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０３）
各ＧＣの偏りが、ＧＣ曲率推定値を含む、項目２０２に記載の方法。
（項目２０４）
（ｃ）の上記フィッティングした関係が線形である、項目１８９から２０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０５）
上記関係の傾きを線形回帰によって決定する、項目２０４に記載の方法。
（項目２０６）
（ｂ）の上記フィッティングした関係が線形であり、（ｃ）の上記フィッティングした関係が線形であり、ゲノミックセクションの高度Ｌｉが、上記参照ゲノムの部分のそれぞれについて、方程式α：
Ｌｉ＝（ｍｉ−ＧｉＳ）Ｉ−１ 方程式α
に従って決定され、式中、ＧｉはＧＣの偏りであり、Ｉは（ｃ）の上記フィッティングした関係の切片であり、Ｓは（ｃ）の上記関係の傾きであり、ｍｉは測定された、上記参照ゲノムの各部分にマッピングされたカウントであり、そしてｉは試料である、項目１８９から２０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０７）
上記参照ゲノムの部分の数が約４０，０００以上の部分である、項目１８９から２０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０８）
上記参照ゲノムの各部分が所定の長さのヌクレオチド配列を含む、項目１８９から２０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０９）
上記所定の長さが約５０キロベースである、項目２０８に記載の方法。
（項目２１０）
（ｂ）の上記ＧＣの偏りをＧＣの偏りモジュールによって決定する、項目１８９から２０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１１）
コンピュータ可読プログラムコードが組み込まれたコンピュータで使用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、上記コンピュータ可読プログラムコードが、配列受信モジュール、論理処理モジュール、およびデータディスプレイ編成モジュールを含む別個のソフトウェアモジュールを含み、かつ、試料核酸における遺伝的変異の有無を同定するための方法であって、
（ａ）上記配列受信モジュールによって、試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）上記論理処理モジュールによって、上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）上記論理処理モジュールによって、各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）上記論理処理モジュールによって、１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）上記論理処理モジュールによって、上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムを生成するステップと、
（ｆ）上記データディスプレイ編成モジュールによって、上記論理処理モジュールによって決定されるのに応じて上記試料核酸における上記遺伝的変異の有無を示すデータディスプレイを編成するステップと
を含む方法の実行が遂行されるように適合されている、コンピュータプログラム製品。
（項目２１２）
項目Ｆ１のコンピュータプログラム製品が記憶されているメモリを含む装置。
（項目２１３）
項目Ｆ１に記載のコンピュータプログラム製品の１つまたは複数の機能を実行するプロセッサを含む、項目Ｆ２に記載の装置。
（項目２１４）
核酸配列決定装置および処理装置を含むシステムであって、上記配列決定装置によって試料核酸からヌクレオチド配列読み取りが得られ、上記処理装置によって上記配列決定装置からのヌクレオチド配列読み取りが得られ、かつ
（ａ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）上記正規化された試料カウントに基づいて上記試料核酸における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む方法が実施される、システム。
（項目２１５）
ヒト参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間の２２ｑ１１．２微小欠失の有無を同定する方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）上記試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）上記ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）の上記カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間に対応する１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
（項目２１６）
上記補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、上記残ったカウントを正規化する、項目Ｆ１からＦ３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１７）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｂ）上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている、システム。
（項目２１８）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリは、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｂ）上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている、装置。
（項目２１９）
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｃ）上記正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
（項目２２０）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｂ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、システム。
（項目２２１）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリは、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｂ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、装置。
（項目２２２）
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、上記カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、そして
（ｃ）上記正規化された試料カウントに基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
（項目２２３）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、
上記メモリは、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、上記配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
（ｄ）（ｃ）における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、システム。
（項目２２４）
１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、
上記メモリが、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムの部分にマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントを含み、上記１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
（ｄ）（ｃ）における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている、装置。
（項目２２５）
コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムの部分にマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは上記予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または上記カウントの誘導値を上記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、上記試験被験体と参照被験体の間の、上記正規化されたカウントまたは上記正規化されたカウントの誘導値の差異の統計的有意性を評価し、そして
（ｅ）（ｄ）における上記評価に基づいて、上記試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含む、コンピュータプログラム製品。
図１は、妊娠期間に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての胎児ＤＮＡ分率を示すグラフである。 図２は、母体の年齢に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての胎児ＤＮＡ分率を示すグラフである。 図３は、母体の体重に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての胎児ＤＮＡ分率を示すグラフである。 図４は、フローセルによる第２１染色体のマッチした読み取りに応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体の百分率を示すグラフである。 図５は、プレート数による第２１染色体のマッチした読み取りに応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体の百分率を示すグラフである。 図６は、配列決定のために使用したＩｌｌｕｍｉｎａ計器に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体の百分率を示すグラフである。 図７は、妊娠期間に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体のｚスコアを示すグラフである。 図８は、母体の年齢に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体のｚスコアを示すグラフである。 図９は、母体の体重に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体のｚスコアを示すグラフである。 図１０は、ライブラリー濃度に応じてプロットした、選択された試料のそれぞれについての第２１染色体のｚスコアを示すグラフである。 図１１は、ライブラリー調製最適化を示すグラフである。図１１Ａは、半自動化ライブラリー調製方法によって調製した標準化されたライブラリー濃度（ｎ＝２８７）と手動ライブラリー調製方法によって調製した標準化されたライブラリー濃度についての比較を示す。図１４Ｂは、９３の試料のそれぞれについてのＧＣＲＭに基づくｚスコアを示す。確認された正倍数性試料（ｎ＝８３）が薄い灰色で示されている。確認された２１トリソミー試料（ｎ＝１０）が濃い灰色で示されている。 図１２は、ｚスコアの対応のある比較を示すグラフである。対の試料についてＺスコアを算出し、ｘ軸は上記のＧＣについて正規化し、反復マスキングしたｚスコアであり、ｙ軸は１２プレックスで配列決定した同じライブラリーからのｚスコアである。核型分析によってトリソミーと分類された試料が、図１２Ａ（第２１染色体）、図１２Ｂ（第１３染色体）、または図１２Ｃ（第１８染色体）で濃い灰色で示されている。各異数性状態に関して影響を受けていない試料が薄い灰色で示されている。各プロット内の横線および縦線は、その染色体についてのそれぞれの分類カットオフを示す（第２１染色体についてはｚ＝３、第１３染色体および第１８染色体についてはｚ＝３．９５）。 図１３は、Ｚスコア（ｘ軸）対胎児分率（ｙ軸）を示すグラフである。各異数性染色体についての染色体特異的ｚスコアが胎児ＤＮＡの割合（胎児分率）に対してプロットされている。核型分析によってトリソミーと分類された試料が、図１３Ａ（第２１染色体）、図１３Ｂ（第１３染色体）、または図１３Ｃ（第１８染色体）で濃い灰色で示されている。各異数性状態に関して影響を受けていない試料が薄い灰色で示されている。各プロット内の横線は各染色体についてのそれぞれの分類カットオフを示す（第２１染色体についてはｚ＝３、第１３染色体および第１８染色体についてはｚ＝３．９５）。各パネル内の破線の縦線は影響を受けた試料のロバストな線形フィッティングを示す。各パネル内の破線の横線は影響を受けていない試料全てのロバストな線形フィッティングを示す。 図１４は、ｚスコアの対応のある比較を示す。１２６９対の試料についてＺスコアを算出し、ｘ軸は上記のＧＣについて正規化し、反復マスキングしたｚスコアであり、ｙ軸はハイスループットなアッセイからのｚスコアである。核型分析によってトリソミーと分類された試料が図１４Ａ（第２１染色体）、図１４Ｂ（第１３染色体）、または図１４Ｃ（第１８染色体）で濃い灰色で示されている。各異数性状態に関して影響を受けていない試料が薄い灰色で示されている。各プロット内の横線および縦線は、その染色体についてのそれぞれの分類カットオフを示す（第２１染色体についてはｚ＝３、第１３染色体および第１８染色体についてはｚ＝３．９５）。
遺伝的変異を同定するために有用な改善された方法、プロセスおよび装置が提供される。１つまたは複数の遺伝的変異または遺伝分散を同定することが、特定の医学的状態の診断、またはそれに対する素因の決定につながる可能性がある。遺伝分散を同定することにより、医学的決定を容易にし、かつ／または有用な医学的手順を使用することができる。
遺伝的変異および医学的状態
遺伝分散の有無は、本明細書に記載の方法または装置を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法および装置によってもたらされるアウトカムに応じて１つまたは複数の遺伝的変異の有無を決定する。遺伝的変異は、一般には、特定の個体に存在する特定の遺伝的表現型であり、多くの場合、遺伝的変異は、個体の統計的に有意な亜集団に存在する。遺伝的変異の非限定的な例としては、１つまたは複数の欠失（例えば、微小欠失）、重複（例えば、微小重複（ｍｉｃｒｏ−ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ））、挿入、突然変異、多型（例えば、一塩基多型）、融合、反復（例えば、短いタンデム反復）、別個のメチル化部位、別個のメチル化パターンなど、およびそれらの組合せが挙げられる。挿入、反復、欠失、重複、突然変異または多型は、任意の観察される長さであってよく、いくつかの実施形態では、約１塩基または塩基対（ｂｐ）〜１，０００キロベース（ｋｂ）の長さ（例えば、約１０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、または１０００ｋｂの長さ）である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、下でさらに詳細に記載されている染色体異常（例えば異数性）、部分的な染色体異常またはモザイク現象である。
被験体について有無が同定される遺伝的変異は、ある特定の実施形態では医学的状態に関連付けられる。したがって、本明細書に記載の技術を使用して、医学的状態（ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）または医学的容態（ｍｅｄｉｃａｌ ｓｔａｔｅ）に関連付けられる１つまたは複数の遺伝的変異の有無を同定することができる。医学的状態の非限定的な例としては、知的障害（例えば、ダウン症候群）、異常な細胞増殖（例えば、がん）、微生物核酸の存在（例えば、ウイルス、細菌、真菌、酵母）、および子癇前症に関連するものが挙げられる。
遺伝的変異、医学的状態および容態（ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｅｓ）の非限定的な例は下に記載されている。
胎児の性別
いくつかの実施形態では、胎児の性別の予測を、本明細書に記載の方法または装置によって決定することができる。性別の決定は、一般には、性染色体に基づく。ヒトでは、Ｘ染色体およびＹ染色体の２種の性染色体が存在する。ＸＸの個体は女性であり、ＸＹは男性であり、また、非限定的なバリエーションンとしてＸＯ、ＸＹＹ、ＸＸＸおよびＸＸＹが挙げられる。
染色体異常
いくつかの実施形態では、胎児の染色体異常の有無は、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定することができる。染色体異常としては、限定することなく、染色体全体または１つまたは複数の遺伝子を含む染色体の領域の増減が挙げられる。染色体異常としては、モノソミー、トリソミー、ポリソミー、異型接合性の欠如、不均衡転座によって引き起こされる欠失および重複を含めた１つまたは複数のヌクレオチド配列（例えば、１つまたは複数の遺伝子）の欠失および／または重複が挙げられる。「異数性（ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）」および「異数性の（ａｎｅｕｐｌｏｉｄ）」という用語は、本明細書で使用される場合、生物体の細胞内の染色体の数が異常であることを指す。異なる生物体が有する染色体組は広範に変動するので、「異数性」という用語は、染色体の特定の数を指すのではなく、生物体内の所与の１つまたは複数の細胞の染色体含量の状況が異常である状況を指す。
モノソミーとは、一般には、正常な組の一方の染色体が欠如していることである。染色体の部分のみが単一のコピーで存在する部分モノソミーが不均衡転座または欠失で起こり得る。例えば、性染色体（４５、Ｘ）のモノソミーにより、ターナー症候群が引き起こされる。
ダイソミーとは、一般に、染色体の２つのコピーが存在することである。各染色体の２つのコピーを有する（二倍体である、または「正倍数性」である）ヒトなどの生物体については、ダイソミーとは正常な状態である。通常各染色体のコピーを３つ以上有する（三倍体以上である）生物体については、ダイソミーは、異数性染色体の状態である。片親性ダイソミーでは、染色体の両方のコピーが同じ親に由来する（他方の親からの寄与がない）。
トリソミーとは、一般に、特定の染色体の２つのコピーではなく３つのコピーが存在することである。ヒトダウン症候群に見いだされる、第２１染色体が余分に存在することは、「２１トリソミー」と称される。１８トリソミーおよび１３トリソミーは、２種の他のヒト常染色体トリソミーである。性染色体のトリソミーは、女性（例えば、４７、ＸＸＸ）または男性（例えば、クラインフェルター症候群における４７、ＸＸＹ；または４７、ＸＹＹ）において見ることができる。
テトラソミーおよびペンタソミーとは、一般に、染色体のコピーがそれぞれ４つまたは５つ存在することである。常染色体ではめったに見られないが、ＸＸＸＸ、ＸＸＸＹ、ＸＸＹＹ、ＸＹＹＹ、ＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＹ、ＸＸＸＹＹ、ＸＸＹＹＹおよびＸＹＹＹＹを含めた性染色体のテトラソミーおよびペンタソミーがヒトにおいて報告されている。
染色体異常は、種々の機構によって引き起こされ得る。機構としては、これだけに限定されないが、（ｉ）有糸分裂チェックポイントが弱まった結果として起こる不分離、（ｉｉ）多数の染色体において不分離を引き起こす不活性な有糸分裂チェックポイント、（ｉｉｉ）１つの動原体が有糸分裂紡錘体極の両方に付着した場合に起こるメロテリック付着、（ｉｖ）３つ以上の紡錘体極が形成された場合の多極紡錘の形成、（ｖ）単一の紡錘体極のみが形成された場合の単極紡錘の形成、および（ｖｉ）単極紡錘機構の最終結果として生じる四倍体の中間体が挙げられる。
部分モノソミーまたは部分トリソミーとは、一般には染色体の部分が減少または増加することによって引き起こされる遺伝物質の不均衡である。部分モノソミーまたは部分トリソミーは、個体が２つの異なる染色体の破壊および融合によって形成される誘導染色体を有する不均衡転座によって生じ得る。この状況では、個体は１つの染色体の部分の３つのコピー（２つの正常なコピーおよび誘導染色体上に存在する部分）ならびに、誘導染色体に関与する他の染色体の部分のただ１つのコピーを有する。
モザイク現象とは、一般には、生物体の全ての細胞ではないがいくつかの細胞における異数性である。ある特定の染色体異常がモザイク型染色体異常および非モザイク型染色体異常として存在し得る。例えば、ある特定の２１トリソミーの個体はモザイク型ダウン症候群を有し、いくつかは非モザイク型ダウン症候群を有する。異なる機構によりモザイク現象が導かれ得る。例えば、（ｉ）最初の接合体が３つの第２１染色体を有する可能性があり、その結果、通常は単純２１トリソミーになるが、細胞分裂の過程中、１つまたは複数の細胞株が第２１染色体のうちの１つを失う；および（ｉｉ）最初の接合体が２つの第２１染色体を有する可能性があるが、細胞分裂の過程中、第２１染色体のうちの１つが重複する。体細胞モザイク現象は、一般には完全な異数性またはモザイク型異数性を伴う遺伝的症候群に関連付けられるものとは別個の機構によって起こる可能性がある。体細胞モザイク現象は、例えば、ある特定の種類のがんにおいて、およびニューロンにおいて同定されている。ある特定の例では、１２トリソミーは慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）において同定されており、８トリソミーは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において同定されている。また、個体が染色体の破壊の素因を有する遺伝的症候群（染色体不安定性症候群）には、しばしば、種々の種類のがんのリスクの増加が伴い、したがって、がん発生における体細胞異数性の役割が強調される。本明細書に記載の方法およびプロトコールにより、非モザイク型染色体異常およびモザイク型染色体異常の有無を同定することができる。
表１Ａおよび表１Ｂには、本明細書に記載の方法および装置によって潜在的に同定することができる染色体の状態、症候群および／または異常の非限定的な一覧が示されている。表１Ｂは、２０１１年１０月６日現在のＤＥＣＩＰＨＥＲデータベース（例えば、バージョン５．１、ＧＲＣｈ３７にマッピングされた位置に基づく；統一資源位置指定子（ＵＲＬ）ｄｅｃｈｉｐｈｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋにおいて利用可能）からのものである。

グレード１の状態では、多くの場合、以下の特性の１つまたは複数を有する；病原となる異常；遺伝学者の間での強力な合意；高度な浸透性；なお変動する表現型を有し得るがいくつかの共通の特徴を有し得る；文献における症例の全てが臨床表現型を有する；異常を有する健康な個体の症例がない；ＤＶＧデータベースで報告されていないまたは健康な集団では見いだされない；機能データにより単一遺伝子または多重遺伝子の量効果が確認される；確認されたまたは強力な候補遺伝子；定義済みの臨床管理的意味；サーベイランスの意味がある公知のがんリスク；多数の情報源（ＯＭＩＭ、Ｇｅｎｅｒｅｖｉｅｗｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ、Ｕｎｉｑｕｅ、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）；および／または診断への使用（生殖カウンセリング）に利用可能である。
グレード２の状態では、多くの場合、以下の特性の１つまたは複数を有する；病原となる可能性が高い異常；高度な浸透性；表現型が変動し、ＤＤ以外の一貫した特徴がない；文献における症例／報告が少数である；報告された症例の全てが臨床表現型を有する；機能データまたは確認された病原性遺伝子がない；多数の情報源（ＯＭＩＭ、Ｇｅｎｅｒｅｖｉｅｗｓ、Ｏｒｐｈａｎｅｔ、Ｕｎｉｑｕｅ、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）；および／または診断目的および生殖カウンセリングのために使用することができる。
グレード３の状態では、多くの場合、以下の特性の１つまたは複数を有する；感受性遺伝子座；健康な個体または記載の発端者の影響を受けていない親；対照母集団において存在する；非浸透性；表現型が軽度であり特異的でない；特徴の一貫性が低いこと；機能データまたは確認された病原性遺伝子がない；データの供給源が限られている；第２の診断の可能性が、大多数から逸脱する症例または新規の臨床的所見が存在する場合の可能性のままである；および／または診断目的で使用する際の注意および生殖カウンセリングのための慎重な助言。
子癇前症
いくつかの実施形態では、子癇前症の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定する。子癇前症は、妊娠中に高血圧症が生じ（すなわち妊娠誘導性高血圧症）、尿中に著しい量のタンパク質を伴う状態である。いくつかの場合には、子癇前症は、細胞外核酸のレベルの上昇および／またはメチル化パターンの変更にも関連する。例えば、細胞外胎児由来高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａレベルと子癇前症の重症度との間の正の相関が観察された。ある特定の例では、子癇前症の胎盤において、正常対照と比較して、Ｈ１９遺伝子についてＤＮＡのメチル化の増加が観察される。
子癇前症は、世界的に、母体および胎児／新生児の死亡率および罹患率の主な原因の１つである。血漿および血清中の循環している無細胞核酸は、出生前診断を含めた種々の医学分野における有望な臨床的適用を伴う新規のバイオマーカーである。切迫子癇前症の指標として母体の血漿中の無細胞胎児（ｃｆｆ）ＤＮＡの定量的変化が、種々の試験において、例えば、雄性特異的なＳＲＹ遺伝子座またはＤＹＳ１４遺伝子座についてのリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して報告されている。早発性子癇前症の場合、レベルの上昇は第１三半期に見られ得る。症状が発症する前のｃｆｆＤＮＡのレベルの上昇は、組織酸化ストレスおよび胎盤のアポトーシスおよび壊死の増加につながる絨毛間腔内の低酸素／再酸素化に起因する可能性がある。子癇前症では、母体の循環中へのｃｆｆＤＮＡの脱落が増加する証拠に加えて、ｃｆｆＤＮＡの腎クリアランスが低下する証拠も存在する。胎児ＤＮＡの量は現在、Ｙ染色体特異的配列を定量することによって決定されるので、全無細胞ＤＮＡの測定、または、ＤＮＡのメチル化などの性別に依存しない胎児の後成的マーカーの使用などの代替の手法により、代替法がもたらされる。胎盤起源の無細胞ＲＮＡは、臨床上の実施において子癇前症をスクリーニングし、診断するために使用することができる別の代替のバイオマーカーである。胎児ＲＮＡは、それを分解から保護する細胞レベル下の胎盤粒子を伴う。胎児ＲＮＡレベルは、時には子癇前症の妊婦において対照と比較して１０倍高くなり、したがって、臨床上の実施において子癇前症をスクリーニングし、診断するために使用することができる代替のバイオマーカーである。
病原体
いくつかの実施形態では、病原となる状態の有無を本明細書に記載の方法または装置によって決定する。病原となる状態は、宿主が、これだけに限定されないが、細菌、ウイルスまたは真菌を含めた病原体に感染することよって引き起こされる可能性がある。病原体は、一般には、宿主核酸と区別可能であり得る核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を保有するので、本明細書において提供される方法および装置を使用して、病原体の有無を決定することができる。多くの場合、病原体は、例えば、後成的な状態および／または１つまたは複数の配列の変動、重複および／または欠失などの特定の病原体に独特の特性を持つ核酸を保有する。したがって、本明細書において提供される方法を使用して、特定の病原体または病原体の変異体（例えば株）を同定することができる。
がん
いくつかの実施形態では、細胞増殖障害（例えば、がん）の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定する。例えば、血清中の無細胞核酸のレベルが、種々の種類のがんの患者において健康な患者と比較して上昇する可能性がある。転移性疾患の患者では、例えば、時には、血清ＤＮＡレベルが非転移性患者のおよそ２倍であり得る。転移性疾患の患者は、例えば、がん特異的マーカーおよび／またはある特定の一塩基多型または短いタンデム反復によって同定することもできる。循環しているＤＮＡのレベルの上昇と正に相関する可能性があるがんの種類の非限定的な例としては、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肝細胞がん、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、膀胱がん、ヘパトーマ、子宮頸がん、食道がん、膵がん、および前立腺がんが挙げられる。種々のがんは、例えば、後成的な状態および／または配列の変動、重複および／または欠失などの、非がん性の健康な細胞由来の核酸と区別可能な特性を持つ核酸を保有する可能性があり、時にはそれらを血流中に放出する可能性がある。そのような特性は、例えば、特定のがんの種類に特異的であり得る。したがって、さらに、本明細書において提供される方法を使用して、特定のがんの種類を同定することができることが意図されている。
他の遺伝的変異
いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無を、本明細書に記載の方法または装置を使用することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、遺伝的変異は、コピー数多型（ＣＮＶ）、微小欠失、重複、または影響を受けていない個体において観察された予測遺伝子の量からの遺伝子の量の変動を引き起こすまたはもたらす任意の状態から選択される１つまたは複数の状態である。いくつかの実施形態では、コピー数多型とは、１つまたは複数のゲノミックセクション、染色体、または染色体の一部の構造的再編成を指し、この再編成は、多くの場合、欠失、重複、逆位、および／または転座によって引き起こされる。ＣＮＶは、遺伝性のものまたは新規の突然変異によって引き起こされるものであり得、一般には、１つまたは複数のゲノミックセクションのコピーの数が異常になる（例えば、影響を受けていない試料に対して遺伝子量が異常になる）。いくつかの実施形態では、コピー数多型は１キロベースの小ささから数メガベースまでにわたる領域において起こり得る。ＣＮＶは、種々の細胞遺伝学的方法（ＦＩＳＨ、ＣＧＨ、ａＣＧＨ、核型分析）および／または配列決定方法を使用して検出することができる。
微小欠失は、一般には、選択されたゲノミックセクションまたはセグメントに位置する遺伝物質（例えば、特定の領域を代表するＤＮＡ、遺伝子、核酸）の量が、影響を受けていない領域に対して減少することである。微小欠失、および微小欠失によって引き起こされる症候群は、多くの場合、それが存在しないことにより時には疾患状態が付与される１つまたは複数の遺伝子にわたる１つまたは複数の染色体セグメントの小さな欠失（例えば、一般に５メガベース未満）を特徴とする。微小欠失は、時には、減数分裂の間の染色体の乗換えの誤りによって引き起こされる。多くの場合、微小欠失は、現在利用されている核型分析方法では検出可能ではない。
染色体重複、または微小重複または重複は、一般に、遺伝物質（例えば、特定の領域を代表するＤＮＡ、遺伝子、核酸）の量が、影響を受けていない領域と比較して増加する１つまたは複数の領域である。重複は、しばしば、相同組換えの誤りの結果として起こる、またはレトロトランスポゾン事象に起因する。重複は、いくつかの場合には、小さな領域（何千もの塩基対）から染色体全体までにわたる可能性がある。重複は、ある特定の種類の増殖性疾患に関連付けられている。重複は、ゲノムマイクロアレイまたは比較遺伝学的ハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して特徴付けることができる。重複は、時には、１回または複数回反復される（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回反復される）遺伝子領域と特徴付けられる。
試料
本明細書に記載の方法および装置において利用する核酸は、多くの場合、被験体から得た試料から単離される。いくつかの実施形態では、被験体は試験被験体と称され、ある特定の実施形態では、被験体は試料被験体または参照被験体と称される。いくつかの実施形態では、試験被験体とは、遺伝的変異の有無について評価される被験体を指す。試料被験体、または参照被験体は、多くの場合、試験被験体と比較するための基礎とし利用される被験体であり、参照被験体は、時には、参照被験体が、試験被験体について評価している遺伝的変異を有さない、またはそれを有することが分かっているという知見に基づいて選択される。被験体は、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌または原生生物を含めた任意の生きている生物体または生きていない生物体であってよい。これだけに限定されないが、哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、ヤギ亜科およびヒツジ属の動物（例えば、ヒツジ、ヤギ）、イノシシ科の動物（例えば、ブタ）、ラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科の動物（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含めた任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができる。被験体は雄であっても雌（例えば女性）であってもよい。
核酸は、任意の種類の適切な生物検体または試料から単離することができる。検体の非限定的な例としては、これだけに限定することなく、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液（ｃｅｒｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、脊髄液、洗浄液（ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ）（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡検査）、生検試料（例えば、着床前胚由来）、腹腔穿刺試料、胎児有核細胞または胎児細胞残留物、女性生殖器系の洗液（ｗａｓｈｉｎｇ）、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、洗浄液（ｌａｖａｇｅ）、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、胚細胞および胎児の細胞（例えば胎盤細胞）を含めた被験体由来の体液または組織が挙げられる。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液であってよく、時には血漿または血清であってよい。本明細書で使用される場合、「血液」とは、一般に、全血、または、例えば、慣習的に定義される血清および血漿などの血液の任意の画分を指す。血漿とは、抗凝固薬を用いて処理した血液を遠心分離することによって生じる全血の画分を指す。血清とは、血液試料が凝固した後に残る体液の水分を多く含む部分を指す。体液または組織試料は、多くの場合、病院または診療所が一般に従う標準のプロトコールに従って採取する。血液については、多くの場合、適量の末梢血（例えば、３〜４０ミリリットル）を採取し、さらに調製する前に、標準の手順に従って保管することができる。核酸を抽出する体液または組織試料は細胞を含まなくてよい。いくつかの実施形態では、体液または組織試料は、細胞エレメントまたは細胞残留物を含有してよい。いくつかの実施形態では、胎児の細胞またはがん細胞が試料中に含まれていてよい。
試料は不均一であってよく、これは、２種類以上の核酸種が試料中に存在することを意味する。例えば、不均一な核酸としては、これだけに限定されないが、（ｉ）胎児に由来する核酸および母体に由来する核酸、（ｉｉ）がん核酸および非がん核酸、（ｉｉｉ）病原体核酸および宿主核酸、より一般的には、（ｉｖ）突然変異した核酸および野生型核酸を挙げることができる。試料は、例えば、胎児の細胞および母体の細胞、がん細胞および非がん細胞、または病原性細胞および宿主細胞など、２つ以上の細胞型が存在することに起因して不均一であってよい。いくつかの実施形態では、少数の核酸種と大多数の核酸種が存在する。
本明細書に記載の技術を出生前に適用するために、検査に適した妊娠期間にある女性から、または妊娠の可能性について検査されている女性から体液または組織試料を採取することができる。適切な妊娠期間は、実施される出生前検査に応じて変動し得る。ある特定の実施形態では、妊婦被験体は、時には妊娠第１三半期にあり、時には妊娠第２三半期にあり、時には妊娠第３三半期にある。ある特定の実施形態では、胎児妊娠期間約１週から約４５週の間（例えば、胎児妊娠期間１〜４週、４〜８週、８〜１２週、１２〜１６週、１６〜２０週、２０〜２４週、２４〜２８週、２８〜３２週、３２〜３６週、３６〜４０週または４０〜４４週）に、および時には胎児妊娠期間約５週から約２８週の間（例えば、胎児妊娠期間６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２１週、２２週、２３週、２４週、２５週、２６週または２７週）に妊婦から体液または組織を採取する。
核酸の単離および処理
核酸は、１つまたは複数の供給源（例えば、細胞、土壌など）から当技術分野で公知の方法によって得ることができる。細胞溶解手順および試薬は当技術分野で公知であり、一般に、化学的溶解方法、物理的溶解方法、または電解による溶解方法によって実施され得る。例えば、化学的方法では、一般に、溶解剤を使用して細胞を破壊し、細胞から核酸を抽出し、その後、カオトロピック塩で処理する。凍結／解凍し、その後に粉砕すること、細胞圧搾の使用などの物理的方法も有用である。高塩濃度溶解手順も一般に使用される。例えば、アルカリ性溶解手順を利用することができる。後者の手順では伝統的にフェノール−クロロホルム溶液の使用が組み込まれ、３つの溶液を伴う、フェノール−クロロホルムを含まない代替的な手順を利用することができる。後者の手順では、１つの溶液は１５ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌのＲＮＡ分解酵素Ａを含有してよく、第２の溶液は０．２ＮのＮａＯＨおよび１％のＳＤＳを含有してよく、第３の溶液は３ＭのＫＯＡｃ、ｐＨ５．５を含有してよい。これらの手順は、その全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６（１９８９年）において見ることができる。
「核酸」および「核酸分子」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤で高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非ネイティブな主鎖などを含有する）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）などの任意の組成形態の核酸を指し、その全てが一本鎖または二本鎖の形態であってよい。他に限定がない限り、核酸は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含んでよく、そのいくつかは、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能し得る。核酸は、本発明のプロセスを行うために有用な任意の形態であってよい（例えば、直鎖状、環状、高次コイル、一本鎖、二本鎖など）。核酸は、ある特定の実施形態では、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、またはｉｎ ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞、細胞、細胞核または細胞質において複製することができるまたは複製される他の核酸であってよい、またはそれ由来であってよい。いくつかの実施形態では、核酸は、単一の染色体由来であってよい（例えば、核酸試料は、二倍体の生物体から得た試料の１つの染色体由来であってよい）。核酸は、一本鎖ポリヌクレオチド（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」読み枠または「リバース」読み枠）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成、複製または増幅されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変異体および類似体も含む。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが挙げられる。ＲＮＡについては、塩基シトシンがウラシルに置き換えられており、糖の２’位にヒドロキシル部を含む。核酸は、被験体から得た核酸を鋳型として使用して調製することができる。
核酸は、別の核酸と比較して異なる時点で単離することができ、試料のそれぞれが同じ供給源または異なる供給源に由来してよい。核酸は、例えばｃＤＮＡライブラリーまたはＲＮＡライブラリーなどの核酸ライブラリー由来であってよい。核酸は、試料由来の核酸分子の核酸精製もしくは単離および／または増幅の結果であってよい。本明細書に記載のプロセスのために提供される核酸は、１つの試料由来の核酸または２つ以上の試料由来（例えば、１以上、２以上、３以上の、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の試料由来）の核酸を含有してよい。
ある特定の実施形態では、核酸は細胞外核酸を含んでよい。細胞外核酸は、多くの場合、実質的に細胞を有さない供給源から単離された核酸である。細胞外核酸は、多くの場合、検出可能な細胞を含まず、細胞エレメントまたは細胞残留物を含有し得る。細胞外核酸の細胞を含まない供給源の非限定的な例は、血漿、血清および尿である。理論によって限定されることなく、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞分解の産物であってよく、多くの場合、大きなスペクトルにわたって一連の長さを有する細胞外核酸の基礎をもたらす（例えば、「ラダー」）。
細胞外核酸は、異なる核酸種を含んでよく、したがって、本明細書では、ある特定の実施形態では「不均一」と称される。例えば、がんを有する人由来の血清または血漿は、がん細胞由来の核酸および非がん細胞核酸を含んでよい。別の例では、妊婦由来の血清または血漿は、母体核酸および胎児核酸を含んでよい。いくつかの場合には、胎児核酸は、時には核酸全体の約５％〜約５０％である（例えば、全核酸の約６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、または４９％が胎児核酸である）。いくつかの実施形態では、核酸中の大多数の胎児核酸が約５００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９または１００％が約５００塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態では、核酸中の大多数の胎児核酸が約２５０塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が約２５０塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態では、核酸中の大多数の胎児核酸が約２００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が約２００塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態では、核酸中の大多数の胎児核酸が約１５０塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が約１５０塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態では、核酸中の大多数の胎児核酸が約１００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が約１００塩基対以下の長さである）。
ある特定の実施形態では、核酸を含有する試料（複数可）を処理することなく本明細書に記載の方法を行うために核酸を提供することができる。いくつかの実施形態では、核酸を含有する試料（複数可）を処理した後に本明細書に記載の方法を行うために核酸が提供される。例えば、核酸は、試料（複数可）から抽出、単離、精製または増幅することができる。本明細書で使用される場合、「単離された」とは、その元の環境（例えば、天然に存在する場合は天然の環境、または外因的に発現させた場合は宿主細胞）から取り出され、したがって、その元の環境から人為的な介入によって（例えば、「人間の手によって」）変更された核酸を指す。非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質）が供給源試料中に存在する成分の量よりも少ない、単離された核酸が提供される。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超含まなくてよい。本明細書で使用される場合、「精製された」とは、含有する核酸種が、核酸が由来する試料供給源中の核酸種よりも少ない核酸を指す。核酸を含む組成物は、他の核酸種を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超含まなくてよい。増幅された核酸は、多くの場合、試料の核酸を、試料中の核酸またはその一部のヌクレオチド配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的にまたは指数関数的に生成するプロセスに供することによって調製される。
核酸は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のプロセスのための核酸をもたらす前に、核酸を、核酸断片を生成する方法に供することによって処理することもできる。いくつかの実施形態では、断片化または切断に供された核酸は、公称、アベレージまたは平均の長さが約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、６５塩基対、７０塩基対、７５塩基対、８０塩基対、８５塩基対、９０塩基対、９５塩基対、１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、２０００塩基対、３０００塩基対、４０００塩基対、５０００塩基対、６０００塩基対、７０００塩基対、８０００塩基対または９０００塩基対であってよい。断片は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって生成することができ、核酸断片のアベレージ、平均または公称の長さは、適切な断片生成手順を選択することによって制御することができる。ある特定の実施形態では、小さな配列の変動を含有する、および／または比較的大きな量の公知のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析するために、長さが比較的短い核酸を利用することができる。いくつかの実施形態では、大きな配列の変動を含有する、および／または比較的少量のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析するために、長さが比較的長い核酸を利用することができる。
核酸断片は、オーバーラップしているヌクレオチド配列を含有してよく、そのようなオーバーラップ配列により、断片化されていない対応核酸またはその一部のヌクレオチド配列の構築を容易にすることができる。例えば、１つの断片は部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｘおよびｙを有してよく、別の断片は、部分配列ｙおよびｚを有してよく、ｘ、ｙおよびｚは５ヌクレオチド長以上であってよいヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、オーバーラップ配列ｙを利用して、試料由来の核酸におけるｘ−ｙ−ｚヌクレオチド配列の構築を容易にすることができる。ある特定の実施形態では、核酸を部分的に断片化することもでき（例えば、不完全なまたは終結した特定の切断反応から）、完全に断片化することもできる。
核酸は、これだけに限定することなく、物理的プロセス、化学的プロセスおよび酵素的プロセスを含む当技術分野で公知のさまざまな方法によって断片化することができる。そのようなプロセスの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００５０１１２５９０号に記載されている（２００５年５月２６日公開、Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｏｏｍら、表題「Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」）。非特異的に切断された断片または特異的に切断された断片が生成されるようにある特定のプロセスを選択することができる。非特異的に切断された断片核酸を生成することができるプロセスの非限定的な例としては、限定することなく、核酸を、核酸をせん断力に曝露させる装置に接触させること（例えば、核酸を、シリンジ針を通過させること；フレンチプレスの使用）；核酸を照射（例えば、ガンマ、Ｘ線、ＵＶ照射；照射の強さによって断片サイズを制御することができる）に曝露させること；水中で核酸を煮沸すること（例えば、約５００塩基対の断片をもたらす）および核酸を酸および塩基加水分解プロセスに曝露させることが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「断片化」または「切断」とは、核酸鋳型遺伝子分子またはその増幅産物などの核酸分子を２つ以上のより小さな核酸分子に切り離すことができる手順または条件を指す。そのような断片化または切断は、配列特異的、塩基特異的、または非特異的であってよく、例えば、化学的断片化、酵素的断片化、物理的断片化を含めた種々の方法、試薬または条件のいずれかによって実現することができる。
本明細書で使用される場合、「断片」、「切断産物」、「切断された産物」またはその文法上の変異形は、核酸鋳型遺伝子分子またはその増幅産物の断片化または切断の結果として生じた核酸分子を指す。そのような断片または切断された産物は、切断反応の結果として生じた全ての核酸分子を指し得るが、一般には、そのような断片または切断された産物は、核酸鋳型遺伝子分子または核酸鋳型遺伝子分子の対応するヌクレオチド配列を含有するその増幅産物の一部の断片化または切断の結果として生じた核酸分子のみを指す。例えば、増幅産物は、核酸鋳型配列の増幅されたヌクレオチド領域を超える１つまたは複数のヌクレオチドを含有してよい（例えば、プライマーは、核酸鋳型遺伝子分子と相補的なヌクレオチドに加えて、転写開始配列などの「余分の」ヌクレオチドを含有してよく、その結果、「余分の」ヌクレオチドまたは核酸鋳型遺伝子分子の増幅されたヌクレオチド領域に対応しないヌクレオチドを含有する増幅産物が生じる）。したがって、断片は、少なくとも一部において、代表的な核酸鋳型分子に由来するまたはそれに基づくヌクレオチド配列情報を含有する増幅された核酸分子の一部から生じる断片を含んでよい。
本明細書で使用される場合、「相補的切断反応」とは、同じ標的核酸もしくはタンパク質または参照核酸もしくはタンパク質の代替の切断パターンが生成されるように、同じ核酸に対して、異なる切断試薬を使用して、または同じ切断試薬の切断特異性を変更することによって行う切断反応を指す。ある特定の実施形態では、核酸を、１つまたは複数の反応容器において、１種または複数種の特異的な切断剤（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、またはそれ以上の特異的な切断剤）を用いて処理することができる（例えば、核酸を別々の容器内で特異的な切断剤のそれぞれを用いて処理する）。
核酸を１種または複数種の特異的な切断剤と接触させることによって核酸を特異的に切断することができる。本明細書で使用される場合、「特異的な切断剤」とは、核酸を１つまたは複数の特定の部位で切断することができる作用剤、時には化学物質または酵素を指す。特異的な切断剤は、多くの場合、特定の部位における特定のヌクレオチド配列に応じて特異的に切断する。
酵素的な特異的切断剤の例としては、これだけに限定することなく、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡ分解酵素（例えば、ＤＮＡ分解酵素Ｉ、ＩＩ）；ＲＮＡ分解酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核生物構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、Ｃｆｏ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｌＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭｌｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｇｌｙｃｏｌｓｙｌａｓｅ）（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡザイムが挙げられる。核酸は化学作用剤を用いて処理することができ、修飾された核酸を切断することができる。非限定的な例では、核酸は、（ｉ）アルキル化剤、例えば、アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識され、切断されるＮ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニンを含めたいくつかのアルキル化された塩基を生成するメチルニトロソ尿素など；（ｉｉ）ＤＮＡ内のシトシン残基の脱アミノ化を引き起こして、ウラシルＮ−グリコシラーゼによって切断することができるウラシル残基を形成させる亜硫酸水素ナトリウム；および（ｉｉｉ）グアニンを、ホルムアミドピリミジンＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼによって切断することができるその酸化形態である８−ヒドロキシグアニンに変換する化学作用剤を用いて処理することができる。化学的切断プロセスの例としては、これだけに限定することなく、アルキル化（例えば、ホスホロチオエートで修飾された核酸のアルキル化）；Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）を含有する核酸の酸不安定性の切断；および核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理が挙げられる。
いくつかの実施形態では、断片化された核酸をサイズ分画手順に供すことができ、分画されたプールの全部または一部を単離または分析することができる。サイズ分画手順は、当技術分野で公知である（例えば、アレイ上での分離、分子ふるいによる分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィーによる分離）。
本明細書に記載の方法のための核酸をもたらす前に、核酸を核酸内のある特定のヌクレオチドを修飾するプロセスに曝露させることもできる。例えば、核酸をヌクレオチドのメチル化の状態に基づいて選択的に修飾するプロセスを核酸に適用することができる。さらに、高温、紫外線放射、ｘ線などの条件により、核酸分子の配列の変化を誘導することができる。核酸は、本明細書に記載の配列解析または製造プロセスを行うために有用な任意の形態、例えば、固体または液体の形態でもたらすことができる。ある特定の実施形態では、核酸は、任意選択で、これだけに限定することなく、１種または複数種の緩衝液または塩を含めた１つまたは複数の他の成分を含む液体の形態でもたらすことができる。
配列読み取りを得ること
配列決定、マッピングおよび関連する分析方法は当技術分野で公知である（例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２９３７７号）。そのようなプロセスのある特定の態様は下に記載されている。
読み取りは、一般に、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意の配列決定プロセスによって作製される短いヌクレオチド配列である。読み取りは、核酸断片の一方の末端から生成することができ（「シングルエンド読み取り」）、時には核酸の両末端から生成される（「ダブルエンド読み取り」）。ある特定の実施形態では、被験体から試料の核酸配列読み取りを「得ること」および／または１つまたは複数の参照人から生物検体の核酸配列読み取りを「得ること」は、核酸について直接配列決定して配列情報を得ることを伴う。いくつかの実施形態では、「得ること」は、別途核酸から直接得た配列情報を受け取ることを伴う。
いくつかの実施形態では、１個体由来の１つの核酸試料を配列決定する。ある特定の実施形態では、各生体試料が１個体または２個体以上に由来する２つ以上の生体試料由来の核酸試料をプールし、そのプールを配列決定する。後者の実施形態では、各生体試料由来の核酸試料は、多くの場合、１種または複数種の独特の同定タグによって同定される。
いくつかの実施形態では、ゲノムの画分を配列決定し、それを時には決定されたヌクレオチド配列に包含されるゲノムの量で表す（例えば、１未満の「倍率」カバレッジ）。ゲノムが約１倍カバレッジで配列決定された場合、ゲノムのヌクレオチド配列のおよそ１００％が、読み取りによって表される。ゲノムの所与の領域が２つ以上の読み取りまたはオーバーラップしている読み取りによって包含され得る冗長性を用いてゲノムを配列決定することもできる（例えば、１を超える「倍率」カバレッジ）。いくつかの実施形態では、約０．１倍〜約１００倍カバレッジ、約０．２倍〜２０倍カバレッジ、または約０．２倍〜約１倍カバレッジ（例えば、約０．２倍カバレッジ、０．３倍カバレッジ、０．４倍カバレッジ、０．５倍カバレッジ、０．６倍カバレッジ、０．７倍カバレッジ、０．８倍カバレッジ、０．９倍カバレッジ、１倍カバレッジ、２倍カバレッジ、３倍カバレッジ、４倍カバレッジ、５倍カバレッジ、６倍カバレッジ、７倍カバレッジ、８倍カバレッジ、９倍カバレッジ、１０倍カバレッジ、１５倍カバレッジ、２０倍カバレッジ、３０倍カバレッジ、４０倍カバレッジ、５０倍カバレッジ、６０倍カバレッジ、７０倍カバレッジ、８０倍カバレッジ、９０倍カバレッジ）でゲノムを配列決定する。
ある特定の実施形態では、１回の実行で配列決定される核酸プールの画分を、さらに副選択した後に配列決定する。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションに基づく技法（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用する）を使用して、まず核酸配列について特定の染色体（例えば、潜在的に異数性の染色体および検査された異数性に関与しない他の染色体（複数可））からの副選択を行うことができる。いくつかの実施形態では、核酸をサイズによって分画することができ（例えば、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーによってまたはマイクロフルイディクスに基づく手法によって）、ある特定の例では、分子量が低い核酸（例えば、３００塩基対未満、２００塩基対未満、１５０塩基対未満、１００塩基対未満）を選択することによって、胎児核酸を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、ホルムアルデヒドを添加することによってなど、母体のバックグラウンド核酸を抑制することによって、胎児核酸を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、予め選択した核酸のプールの一部またはサブセットについて無作為に配列決定する。いくつかの実施形態では、配列決定の前に核酸を増幅する。いくつかの実施形態では、配列決定の前に核酸の一部またはサブセットを増幅する。
本明細書に記載の方法を行うために適した任意の配列決定方法を利用することができる。いくつかの実施形態では、ハイスループットな配列決定方法を使用する。ハイスループットな配列決定方法では、一般に、クローン的に増幅したＤＮＡ鋳型またはフローセルにおいて大規模並列処理様式で配列決定した単一のＤＮＡ分子を必要とする（例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ Ｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ １１巻：３１〜４６頁（２０１０年）；Ｖｏｌｋｅｒｄｉｎｇら Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５５巻：６４１〜６５８頁（２００９年）に記載されている）。そのような配列決定方法では、デジタルの定量情報をもたらすこともでき、各配列読み取りは、個々のクローンＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を表す可算「配列タグ」である。ハイスループットな配列決定技術としては、例えば、可逆的ダイターミネーターを用いた１塩基合成反応（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによる配列決定、パイロシークエンスおよびリアルタイム配列決定が挙げられる。
ハイスループットな配列決定方法のために利用するシステムは市販されており、それらとしては、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４ ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬＩＤ ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ ａｎｄ Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍが挙げられる。Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびナノポア配列決定も、ハイスループットな配列決定手法において使用することができる。
いくつかの実施形態では、第１世代の技術、例えば、自動化サンガー配列決定を含めたサンガー配列決定などを本明細書において提供される方法において使用することができる。発展している核酸イメージング技術（例えば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））の使用を含む追加的な配列決定技術も本明細書において考えられている。種々の配列決定技術の例が下に記載されている。
本明細書に記載の方法において使用することができる核酸配列決定技術は、合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および可逆的ターミネーターに基づく配列決定（例えばＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＧｅｎｏｍｅ ＡｎａｌｙｚｅｒＩＩ）である。この技術を用いると、数百万の核酸（例えばＤＮＡ）断片について並行して配列決定することができる。この種類の配列決定技術の１つの例では、表面上にオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）が結合した８つの個々のレーンを有する光学的に透明なスライドを含有するフローセルを使用する。フローセルは、多くの場合、結合した分析物の上を試薬溶液が順序正しく通過することを保持および／または可能にするように構成することができる固体支持体である。フローセルは、しばしば、平面形状であり、光学的に透明であり、一般にミリメートルまたはミリメートル未満の尺度であり、多くの場合、分析物／試薬の相互作用が起こるチャネルまたはレーンを有する。
合成手順による特定の配列決定では、例えば、鋳型ＤＮＡ（例えば、循環している無細胞ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ））を、時には、ライブラリーを生成するための調製中に数百塩基対の長さに断片化する。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡ（例えば、ｃｃｆＤＮＡ）をさらに断片化またはサイズ選択せずにライブラリー調製を実施することができる。ある特定の実施形態では、ライブラリー生成を、実施例２に記載の通り製造者のプロトコールを改変したものを使用して実施する。ある特定の実施形態では、自動化された方法および装置を使用して試料の単離およびライブラリー生成を実施する。簡単に述べると、ｃｃｆＤＮＡをフィルイン反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、エキソヌクレアーゼ反応またはフィルイン反応とエキソヌクレアーゼ反応の組合せによって末端修復する。生じた平滑末端修復ｃｃｆＤＮＡを単一ヌクレオチド分伸長させ、それはアダプタープライマーの３’末端上の一ヌクレオチドオーバーハングと相補的であり、多くの場合、それによりライゲーション効率が上昇する。伸長／オーバーハングヌクレオチドのために任意の相補的なヌクレオチドを使用することができるが（例えば、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ）、しばしば、末端修復ＤＮＡを伸長させるためにアデニンが使用され、多くの場合、３’末端オーバーハングヌクレオチドとしてチミンが使用される。
合成手順によるある特定の配列決定では、例えば、アダプターオリゴヌクレオチドはフローセルアンカーと相補的であり、これを時には、修飾ｃｃｆＤＮＡ（例えば、末端修復し、単一ヌクレオチド延長させた）を、固体支持体、フローセルの内側表面に結びつけるために利用する。いくつかの実施形態では、アダプタープライマーは、指標ヌクレオチド、または「バーコード」ヌクレオチド（例えば、試料を一義的に同定することを可能にする指標プライマーとして使用可能なヌクレオチドの独特の配列）、１つまたは複数の配列決定プライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、ユニバーサル配列決定プライマー、シングルエンド配列決定プライマー、ペアエンド配列決定プライマー、多重化配列決定プライマーなどと相補的な配列）、またはそれらの組合せ（例えば、アダプター／配列決定、アダプター／指標、アダプター／指標／配列決定）を含む。アダプタープライマーに含有される指標プライマーまたはヌクレオチドは、多くの場合、６ヌクレオチド以上の長さであり、しばしば、プライマー内に、指標ヌクレオチドが配列決定反応の間に配列決定される最初のヌクレオチドになるように位置づけられる。ある特定の実施形態では、指標ヌクレオチドまたはバーコードヌクレオチドは試料と結びついているが、配列読み取りの質が損なわれることを回避するために別々の配列決定反応で配列決定する。その後、バーコードの配列決定および試料の配列決定からの読み取りを一緒に連結させ、読み取りを逆多重化する。連結し逆多重化した後、配列読み取りを本明細書に記載の通りさらに補正または処理することができる。
合成手順によるある特定の配列決定では、指標プライマーを利用することにより、フローセルレーンにおける配列反応を多重化することが可能になり、それにより、フローセル１レーン当たり複数の試料を分析することが可能になる。所与のフローセルレーンにおいて分析することができる試料の数は、多くの場合、ライブラリー調製の間に利用する独特の指標プライマーの数に左右される。指標プライマーは、いくつもの商業的な供給源（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＥＢ）から入手可能である。実施例２に記載の反応を、試験時に利用可能ないくつかの市販のキットの１つを使用して実施し、これは１２の独特の指標プライマーを含んだ。市販のマルチプレックス配列決定キットの非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａの多重化試料調製オリゴヌクレオチドキットおよび多重化配列決定プライマーおよびＰｈｉＸ対照キット（例えば、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａカタログ番号ＰＥ−４００−１００１およびＰＥ−４００−１００２）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、１２の指標プライマーに限定されず、任意の数の独特の指標プライマー（例えば、４、８、１２、２４、４８、９６、またはそれ以上）を使用して実施することができる。独特の指標プライマーの数が多いほど、単一のフローセルレーンにおいて多重化することができる試料の数が多くなる。１２の指標プライマーを使用した多重化により、９６の試料（例えば、９６ウェルマイクロウェルプレートのウェルの数と等しい）を８レーンのフローセルで同時に分析することが可能になる。同様に、４８の指標プライマーを使用した多重化により、３８４の試料（例えば、３８４ウェルマイクロウェルプレートのウェルの数と等しい）を８レーンのフローセルで同時に分析することが可能になる。
合成手順によるある特定の配列決定では、アダプター修飾した一本鎖の鋳型ＤＮＡをフローセルに加え、限界希釈条件下でアンカーとハイブリダイズさせることによって固定化する。エマルションＰＣＲとは対照的に、ＤＮＡ鋳型をフローセル内で捕捉ＤＮＡ鎖の「アーチ形成」に依拠する「架橋」増幅によって増幅し、近接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。多数の増幅サイクルにより、単一分子ＤＮＡ鋳型がクローン的に増幅されたアーチ形の「クラスター」に変換され、各クラスターはおよそ１０００クローンの分子を含有する。フローセル１個当たりおよそ５０×１０６個の別々のクラスターを生成することができる。配列決定するために、クラスターを変性させ、その後に化学的切断反応および洗浄によりフォワード鎖のみをシングルエンド配列決定のために残す。アダプター配列と相補的なプライマーとハイブリダイズさせることによってフォワード鎖の配列決定を開始し、その後、ポリメラーゼおよび４つの異なるように着色した蛍光可逆的ダイターミネーターの混合物を加えた。ターミネーターはクローンクラスター内の各鎖における配列相補性に応じて組み込まれる。組み込み後、過剰な試薬を洗い流し、クラスターを光学的に調べ、蛍光を記録する。逐次的な化学的ステップを用いて、可逆的ダイターミネーターを遮断解除し、蛍光標識を切断し、洗い流し、次の配列決定サイクルを実施する。この反復的な合成による配列決定プロセスは、時には、３６塩基の読み取り長を生成するためにおよそ２．５日を必要とする。フローセル１個当たり５０×１０６個のクラスターを用いると、全体的な配列アウトプットは、分析の実行１回当たり１０億塩基対（Ｇｂ）を超え得る。
本明細書に記載の方法と一緒に使用することができる別の核酸配列決定技術は４５４シークエンシング（Ｒｏｃｈｅ）である。４５４シークエンシングでは、実行１回当たり約４００〜６００メガベースのＤＮＡを配列決定することができる大規模並行パイロシークエンスシステムを使用する。プロセスは、一般には２つのステップを伴う。第１のステップでは、試料核酸（例えばＤＮＡ）を、時には、より小さな断片（３００〜８００塩基対）に分画し、磨く（各末端を平滑にする）。次いで、短いアダプターを断片の末端にライゲーションする。これらのアダプターにより、試料−ライブラリー断片の増幅および配列決定の両方のためのプライミング配列がもたらされる。１つのアダプター（アダプターＢ）は、ＤＮＡライブラリーをストレプトアビジンでコーティングしたビーズ上に固定化するための５’−ビオチンタグを含有する。ニック修復後、非ビオチン化鎖を放出させ、一本鎖の鋳型ＤＮＡ（ｓｓｔＤＮＡ）ライブラリーとして使用する。ｓｓｔＤＮＡライブラリーを、その質について評価し、ｅｍＰＣＲのために必要な最適量（ビーズ１個当たりのＤＮＡコピー）を滴定によって決定する。ｓｓｔＤＮＡライブラリーをビーズ上に固定化する。ライブラリー断片を含有するビーズは単一のｓｓｔＤＮＡ分子を有する。ビーズに結合させたライブラリーを、増幅試薬を用いて乳化して油中水混合物にする。各ビーズをＰＣＲ増幅が起こるそれ自体のマイクロリアクター内で捕捉する。これにより、ビーズに固定化した、クローン的に増幅されたＤＮＡ断片が生じる。
４５４シークエンシングの第２のステップでは、一本鎖の鋳型ＤＮＡライブラリービーズを、ＤＮＡポリメラーゼを含有するインキュベーションミックスに加え、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含有するビーズと一緒にピコリットルサイズのウェルを含有するデバイス上に積み重ねた。各ＤＮＡ断片に対してパイロシークエンスを並行して実施する。１つまたは複数のヌクレオチドが付加することにより、光信号が生成し、それがシークエンシング計器内のＣＣＤカメラによって記録される。シグナル強度は、組み込まれたヌクレオチドの数に比例する。パイロシークエンスでは、ヌクレオチドが付加するとピロリン酸（ＰＰｉ）が放出されることを活用する。ＰＰｉを、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換する。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応により、識別され、分析される光が生成する（例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｍ．ら Ｎａｔｕｒｅ ４３７巻：３７６〜３８０頁（２００５年）を参照されたい）。
本明細書において提供される方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（商標）技術である。ＳＯＬｉＤ（商標）ライゲーションによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）では、核酸断片のライブラリーを試料から調製し、クローンビーズの集団を調製するために使用する。この方法を用いると、各ビーズ（例えば磁気ビーズ）の表面上に１つの種の核酸断片が存在する。試料核酸（例えばゲノムＤＮＡ）をせん断して断片にし、その後、アダプターを断片の５’末端および３’末端に付着させて、断片ライブラリーを生成する。アダプターは、一般には、ユニバーサルアダプター配列であり、したがって、あらゆる断片の出発配列が既知であり、かつ同一である。ＰＣＲのために必要な試薬を全て含有するマイクロリアクター内でエマルションＰＣＲを行う。次いで、ビーズに付着した、生じたＰＣＲ産物をガラススライドに共有結合させる。次いで、プライマーをライブラリー鋳型内のアダプター配列とハイブリダイズさせる。４つの蛍光標識された二塩基（ｄｉ−ｂａｓｅ）プローブのセットを配列決定プライマーとのライゲーションについて競合させる。二塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応における最初の塩基および２番目の塩基を調べることによって実現される。ライゲーション、検出および切断の多数のサイクルを実施し、サイクルの数により最終的な読み取り長が決定される。一連のライゲーションサイクルの後、ライゲーションサイクルの第２のラウンドのために伸長産物を取り出し、鋳型をｎ−１位と相補的なプライマーでリセットする。多くの場合、各配列タグについて５ラウンドのプライマーのリセットを完了する。プライマーのリセットプロセスを通して、各塩基を２つの独立したライゲーション反応において２つの異なるプライマーによって調べる。例えば、読み取り位５の塩基を、ライゲーションサイクル２において２番のプライマーによって、およびライゲーションサイクル１において３番のプライマーによってアッセイする。
本明細書に記載の方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）である。ｔＳＭＳ技法では、試料由来の各核酸（例えばＤＮＡ）鎖の３’末端にポリＡ配列を付加する。蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドを付加することによって各鎖を標識する。次いで、ＤＮＡ鎖を、フローセル表面に固定化された数百万のオリゴ−Ｔ捕捉部位を含有するフローセルとハイブリダイズさせる。鋳型は、１ｃｍ２当たり鋳型約１億個の密度で存在してよい。次いで、フローセルを配列決定装置内にローディングし、フローセルの表面にレーザー照射し、各鋳型の位置を明らかにする。ＣＣＤカメラにより、フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングすることができる。次いで、鋳型蛍光標識を切断し、洗い流す。ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したヌクレオチドを導入することによって配列決定反応を開始する。オリゴ−Ｔ核酸がプライマーとしての機能を果たす。ポリメラーゼにより、標識したヌクレオチドが鋳型内のプライマーに指向的に組み込まれる。ポリメラーゼおよび取り込まれなかったヌクレオチドを除去する。蛍光標識したヌクレオチドが指向的に組み込まれた鋳型を、フローセル表面を画像処理することによって検出する。画像処理した後、切断ステップにより蛍光標識を除去し、所望の読み取り長が実現されるまで他の蛍光標識したヌクレオチドを用いてプロセスを繰り返す。各ヌクレオチド付加ステップを用いて配列情報を収集する（例えば、Ｈａｒｒｉｓ Ｔ． Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０巻：１０６〜１０９頁（２００８年）を参照されたい）。
本明細書において提供される方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子、リアルタイム（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）（ＳＭＲＴ（商標））配列決定技術である。この方法を用いて、４つのＤＮＡ塩基のそれぞれを４つの異なる蛍光色素のうちの１つに付着させる。これらの色素をリン酸基によって連結させる（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋ）。単一のＤＮＡポリメラーゼを、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）の底部に鋳型一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定化する。ＺＭＷは、ＺＭＷの外側に急速に（マイクロ秒で）拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対してＤＮＡポリメラーゼによる一塩基の組み込みを観察することを可能にする閉じ込め構造である。ヌクレオチドが成長している鎖に組み込まれるのには数ミリ秒かかる。この時間中に蛍光標識が励起され、蛍光シグナルが生じ、蛍光タグが切断される。対応する色素の蛍光が検出されることにより、その塩基が組み込まれたことが示される。次いで、このプロセスを繰り返す。
本明細書に記載の方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は、半導体技術と単純な配列決定化学を組み合わせて、化学的にコードされる情報（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を半導体チップ上のデジタル情報（０、１）に直接翻訳するＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単一分子配列決定である。ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴでは、微小機械処理したウェルの高密度アレイを使用して核酸配列決定を大規模並列処理式で実施する。各ウェルは異なるＤＮＡ分子を保持する。ウェルの真下にはイオン感応性層があり、その真下にイオンセンサーがある。一般には、ポリメラーゼによってヌクレオチドがＤＮＡの鎖に組み込まれると、副生成物として水素イオンが放出される。ヌクレオチド、例えばＣがＤＮＡ鋳型に付加され、次いでＤＮＡの鎖に組み込まれると、水素イオンが放出される。そのイオン由来の電荷により、溶液のｐＨが変化し、これをイオンセンサーによって検出することができる。シークエンサーにより塩基を呼び出し、直接化学的情報からデジタル情報にすることができる。次いで、シークエンサーにより、チップに次々にヌクレオチドを逐次的に送り込む。チップに送り込まれる次のヌクレオチドがマッチしない場合、電圧の変化は記録されず、塩基は呼び出されない。ＤＮＡ鎖上に２つの同一の塩基がある場合、電圧は倍増し、チップには呼び出された２つの同一の塩基が記録される。これは直接検出（すなわち、スキャニング、カメラまたは光を伴わない検出）であるので、各ヌクレオチドの組み込みは数秒の間に記録される。
本明細書に記載の方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は、化学感応性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイである。この配列決定技法の１つの例では、ＤＮＡ分子を反応チャンバーに入れ、鋳型分子をポリメラーゼに結合させた配列決定プライマーとハイブリダイズさせることができる。配列決定プライマーの３’末端において１つまたは複数の三リン酸が新しい核酸鎖に組み込まれることは、ＣＨＥＭＦＥＴセンサーにより、電流の変化によって検出することができる。アレイは多数のＣＨＥＭＦＥＴセンサーを有してよい。別の例では、単一の核酸をビーズに付着させ、その核酸をビーズ上で増幅することができ、個々のビーズをＣＨＥＭＦＥＴアレイ上の個々の反応チャンバーに写すことができ、各チャンバーはＣＨＥＭＦＥＴセンサーを有し、核酸について配列決定することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号を参照されたい）。
本明細書に記載の方法において使用することができる別の核酸配列決定技術は電子顕微鏡である。この配列決定技法の１つの例では、電子顕微鏡を使用して区別可能な金属標識を使用して個々の核酸（例えばＤＮＡ）分子を標識する。次いで、これらの分子を平らな表面上に伸ばし、電子顕微鏡を使用して画像処理して、配列を測定する（例えば、Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ Ｅ． Ｎ．およびＢｅｅｒ Ｍ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９６５年３月；５３巻：５６４〜７１頁を参照されたい）。いくつかの場合には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用する（例えばＨａｌｃｙｏｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＴＥＭ法）。Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｒａｐｉｄ Ｎａｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＭＰＲＮＴ）と称されるこの方法は、重原子マーカーを用いて選択的に標識した高分子量（例えば約１５０ｋｂ以上）のＤＮＡの単一原子分解透過形電子顕微鏡画像処理を利用すること、およびこれらの分子を超薄膜上に超高密度（鎖間３ｎｍ）の並行のアレイに一貫した塩基間の間隔で配置することを含む。重原子マーカーの位置を決定するため、およびＤＮＡから塩基配列情報を抽出するために、電子顕微鏡を使用して膜上の分子を画像処理する（例えば、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２００９／０４６４４５を参照されたい）。
本明細書の方法を行うために使用することができる他の配列決定方法として、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによる配列決定が挙げられる。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲまたはｄＰＣＲ）を使用して、試料中の核酸を直接同定し、定量することができる。いくつかの実施形態では、デジタルＰＣＲをエマルション中で実施することができる。例えば、個々の核酸を、例えばマイクロ流体チャンバーデバイス内で分離し、各核酸を個別にＰＣＲによって増幅する。１ウェル当たりに存在する核酸が１つ以下になるように核酸を分離することができる。いくつかの実施形態では、異なるプローブを使用して種々の対立遺伝子（例えば胎児の対立遺伝子および母体の対立遺伝子）を区別することができる。対立遺伝子を数え上げてコピー数を決定することができる。ハイブリダイゼーションによる配列決定では、方法は、複数のポリヌクレオチド配列を複数のポリヌクレオチドプローブと接触させることを伴い、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれを任意選択で基質につなぎ留めることができる。いくつかの実施形態では、基質は既知のヌクレオチド配列のアレイを伴う平らな表面であってよい。アレイとのハイブリダイゼーションのパターンを使用して、試料中に存在するポリヌクレオチド配列を決定することができる。いくつかの実施形態では、各プローブをビーズ、例えば、磁気ビーズなどにつなぎ留める。ビーズとのハイブリダイゼーションを同定することができ、それを使用して試料中の複数のポリヌクレオチド配列を同定することができる。
いくつかの実施形態では、ナノポアシークエンシングを本明細書に記載の方法において使用することができる。ナノポアシークエンシングは、単一分子の配列決定技術であり、それにより、単一の核酸分子（例えばＤＮＡ）がナノポアを通過するに従い、それが直接配列決定される。ナノポアは、直径１ナノメートル程度の小さな穴またはチャネルである。ある特定の膜貫通細胞タンパク質がナノポアとしての機能を果たし得る（例えばアルファ溶血素）。いくつかの場合には、ナノポアを合成することができる（例えばシリコンプラットフォームを使用して）。ナノポアを導電性流体に浸漬し、それにわたって電位を印加することにより、ナノポアを通じたイオンの伝導に起因してわずかな電流が生じる。流れる電流の量はナノポアのサイズに対して感応性である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するに従い、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドによってナノポアが異なる程度に閉塞され、電流に特徴的な変化が生じる。したがって、任意の所与の瞬間にナノポアを通過することができる電流の量は、ナノポアがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはいくつかの場合にはメチル−Ｃによって遮断されるかどうかに応じて変動する。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときにナノポアを通る電流の変化により、ＤＮＡ配列の直接読み取りが表される。いくつかの場合には、ナノポアを使用して、個々のＤＮＡ塩基が正しい順序でナノポアを通過するときにそれらを同定することができる（例えば、Ｓｏｎｉ ＧＶおよびＭｅｌｌｅｒ Ａ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３巻：１９９６〜２００１頁（２００７年）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／００４２６５を参照されたい）。
ナノポアを使用して核酸分子について配列決定することができるいくつもの方法が存在する。いくつかの実施形態では、デオキシリボヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼ酵素を使用する。この場合、エキソヌクレアーゼ酵素を使用して、ヌクレオチドを核酸（例えばＤＮＡ）分子から逐次的に引き離す。次いで、ナノポアによってヌクレオチドが検出され、それらの放出の順に識別され、したがって、元の鎖の配列が読み取られる。そのような実施形態に関して、ＤＮＡ分子から放出されるヌクレオチドの一部が、ナノポアのチャネルに進入し、それと相互作用することができるように、エキソヌクレアーゼ酵素をナノポアに付着させることができる。エキソヌクレアーゼは、ナノポア構造の、チャネルの開口部を形成するナノポアの一部の極めて近傍にある部位に付着させることができる。いくつかの場合には、エキソヌクレアーゼ酵素は、ナノポア構造に、そのヌクレオチドの出口軌道部位が、開口の一部を形成するナノポアの一部に向かって方向付けられるように付着させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸のナノポアシークエンシングは、核酸（例えばＤＮＡ）分子を、ポアを通して押し出すまたは引き寄せる酵素の使用を伴う。この場合、イオン電流はＤＮＡ分子内のヌクレオチドがポアを通過するときに変動する。電流の変動により、ＤＮＡ配列が示される。そのような実施形態については、酵素をナノポア構造に付着させ、したがって、ポアを通るイオン電流の流れに干渉することなく標的核酸をナノポアのチャネルを通して押し出すまたは引き寄せることができるようにすることができる。酵素は、ナノポア構造の、開口部の一部を形成する構造の一部の極めて近傍にある部位に付着させることができる。酵素は、例えば、その活性部位が開口部の一部を形成する構造の一部に向かって方向付けられるように、サブユニットに付着させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸のナノポアシークエンシングは、ナノポア検出器の極めて近傍においてポリメラーゼ副生成物を検出することを伴う。この場合、ヌクレオシドリン酸（ヌクレオチド）を標識し、したがって、ポリメラーゼがヌクレオチド鎖に付加されるとリン酸標識された種が放出され、リン酸標識された種がポアによって検出される。一般には、リン酸種は、各ヌクレオチドに対して特異的な標識を含有する。核酸鎖にヌクレオチドが逐次的に付加されるに従い、塩基付加の副生成物が検出される。リン酸標識された種が検出される順序を使用して、核酸鎖について配列を決定することができる。
配列読み取りの長さは、多くの場合、特定の配列決定技術に関連付けられる。ハイスループットな方法では、例えば、サイズが数十塩基対から数百塩基対（ｂｐ）まで変動し得る配列読み取りがもたらされる。ナノポアシークエンシングでは、例えば、サイズが数十塩基対から数百塩基対、数千塩基対まで変動し得る配列読み取りをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列読み取りは、平均値、中央値またはアベレージの長さが、約１５ｂｐ〜９００ｂｐ長（例えば約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、または約５００ｂｐの読み取りである。いくつかの実施形態では、配列読み取りは平均値、中央値またはアベレージの長さが約１０００ｂｐ以上の読み取りである。
いくつかの実施形態では、核酸は、蛍光シグナルまたは配列タグ情報を含んでよい。シグナルまたはタグの定量を、例えば、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、遺伝子チップ解析、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光分析（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡、レーザー走査型サイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィー、手動バッチモード分離（ｍａｎｕａｌ ｂａｔｃｈ ｍｏｄｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、電場サスペンション（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、配列決定、およびその組合せなどのさまざまな技法において使用することができる。
読み取りをマッピングすること
マッピングヌクレオチド配列読み取り（すなわち、物理的なゲノムの位置が未知の断片からの配列情報）をいくつもの方法で実施することができ、これは多くの場合、得られた配列読み取りを参照ゲノム内のマッチする配列とアラインメントすることを含む（例えば、Ｌｉら、「Ｍａｐｐｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｓ ａｎｄ ｃａｌｌｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、２００８年８月１９日）。そのようなアラインメントでは、一般に、配列読み取りを参照配列に対してアラインメントし、アラインメントした配列読み取りは「マッピングされた」または「配列タグ」と称される。いくつかの場合には、マッピングされた配列読み取りは、「ヒット」と称される。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りを種々のパラメータに応じて一緒に群分けし、下でさらに詳細に考察されている特定のゲノムセクションに割り当てる。
種々のコンピュータによる方法を使用して、各配列読み取りをゲノムセクションにマッピングすることができる。配列をアラインメントするために使用することができるコンピュータアルゴリズムの非限定的な例としては、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＩＴＺ、およびＦＡＳＴＡ、またはその変形が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴ、ｄｂＳＴＳ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）を含めた、当技術分野で公知の核酸データベース内の配列を用いて配列読み取りを見いだし、かつ／またはアラインメントすることができる。ＢＬＡＳＴまたは同様のツールを使用して、同定された配列を配列データベースに対して検索することができる。次いで、例えば、検索ヒットを使用して、同定された配列を適切なゲノムセクション（下記）に選別して入れることができる。実施例１、実施例２および実施例３において生成された配列読み取りを、実施例２および実施例３に記載の通り、ＣＡＳＡＶＡバージョン１．６を使用してＵＣＳＣｈｇ１９ヒト参照ゲノムにマッピングした。いくつかの実施形態では、配列読み取りのマッピングは、反復配列および／またはＧＣ含量について補正する前に実施することができ、ある特定の実施形態では、配列読み取りのマッピングは、反復配列および／またはＧＣ含量について補正した後に実施することができる。
「配列タグ」とは、特定のゲノムセクションおよび／または染色体（すなわち、ヒト被験体については第１染色体〜第２２染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体のうちの１つ）に特異的に割り当てられた核酸（例えばＤＮＡ）配列（すなわち読み取り）である。配列タグは、単一の参照ゲノムの部分（例えば、染色体）内で反復性であっても非反復性であってもよい。いくつかの実施形態では、反復配列タグをさらなる分析（例えば定量）から排除する。いくつかの実施形態では、読み取りは、参照ゲノムの部分に一意的または非一意的にマッピングすることができる。読み取りは、参照ゲノム内の単一の配列とアラインメントされている場合、「一意的にマッピングされた」とみなされる。読み取りは、参照ゲノム内の２つ以上の配列とアラインメントされている場合、「非一意的にマッピングされた」とみなされる。いくつかの実施形態では、非一意的にマッピングされた読み取りをさらなる分析（例えば定量）から排除する。ある特定の実施形態では、ある特定の小さな程度のミスマッチ（０〜１）が参照ゲノムとマッピングされている個々の試料からの読み取りとの間に存在し得る一塩基多型の原因となることが許容され得る。いくつかの実施形態では、参照配列にマッピングされる読み取りにはいかなる程度のミスマッチも許容されない。
参照配列、または参照ゲノムは、多くの場合、一個体または多数の個体から集合させたまたは部分的に集合させたゲノム配列である。試料核酸が妊婦に由来するある特定の実施形態では、参照配列は、時には胎児、胎児の母親または胎児の父親由来ではなく、本明細書では、「外部参照」と称される。いくつかの実施形態では、母体参照を調製し、使用することができる。外部参照に基づいて妊婦由来の参照を調製する場合（「母体参照配列」）、多くの場合、胎児ＤＮＡを実質的に含有しない妊婦のＤＮＡからの読み取りを外部参照配列にマッピングし、集合させる。ある特定の実施形態では、外部参照は妊婦と実質的に同じ民族性を有する１つまたは複数の個体のＤＮＡ由来である。母体参照配列は、母体のゲノムＤＮＡを完全に包含しなくてよく（例えば、母体のゲノムＤＮＡの約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を包含してよく）、母体参照は、母体のゲノムＤＮＡ配列と完全にマッチしなくてよい（例えば、母体参照配列は多数のミスマッチを含んでよい）。
ゲノムセクション
いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取り（すなわち配列タグ）を種々のパラメータに応じて一緒に群分けし、特定のゲノムセクションに割り当てる。多くの場合、個々のマッピングされた配列読み取りを使用して、試料中に存在するゲノムセクションの量を同定することができる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションの量は、試料中のより大きな配列（例えば染色体）の量を示す可能性がある。「ゲノムセクション」という用語は、「配列ウィンドウ」、「セクション」、「ビン」、「遺伝子座」、「領域」、「区分」または「セグメント」と互換的に使用することもできる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、染色体全体、染色体の部分、多数の染色体の部分、多数の染色体、多数の染色体由来の部分、および／またはそれらの組合せである。いくつかの場合には、ゲノムセクションは、例えば、配列の長さまたは特定の１つまたは複数の特徴を含む１つまたは複数のパラメータに基づいて線引きされる。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、ゲノム配列の特定の長さに基づく。いくつかの実施形態では、方法は、複数のゲノムセクションにマッピングされた多数の配列読み取りを分析することを含む。ゲノムセクションはほぼ同じ長さであってもよく、ゲノムセクションは異なる長さであってもよい。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、約１０キロベース（ｋｂ）〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、および時には約５０ｋｂである。いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは約１０ｋｂ〜約２０ｋｂである。本明細書で考察されているゲノミックセクションは、連続したひと続きの配列に限定されない。したがって、ゲノムセクションは、連続した配列または連続していない配列で構成されていてよい。本明細書で考察されているゲノミックセクションは、単一の染色体に限定されず、いくつかの実施形態では、個々の染色体を超越し得る。いくつかの場合には、ゲノミックセクションは、１つの染色体全体、２つの染色体全体、またはより多くの染色体全体にわたってよい。さらに、ゲノミックセクションは、多数の染色体の接合部または分離部にわたってよい。
いくつかの実施形態では、ゲノムセクションは、例えば、遺伝的変異が評価される染色体（例えば第１３染色体、第１８染色体および／または第２１染色体の異数性）などの対象の染色体内の特定の染色体セクションであってよい。ゲノムセクションは、病原体のゲノム（例えば細菌、真菌またはウイルスのゲノム）またはその断片であってもよい。ゲノムセクションは、遺伝子、遺伝子断片、調節配列、イントロン、エクソンなどであってよい。
いくつかの実施形態では、ゲノム（例えばヒトゲノム）を領域の情報量に基づいてゲノムセクションに分割する。生じたゲノム領域は、多数の染色体についての配列を含有してよく、かつ／または、多数の染色体の部分についての配列を含有してよい。いくつかの場合には、分割することにより、ゲノム全体にわたって類似した位置を排除し、独特の領域のみを保持することができる。排除された領域は、単一の染色体内にあってもよく、多数の染色体にわたってもよい。したがって、生じたゲノムは、より速いアラインメントのために切り詰められ、最適化されており、多くの場合、一意的に同定可能な配列に焦点を合わせることが可能になる。いくつかの場合には、分割することにより、類似した領域の重みを減らすことができる。ゲノムセクションの重みを減らすためのプロセスは下でさらに詳細に考察されている。いくつかの実施形態では、ゲノムを、染色体を超越する領域に分割することは、分類の状況において生じた情報取得に基づいてよい。例えば、情報量は、確認された正常な被験体および異常な被験体（例えば正倍数性被験体およびトリソミー被験体）の群間を区別するための特定の遺伝子位置の有意性を測定するｐ値プロファイルを使用して定量することができる。いくつかの実施形態では、ゲノムを、染色体を超越する領域に分割することは、例えば、タグをアラインメントする間のスピード／利便性、ＧＣ含量の高低、ＧＣ含量の均一性、反復配列の存在、配列含量の他の尺度（例えば個々のヌクレオチドの分率、ピリミジンまたはプリンの分率、天然核酸と非天然核酸の分率、メチル化されたヌクレオチドの分率、およびＣｐＧ含量）、メチル化の状態、２重鎖融解温度、配列決定またはＰＣＲに対する従順性、個々のビンに割り当てられる不確実性のレベル、および／または特定の特徴についての標的化検索などの任意の他の基準に基づいてよい。
配列タグ密度
「配列タグ密度」とは、異なる試料を比較するため、およびその後の分析のために配列タグ密度を使用する定義済みのゲノムセクションについての配列タグまたは読み取りの値を指す。いくつかの実施形態では、配列タグの値は、正規化された配列タグの値である。配列タグ密度の値は、時には試料内で正規化し、時には試料の一群（例えば、フローレーンにおいて処理された試料、ライブラリー生成プレートにおいて調製された試料、段階分けプレートにおいて採取された試料など、およびそれらの組合せ）についての中央値に対して正規化する。
いくつかの実施形態では、正規化は、各ゲノムセクション内に入るタグの数をカウントすること；各染色体について配列タグカウントの総計の中央値、最頻値、アベレージ、または中点値を得ること；常染色体の値の全ての中央値、最頻値、アベレージまたは中点値を得ること；およびこの値を異なる試料について得られた配列タグの総数の差異を説明するための正規化定数として使用することによって実施することができる。ある特定の実施形態では、正規化は、フローセル内の全ての試料について、各ゲノムセクション内に入るタグの数をカウントすること；フローセル内の全ての試料について各染色体についての配列タグカウントの総計の中央値、最頻値、アベレージまたは中点値を得ること、フローセル内の全ての試料について常染色体の値の全ての中央値、最頻値、アベレージまたは中点値を得ること；およびこの値をフローセル内で並行して処理された異なる試料について得られた配列タグの総数の差異を説明するための正規化定数として使用することによって実施することができる。いくつかの実施形態では、正規化は、プレート（例えば、試薬プレート、マイクロウェルプレート）内で調製された全ての試料について、各ゲノムセクション内に入るタグの数をカウントすること；プレート内で調製された全ての試料について各染色体についての配列タグカウントの総計の中央値、最頻値、アベレージまたは中点値を得ること、プレート内で調製された全ての試料について常染色体の値の全ての中央値、最頻値、アベレージまたは中点値を得ること；およびこの値をプレート内で並行して処理された異なる試料について得られた配列タグの総数の差異を説明するための正規化定数として使用することによって実施することができる。
配列タグ密度は、時には二染色体について約１である。配列タグ密度は、配列決定アーチファクト、とりわけＧ／Ｃの偏り、バッチプロセスの影響（例えば、試料の調製）などに応じて変動する可能性があり、外部標準または内部参照（例えば、いくつかの実施形態では、例えば、単一の染色体、全ての常染色体からの算出値、フローセル内で分析された全ての試料（単一の染色体または全ての常染色体）からの算出値、またはプレート内で処理され、１つまたは複数のフローセル内で分析された全ての試料からの算出値であってよい配列タグ（ゲノム配列）の実質的に全てに由来する）を使用することによって補正することができる。したがって、染色体または染色体領域の量不均衡は、検体の他のマッピング可能な配列決定されたタグの間での遺伝子座の百分率表示から推定することができる。したがって、特定の染色体または染色体領域の用量不均衡は、定量的に決定し、正規化することができる。配列タグ密度を正規化および定量するための方法は下でさらに詳細に考察されている。
いくつかの実施形態では、配列読み取りの全てのうちのある割合は異数性に関与する染色体（例えば、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体）からのものであり、他の配列読み取りは他の染色体からのものである。いくつかの実施形態では、異数性に関与する染色体（例えば、「標的染色体」：第２１染色体）の他の染色体と比較した相対的なサイズを考慮に入れることにより、標的染色体に特異的な配列の基準範囲内に入る正規化された頻度を得ることができる。胎児が標的染色体に異数性を有する場合、標的染色体由来の配列の正規化された頻度は、非標的染色体由来の配列の正規化された頻度を統計学的に超え、したがって、異数性を検出することが可能になる。いくつかの実施形態では、正規化された頻度の変化の程度は、分析された試料中の胎児核酸の分画濃度に左右される。
遺伝的変異の有無のアウトカムおよび決定
いくつかの遺伝的変異は医学的状態に関連付けられる。遺伝的変異は、多くの場合、遺伝的変異がない参照被験体に対して試験被験体のゲノムまたは遺伝情報の検出可能な変化をもたらす遺伝情報（例えば、染色体、染色体の部分、多型領域、転座した領域、変更されたヌクレオチド配列など、または前述のものの組合せ）の増加、減少および／または変更（例えば、重複、欠失、融合、挿入、突然変異、再編成、置換または異常なメチル化）を含む。遺伝的変異の有無は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の通り、ゲノミックセクション（例えば、ゲノムのビン）にマッピングされた配列読み取りを分析し、かつ／または操作することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、非限定的な例が表１Ａおよび１Ｂにおいて提供される公知の状態、症候群および／または異常の有無を、本明細書に記載の方法を利用して検出し、かつ／または決定することができる。
カウントすること
いくつかの実施形態では、選択された特徴または変数に基づいてマッピングまたは分割された配列読み取りを定量して、各ゲノミックセクション（例えば、ビン、区分、ゲノムのセグメントなど）にマッピングされた読み取りの数を決定することができる。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列読み取りの総数をマッピングされた配列読み取りの全てをカウントすることによって決定し、いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの総数を、各ビンまたは区分にマッピングされたカウントを合計することによって決定する。いくつかの実施形態では、カウントすることを、読み取りをマッピングするプロセスにおいて実施する。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列読み取りのサブセットをマッピングされた配列読み取りの所定のサブセットをカウントすることによって決定し、いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセットを、所定のビンまたは区分のそれぞれにマッピングされたカウントを合計することによって決定する。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセットは、１〜ｎの配列読み取りを含んでよく、ｎは、試験被験体試料、１つまたは複数の参照被験体試料、フローセル内で処理された全ての試料、または１つまたは複数のフローセルを使用した分析のためにプレート内で調製された全ての試料から生成された全ての配列読み取りの合計と等しい数を表す。試験被験体試料、１つまたは複数の参照被験体試料、フローセル内で処理された全ての試料、またはプレート内で調製された全ての試料についてマッピングされ、カウントされた配列読み取りは、時には試料カウントと称される。試料カウントは、時には、試料を単離した被験体（例えば、試験被験体試料カウント、参照被験体試料カウントなど）を参照することによってさらに区別される。
いくつかの実施形態では、試験試料を参照試料としても使用する。試験試料を時には参照試料として使用し、遺伝的変異がない（例えば、１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションにおいていかなる微小欠失、重複、異数性なども有さない）ことが既知の１つまたは複数の選択されたゲノミックセクション（例えば、第１のゲノミックセクション、第２のゲノミックセクション、第３のゲノミックセクション、５以上のゲノミックセクション、５０以上のゲノミックセクション、５００以上のゲノミックセクションなど）について、予測カウント中央値および／または予測カウント中央値の誘導値を決定する。遺伝的変異がない１つまたは複数のゲノミックセクションについての予測カウント中央値または予測カウント中央値の誘導値を使用して、試験試料の他の選択されたゲノミックセクション（例えば、参照試料セクションとして利用したものとは異なるゲノミックセクション）から得たカウントの統計的有意性を評価することができる。いくつかの実施形態では、中央絶対偏差も決定し、ある特定の実施形態では、試験試料の他の選択されたゲノミックセクションから得たカウントの統計的有意性を評価するために中央絶対偏差も使用する。
ある特定の実施形態では、カウントを正規化する正規化プロセスは、予測カウントを使用することを含む。いくつかの実施形態では、試料カウントは、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセットから得られる。ある特定の実施形態では、任意の適切な特徴または変数を利用してマッピングされた配列読み取りの所定のサブセットを選択することができる。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りの所定のセットを比較するための基礎として利用し、これを「予測試料カウント」または「予測カウント」（総称して「予測カウント」）と称することができる。予測カウントは、多くの場合、一部において、１つまたは複数の選択されたゲノミックセクション（例えば、第１のゲノミックセクション、第２のゲノミックセクション、第３のゲノミックセクション、５つ以上のゲノミックセクション、５０以上のゲノミックセクション、５００以上のゲノミックセクションなど）についてのカウントを合計することによって得られる値である。時には、選択されたゲノミックセクションを、１つまたは複数の変数または特徴の有無に起因して参照、または比較するための基礎として選択する。時には、遺伝的変異（例えば、重複、欠失、挿入、胎児の異数性、トリソミー）がないゲノミックセクション（例えば、１つまたは複数のゲノミックセクション、染色体、ゲノムまたはその一部）のカウントから予測カウントを決定する。ある特定の実施形態では、予測カウントは、遺伝的変異（例えば、重複、欠失、挿入、胎児の異数性、トリソミー）を含むゲノミックセクション（例えば、１つまたは複数のゲノミックセクション、染色体、ゲノムまたはその一部）のカウントに由来する。時には、ゲノミックセクションのいくつかが遺伝的変異を含み、ゲノミックセクションのいくつかが遺伝的変異を実質的に含まない１つまたは複数のゲノミックセクションのカウントから予測カウントを決定する。予測カウントは、多くの場合、少なくとも１つの共通の実験条件下で得た、試料の一群からのデータ（例えば、マッピングされた配列読み取りのカウント）を使用して決定する。時には、予測カウントを、カウントに本明細書に記載のまたはそうでなければ当技術分野で公知の１つまたは複数の数学的操作または統計学的操作を適用することによって決定する。そのような数学的操作または統計学的操作によってもたらされる予測カウントまたは予測試料カウント値の非限定的な例としては、中央値、平均値、最頻値、アベレージおよび／または中点、中央絶対偏差、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入される中央絶対偏差の代替値、ブートストラップ推定値など、およびそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、予測カウントは、カウント（例えば、ゲノミックセクション、染色体、ゲノムまたはその一部のカウント）の中央値、最頻値、アベレージおよび／または中点である。予測カウントは時には、カウントまたは試料カウントの中央値、最頻値、アベレージおよび／または中点もしくは平均値である。カウントおよび予測カウントの非限定的な例としては、フィルタリングされたカウント、フィルタリングされた予測カウント、正規化されたカウント、正規化された予測カウント、補正されたカウントおよび補正された予測カウントが挙げられる。フィルタリングプロセス、正規化プロセスおよび補正プロセスは、本明細書においてさらに詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、予測カウントの誘導値は、正規化および／または操作された（例えば、数学的に操作された）カウントに由来する予測カウントである。正規化および／または操作された（例えば、数学的に操作された）カウントは、時には、カウントの誘導値と称される。カウントの誘導値は時には、第１のゲノミックセクションからのカウントの表示であり、この表示は、多くの場合、第１のゲノミックセクションを含むゲノミックセクションからのカウントと比較した（例えば、それで割った）第１のゲノミックセクションからのカウントである。時には、カウントの誘導値は、パーセント表示または比率表示として表される。時には、表示は、多数のゲノミックセクションに対する１つのゲノミックセクションの表示であり、多数のゲノミックセクションは染色体の全部または一部に由来する。時には、表示は、より多数のゲノミックセクションに対する多数のゲノミックセクションの表示であり、多数のゲノミックセクションは染色体の全部または一部に由来し、より多数のゲノミックセクションは多数の染色体、実質的に全ての常染色体または実質的にゲノム全体に由来する。いくつかの実施形態では、カウントの誘導値を正規化する正規化プロセスは、予測カウントの誘導値を使用することを含む。カウントの誘導値から得た予測カウントは、本明細書では「予測カウントの誘導値」と称される。時には、予測カウントの誘導値は、カウントの表示（例えば、パーセント表示、染色体表示）に由来する予測カウントである。いくつかの実施形態では、予測カウントの誘導値は、カウント表示の中央値、最頻値、アベレージおよび／または中点（例えば、パーセント表示、染色体表示）である。ある特定の実施形態では、中央値は、中央値、平均値、最頻値、中点、アベレージなどである。
時には、カウント、予測カウントまたは予測カウントの誘導値について変動性の推定値を決定する。変動性の推定値の非限定的な例としては、カウント、予測カウントまたは予測カウントの誘導値の中央絶対偏差（ＭＡＤ）；ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値；ブートストラップ推定値；カウント、予測カウントまたは予測カウントの誘導値の標準偏差など、およびそれらの組合せが挙げられる。変動性の推定値は、時には正規化された試料カウントを得るための正規化プロセスにおいて利用される。
ある特定の実施形態では、正規化された試料カウントを得るための正規化プロセスは、第１のゲノムセクションについてのカウントから予測カウントを引き算し、それにより減算値を生成し、減算値をカウントまたは予測カウントの変動性の推定値で割ることを含む。カウントまたは予測カウントの変動性の非限定的な例は、カウントまたは予測カウントの中央絶対偏差（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値である。いくつかの実施形態では、正規化された試料カウントを得るための正規化プロセスは、第１のゲノムセクションカウント表示から、予測された第１のゲノムセクションカウント表示を引き算し、それにより減算値を生成し、減算値を第１のゲノムセクションカウント表示または予測された第１のゲノムセクションカウント表示の変動性の推定値で割ることを含む。カウント表示または予測カウント表示の変動性の非限定的な例は、カウント表示または予測カウント表示の中央絶対偏差（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値である。いくつかの実施形態では、予測カウントは、第１のゲノムセクションのカウントの中央値、最頻値、アベレージ、平均値および／または中点であり、時には、予測カウント表示は、第１のゲノミックセクションのカウント表示の中央値、平均値、最頻値、アベレージおよび／または中点である。
いくつかの実施形態では、予測カウント、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）、またはカウント、カウントの誘導値、予測カウントまたは予測カウントの誘導値の変動性の推定値を、１つまたは複数の共通の実験条件下で取得した試料データに従ってそれぞれ独立に決定する。時には、変動性の推定値を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得、時には、変動性の推定値を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得、時には、予測カウントを、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得、時には、予測カウントを、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得、時には、変動性の推定値および予測カウントを、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得る。時には、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）の変動性の推定値を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得、時には、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）の変動性の推定値を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得、時には、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得、時には、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得、時には、予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）の変動性の推定値および予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）を、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得る。
いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）を１つまたは複数の共通の実験条件下で取得した試料データを使用して決定し、カウント、カウントの誘導値、予測カウントまたは予測カウントの誘導値の変動性の推定値を共通の実験条件下で取得したものではない試料データを使用して決定する。ある特定の実施形態では、カウント、カウントの誘導値、予測カウントまたは予測カウントの誘導値の変動性の推定値を、第１番の試料について取得し、共通の実験条件下で取得したものではない試料データを使用して決定し、予測カウントまたは予測カウントの誘導値（例えば、予測カウント表示）を、１つまたは複数の共通の実験条件下で取得し、第１番の試料よりも少ない第２番の試料について取得した試料データを使用して決定する。第２番の試料は、時には、第１番の試料を取得した時間枠よりも短い時間枠で取得する。
１つまたは複数の共通の実験条件下で取得した試料データは、時には、１〜約５つの共通の実験条件（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの共通の実験条件）の下で取得する。共通の実験条件の非限定的な例としては、フローセル内のチャネル、フローセルユニット、コンテナに共通のフローセル、ロットまたは製造の連続運転に共通のフローセル；試薬プレートユニット、コンテナに共通の試薬プレート、ロットまたは製造の連続運転に共通の試薬プレート；オペレーター；計器（例えば、シークエンシング計器）；湿度、温度；同定タグ指標など、およびそれらの組合せが挙げられる。試薬プレートは、時には、核酸ライブラリー調製および／または核酸の配列決定のために利用される。
配列読み取りを定量することまたはカウントすることは、これだけに限定されないが、手動のカウント方法および自動化されたカウント方法を含めた任意の適切な様式で実施することができる。いくつかの実施形態では、自動化されたカウント方法は、各染色体および／または１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションにマッピングされる配列読み取りまたは配列タグの数を決定またはカウントするソフトウェアにおいて具体化することができる。ソフトウェアは、一般に、コンピュータによって遂行される場合、本明細書に記載の通りコンピュータ操作を実施するコンピュータ可読プログラム命令である。
試験被験体および／または参照被験体に由来する試料についての各ビンにマッピングされた配列読み取りの数および配列読み取りの総数をさらに解析および処理して、遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすことができる。カウントされ、マッピングされた配列読み取りは、時には、「データ」または「データセット」と称される。いくつかの実施形態では、データまたはデータセットは、１つまたは複数の特徴または変数（例えば、配列に基づくもの［例えば、ＧＣ含量、特定のヌクレオチド配列など］、機能に特異的なもの［例えば、発現された遺伝子、がん遺伝子など］、位置に基づくもの［ゲノム特異的、染色体特異的、ゲノミックセクションまたはビン特異的］、実験条件に基づくもの［例えば、指標に基づくもの、フローセルに基づくもの、プレートに基づくもの］など、およびそれらの組合せ）によって特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、データまたはデータセットを、１つまたは複数の特徴または変数（例えば、胎児分率および母体の年齢；胎児分率および地理的位置；パーセント第２１染色体表示およびフローセル数；第２１染色体のｚスコアおよび母体の体重；第２１染色体のｚスコアおよび妊娠期間など）に基づいて２つ以上の次元を有するマトリックスに組織化および／または層別化することができる。マトリックスへ組織化および／または層別化されたデータは、任意の適切な特徴または変数を使用して組織化および／または層別化されてもよい。マトリックス内のデータの非限定的な例としては、母体の年齢、母体の倍数性、および胎児の寄与によって組織化されたデータが挙げられる。特徴または変数を用いて層別化されるデータの非限定的な例は、図４〜４５に示されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の特徴または変数によって特徴付けられるデータセットを、時には、カウントした後に処理する。
高度（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）
いくつかの実施形態では、値は、高度（例えば、数）に帰する。高度は、適切な方法、操作または数学的プロセスによって決定することができる（例えば、処理された高度）。高度は、多くの場合、ゲノミックセクションのセットについてのカウント（例えば、正規化されたカウント）である、またはそれに由来する。時には、ゲノミックセクションの高度は、ゲノミックセクションにマッピングされたカウントの総数（例えば、正規化されたカウント）と実質的に等しい。多くの場合、高度は、当技術分野で公知の適切な方法、操作または数学的プロセスによって処理、変換または操作されたカウントから決定する。時には、高度は処理されたカウントに由来し、処理されたカウントの非限定的な例としては、重み付けされたカウント、除去されたカウント、フィルタリングされたカウント、正規化されたカウント、補正されたカウント、平均されたカウント、平均として導かれたカウント（例えば、平均高度）、足し算されたカウント、引き算されたカウント、変換されたカウントまたはその組合せが挙げられる。時には、高度は、正規化されたカウント（例えば、ゲノミックセクションの正規化されたカウント）を含む。高度は、適切なプロセスによって正規化されたカウントについてのものであってよく、その非限定的な例としては、ビンに関した（ｂｉｎ−ｗｉｓｅ）正規化、ＧＣ含量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＲＭ、ＧＣＲＭ、ｃＱｎなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。高度は、正規化されたカウントまたはカウントの相対量を含んでよい。時には、高度は、平均された２つ以上のゲノミックセクションのカウントまたは正規化されたカウントについてのものであってよく、高度は、アベレージ高度と称される。時には、高度は、平均カウントまたは正規化されたカウントの平均値を有するゲノミックセクションのセットについてのものであり、平均高度と称される。時には、高度は、生のカウントおよび／またはフィルタリングされたカウントを含むゲノミックセクションについて誘導される。いくつかの実施形態では、高度は、生のカウントに基づく。時には、高度は、不確実性値を伴う。ゲノミックセクションについての高度は、時には、「ゲノミックセクションの高度」と称され、これは、本明細書では「ゲノミックセクションレベル」と同義である。
２つ以上の高度（例えば、プロファイルにおける２つ以上の高度）について正規化されたまたは正規化されていないカウントは、時には、高度に応じて数学的に操作することができる（例えば、足し算すること、掛け算すること、平均すること、正規化することなど、またはその組合せ）。例えば、２つ以上の高度について正規化されたまたは正規化されていないカウントは、プロファイルにおける高度の１つ、いくつか、または全部に応じて正規化することができる。時には、プロファイルにおける全ての高度の正規化されたまたは正規化されていないカウントを、プロファイルにおける１つの高度に応じて正規化する。時には、プロファイルにおける第１の高度の正規化されたまたは正規化されていないカウントをプロファイルにおける第２の高度の正規化されたまたは正規化されていないカウントに応じて正規化する。
高度（例えば、第１の高度、第２の高度）の非限定的な例は、処理されたカウントを含むゲノミックセクションのセットについての高度、カウントの平均値、中央値、最頻値、中点またはアベレージを含むゲノミックセクションのセットについての高度、正規化されたカウントを含むゲノミックセクションのセットについての高度など、またはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、プロファイルにおける第１の高度および第２の高度は、同じ染色体にマッピングされたゲノミックセクションのカウントに由来する。いくつかの実施形態では、プロファイルにおける第１の高度および第２の高度は、異なる染色体にマッピングされたゲノミックセクションのカウントに由来する。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノミックセクションにマッピングされた、正規化されたまたは正規化されていないカウントから高度を決定する。いくつかの実施形態では、２つ以上のゲノミックセクションにマッピングされた、正規化されたまたは正規化されていないカウントから高度を決定し、各ゲノミックセクションについて正規化されたカウントは多くの場合ほとんど同じである。高度についてのゲノミックセクションのセットにおけるカウント（例えば、正規化されたカウント）は変動し得る。高度についてのゲノミックセクションのセットでは、そのセットの他のゲノミックセクションにおけるものとは有意に異なるカウントを有する１つまたは複数のゲノミックセクションが存在し得る（例えば、ピークおよび／またはディップ）。任意の適切な数のゲノミックセクションに関連付けられる任意の適切な数の正規化されたまたは正規化されていないカウントにより高度を定義することができる。
時には、１つまたは複数の高度は、ゲノムのゲノミックセクションの全部またはいくつかの正規化されたまたは正規化されていないカウントから決定することができる。多くの場合、高度は、染色体またはそのセグメントの正規化されたまたは正規化されていないカウントの全部またはいくつかから決定することができる。時には、２つ以上のゲノミックセクション（例えば、ゲノミックセクションのセット）に由来する２つ以上のカウントにより、高度が決定される。時には、２つ以上のカウント（例えば、２つ以上のゲノミックセクションからのカウント）により、高度が決定される。いくつかの実施形態では、２〜約１００，０００のゲノミックセクションからのカウントにより、高度が決定される。いくつかの実施形態では、２〜約５０，０００、２〜約４０，０００、２〜約３０，０００、２〜約２０，０００、２〜約１０，０００、２〜約５０００、２〜約２５００、２〜約１２５０、２〜約１０００、２〜約５００、２〜約２５０、２〜約１００または２〜約６０のゲノミックセクションからのカウントにより、高度が決定される。いくつかの実施形態では、約１０〜約５０のゲノミックセクションからのカウントにより、高度が決定される。いくつかの実施形態では、約２０〜約４０以上のゲノミックセクションからのカウントにより、高度が決定される。いくつかの実施形態では、高度は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上のゲノミックセクションからのカウントを含む。いくつかの実施形態では、高度は、ゲノミックセクションのセット（例えば、参照ゲノムのゲノミックセクションのセット、染色体のゲノミックセクションのセットまたは染色体のセグメントのゲノミックセクションのセット）に対応する。
いくつかの実施形態では、連続したゲノミックセクションの正規化されたまたは正規化されていないカウントについて高度を決定する。時には、連続したゲノミックセクション（例えば、ゲノミックセクションのセット）とは、ゲノムの隣接するセグメントまたは染色体または遺伝子の隣接するセグメントを表す。例えば、２つ以上の連続したゲノミックセクションは、ゲノミックセクションを端から端までマージすることによってアラインメントした場合、各ゲノミックセクションよりも長いＤＮＡ配列の配列集合を表し得る。例えば、２つ以上の連続したゲノミックセクションはインタクトなゲノム、染色体、遺伝子、イントロン、エクソンまたはそのセグメントを表し得る。時には、連続したゲノミックセクションおよび／または連続していないゲノミックセクションの収集物（例えば、セット）から高度を決定する。
有意に異なる高度
いくつかの実施形態では、正規化されたカウントのプロファイルは、プロファイル内に別の高度（例えば、第２の高度）とは有意に異なる高度（例えば、第１の高度）を含む。第１の高度は第２の高度よりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態では、第１の高度は、コピー数多型（例えば、母体のコピー数多型、胎児のコピー数多型、または母体のコピー数多型および胎児のコピー数多型）を含む１つまたは複数の読み取りを含むゲノミックセクションのセットについてのものであり、第２の高度は、コピー数多型を実質的に有さない読み取りを含むゲノミックセクションのセットについてのものである。いくつかの実施形態では、有意に異なるとは、観察可能な差異を指す。時には、有意に異なるとは、統計学的に異なることまたは統計的有意差を指す。統計的有意差は、時には、観察された差異の統計学的評価である。統計的有意差は、当技術分野における適切な方法によって評価することができる。任意の適切な閾値または範囲を使用して、２つの高度が有意に異なることを決定することができる。いくつかの場合には、約０．０１パーセント以上異なる（例えば、高度値の一方またはいずれかの０．０１パーセント）２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なる。時には、約０．１パーセント以上異なる２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なる。いくつかの場合には、約０．５パーセント以上異なる２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なる。時には、約０．５％、０．７５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％または約１０％超異なる２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なる。時には、２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なり、いずれの高度にもオーバーラップは存在せず、かつ／または一方の高度または両方の高度について算出された不確実性値によって定義される範囲内にオーバーラップは存在しない。いくつかの場合には、不確実性値はシグマとして表される標準偏差である。時には、２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なり、これらは約１倍以上不確実性値が異なる（例えば、１シグマ）。時には、２つの高度（例えば、平均高度）は有意に異なり、これらは約２倍以上（例えば、２シグマ）、約３倍以上の、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、または約１０倍以上不確実性値が異なる。時には、２つの高度（例えば、平均高度）は、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、または４．０倍以上不確実性値が異なる場合に、有意に異なる。いくつかの実施形態では、２つの高度の間の差異が増加するに従い信頼水準が増加する。いくつかの場合には、２つの高度の間の差異が減少するに従い、かつ／または不確実性値が増加するに従い、信頼水準が減少する。例えば、時には、信頼水準は高度と標準偏差（例えば、ＭＡＤ）の間の差異の比率と共に増加する。
いくつかの実施形態では、ゲノミックセクションの第１のセットは、多くの場合、ゲノミックセクションの第２のセットとは異なる（例えば、それとオーバーラップしない）ゲノミックセクションを含む。例えば、時には、正規化されたカウントの第１の高度は、プロファイル内の正規化されたカウントの第２の高度とは有意に異なり、第１の高度はゲノミックセクションの第１のセットについてのものであり、第２の高度はゲノミックセクションの第２のセットについてのものであり、ゲノミックセクションは、ゲノミックセクションの第１のセットおよび第２のセットにおいてオーバーラップしない。いくつかの場合には、ゲノミックセクションの第１のセットは、それぞれ第１の高度および第２の高度が決定されるゲノミックセクションの第２のセットのサブセットではない。時には、ゲノミックセクションの第１のセットは、それぞれ第１の高度および第２の高度が決定されるゲノミックセクションの第２のセットとは異なり、かつ／または別個のものである。
時には、ゲノミックセクションの第１のセットは、プロファイル内のゲノミックセクションの第２のセットのサブセットである。例えば、時には、プロファイル内のゲノミックセクションの第２のセットについての正規化されたカウントの第２の高度は、プロファイル内の第１の高度についてのゲノミックセクションの第１のセットの正規化されたカウントを含み、ゲノミックセクションの第１のセットは、プロファイル内のゲノミックセクションの第２のセットのサブセットである。時には、アベレージ、平均値、中央値、最頻値または中点の高度は第２の高度に由来し、第２の高度は第１の高度を含む。時には、第２の高度は染色体全体を表すゲノミックセクションの第２のセットを含み、第１の高度はゲノミックセクションの第１のセットを含み、第１のセットは、ゲノミックセクションの第２のセットのサブセットであり、第１の高度により、染色体に存在する母体のコピー数多型、胎児のコピー数多型、または母体のコピー数多型および胎児のコピー数多型が表される。
いくつかの実施形態では、第２の高度の値は、染色体またはそのセグメントについてのカウントプロファイルの平均値、アベレージ最頻値、中点または中央値に第１の高度よりも近い。いくつかの実施形態では、第２の高度は、染色体、染色体の部分またはそのセグメントの平均高度である。いくつかの実施形態では、第１の高度は、染色体またはそのセグメントを表す優勢な高度（例えば、第２の高度）とは有意に異なる。プロファイルは、第２の高度と有意に異なる多数の第１の高度を含んでよく、各第１の高度はそれぞれ独立に、第２の高度よりも高くても低くてもよい。いくつかの実施形態では、第１の高度および第２の高度は同じ染色体に由来し、第１の高度は第２の高度よりも高いか低いかであり、第２の高度は染色体の優勢な高度である。時には、第１の高度および第２の高度は同じ染色体に由来し、第１の高度により、コピー数多型（例えば、母体および／または胎児のコピー数多型、欠失、挿入、重複）が示され、第２の高度は、染色体またはそのセグメントについてのゲノミックセクションの平均高度または優勢な高度である。
いくつかの場合には、第２の高度についてのゲノミックセクションの第２のセット内の読み取りは、遺伝的変異（例えば、コピー数多型、母体および／または胎児のコピー数多型）を実質的に含まない。多くの場合、第２の高度についてのゲノミックセクションの第２のセットは、いくらかの変動性（例えば、高度の変動性、ゲノミックセクションについてのカウントの変動性）を含む。時には、コピー数多型と実質的に関連しない、高度についてのゲノミックセクションのセット内の１つまたは複数のゲノミックセクションは、母体のゲノムおよび／または胎児のゲノムに存在するコピー数多型を有する１つまたは複数の読み取りを含む。例えば、時には、ゲノミックセクションのセットは、小さな染色体のセグメント（例えば、１０ゲノミックセクション未満）に存在するコピー数多型を含み、ゲノミックセクションのセットは、コピー数多型と実質的に関連しない高度についてのものである。したがって、コピー数多型を実質的に含まないゲノミックセクションのセットは、それでも、ある高度の約１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満のゲノミックセクションに存在するコピー数多型を含んでよい。
時には、第１の高度はゲノミックセクションの第１のセットについてのものであり、第２の高度はゲノミックセクションの第２のセットについてのものであり、ゲノミックセクションの第１のセットおよびゲノミックセクションの第２のセットは連続している（例えば、染色体またはそのセグメントの核酸配列に関して近接する）。時には、ゲノミックセクションの第１のセットおよびゲノミックセクションの第２のセットは連続していない。
胎児核酸と母体核酸の混合物からの比較的短い配列読み取りを利用して、高度および／またはプロファイルに変換することができるカウントをもたらすことができる。カウント、高度およびプロファイルは、電子形態または有形形態で示すことができ、可視化することができる。ゲノミックセクションにマッピングされたカウント（例えば、高度および／またはプロファイルとして示される）により、胎児および／または妊婦に存在する胎児のゲノム、染色体、または染色体の部分もしくはセグメントおよび／もしくは母体のゲノム、染色体、または染色体の部分もしくはセグメントの視覚的な表示をもたらすことができる。
データ処理
カウントされた、マッピングされた配列読み取りは、本明細書では、データが操作されていないカウント（例えば、生のカウント）を表すので、生のデータと称される。いくつかの実施形態では、データセット内の配列読み取りデータをさらに補正および／または処理し（例えば、数学的かつ／または統計学的に操作し）、かつ／または提示してアウトカムをもたらすことを容易にすることができる。補正された配列読み取りデータは、多くの場合、配列読み取り、データセット内のデータ、および／または試料核酸の一部または全部を操作することによってもたらされる。任意の適切な操作を使用して配列読み取り、データセット内のデータおよび／または試料核酸の一部または全部を補正することができる。いくつかの実施形態では、配列読み取り、データセット内のデータおよび／または試料核酸に対する補正は、フィルタリング（例えば、選択された特徴または変数に基づいてデータの一部を除去すること；反復配列を除去すること、情報価値のないビンまたはゼロカウント中央値を有するビンを除去すること）、補正すること（例えば、データの一部または全部を推定量に基づいて再尺度化および／または再重み付けすること；試料カウントをＧ／Ｃ含量に基づいて再重み付けすること、データの一部または全部を胎児分率に基づいて再尺度化および／または再重み付けすること）、１つまたは複数の推定量または統計学的操作を用いて正規化すること（例えば、所与のフローセル内の全てのデータをフローセル内の全てのデータの中央絶対偏差に対して正規化すること）などから選択されるプロセスである。いくつかの実施形態では、推定量はロバストな推定量である。ある特定の実施形態では、配列読み取りデータの一部を補正および／または処理し、いくつかの実施形態では、配列読み取りデータの全てを補正および／または処理する。
補正または処理された配列読み取り、データセット内のデータおよび／または試料核酸は、時には、誘導値（例えば、カウントの誘導値、データ誘導値、配列読み取りの誘導値など）と称される。カウント、データまたは配列読み取りの誘導値は、多くの場合、カウント、データまたは配列読み取りに対して１つまたは複数の数学的操作および／または統計学的操作を使用することによって生成する。本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意の適切な数学的操作および／または統計学的操作を使用して、カウント、データ、または配列読み取りの誘導値を生成することができる。カウント、データ、または配列読み取りをフィルタリング、補正、正規化または操作して誘導値を生成するために利用することができる数学的操作および／または統計学的操作の非限定的な例としては、アベレージ、平均値、中央値、最頻値、中点、中央絶対偏差、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入される中央絶対偏差の代替値、ブートストラップ推定値、本明細書に記載されており、当技術分野で公知の他の方法など、またはそれらの組合せが挙げられる。
ある特定の実施形態では、より大きなデータセットを含めたデータセットは、さらなる解析を容易にするために前処理することが有効である。データセットの前処理は、時には、冗長であり、かつ／または情報価値のないゲノミックセクションまたはビン（例えば、情報価値のないデータを有するビン、マッピングされた冗長な読み取り、ゼロカウント中央値を有するゲノミックセクションまたはビン、過大表示または過小表示された配列［例えば、Ｇ／Ｃ配列］、反復配列）を除去することを伴う。理論によって限定されることなく、データ処理および／または前処理により、（ｉ）ノイズの多いデータを除去することができ、（ｉｉ）情報価値のないデータを除去することができ、（ｉｉｉ）冗長なデータを除去することができ、（ｉｖ）より大きなデータセットの複雑さを低下させることができ、（ｖ）実験条件に誘導されるデータの変動性を低下させるまたは排除することができ、（ｖｉ）データセット内のデータの一部または全部を再尺度化および／または再重み付けすることができ、かつ／または（ｖｉｉ）ある形態から１つまたは複数の他の形態へのデータの変換を容易にすることができる。「前処理」および「処理」という用語は、データまたはデータセットに関して利用される場合、本明細書では総称して「処理」と称される。処理により、データをさらなる解析により適するものにすることができ、いくつかの実施形態ではアウトカムを生成することができる。
ノイズの多いデータとは、多くの場合、（ａ）解析またはプロットした場合にデータ点間に有意な分散を有するデータ、（ｂ）有意な標準偏差（例えば、３標準偏差を超える）を有するデータ、（ｃ）有意な平均値の標準誤差を有するデータなど、および前述のものの組合せである。ノイズの多いデータは、時には、出発材料（例えば、核酸試料）の量および／または品質に起因して生じ、時には、配列読み取りを生成するために使用するＤＮＡを調製または複製するためのプロセスの一部として生じる。ある特定の実施形態では、ＰＣＲに基づく方法を用いて調製した場合、ノイズは、過大表示されたある特定の配列に由来する。本明細書に記載の方法により、ノイズの多いデータの寄与を低下させるまたは排除すること、したがって、もたらされるアウトカムに対するノイズの多いデータの影響を低下させることができる。
情報価値のないデータ、情報価値のないビン、および情報価値のないゲノミックセクションとは、多くの場合、所定のカットオフ閾値と有意に異なるまたは所定の値のカットオフ範囲の範囲外の数値を有するゲノミックセクション、またはそれに由来するデータである。いくつかの実施形態では、カットオフ閾値または値の範囲は、多くの場合、配列読み取りデータ（例えば、参照、被験体、フローセルおよび／またはプレートからのもの）を数学的かつ／または統計学的に操作することによって算出され、ある特定の実施形態では、閾値カットオフ値または値の範囲を生成するために操作された配列読み取りデータは配列読み取りデータ（例えば、参照、被験体、フローセルおよび／またはプレートからのもの）である。いくつかの実施形態では、閾値カットオフ値は、生のまたは正規化されたカウントプロファイルの標準偏差および／または中央絶対偏差（例えば、ＭＡＤまたはＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値）を算出し、プロファイルについての標準偏差に、カットオフ閾値として選択された標準偏差の数を表す定数を掛け（例えば、３標準偏差については３を掛ける）、それにより、不確実性についての値を生成することによって得られる。ある特定の実施形態では、算出された不確実性の閾値カットオフ値を超える、または閾値カットオフ値の範囲の外側のゲノミックセクションの一部または全部を、正規化プロセスの一部として、その前に、またはその後に除去する。いくつかの実施形態では、算出された不確実性の閾値カットオフ値を超える、または閾値カットオフ値または生のデータ点の範囲の外側のゲノミックセクションの一部または全部について、正規化または分類プロセスの一部として、またはその前に重み付けする。重み付けの例は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、冗長なデータ、およびマッピングされた冗長な読み取りとは、すでに遺伝子位置（例えば、塩基位置）に割り当てられ、かつ／またはゲノミックセクションについてカウントされていると同定された試料由来の配列読み取りを指す。
実験条件
試料は、時には、共通の実験条件の影響を受ける。実質的に同じ時間にまたは実質的に同じ条件および／または試薬を使用して処理された試料は、時には、異なる時間におよび／または同時に異なる条件および／または試薬を使用して処理された他の試料と比較して、同様の実験条件（例えば、共通の実験条件）に誘導されるデータの変動性を示す。多くの場合、実験手順の間の任意の所与の時間に調製、処理および／または分析することができる試料の数を限定する実施上の考慮すべき問題が存在する。ある特定の実施形態では、アウトカムを生成するために試料を原料から処理するための時間枠は、時には数日、数週間、さらには数ヶ月である。単離と最後の分析の間の時間に起因して、大量の試料を分析するハイスループットな実験により、時には、バッチの影響または実験条件に誘導されるデータの変動性が生じる。実験条件に誘導されるデータの変動性は、多くの場合、試料の単離、保管、調製および／または分析の結果であるあらゆるデータの変動性を含む。実験条件に誘導される変動性の非限定的な例としては、配列の過大表示または過小表示；ノイズの多いデータ；偽データ点または外れ値データ点、試薬の影響、人員の影響、研究所条件の影響などを含む、フローセルに基づく変動性および／またはプレートに基づく変動性が挙げられる。実験条件に誘導される変動性は、時には、データセット内の試料の亜集団に対して生じる（例えば、バッチの影響）。バッチは、多くの場合、実質的に同じ試薬を使用して処理された試料、同じ試料調製プレート（例えば、試料の調製；核酸の単離のために使用するマイクロウェルプレート）において処理された試料、同じ段階分けプレート（例えば、試料をフローセルにローディングする前に組織化するために使用するマイクロウェルプレート）において分析のために段階分けされた試料、実質的に同じ時間に処理された試料、同じ人員によって処理された試料、および／または実質的に同じ実験条件（例えば、温度、ＣＯ２レベル、オゾンレベルなど、またはそれらの組合せ）の下で処理された試料である。実験条件バッチの影響は、時には、同じフローセルで分析され、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて調製され、かつ／または、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて分析のために段階分けされた（例えば、配列決定するために核酸ライブラリーを調製すること）試料に影響を及ぼす。追加的な変動性の原因は、単離された核酸の質、単離された核酸の量、核酸を単離した後保管するまでの時間、保管時間、保管温度など、およびそれらの組合せを含み得る。バッチ（例えば、同時に、かつ／または同じ試薬および／または実験条件を使用して処理されたデータセット内の試料の亜集団）内のデータ点の変動性は、時には、バッチ間で見られるデータ点の変動性を超える。このデータの変動性は、時には、その大きさがデータセット内の他のデータのいくつか、または全ての解釈に影響を及ぼす可能性がある偽データまたは外れ値データを含む。データセットの一部または全部は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知のデータ処理ステップを用いて、実験条件について補正することができる；例えば、フローセル内で分析された、またはマイクロウェルプレートにおいて処理された全ての試料について算出された中央絶対偏差に対する正規化。
実験条件に誘導される変動性は、数週間から数ヶ月または数年（例えば、１週間、１〜４週間、１ヶ月、１〜３ヶ月、１〜６ヶ月）の期間にわたって得られるデータについて観察することができる。時には、１つまたは複数の実験条件が共通の実験条件である多数の実験を数週間から数ヶ月の期間にわたって行う。共通の実験条件の非限定的な例としては、同じ計器、機械またはその一部（例えば、シークエンサー、液体取扱いデバイス、分光光度計、光電池など）の使用、同じデバイス（例えば、フローセル、フローセルチャネル、プレート、チップなど、またはその一部）の使用、同じプロトコール（操作手順、標準操作手順、レシピ、方法および／または条件（例えば、インキュベーションの時間、温度、圧力、湿度、体積、濃度）の使用、同じオペレーター（例えば、技師、科学者）、ならびに同じ試薬（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、配列タグ、同定タグ指標、試料（例えば、ｃｃｆ ＤＮＡ試料）、タンパク質（例えば、酵素、緩衝液、塩、水）など）が挙げられる。
同じデバイス、装置または試薬の使用は、同じ製造者からのデバイス、装置、試薬またはその一部、同じ製造の連続運転、同じロット（例えば、同じプラント、製造者、製造の連続運転または位置に由来する材料、同じ日付が標識された収集物）、同じクリーニングサイクル、同じ調製プロトコール、同じコンテナ（袋、箱、パッケージ、保管ビン、パレット、トレーラー）、同じ輸送（例えば、同じ納期、同じ注文、同じ送り状を有する）、同じ製造プラント、同じ組立てラインなど、またはそれらの組合せを含んでよい。いくつかの実施形態では、同じオペレーターの使用とは、機械、装置またはデバイスの１つまたは複数のオペレーターが同じであることを意味する。
データセット内のデータを補正することにより、多くの場合、データセットに対する外れ値の影響を低下させるまたは排除すること、データを再尺度化または再重み付けして、アウトカムをもたらすことを容易にすること、および／またはデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件（例えば、使用した試薬、使用したフローセル、使用したプレート、試料を処理した人員、使用した指標配列など、またはそれらの組合せ）に応じてデータを選別（例えば、層別化、組織化）することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の共通の実験条件に応じてデータを正規化または補正することができる。
ロバストな推定量を使用してデータを再尺度化または再重み付けすることができる。ロバストな推定量は、多くの場合、その大きさがアウトカムをもたらすこと（例えば、遺伝的変異の有無を決定すること）に影響を及ぼす可能性がある偽データまたは外れ値データの影響を最小限にするまたは排除する数学的操作または統計学的操作である。任意の適切なロバストな推定量を使用してデータセットを補正することができる。いくつかの実施形態では、ロバストな推定量は、尺度のロバストな推定量であり（例えば、変動性； 中央絶対偏差［ＭＡＤ］もしくはＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値と同様である、および／またはそれを含む）、ある特定の実施形態では、ロバストな推定量は、位置のロバストな推定量である（例えば、予測値；アベレージまたは中央値と同様である）。尺度および位置のロバストな推定量の非限定的な例は実施例２に記載されており、また当技術分野で公知である（例えば、中央値、ＡＮＯＶＡなど）。いくつかの実施形態では、データセット内の一部、または全てのデータを、ロバストな推定量を使用して得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値を使用して補正することができる。いくつかの実施形態では、予測カウントは、参照または参照試料（例えば、公知の正倍数性試料）から得られるカウントである。
本明細書に記載のデータセットを補正および／または処理するために任意の適切な手順を利用することができる。データセットを補正するために使用することができる手順の非限定的な例としては、実験条件に基づく補正（例えば、プレートに基づく正規化、フローセルに基づく正規化［例えば、フローセルに基づく中央値の比較］、反復マスキング補正（例えば、反復配列の除去）；Ｇ／Ｃ含量の補正；局所重み付け多項式（例えば、ＬＯＥＳＳ）回帰補正、ロバストな推定量（例えば、位置の推定値［例えば、予測値；アベレージと同様である］、尺度の推定値［例えば、変動性］；および変動性の分析［例えば、ＡＮＯＶＡ］）を使用した正規化が挙げられる。さらに、ある特定の実施形態では、以下のデータ処理方法、フィルタリング、正規化、重み付け、ピーク高さのモニタリング、ピーク面積のモニタリング、ピーク端のモニタリング、面積比の決定、データの数学的処理、データの統計学的処理、統計アルゴリズムの適用、固定された変数を用いた解析、最適化された変数を用いた解析、追加的な処理のためにデータをプロットしてパターンまたは傾向を同定すること、スライディングウィンドウ処理（例えば、スライディングウィンドウ正規化）、スタティックウィンドウ処理（例えば、スタティックウィンドウ正規化）など、および前述のものの組合せの１つまたは複数を利用してデータセットをさらに処理することができ、ある特定の実施形態では、補正ステップの前に、処理方法をデータセットに適用することができる。いくつかの実施形態では、さまざまな特徴（例えば、ＧＣ含量、マッピングされた冗長な読み取り、セントロメア領域、テロメア領域、反復配列など、およびそれらの組合せ）および／または変数（例えば、胎児の性別、母体の年齢、母体の倍数性、胎児核酸のパーセント寄与など、またはそれらの組合せ）に基づいてデータセットを補正および／または処理する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の通りデータセットを処理することにより、大きく、かつ／または複雑なデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。複雑なデータセットの非限定的な例としては、年齢および民族的なバックグラウンドが異なる１つまたは複数の試験被験体および複数の参照被験体から生成した配列読み取りデータが挙げられる。いくつかの実施形態では、データセットは、数千から数百万までの、それぞれの試験被験体および／または参照被験体についての配列読み取りを含んでよい。
ある特定の実施形態では、データの補正および／または処理は任意の数のステップで実施することができ、２以上のステップを伴う実施形態では、ステップを任意の順序で実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、単一の補正／処理手順のみを使用してデータを補正および／または処理することができ、ある特定の実施形態では、１以上、５以上、１０以上または２０以上の補正／処理ステップ（例えば、１以上の補正／処理ステップ、２つ以上の補正／処理ステップ、３以上の補正／処理ステップ、４以上の補正／処理ステップ、５以上の補正／処理ステップ、６以上の補正／処理ステップ、７以上の補正／処理ステップ、８以上の補正／処理ステップ、９以上の補正／処理ステップ、１０以上の補正／処理ステップ、１１以上の補正／処理ステップ、１２以上の補正／処理ステップ、１３以上の補正／処理ステップ、１４以上の補正／処理ステップ、１５以上の補正／処理ステップ、１６以上の補正／処理ステップ、１７以上の補正／処理ステップ、１８以上の補正／処理ステップ、１９以上の補正／処理ステップ、または２０以上の補正／処理ステップ）を使用してデータを補正／処理することができる。いくつかの実施形態では、補正／処理ステップは、２回以上繰り返される同じステップであってよく（例えば、２回以上フィルタリングすること、２回以上正規化すること）、ある特定の実施形態では、補正／処理ステップは、２回以上の異なる補正／処理ステップ（例えば、反復マスキング、フローセルに基づく正規化；ビンに関したＧ／Ｃ含量の補正、フローセルに基づく正規化；反復マスキング、ビンに関したＧ／Ｃ含量の補正、プレートに基づく正規化；フィルタリング、正規化；正規化、ピーク高さおよび端のモニタリング；フィルタリング、正規化、参照に対する正規化、ｐ値を決定するための統計学的操作など）、を同時にまたは逐次的に行う。いくつかの実施形態では、配列読み取りデータを処理してアウトカムをもたらすことを容易にするために、任意の適切な数および／または組合せの同じまたは異なる補正／処理ステップを利用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の基準によってデータセットを補正および／または処理することにより、データセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、本明細書に記載の１つまたは複数の実験条件について補正することを含んでよい。時には、データの変動性をもたらす実験条件の非限定的な例としては、配列の過大表示または過小表示（例えば、偏った増幅に基づく変動性）；ノイズの多いデータ；偽データ点または外れ値データ点；フローセルに基づく変動性（例えば、あるフローセルで分析された試料では見られるが、同じバッチ由来の（例えば、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて調製された））試料を分析するために使用した他のフローセルでは見られない変動性；および／またはプレートに基づく変動性（例えば、分析のために使用したフローセルには関係なく、同じ試薬プレートまたはマイクロウェルプレートにおいて調製され、かつ／または同じマイクロウェルプレートにおいて分析のために段階分けされたいくつかのまたは全ての試料において見られる変動性）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、パーセント表示を、ゲノミックセクション（例えば、ゲノミックセクション、染色体、ゲノムまたはその一部）について算出する。いくつかの実施形態では、パーセント表示を、多数のゲノミックセクションにマッピングされたカウントの数に対して正規化された（例えば、それで割った）、１つのゲノミックセクションにマッピングされたカウントの数として決定する。時には、パーセント表示の決定では、性染色体（例えば、Ｘ染色体および／またはＹ染色体）に由来するゲノミックセクションおよび／またはカウントを排除する。時には、パーセント表示の決定には、常染色体に由来するゲノミックセクションおよび／またはカウントのみを含める。時には、パーセント表示の決定には、常染色体および性染色体に由来するゲノミックセクションおよび／またはカウントを含める。例えば、ｐｅｒｃｉは選択されたゲノミックセクションｉについてのパーセント表示を示す
（式中、カウントｉは、選択されたゲノミックセクションｉにマッピングされた読み取りのカウントであり、カウントｊは、多数のゲノミックセクションｊ（例えば、染色体ｊ上の多数のゲノミックセクション、全ての常染色体ｊ上のゲノミックセクション、ゲノムｊのゲノミックセクション）にマッピングされた読み取りのカウントの数である）。例えば、ｃｈｒｉは染色体ｉについての染色体表示を示す
（式中、カウントｊは染色体ｊ上のアラインメントされた読み取りの数である）。いくつかの実施形態では、パーセント表示は、「ゲノムセクションカウント表示」である。時には、パーセント表示は、「ゲノミックセクション表示」または「染色体表示」である。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、実験条件に誘導される変動性について補正することを含んでよい。変動性は、尺度および／または位置のロバストな推定量を使用することによって補正することができる。いくつかの実施形態では、（１）選択されたゲノミックセクションのパーセント表示（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示；染色体、例えば第２１染色体）、（２）選択されたゲノミックセクションについてのパーセント表示の全ての値の中央値、平均値、最頻値、アベレージおよび／または中点、（３）パーセント表示の全ての値の中央絶対偏差（ＭＡＤ）を決定し、外れ値の影響を最小限にするまたは排除する、フローセルに基づくロバストな推定量を使用してｚスコアを補正することによって、ｚスコアを実験条件に誘導される変動性について補正することができる。ある特定の実施形態では、標的染色体、標的ゲノム領域または標的ゲノミックセクション（例えば、第２１染色体）についての、ロバストなフローセルに基づくｚスコアの補正は、以下の式を利用して算出する。
書かれている式は、ゲノミックセクションについてのロバストなＺスコアを算出するように構成されており、式中、ｐｅｒｃは選択されたゲノミックセクションｉ（例えば、任意の適切なゲノミックセクション、染色体、ゲノムまたはその一部）のパーセント表示（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示、染色体表示）である。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃについて得られた、選択されたゲノミックセクションｉについての１つまたは複数のパーセント表示値から中央値を算出する。実験条件ｅｃ’について得られた、選択されたゲノミックセクションｉについての１つまたは複数のパーセント表示値からＭＡＤを算出する。ある特定の実施形態では、一般式を利用して、選択された標的ゲノミックセクションについての等価な値を代入することによって任意のゲノミックセクションについてのロバストなｚスコアを得ることができる。いくつかの実施形態では、選択された試料のセットまたは試料のサブセットについて中央値、平均値、最頻値、アベレージ、中点および／またはＭＡＤを算出する。時には、同じ試料のセットについて中央値および／またはＭＡＤを算出する。いくつかの実施形態では、異なる試料のセットについて中央値および／またはＭＡＤを算出する。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃは同じである。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃは、１つまたは複数の共通の実験条件を含んでよいまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃは異なる。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃ’は同じである。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃ’は、１つまたは複数の共通の実験条件を含んでよいまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃ’は異なる。時には、実験条件ｅｃおよびｅｃ’は異なる。いくつかの実施形態では、実験条件ｅｃおよびｅｃ’は、１つまたは複数の共通の実験条件を含んでよい、またはそれからなってよい。例えば、選択されたゲノミックセクションについてのロバストなＺスコアを、（ａ）選択された試料のセットから収集された、１つまたは複数の共通の実験条件下で（例えば、同じフローセルから）得たデータの選択されたセットから得た平均値、および（ｂ）別の選択された試料のセットから収集された、１つまたは複数の共通の実験条件下で（例えば、異なるフローセルおよび選択された試薬の同じロットを使用して）得たデータの別の選択されたセットから得たＭＡＤから算出することができる。いくつかの実施形態では、平均値およびＭＡＤは、少なくとも１つの共通の実験条件を共有するデータから得られる。時には、平均値およびＭＡＤは、共通の実験条件を共有しないデータから得られる。
いくつかの実施形態では、正規化された試料カウント（例えば、Ｚスコア）は、第１のゲノミックセクションのカウント（例えば、カウント、パーセント表示）から予測カウント（例えば、カウントの中央値、パーセント表示の中央値）を引き算し、それにより減算値を生成し、減算値をカウントの変動性の推定値で割ること（例えば、ＭＡＤ、カウントのＭＡＤ、パーセント表示のＭＡＤ）を含むプロセスによって得られる。いくつかの実施形態では、予測カウント（例えば、カウントの中央値、パーセント表示の中央値）およびカウントの変動性の推定値（例えば、ＭＡＤ、カウントのＭＡＤ、パーセント表示のＭＡＤ）は、少なくとも１つの共通の実験条件を共有するデータから得られる。時には、予測カウント（例えば、カウントの中央値、パーセント表示の中央値）およびカウントの変動性の推定値（例えば、ＭＡＤ、カウントのＭＡＤ、パーセント表示のＭＡＤ）は、共通の実験条件を共有しないデータから得られる。いくつかの実施形態では、中央値は、中央値、平均値、最頻値、アベレージおよび／または中点であってよい。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、フローセルに基づく変動性について補正することを含んでよい。フローセルに基づく変動性は、尺度および／または位置のロバストな推定量を使用することによって補正することができる。いくつかの実施形態では、（１）選択された染色体（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示；例えば第２１染色体）のパーセント表示、（２）フローセルにおいて観察された染色体表示の全ての値の中央値、（３）フローセルにおいて観察された染色体表示の全ての値の中央絶対偏差を決定し、外れ値の影響を最小限にするまたは排除する、フローセルに基づくロバストな推定量を使用してｚスコアを補正することによって、フローセルに基づく変動性についてｚスコアを補正することができる。ある特定の実施形態では、標的染色体、標的ゲノム領域または標的ゲノミックセクション（例えば、第２１染色体）についての、ロバストなフローセルに基づくｚスコアの補正は、以下の式を利用して算出する。
書かれている式は第２１染色体についてのロバストなＺスコアを算出するように構成されており、式中、ｐｅｒｃ．ｃｈｒ２１は、パーセント第２１染色体表示（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示）であり、ＭＡＤは中央絶対偏差を表し、ＦＣはフローセルを表す。ある特定の実施形態では、第２１染色体参照が指定される（例えば、．ｃｈｒ２１）場合、一般式を利用して、選択された標的染色体、標的ゲノム領域または標的ゲノミックセクションについての等価な値を代入することによって任意の染色体についてのロバストなｚスコアを得ることができる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、プレートに基づく変動性について補正することを含んでよい。プレートに基づく変動性は、尺度および／または位置のロバストな推定量を使用することによって補正することができる。ある特定の実施形態では、（１）選択された染色体（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示；例えば第２１染色体）のパーセント表示、（２）１つまたは複数のプレートにおいて観察された染色体表示の全ての値の中央値、（３）１つまたは複数のプレートにおいて観察された染色体表示の全ての値の中央絶対偏差を決定し、外れ値の影響を最小限にするまたは排除する、プレートに基づくロバストな推定量を使用してｚスコアを補正することによって、プレートに基づく変動性についてｚスコアを補正することができる。ある特定の実施形態では、標的染色体、標的ゲノム領域または標的ゲノミックセクション（例えば、第２１染色体）についてのロバストなプレートに基づくｚスコアの補正は、以下の式を利用して算出する。
書かれている式は第２１染色体についてのロバストなＺスコアを算出するように構成されており、式中、ｐｅｒｃ．ｃｈｒ２１はパーセント第２１染色体表示（例えば、第１のゲノムセクションカウント表示）であり、ＭＡＤは中央絶対偏差を表し、プレートは、試料の１つまたは複数のプレート（例えば、１つまたは複数の試薬プレート、１つまたは複数の試料調製プレート、１つまたは複数の段階分けプレート）を表す。ある特定の実施形態では、第２１染色体参照が指定される（例えば、．ｃｈｒ２１）場合、一般式を利用して、選択された標的染色体、標的ゲノム領域または標的ゲノミックセクションについての等価な値を代入することによって任意の染色体についてのロバストなｚスコアを得ることができる。
時には、次式を使用して中央絶対偏差（ＭＡＤ）を算出する：
式中、Ｘは中央絶対偏差が算出される任意のランダムな変数を表し、正規化定数１．４８２６は１／Ｉｎｖ［ファイ］（３／４）を表し、ファイは標準のガウス（例えば、正規）分布についての累積分布関数を表し、Ｉｎｖ［ファイ］はその逆関数である（例えば、分位関数に関連する）。Ｉｎｖ［ファイ］はＸ＝３／４で評価したものであり、１／１．４８２６と等しい。「Ｒコード」では、正規化定数を算出するための方程式は、１／ｑｎｏｒｍ（３／４）＝１．４８２６である。「Ｒコード」は、Ｓプログラミング言語に実質的に類似した、種々の統計解析のために使用される非専売のオープンソースプログラミング言語である（例えば、Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１０年）． Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ． ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０、ＵＲＬワールドワイドウェブ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。正規化定数１．４８２６は、正規分布したデータの中央絶対偏差（例えば、ＭＡＤ）が、大きな試料について、同じデータの標準偏差（例えば、ＳＴＤＥＶ）と等しくなるように選択され、ＭＡＤおよびＳＴＤＥＶが同じ尺度に有効に置かれる。多くの場合、分位関数を利用して確率分布を規定する。いくつかの実施形態では、確率分布の分位関数はその積分の逆関数であり、多くの場合、所与の確率についてランダムな変数の値またはそれが下回る値を特定する。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、配列の過大表示または過小表示について補正することを含んでよい。本明細書に記載の通り、いくつかの調製および／または配列決定ステップにおいて利用する増幅手順により、時には、配列含量および／または構造に起因して配列の過大表示または過小表示が生じる。配列の過大表示または過小表示により、時には、もたらされるアウトカムの信頼度が低下する。ある特定の実施形態では、ロバストな推定量を使用してデータセットの一部または全部を予測値に関して補正または正規化することにより、過剰配列表示または過小配列表示の影響を最小限にすることまたは排除することができる。いくつかの実施形態では、アベレージ、中央値、アベレージ、中点、最頻値、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、ブートストラップ推定値、標準偏差、ｚスコア、ロバストなｚスコア、ＡＮＯＶＡ、ＬＯＥＳＳ回帰分析（例えば、ＬＯＥＳＳ平滑化、ＬＯＷＥＳＳ平滑化）などから選択される１つまたは複数の推定量を使用して、染色体の部分、または全てについての予測値を算出する。データセットの一部または全部を補正して配列の過大表示または過小表示の影響を低下させるまたは排除することにより、アウトカムをもたらすことを容易にし、かつ／またはデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、Ｇ／Ｃ含量について補正することを含んでよい。本明細書に記載の通り、Ｇ／Ｃ含量が高い配列は、時には、生のデータセットまたは処理されたデータセットにおいて過大表示または過小表示される。ある特定の実施形態では、ロバストな推定量を使用してデータセットの一部または全部を予測値に関して補正または正規化することにより、データセットの一部または全部（例えば、選択されたビン、染色体の選択された部分、選択された染色体）についてのＧ／Ｃ含量を補正してＧ／Ｃ含量の偏りを最小限にするまたは排除する。いくつかの実施形態では、予測値はヌクレオチド配列読み取りのＧ／Ｃ含量であり、ある特定の実施形態では、予測値は試料核酸のＧ／Ｃ含量である。いくつかの実施形態では、アベレージ、中央値、平均値、最頻値、中点、中央絶対偏差、（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、ブートストラップ推定値、標準偏差、ｚスコア、ロバストなｚスコア、ＡＮＯＶＡ、ＬＯＥＳＳ回帰分析（例えば、ＬＯＥＳＳ平滑化、ＬＯＷＥＳＳ平滑化）などから選択される１つまたは複数の推定量を使用して、染色体の部分、または全てについての予測値を算出する。いくつかの実施形態では、データセットの一部または全部を補正してＧ／Ｃ含量の偏りの影響を低下させるまたは排除することにより、アウトカムをもたらすことを容易にし、かつ／またはデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。
ＰＥＲＵＮ
核酸指標に関連する誤差を減少させるために特に有用な正規化方法体系は、本明細書では、パラメータ化された誤差除去および不偏正規化（Ｐａｒａｍｅｔｅｒｉｚｅｄ Ｅｒｒｏｒ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ Ｕｎｂｉａｓｅｄ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＰＥＲＵＮ）と称される。ＰＥＲＵＮ方法体系は、種々の核酸指標（例えば、核酸配列読み取り）に、そのような指標に基づく予測を交絡させる誤差の影響を低下させるために適用することができる。
例えば、ＰＥＲＵＮ方法体系は、試料からの核酸配列読み取りに適用し、核酸の高度の決定（例えば、ゲノミックセクションの高度の決定）を損なう可能性がある誤差の影響を低下させることができる。そのような適用は、核酸配列読み取りを使用して、ヌクレオチド配列（例えばゲノミックセクション）の変動する高度として顕在化する、被験体における遺伝的変異の有無を評価するために有用である。ゲノミックセクションにおける変動の非限定的な例は、染色体異数性（例えば、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー）および性染色体（例えば、女性におけるＸＸ対男性におけるＸＹ）の有無である。常染色体（例えば、性染色体以外の染色体）のトリソミーは、影響を受けた常染色体と称することができる。ゲノミックセクションの高度における変動の他の非限定的な例としては、微小欠失、微小挿入（ｍｉｃｒｏｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、重複およびモザイク現象が挙げられる。
ある特定の適用では、ＰＥＲＵＮ方法体系により、ビンと称される特定のゲノムの群についての核酸指標を正規化することによって実験上の偏りを減少させることができる。ビンは適切な核酸指標の収集物を含み、その非限定的な例としては、本明細書ではゲノミックセクションまたは参照ゲノムの部分と称される、ある長さの連続したヌクレオチドが挙げられる。ビンは、本明細書に記載の他の核酸指標を含んでよい。そのような適用では、ＰＥＲＵＮ方法体系により、一般には、３次元においていくつもの試料にわたって特定のビンでの核酸指標を正規化する。特定のＰＥＲＵＮの適用の詳細な説明は本明細書の実施例４および実施例５に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＰＥＲＵＮ方法体系は、各ビンについて、（ｉ）配列読み取りをマッピングする参照ゲノムのビンについての実験上の偏りと（ｉｉ）ビンにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係からゲノミックセクションの高度を算出することを含む。ビンのそれぞれについての実験上の偏りは、複数の試料にわたって、各試料についての（ｉ）ビンのそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）ビンのそれぞれについてのマッピングの特徴との間のフィッティングした関係に応じて決定することができる。この各試料についてのフィッティングした関係を複数の試料について３次元で集合させることができる。ある特定の実施形態では（例えば、図８２、実施例４）、この集合体を実験上の偏りに応じて順序づけることができるが、ＰＥＲＵＮ方法体系は実験上の偏りに応じて集合体を順序づけずに実施することができる。
関係は当技術分野で公知の方法によって生成することができる。ある特定の実施形態では、各試料について２次元で関係を生成することができ、誤差を証明する、またはおそらく誤差を証明する変数を次元の１つまたは複数について選択することができる。関係は、例えば、ユーザーによって提供される２つ以上の変数の値を使用してグラフをプロットする当技術分野で公知のグラフ作成ソフトウェアを使用して生成することができる。関係は、当技術分野で公知の方法（例えば、グラフ作成ソフトウェア）を用いてフィッティングすることができる。ある特定の関係を線形回帰によってフィッティングすることができ、線形回帰によって傾き値および切片値を生成することができる。ある特定の関係は、時には、線形ではなく、例えば放物線関数、双曲線関数または指数関数などの非線形関数によってフィッティングすることができる。
ＰＥＲＵＮ方法体系では、フィッティングした関係の１つまたは複数は線形であってよい。実験上の偏りがＧＣの偏りであり、マッピングの特徴がＧＣ含量である妊婦由来の循環している無細胞核酸を分析するためには、試料についての（ｉ）各ビンにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）ビンのそれぞれについてのＧＣ含量との間のフィッティングした関係は線形であってよい。後者のフィッティングした関係について、傾きはＧＣの偏りに関係し、ＧＣの偏り係数は、フィッティングした関係を複数の試料にわたって集合させた際に各ビンについて決定することができる。そのような実施形態では、複数の試料およびビンについての（ｉ）ビンについてのＧＣの偏り係数と（ｉｉ）ビンにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係も線形であってよい。切片および傾きは、後者のフィッティングした関係から入手することができる。そのような適用では、傾きはＧＣ含量に基づいて試料に特異的な偏りに対処し、切片は全ての試料に共通するビンに特異的な減弱パターンに対処する。ＰＥＲＵＮ方法体系では、アウトカム（例えば、遺伝的変異の有無；胎児の性別の決定）をもたらすためにゲノミックセクションの高度を算出する際のそのような試料に特異的な偏りおよびビンに特異的な減弱を有意に減少させることができる。
したがって、ＰＥＲＵＮ方法体系を並行して複数の試料にわたって配列読み取りに適用することにより、（ｉ）試料に特異的な実験上の偏り（例えば、ＧＣの偏り）および（ｉｉ）試料に共通するビンに特異的な減弱によって引き起こされる誤差を有意に減少させることができる。これらの２つの誤差の原因のそれぞれに別々にまたは逐次的に対処する他の方法では、多くの場合、これらをＰＥＲＵＮ方法体系ほど有効に減少させることができない。理論によって限定されることなく、ＰＥＲＵＮ方法体系では、一部において、その一般に加法的なプロセスでは、他の正規化手法（例えば、ＧＣ−ＬＯＥＳＳ）において利用される一般に乗法的なプロセスほど広がりが大きくならないので、より有効に誤差が減少することが予想される。
追加的な正規化および統計学的技法をＰＥＲＵＮ方法体系と組み合わせて利用することができる。追加的なプロセスは、ＰＥＲＵＮ方法体系を用いる前、その後、またはその間に適用することができる。ＰＥＲＵＮ方法体系と組み合わせて使用することができるプロセスの非限定的な例は下に記載されている。
いくつかの実施形態では、ＧＣ含量についてのゲノミックセクションの高度の二次的な正規化または補正をＰＥＲＵＮ方法体系と併せて利用することができる。適切なＧＣ含量の補正または正規化の手順を利用することができる（例えば、ＧＣ−ＬＯＥＳＳ、ＧＣＲＭ）。ある特定の実施形態では、追加的なＧＣ正規化プロセスを適用するための特定の試料を同定することができる。例えば、ＰＥＲＵＮ方法体系を適用することにより、各試料についてＧＣの偏りを決定することができ、ＧＣの偏りがある特定の閾値を上回る試料を追加的なＧＣ正規化プロセスのために選択することができる。そのような実施形態では、所定の閾値の高度を使用して、そのような試料を追加的なＧＣ正規化のために選択することができる。
ある特定の実施形態では、ビンフィルタリングまたは重み付けプロセスをＰＥＲＵＮ方法体系と併せて利用することができる。適切なビンフィルタリングまたは重み付けプロセスを利用することができ、その非限定的な例は本明細書に記載されている。実施例４および実施例５には、ビンフィルタリングのための誤差のＲ因子（Ｒ ｆａｃｔｏｒ）尺度の利用について記載されている。
ＧＣの偏りモジュール
ＧＣの偏りの決定（例えば、参照ゲノムの部分（例えば、ゲノミックセクション）のそれぞれについてのＧＣの偏りの決定）は、ＧＣの偏りモジュールによって（例えば、ＧＣの偏りモジュールを含む装置によって）もたらされる。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りの決定をもたらすためにはＧＣの偏りモジュールが必要である。時には、ＧＣの偏りモジュールにより、参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと各部分のＧＣ含量との間のフィッティングした関係（例えば、フィッティングした線形関係）からＧＣの偏りの決定がもたらされる。ＧＣの偏りモジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りの決定（すなわち、ＧＣの偏りのデータ）は、ＧＣの偏りモジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りのデータは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りモジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りのデータは、以下の１つまたは複数を含む装置によってもたらされる：１つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。ＧＣの偏りモジュールにより、適切な装置またはモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。時には、ＧＣの偏りモジュールにより、配列決定モジュール、正規化モジュール、重み付けモジュール、マッピングモジュールまたはカウントモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。ＧＣの偏りモジュールは、時には、正規化モジュール（例えば、ＰＥＲＵＮ正規化モジュール）の一部である。いくつかの実施形態では、ＧＣの偏りモジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ／またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、ＧＣの偏りモジュールにより、装置または別のモジュール（例えば、カウントモジュール）からデータおよび／または情報が受け取られ、データおよび／または情報が変換され、ＧＣの偏りのデータおよび／または情報（例えば、ＧＣの偏りの決定、線形フィッティングした関係など）がもたらされる。ある特定の実施形態では、ＧＣの偏りのデータおよび／または情報を、ＧＣの偏りモジュールから、予測カウントモジュール、フィルタリングモジュール、比較モジュール、正規化モジュール、重み付けモジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および／またはアウトカムモジュールに移行することができる。
他のデータ処理
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、反復配列について補正することを含んでよい。本明細書に記載の通り、反復配列は、多くの場合、情報価値のないデータであり、かつ／またはノイズの多いデータに寄与する可能性があり、それにより、時には、もたらされるアウトカムの信頼度が低下する。本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の反復配列の影響を低下させるための任意の適切な方法（例えば、反復配列の除去）を使用することができる。反復配列を除去するために利用可能なリソースの非限定的な例は、以下の刊行物に見いだすことができる：ＵＲＬワールドワイドウェブｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／ｐａｐｅｒｓ．ｈｔｍｌおよびワールドワイドウェブｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７１−２１０５／１１／８０。ある特定の実施形態では、もたらされるアウトカムに対する反復配列の存在の影響を、ロバストな推定量を使用してデータセットの一部または全部を予測値に関して補正または正規化することにより、最小限にすることまたは排除することができる。いくつかの実施形態では、アベレージ、中央値、最頻値、中点、平均値、中央絶対偏差、（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、ブートストラップ推定値、標準偏差、ｚスコア、ロバストなｚスコア、ＡＮＯＶＡ、ＬＯＥＳＳ回帰分析（例えば、ＬＯＥＳＳ平滑化、ＬＯＷＥＳＳ平滑化）などから選択される１つまたは複数の推定量を使用して、染色体の部分、または全てについての予測値を算出する。データセットの一部または全部を補正して反復配列の影響を低下させるまたは排除することにより、アウトカムをもたらすことを容易にし、かつ／またはデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の補正／処理ステップは、指標配列を補正することを含んでよい。本明細書に記載の通り、本明細書に記載の複数の実施形態において利用されるアダプタープライマーは、しばしば指標配列を含む。全ての指標が実質的に同じ性能を有する場合、染色体表示、またはいくつかの他のゲノムに関連する同等の測定基準は、異なる指標によって標識された試料の実質的に全てにわたって同じように分布することになる。しかし実際には、いくつかの指標は、他のものよりも良好に働き、それにより今度は、アルゴリズムによっていくつかの断片が他の断片に対して優先的に分析される（例えば、高く重み付けされる）ということが引き起こされる。さらに、いくつかの指標によってもたらされる検出され、かつ／またはアラインメントされた読み取りの数はより少なく、それにより今度は、他の指標を用いてタグ付けされた試料と比較した場合、それらの指標配列を用いてタグ付けされた試料についての分解がもたらされる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の指標配列に関して、推定量を使用してデータセットの一部または全部を補正または正規化することができ、ある特定の実施形態では、推定量は、アベレージ、中央値、平均値、最頻値、中点、中央絶対偏差（ＭＡＤ）、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、ブートストラップ推定値、標準偏差、ｚスコア、ロバストなｚスコア、ＡＮＯＶＡ、ＬＯＥＳＳ回帰分析（例えば、ＬＯＥＳＳ平滑化、ＬＯＷＥＳＳ平滑化）などから選択される。データセットの一部または全部を補正して、１つまたは複数の指標配列に関して低下させることにより、アウトカムをもたらすことを容易にし、かつ／またはデータセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。
データセットの一部または全部を、下記の１つまたは複数の手順を使用してさらに処理することもできる。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の処理ステップは、１つまたは複数のフィルタリングステップを含んでよい。フィルタリングにより、一般に、ゲノミックセクションまたはビンが考察から除去される。これだけに限定されないが、冗長なデータ（例えば、冗長なまたはオーバーラップしている マッピングされた読み取り）、情報価値のないデータ（例えば、ゼロカウント中央値を有するビン）、過大表示または過小表示された配列を有するビン、ノイズの多いデータなど、または前述のものの組合せを含めた任意の適切な基準に基づいて、除去するためにビンを選択することができる。フィルタリングプロセスは、多くの場合、１つまたは複数のビンを考察から除去し、除去に選択された１つまたは複数のビンにおけるカウントを、考察されているビン、１つまたは複数の染色体、またはゲノムについてのカウントまたは合計されたカウントから引き算することを含む。いくつかの実施形態では、ビンを逐次的に（例えば、個々のビンそれぞれの除去の影響を評価することを可能にするために一度に１つ）除去することができ、ある特定の実施形態では、除去に選出された全てのビンを同時に除去することができる。いくつかの実施形態では、分散がある特定のレベルを上回るまたは下回ることを特徴とするゲノミックセクションを除去し、これは、時には、本明細書では、「ノイズの多い」ゲノミックセクションのフィルタリングと称される。ある特定の実施形態では、フィルタリングプロセスは、データセットから、ゲノミックセクション、染色体、または染色体の部分のプロファイルの高度の平均値から、プロファイルの分散の所定の倍数だけ逸脱するデータ点を得ることを含み、ある特定の実施形態では、フィルタリングプロセスは、データセットから、ゲノミックセクション、染色体または染色体の部分のプロファイルの高度の平均値から、プロファイルの分散の所定の倍数だけ逸脱しないデータ点を除去することを含む。いくつかの実施形態では、フィルタリングプロセスを利用して、遺伝的変異の有無について分析する候補ゲノミックセクションの数を減少させる。遺伝的変異（例えば、微小欠失、微小重複）の有無について分析される候補ゲノミックセクションの数を減少させることにより、多くの場合、データセットの複雑さおよび／または次元性が低下し、時には、遺伝的変異および／または遺伝子異常（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）を検索し、かつ／または同定するスピードが２桁以上増大する。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の処理ステップは、１つまたは複数の正規化ステップを含んでよい。正規化は、当技術分野で公知の適切な方法によって実施することができる。時には、正規化は、異なる尺度で測定された値を概念上共通の尺度に対して補正することを含む。時には、正規化は、補正された値の確率分布をアラインメントする複雑な数学的補正を含む。いくつかの場合には、正規化は、分布を正規分布に対してアラインメントすることを含む。時には、正規化は、異なるデータセットについての対応する正規化された値を、特定の全般的な影響（例えば、誤差および例外）の影響が排除されるように比較することを可能にする数学的補正を含む。時には、正規化は、尺度化を含む。正規化は、時には、１つまたは複数のデータセットを所定の変数または式によって分割することを含む。正規化方法の非限定的な例としては、ビン様式での正規化（ｂｉｎ ｗｉｓｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、ＧＣ含量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所重み付け散布プロット平滑化）、ＰＥＲＵＮ（以下を参照されたい）、反復マスキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化および反復マスキング（ＧＣＲＭ）、ｃＱｎおよび／またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無（例えば異数性）の決定に、正規化方法（例えば、ビン様式での正規化、ＧＣ含量による正規化、線形最小二乗回帰および非線形最小二乗回帰、ＬＯＥＳＳ、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＬＯＷＥＳＳ（局所重み付け散布プロット平滑化）、ＰＥＲＵＮ、反復マスキング（ＲＭ）、ＧＣ正規化および反復マスキング（ＧＣＲＭ）、ｃＱｎ、当技術分野で公知の正規化方法および／またはその組合せ）を利用する。
例えば、ＬＯＥＳＳは、ｋ近傍に基づくメタモデルにおいて多数の回帰モデルを組み合わせる当技術分野で公知の回帰モデリング方法である。ＬＯＥＳＳは、時には、局所重み付け多項式回帰と称される。いくつかの実施形態では、ＧＣ ＬＯＥＳＳでは、ゲノミックセクションについての断片カウント（例えば、配列読み取り、カウント）とＧＣ組成との間の関係にＬＯＥＳＳモデルを適用する。ＬＯＥＳＳを使用してデータ点のセットを通して滑らかな曲線をプロットすることは、時には、特に平滑化された値のそれぞれが、重み付けされた二次最小二乗回帰によってｙ軸の散布図基準変数の値の範囲にわたって得られる場合、ＬＯＥＳＳ曲線と称される。ＬＯＥＳＳ法では、データセット内の各点について、応答が推定される点の近くの説明的な変数値を用いて低次数の多項式をデータのサブセットにフィッティングする。重み付けされた最小二乗を使用して多項式をフィッティングし、応答が推定される点の近くの点を高く重み付けし、さらに離れた点を低く重み付けする。次いで、ある点についての回帰関数の値を、そのデータ点についての説明的変数値を使用して局所多項式を評価することによって得る。ＬＯＥＳＳフィッティングは、時には、データ点のそれぞれについて回帰関数値が計算された後に完了したとみなされる。多項式モデルの次数および重みなどのこの方法の詳細の多くは柔軟である。
ある特定の実施形態では、正規化とは、１つまたは複数のデータセットを所定の変数によって分割することを指す。任意の適切な数の正規化を使用することができる。いくつかの実施形態では、データセットを１回以上、５回以上、１０回以上、さらには２０回以上正規化することができる。データセットは、任意の適切な特徴または変数（例えば、試料データ、参照データ、またはその両方）を表す値（例えば、正規化値）に対して正規化することができる。使用することができるデータ正規化の種類の非限定的な例としては、１つまたは複数の選択された検査ゲノミックセクションまたは参照ゲノミックセクションについての生のカウントデータを、選択された１つまたは複数のゲノミックセクションがマッピングされる染色体またはゲノム全体にマッピングされたカウントの総数に対して正規化すること；１つまたは複数の選択されたゲノムのセグメントについての生のカウントデータを１つまたは複数の選択されたゲノムのセグメントがマッピングされる１つまたは複数のゲノミックセクションまたは染色体についての参照カウント中央値に対して正規化すること；生のカウントデータを予め正規化されたデータまたはその誘導値に対して正規化すること；および予め正規化されたデータを１つまたは複数の他の所定の正規化変数に対して正規化することが挙げられる。データセットを正規化することには、時には、所定の正規化変数として選択される特徴または性質に応じて統計学的誤差を分離する効果がある。データセットを正規化することにより、時には、データを共通の尺度（例えば、所定の正規化変数）に導くことによって異なる尺度を有するデータのデータ特性を比較することも可能になる。いくつかの実施形態では、統計学的に導かれた値に対する１つまたは複数の正規化を利用して、データの差異を最小限にし、特定範囲外のデータの重要性を減らすことができる。正規化値に関してゲノミックセクション、またはビンを正規化することは、時には、「ビン様式での正規化」と称される。
ある特定の実施形態では、正規化を含む処理ステップは、スタティックウィンドウに対して正規化することを含み、いくつかの実施形態では、正規化を含む処理ステップは、ムービングウィンドウまたはスライディングウィンドウに対して正規化することを含む。「ウィンドウ」は、多くの場合、分析のために選択された１つまたは複数のゲノミックセクションであり、時には、比較のための参照として使用される（例えば、正規化および／または他の数学的操作または統計学的操作のために使用される）。スタティックウィンドウに対して正規化することは、多くの場合、正規化プロセスにおいて試験被験体データセットと参照被験体データセットを比較するために選択された１つまたは複数のゲノミックセクションを使用することを伴う。いくつかの実施形態では、選択されたゲノミックセクションを利用してプロファイルを生成する。スタティックウィンドウは、一般に、操作および／または分析の間に変化しない所定のゲノミックセクションのセットを含む。ムービングウィンドウに対する正規化、またはスライディングウィンドウに対する正規化は、多くの場合、選択された検査ゲノミックセクションのゲノム領域に局在しているゲノミックセクション（例えば、遺伝学的にごく周囲の近接する１つまたは複数のゲノミックセクションなど）に対して実施される正規化であり、１つまたは複数の選択された検査ゲノミックセクションを、その選択された検査ゲノミックセクションのごく周囲のゲノミックセクションに対して正規化する。ある特定の実施形態では、選択されたゲノミックセクションを利用してプロファイルを生成する。スライディングウィンドウまたはムービングウィンドウ正規化は、多くの場合、近接する検査ゲノミックセクションに繰り返し移動またはスライドさせ、新しく選択された検査ゲノミックセクションを、新しく選択された検査ゲノミックセクションのごく周囲のまたはそれに近接するゲノミックセクションに対して正規化することを含み、近接するウィンドウは、共通の１つまたは複数のゲノミックセクションを有する。ある特定の実施形態では、複数の選択された検査ゲノミックセクションおよび／または染色体をスライディングウィンドウプロセスによって分析することができる。
いくつかの実施形態では、スライディングウィンドウまたはムービングウィンドウに対して正規化することにより１つまたは複数の値を生成することができ、各値は、ゲノム（例えば、染色体）の異なる領域から選択される参照ゲノミックセクションの異なるセットに対する正規化を表す。ある特定の実施形態では、生成される１つまたは複数の値は累積和（例えば、選択されたゲノミックセクション、ドメイン（例えば、染色体の部分）、または染色体にわたって正規化されたカウントプロファイルの積分の数値的な推定値）である。スライディングウィンドウプロセスまたはムービングウィンドウプロセスによって生成される値を使用して、プロファイルを生成し、アウトカムに達することを容易にすることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノミックセクションの累積和をゲノムの位置に応じて示すことができる。時には、ムービングウィンドウ分析またはスライディングウィンドウ分析を使用して、ゲノムを微小欠失および／または微小挿入の有無について分析する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のゲノミックセクションの累積和を示すことを使用して、遺伝的変異（例えば、微小欠失、微小重複）の領域の有無を同定する。いくつかの実施形態では、ムービングウィンドウ分析またはスライディングウィンドウ分析を使用して微小欠失を含有するゲノム領域を同定し、ある特定の実施形態では、ムービングウィンドウ分析またはスライディングウィンドウ分析を使用して、微小重複を含有するゲノム領域を同定する。
いくつかの実施形態では、処理ステップは、重み付けすることを含む。重み付け、または重み関数の実施とは、多くの場合、時には、ある特定のデータセットの特徴または変数の、他のデータセットの特徴または変数に対する影響を変更する（例えば、１つまたは複数のゲノミックセクションまたはビンに含有されるデータの有意性および／または寄与を、選択された１つまたは複数のビン内のデータの質または有用性に基づいて増加または減少させる）ために利用されるデータセットの一部または全部の数学的操作である。いくつかの実施形態では、重み関数を使用して、測定の分散が比較的小さいデータの影響を増加させ、かつ／または測定の分散が比較的大きいデータの影響を減少させることができる。例えば、過小表示されたまたは質が低い配列データを有するビンを「低く重み付け」して、データセットに対する影響を最小限にすることができ、一方で選択されたビンを「高く重み付け」して、データセットに対する影響を増加させることができる。重み関数の非限定的な例は、［１／（標準偏差）２］である。重み付けステップは、時には、正規化するステップと実質的に同様の様式で実施する。いくつかの実施形態では、データセットを所定の変数（例えば、重み付け変数）で割る。所定の変数（例えば、最小化した標的関数、ファイ）は、多くの場合、データセットの異なる一部が違うように重み付けされる（例えば、ある特定のデータ型の影響が増加し、他のデータ型の影響が減少する）ように選択される。
ある特定の実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の数学的操作および／または統計学的操作を含んでよい。任意の適切な数学的操作および／または統計学的操作を単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載のデータセットを分析し、かつ／または操作することができる。任意の適切な数の数学的かつ／または統計学的操作を使用することができる。いくつかの実施形態では、データセットを、１回以上、５回以上、１０回以上または２０回以上数学的かつ／または統計学的に操作することができる。使用することができる数学的かつ統計学的な操作の非限定的な例としては、足し算、引き算、掛け算、割り算、代数関数、最小二乗推定量、曲線フィッティング、微分方程式、有理多項式、二重多項式、直交多項式、ｚスコア、ｐ値、カイ値、ファイ値、ピークの高度の分析、ピーク端位置の決定、ピーク面積比の算出、染色体の高度の中央値の分析、平均絶対偏差の算出、残差平方和、平均値、標準偏差、標準誤差など、またはそれらの組合せが挙げられる。数学的操作および／または統計学的操作は、配列読み取りデータの全部または一部、またはその処理生成物に対して実施することができる。統計学的に操作することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例としては、生のカウント、フィルタリングされたカウント、正規化されたカウント、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク面積、ピーク端、側方許容差（ｌａｔｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、Ｐ値、中央値の高度、平均高度、ゲノム領域内のカウント分布、核酸種の相対的な表示など、またはそれらの組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態では、処理ステップは、１つまたは複数の統計アルゴリズムの使用を含んでよい。任意の適切な統計アルゴリズムを単独でまたは組み合わせて使用して、本明細書に記載のデータセットを分析し、かつ／または操作することができる。任意の適切な数の統計アルゴリズムを使用することができる。いくつかの実施形態では、１種以上、５種以上、１０種以上または２０種以上の統計アルゴリズムを使用してデータセットを分析することができる。本明細書に記載の方法と一緒に使用するために適した統計アルゴリズムの非限定的な例としては、決定木、カウンターヌル（ｃｏｕｎｔｅｒｎｕｌｌ）、多重比較、オムニバス検定、ベーレンス・フィッシャー問題、ブートストラッピング、独立した有意性の検定を組み合わせるためのフィッシャーの方法、帰無仮説、第１種の過誤、第２種の過誤、直接検定、１標本ｚ検定、２標本ｚ検定、１標本ｔ検定、対応のあるｔ検定、等分散を有する２標本のプールしたｔ検定、不等分散を有する２標本のプールしていないｔ検定、１比率ｚ検定（ｏｎｅ−ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｚ−ｔｅｓｔ）、プールした２比率ｚ検定（ｔｗｏ−ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｚ−ｔｅｓｔ）、プールしていない２比率ｚ検定、１標本カイ二乗検定、等分散性についての２標本Ｆ検定、信頼区間、信用区間、有意性、メタ分析、単純線形回帰、ロバスト線形回帰など、または前述のものの組合せが挙げられる。統計アルゴリズムを使用して分析することができるデータセットの変数または特徴の非限定的な例としては、生のカウント、フィルタリングされたカウント、正規化されたカウント、ピーク高さ、ピーク幅、ピーク端、側方許容差、Ｐ値、中央値の高度、平均高度、ゲノム領域内のカウント分布、核酸種の相対的な表示など、またはそれらの組合せが挙げられる。
ある特定の実施形態では、多数（例えば、２つ以上）の統計アルゴリズム（例えば、最小二乗回帰、主成分分析、線形判別分析、二次判別分析、バギング、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシンモデル、ランダムフォレスト、分類木モデル、Ｋ−最隣接点、ロジスティック回帰および／またはロススムージング（ｌｏｓｓ ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ））および／または数学的操作および／または統計学的操作（例えば、本明細書では操作と称される）を利用することによってデータセットを分析することができる。いくつかの実施形態では、多数の操作を使用することにより、アウトカムをもたらすために使用することができるＮ次元の空間を生成することができる。ある特定の実施形態では、多数の操作を利用することによってデータセットを分析することにより、データセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。例えば、参照データセットに対して多数の操作を使用することにより、参照試料の遺伝的状態（例えば、選択された遺伝的変異について陽性または陰性）に応じて遺伝的変異の有無を表すために使用することができるＮ次元の空間（例えば、確率プロット）を生成することができる。実質的に同様の操作のセットを使用した試験試料の分析を使用して、試験試料のそれぞれについてＮ次元の点を生成することができる。試験被験体データセットの複雑さおよび／または次元性を、時には、参照データから生成されたＮ次元の空間と容易に比較することができる単一の値またはＮ次元の点まで低下させる。参照被験体データが入るＮ次元の空間の範囲内に入る試験試料データは、遺伝的状態が参照被験体の遺伝的状態と実質的に同様であることを示す。参照被験体データが入るＮ次元の空間の範囲外の試験試料データは、遺伝的状態が参照被験体の遺伝的状態と実質的に同様でないことを示す。いくつかの実施形態では、参照は正倍数性であるか、そうでなければ遺伝的変異または医学的状態を有さない。
いくつかの実施形態では、補正／処理ステップは、任意選択で、データセットまたはその誘導物（例えば、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の１つまたは複数の数学的かつ／または統計学的なデータ処理ステップの生成物）の種々の態様から１つまたは複数のプロファイル（例えば、プロファイルプロット）を生成するステップを含む。プロファイルの生成は、多くの場合、大量のデータのパターンおよび／または相関の同定を容易にする、データの数学的操作および／または統計学的操作を用いることを伴う。プロファイルは、多くの場合、１つまたは複数の基準に基づく、データまたはデータセットの１つまたは複数の操作によって生じる値である。プロファイルは、多くの場合、多数のデータ点を含む。データセットの本質および／または複雑さに応じて、任意の適切な数のデータ点をプロファイルに含めることができる。ある特定の実施形態では、プロファイルは、２個以上のデータ点、３個以上のデータ点、５個以上のデータ点、１０個以上のデータ点、２４個以上のデータ点、２５個以上のデータ点、５０個以上のデータ点、１００個以上のデータ点、５００個以上のデータ点、１０００個以上のデータ点、５０００個以上のデータ点、１０，０００個以上のデータ点、または１００，０００個以上のデータ点を含んでよい。
いくつかの実施形態では、プロファイルはデータセットの全体を表し、ある特定の実施形態では、プロファイルはデータセットの一部またはサブセットを表す。プロファイルは、時には、フィルタリングされずにいかなるデータも除去されていないデータを表すデータ点を含む、またはそれから生成され、時には、プロファイルは、フィルタリングされて望ましくないデータが除去されたデータを表すデータ点を含む、またはそれから生成される。いくつかの実施形態では、プロファイルにおけるデータ点は、ゲノミックセクションについてのデータ操作の結果を表す。ある特定の実施形態では、プロファイルにおけるデータ点は、ゲノミックセクションの群についてのデータ操作の結果を表す。いくつかの実施形態では、ゲノミックセクションの群は互いに近接していてよく、ある特定の実施形態では、ゲノミックセクションの群は染色体またはゲノムの異なる一部由来であってよい。
データセットから得られるプロファイルにおけるデータ点は、任意の適切なデータのカテゴリー化を表し得る。データを群分けしてプロファイルデータ点を生成することができるカテゴリーの非限定的な例としては、サイズに基づくゲノミックセクション、配列の特徴（例えば、ＧＣ含量、ＡＴ含量、染色体上の位置（例えば、短腕、長腕、セントロメア、テロメア）など）に基づくゲノミックセクション、発現のレベル、染色体など、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロファイルを、別のプロファイル（例えば、再正規化されたデータプロファイルを生成するために異なる正規化値に対して再正規化（ｒｅｎｏｒｍａｌｉｚｅ）された正規化されたデータプロファイル）から得たデータ点から生成することができる。ある特定の実施形態では、別のプロファイルから得たデータ点から生成されたプロファイルにより、データ点の数および／またはデータセットの複雑さが低下する。データ点の数および／またはデータセットの複雑さが低下することにより、多くの場合、データの解釈が容易になり、かつ／またはアウトカムをもたらすことが容易になる。
プロファイルは、頻繁にプロットとして示され、生成することができるプロファイルプロットの非限定的な例としては、生のカウント（例えば、生のカウントプロファイルまたは生のプロファイル）、正規化されたカウント（例えば、正規化されたカウントプロファイルまたは正規化されたプロファイル）、重み付けされたビン、ｚスコア、ｐ値、フィッティングした倍数性に対する面積比、フィッティングされた胎児分率と測定された胎児分率との間の比に対する中央値の高度、主成分など、またはそれらの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロファイルプロットにより、操作されたデータを可視化することが可能になる。ある特定の実施形態では、プロファイルプロットを利用して、アウトカム（例えば、フィッティングした倍数性に対する面積比、フィッティングされた胎児分率と測定された胎児分率との間の比に対する中央値の高度、主成分）をもたらすことができる。生のカウントプロファイルプロット、または生のプロファイルプロットは、多くの場合、領域（例えば、ゲノム、染色体、染色体の部分）内の総カウントに対して正規化された、領域内の各ゲノミックセクションにおけるカウントのプロットである。いくつかの実施形態では、スタティックウィンドウプロセスを使用してプロファイルを生成することができ、ある特定の実施形態では、スライディングウィンドウプロセスを使用してプロファイルを生成することができる。
試験被験体について生成されたプロファイルを、時には、１つまたは複数の参照被験体について生成されたプロファイルと比較して、データセットの数学的操作および／または統計学的操作の解釈および／またはアウトカムをもたらすことを容易にする。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の出発仮定（例えば、核酸の母体寄与（例えば、母体分率）、核酸の胎児の寄与（例えば、胎児分率）、参照試料の倍数性など、またはそれらの組合せ）に基づいてプロファイルを生成する。ある特定の実施形態では、検査プロファイルは、多くの場合、遺伝的変異が存在しないことを表す所定の値に集中し、多くの場合、試験被験体が遺伝的変異を保有する場合には、試験被験体における遺伝的変異が位置する遺伝子位置に対応する領域内の所定の値から逸脱する。遺伝的変異に関連付けられる医学的状態のリスクがある、またはそれに罹患している試験被験体では、選択されたゲノミックセクションについての数値は、影響を受けていない遺伝子位置についての所定の値から有意に変動することが予想される。出発仮定（例えば、固定された倍数性もしくは最適化された倍数性、固定された胎児分率もしくは最適化された胎児分率またはそれらの組合せ）に応じて、遺伝的変異の有無を示す所定の閾値またはカットオフ値または値の範囲は変動し得るが、それでも、遺伝的変異の有無を決定するために有用なアウトカムがもたらされる。いくつかの実施形態では、プロファイルにより、表現型が示され、かつ／または表される。
非限定的な例として、生の配列読み取りデータから、（ａ）１つまたは複数のフローセルからの全ての試料、または１つまたは複数のプレートからの全ての試料について、全ての染色体、選択された染色体、ゲノミックセクションおよび／またはその一部についての総カウントを得るステップと、（ｂ）（ｉ）情報価値のないゲノミックセクションおよび／または反復性のゲノミックセクション（例えば、反復マスキング；実施例２に記載の）（ｉｉ）Ｇ／Ｃ含量の偏り（ｉｉｉ）過大表示または過小表示された配列、（ｉｖ）ノイズの多いデータの１つまたは複数を補正、フィルタリングおよび／または除去するステップと、（ｃ）（ｂ）で残ったデータの一部または全部を、選択された染色体または選択された遺伝子位置について、ロバストな推定量を使用して予測値に対して補正／正規化し、それにより、補正／正規化された値を生成するステップとによって、補正／正規化されたデータセットを生成することができる。ある特定の実施形態では、（ｃ）におけるデータを１つまたは複数の指標配列、１つまたは複数の追加的な推定量、１つまたは複数の追加的な処理ステップなど、またはそれらの組合せに対して任意選択で補正する。いくつかの実施形態では、ｉ）情報価値のないゲノミックセクションおよび／または反復性のゲノミックセクション（例えば、反復マスキング）（ｉｉ）Ｇ／Ｃ含量の偏り（ｉｉｉ）過大表示または過小表示された配列、（ｉｖ）ノイズの多いデータの１つまたは複数を補正、フィルタリングおよび／または除去するステップは、任意の順序で実施することができる（例えば，（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉｖ）；（ｉ）、（ｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉ）；（ｉｉｉ）、（ｉ）；（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）；（ｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉｉ）；（ｉｉ）、（ｉ）（ｉｉｉ）；（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）；（ｉｉ）、（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）；（ｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）など）。ある特定の実施形態では、残ったデータを本明細書に記載の１つまたは複数の実験条件に基づいて補正することができる。いくつかの実施形態では、１つの方法によって補正された配列は、異なる方法によって実質的に完全に補正された配列の一部に影響を及ぼし得る（例えば、Ｇ／Ｃ含量の偏りの補正により、時には、反復マスキングによって実質的に完全に除去された配列の最大５０％が除去される）。
カウントされた、マッピングされた配列読み取りデータの１つまたは複数の操作によって、補正／正規化されたデータセットを生成することができる。配列読み取りをマッピングし、各ゲノムのビンにマッピングされる配列タグの数を決定する（例えば、カウントする）。いくつかの実施形態では、マッピングする前に、データセットについて反復マスキング補正して情報価値のないゲノミックセクションおよび／または反復性のゲノミックセクションを除去し、ある特定の実施形態では、マッピングする前に参照ゲノムについて反復マスキング補正する。いずれのマスキング手順を実施することによっても実質的に同じ結果がもたらされる。ある特定の実施形態では、データセットを、染色体の部分または全てについて予測されたＧ／Ｃ配列表示のロバストな推定量に関してビンに関したＧ／Ｃ正規化することによって、Ｇ／Ｃ含量の偏りについて補正する。いくつかの実施形態では、データセットについて、反復マスキング補正した後にＧ／Ｃ含量補正し、ある特定の実施形態では、データセットについて、Ｇ／Ｃ含量補正した後に、反復マスキング補正する。補正後に、残ったカウントを、一般には、合計して、補正されたデータセットを生成する。ある特定の実施形態では、データセットを補正することにより、分類、および／またはアウトカムをもたらすことが容易になる。いくつかの実施形態では、補正されたデータセットから補正されたデータセットプロファイルを生成し、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にするために利用する。
いくつかの実施形態では、配列読み取りデータをカウントし、反復配列、Ｇ／Ｃ含量の偏り、または反復配列およびＧ／Ｃ含量の偏りについて補正した後、データセットを１つまたは複数の指標配列について補正することができる。多数の患者由来の試料を、異なる指標配列で標識し、フローセル上で混合することができる。いくつかの実施形態では、患者および指標の間の配列読み取りのマッピングは同形である（どちらの方向にも独特である）。配列決定測定が完了した後、種々の配列決定された断片を、それが由来する個々の患者に割り当てることができる。種々の配列断片間の分離は、多くの場合、断片配列の指標（バーコード）部分に基づいて実現される。同じ指標（バーコード）を担持する断片の実質的に全てが一緒に群分けされ、その指標に関連付けられる患者に帰する。ある特定の実施形態では、各患者試料について同じ手順を繰り返す。少数の断片は、指標を有さないまたは認識されない指標を有する可能性がある（実験的な誤差に起因して）。認識されない指標が予測された指標のうちの１つと同様だと思われる場合には、任意選択でそれらの断片を同様に許容することができ、それ以外には、指標を有さないまたは認識されない指標を有する断片は割り当てずに残す。所与の患者に割り当てられた断片のみを、参照ゲノムと対照してアラインメントし、その特定の患者の染色体表示にカウントする。補正後に、残ったカウントを、一般には、合計して、補正されたデータセットを生成する。ある特定の実施形態では、データセットを補正することにより、分類、および／またはアウトカムをもたらすことが容易になる。いくつかの実施形態では、補正されたデータセットから補正されたデータセットプロファイルを生成し、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にするために利用する。
配列読み取りデータをカウントし、反復配列、Ｇ／Ｃ含量の偏り、または反復配列およびＧ／Ｃ含量の偏り、ならびに／または指標配列について補正した後、データセットを補正して、フローセルに基づく実験条件および／またはプレートに基づく実験条件の偏りの影響を最小限にするまたは排除することができる。ある特定の実施形態では、データセットを補正することにより、分類、および／またはアウトカムをもたらすことが容易になる。いくつかの実施形態では、補正されたデータセットから補正されたデータセットプロファイルを生成し、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にするために利用する。
データセットを本明細書に記載の通り補正した後、データセットの一部または全部を、下記の１つまたは複数の手順を用いてさらに処理することもできる。いくつかの実施形態では、データセットの一部または全部の追加的な処理は、本明細書に記載の通り、または当技術分野で公知の通りＺスコアを生成することを含む。ある特定の実施形態では、Ｚスコアを、偽データまたは外れ値データの影響を最小限にするロバストなＺスコアとして生成する。
任意選択で、データセットを正規化して、正規化されたカウントプロファイルを生成することができる。１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションを適切な正規化参照値に対して正規化することによってデータセットを正規化することができる。いくつかの実施形態では、正規化参照値は、ゲノミックセクションが選択された１つまたは複数の染色体についての総カウントを表す。ある特定の実施形態では、正規化参照値は、遺伝的変異を保有しないことが分かっている参照被験体のセットから調製した参照データセットからの１つまたは複数の対応するゲノミックセクション、染色体の部分または染色体を表す。いくつかの実施形態では、正規化参照値は、遺伝的変異の有無について分析される試験被験体から調製した試験被験体データセットからの１つまたは複数の対応するゲノミックセクション、染色体の部分または染色体を表す。ある特定の実施形態では、スタティックウィンドウ手法を利用して正規化プロセスを実施し、いくつかの実施形態では、ムービングウィンドウ手法またはスライディングウィンドウ手法を利用して正規化プロセスを実施する。ある特定の実施形態では、正規化されたプロファイルプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にする。正規化されたプロファイルプロットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、データセットを任意選択でフィルタリングし、正規化することができ、処理されたデータセットを、１つまたは複数のフィルタリング手順および／または正規化手順によってさらに操作することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のフィルタリング手順および／または正規化手順によってさらに操作されたデータセットを使用して、プロファイルを生成することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のフィルタリング手順および／または正規化手順により、時には、データセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。複雑さおよび／または次元性が低下したデータセットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、データセットを、重み付けによってさらに操作することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のゲノミックセクションを重み付けのために選択して、選択されたゲノミックセクションに含有されるデータ（例えば、ノイズの多いデータ、情報価値のないデータ）の影響を低下させることができ、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノミックセクションを重み付けのために選択して、選択されたゲノムのセグメント内に含有されるデータ（例えば、測定された分散が小さいデータ）の影響を増強または増大させることができる。いくつかの実施形態では、分散が大きいデータの影響を減少させ、分散が小さいデータの影響を増加させる単一の重み関数を利用してデータセットを重み付けする。時には、重み関数を使用して、分散が大きいデータの影響を低下させ、分散が小さいデータの影響を増大させる（例えば、［１／（標準偏差）２］）。いくつかの実施形態では、重み付けによってさらに操作された、処理されたデータのプロファイルプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にする。重み付けされたデータのプロファイルプロットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、データセットを、１つまたは複数の数学的かつ／または統計学的な（例えば、統計関数または統計アルゴリズム）操作によってさらに操作することができる。ある特定の実施形態では、処理されたデータセットを、１つまたは複数の選択されたゲノミックセクション、染色体、または染色体の部分についてＺスコアを算出することによってさらに操作することができる。いくつかの実施形態では、処理されたデータセットを、Ｐ値を算出することによってさらに操作することができる。ＺスコアおよびＰ値を算出するための式は当技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、数学的操作および／または統計学的操作は、倍数性および／または胎児分率に関する１つまたは複数の仮定を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の統計学的操作および／または数学的操作によってさらに操作された、処理されたデータのプロファイルプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にする。統計学的かつ／または数学的に操作されたデータのプロファイルプロットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。統計学的かつ／または数学的に操作されたデータのプロファイルプロットに基づいてもたらされたアウトカムは、多くの場合、倍数性および／または胎児分率に関する１つまたは複数の仮定を含む。
ある特定の実施形態では、データセットをカウントし、任意選択でフィルタリングし、正規化した後に、処理されたデータセットに対して多数の操作を実施してＮ次元の空間および／またはＮ次元の点を生成する。Ｎ次元で分析されたデータセットのプロファイルプロットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。
データセットの処理および／または操作の一部として、またはその後に、ピーク高度分析、ピーク幅分析、ピーク端位置分析、ピーク側方許容差など、その派生物、または前述のものの組合せから選択される１つまたは複数のプロセスを利用することによって、データセットをさらに操作することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のピーク高度分析、ピーク幅分析、ピーク端位置分析、ピーク側方許容差など、その派生物、または前述のものの組合せを利用して処理されたデータのプロファイルプロットを生成して、分類、および／またはアウトカムをもたらすことを容易にする。１つまたは複数のピーク高度分析、ピーク幅分析、ピーク端位置分析、ピーク側方許容差など、その派生物、または前述のものの組合せを利用して処理されたデータのプロファイルプロットに基づいてアウトカムをもたらすことができる。
いくつかの実施形態では、問題の遺伝的変異がないことが分かっている１つまたは複数の参照試料を使用して、参照カウントプロファイル中央値を生成することができ、これにより、遺伝的変異が存在しないことを表す所定の値をもたらすことができ、また、これは多くの場合、試験被験体が遺伝的変異を保有する場合には、試験被験体における遺伝的変異が位置する遺伝子位置に対応する領域内の所定の値から逸脱する。遺伝的変異に関連付けられる医学的状態のリスクがある、またはそれに罹患している試験被験体では、選択された１つまたは複数のゲノミックセクションについての数値は、影響を受けない遺伝子位置についての所定の値から有意に変動することが予想される。ある特定の実施形態では、問題の遺伝的変異を保有することが分かっている１つまたは複数の参照試料を使用して、参照カウントプロファイル中央値を生成することができ、これにより、遺伝的変異が存在することを表す所定の値をもたらすことができ、また、これは多くの場合、遺伝的変異を保有しない試験被験体における遺伝子位置に対応する領域内の所定の値から逸脱する。遺伝的変異に関連付けられる医学的状態のリスクがない、またはそれに罹患していない試験被験体では、選択された１つまたは複数のゲノミックセクションについての数値は、影響を受けた遺伝子位置についての所定の値から有意に変動することが予想される。
いくつかの実施形態では、データの解析および処理は、１つまたは複数の仮定を使用することを含んでよい。任意の適切な数または種類の仮定を利用してデータセットを解析または処理することができる。データを処理および／または解析するために使用することができる仮定の非限定的な例としては、母体の倍数性、胎児の寄与、参照集団における特定の配列の分布率、民族的なバックグラウンド、選択された医学的状態の血縁の家族構成員における分布率、種々の患者からの生のカウントプロファイル間の相似および／またはＧＣ正規化および反復マスキング（例えば、ＧＣＲＭ）後の実行、ＰＣＲアーチファクトを表す同一のマッチ（例えば、同一の塩基位置）、胎児定量器アッセイ（ｆｅｔａｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ ａｓｓａｙ）（例えば、ＦＱＡ）に固有の仮定、双生児に関する仮定（例えば、双生児２体の１体のみが影響を受けた場合、有効な胎児分率は測定された胎児の総分率の５０％のみである（同様に三胎児、四胎児など））、ゲノム全体を均一に網羅する胎児の無細胞ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）など、およびそれらの組合せが挙げられる。
マッピングされた配列読み取りの質および／または深さにより、所望の信頼水準（例えば、９５％以上の信頼水準）で遺伝的変異の有無のアウトカム予測が可能にならない例では、正規化されたカウントプロファイルに基づいて、１つまたは複数の追加的な数学的操作アルゴリズムおよび／または統計学的予測アルゴリズムを利用して、データを解析し、かつ／またはアウトカムをもたらすために有用な追加的な数値を生成することができる。正規化されたカウントプロファイルは、多くの場合は、正規化されたカウントを使用して生成されたプロファイルである。正規化されたカウントおよび正規化されたカウントプロファイルを生成するために使用することができる方法の例は本明細書に記載されている。記載の通り、カウントされた、マッピングされた配列読み取りを試験試料カウントまたは参照試料カウントに関して正規化することができる。いくつかの実施形態では、正規化されたカウントプロファイルをプロットとして示すことができる。
上記の通り、時には、データをある形態から別の形態に変換する。変換されたデータ、または変換は、多くの場合、物理的な出発材料（例えば、試験被験体試料核酸および／または参照被験体試料核酸）からのデータを物理的な出発材料（例えば、配列読み取りデータ）のデジタル表示に変更することであり、いくつかの実施形態では、アウトカムをもたらすために利用することができる１つまたは複数のデジタル表示の数値またはグラフ表示にさらに変換することを含む。ある特定の実施形態では、デジタル表示されたデータの数値および／またはグラフ表示の１つまたは複数を利用して、試験被験体の物理的なゲノムの様相を表す（例えば、ゲノムの挿入またはゲノムの欠失の有無を仮想的に表すまたは視覚的に表す；医学的状態に関連付けられる配列の物理量の変動の有無を表す）ことができる。時には、仮想表示を出発材料のデジタル表示の１つまたは複数の数値またはグラフ表示にさらに変換する。これらの手順により、物理的な出発材料を数値もしくはグラフ表示、または試験被験体のゲノムの物理的様相の表示に変換することができる。
いくつかの実施形態では、データセットを変換することにより、データの複雑さおよび／またはデータの次元性が低下することによって、アウトカムをもたらすことが容易になる。時には、データセットの複雑さを、物理的な出発材料を出発材料の仮想表示（例えば、物理的な出発材料を表す配列読み取り）に変換するプロセスの間に低下させる。任意の適切な特徴または変数を利用して、データセットの複雑さおよび／または次元性を補正し、かつ／または低下させることができる。データを補正／処理するための標的特徴として使用するために選択することができる特徴の非限定的な例としては、フローセルに基づく実験条件および／またはプレートに基づく実験条件、ＧＣ含量、反復配列、指標配列、胎児の性別予測、染色体異数性の同定、特定の遺伝子またはタンパク質の同定、がんの同定、疾患、遺伝性の遺伝子／形質、染色体異常、生物学的カテゴリー、化学的カテゴリー、生化学的カテゴリー、遺伝子またはタンパク質のカテゴリー、遺伝子オントロジー、タンパク質オントロジー、同時調節される遺伝子、細胞シグナル伝達遺伝子、細胞周期遺伝子、前述の遺伝子に関するタンパク質、遺伝子変異体、タンパク質変異体、同時調節される遺伝子、同時調節されるタンパク質、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、タンパク質の構造データなど、および前述のものの組合せが挙げられる。データセットの複雑さおよび／または次元性の低下の非限定的な例としては、複数の配列読み取りをプロファイルプロットに低下させること、複数の配列読み取りを数値（例えば、正規化された値、Ｚスコア、ロバストなＺスコア、ｐ値、中央絶対偏差、または本明細書に記載のＭＡＤの代替値）に低下させること；多数の分析方法を確率プロットまたは単一の点に低下させること；誘導量の主成分分析など、またはそれらの組合せが挙げられる。
アウトカム
データの分析、補正および処理により、１つまたは複数のアウトカムをもたらすことができる。アウトカムは、多くの場合、被験体が遺伝的変異を有するリスクがあった、またはそのリスクがあるかどうかを決定することを容易にするデータの補正および処理の結果である。アウトカムは、多くの場合、１つまたは複数の確率または推定量の考察に関連して本明細書に記載の補正／処理方法を使用して生成した１つまたは複数の数値を含む。確率の考察としては、これだけに限定されないが、変動性の尺度、信頼水準、感度、特異度、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および／または信頼水準、Ｚスコア、ロバストなＺスコア、パーセント染色体表示、中央絶対偏差、または中央絶対偏差の代替値、カイ値、ファイ値、倍数性値、胎児分率、フィッティングした胎児分率、面積比、中央値の高度など、またはそれらの組合せが挙げられる。確率の考察により、被験体が遺伝的変異を有するリスクがある、または遺伝的変異を有するかどうかを決定することを容易にすることができ、遺伝的障害の有無を決定するアウトカムは、多くの場合そのような考察を含む。
いくつかの実施形態では、アウトカムは、試料核酸中の胎児核酸の分率をファクタリング（ｆａｃｔｏｒｉｎｇ）すること（例えば、カウントを補正すること、試料を除去することまたは呼び出しを行わないこと）を含む。胎児分率の決定は、時には、本明細書の実施例に記載されており、当技術分野で公知の胎児定量器アッセイ（ＦＱＡ）を使用して実施する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる「ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ−ＢＡＳＥＤ ＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴ ＯＦ ＦＥＴＡＬ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ」という表題の米国特許出願公開第２０１０−０１０５０４９Ａ１号）。
アウトカムは、多くの場合、関連する信頼度の水準を伴う表現型である（例えば、胎児は９９％の信頼水準で２１トリソミーについて陽性であり、試験被験体は９５％の信頼水準で遺伝的変異に関連付けられるがんについて陰性である）。アウトカムの値を生成する異なる方法により、時には、異なる種類の結果が生じ得る。一般に、本明細書に記載の方法を使用して生成したアウトカムの値に基づいて生じさせることができる、可能性のあるスコアまたは呼び出しは、真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性の４種類ある。スコアまたは呼び出しは、多くの場合、被験体／試料において特定の遺伝的変異が存在する確率または存在しない確率を算出することによって生成する。スコアの値を用いて、例えば、遺伝的変異に対応する可能性があるマッピングされた配列読み取りの変動、差異、または比率を決定することができる。例えば、参照ゲノムに対して、データセットから選択された遺伝的変異またはゲノミックセクションについて陽性のスコアを算出することにより、遺伝的変異の有無の同定を導くことができ、遺伝的変異は、時には、医学的状態（例えば、がん、子癇前症、トリソミー、モノソミーなど）に関連付けられる。ある特定の実施形態では、補正されたデータセットからアウトカムを生成する。いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無および／または胎児の異数性を決定する、もたらされるアウトカムは、正規化された試料カウントに基づく。いくつかの実施形態では、アウトカムはプロファイルを含む。アウトカムがプロファイルを含む実施形態では、任意の適切なプロファイルまたはプロファイルの組合せをアウトカムのために使用することができる。アウトカムのために使用することができるプロファイルの非限定的な例としては、ｚスコアプロファイル、ロバストなＺスコアプロファイル、ｐ値プロファイル、カイ値プロファイル、ファイ値プロファイルなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
遺伝的変異の有無を決定するために生成されたアウトカムは、時にはヌル結果（例えば、２つのクラスター間のデータ点、遺伝的変異の有無のどちらの値も包含する標準偏差を伴う数値、調査されている遺伝的変異を有する被験体または有さない被験体のプロファイルプロットと同様ではないプロファイルプロットを伴うデータセット）を含む。いくつかの実施形態では、ヌル結果を示すアウトカムは、それでも、決定力のある結果であり、決定は、遺伝的変異の有無を決定するための追加的な情報ならびに／またはデータの生成および／もしくは解析を繰り返す必要性を含む可能性がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数の処理ステップを実施した後に、アウトカムを生成することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の処理ステップのうちの１つの結果としてアウトカムを生成し、いくつかの実施形態では、データセットの統計学的操作および／または数学的操作のそれぞれを実施した後に、アウトカムを生成する。遺伝的変異の有無の決定に関わるアウトカムは、任意の適切な形態で表すことができ、その形態は、これだけに限定することなく、被験体または試料について、遺伝的変異の有無に関連付けられる確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度、クラスターの範囲内または範囲外の値、閾値を超えるまたは下回る値、分散または信頼度の尺度を伴う値、または危険因子を含む。ある特定の実施形態では、試料間の比較により、試料の同一性を確認することが可能になる（例えば、反復試料および／または混同された（例えば、誤って標識付けられた、混合されたなど）試料を同定することが可能になる）。
いくつかの実施形態では、アウトカムは、所定の閾値またはカットオフ値を上回るまたは下回る値（例えば、１超、１未満）、およびその値に関連付けられる不確実性または信頼水準を含む。アウトカムにより、データ処理において使用される任意の仮定を説明することもできる。ある特定の実施形態では、アウトカムは、所定の値の範囲内に入るまたはその範囲外の値、および範囲内または範囲外にあるその値に関連する不確実性または信頼水準を含む。いくつかの実施形態では、アウトカムは、所定の値と等しい（例えば、１と等しい、ゼロと等しい）、または所定の値の範囲内の値と等しい値、および範囲と等しいまたは範囲内にあるまたは範囲外にあるその値の関連する不確実性または信頼水準を含む。アウトカムは、時には、プロット（例えば、プロファイルプロット）としてグラフ表示される。
上記の通り、アウトカムを、真陽性、真陰性、偽陽性または偽陰性と特徴付けることができる。真陽性とは、遺伝的変異を有すると正確に診断された被験体を指す。偽陽性とは、遺伝的変異を有すると間違って同定された被験体を指す。真陰性とは、遺伝的変異を有さないと正確に同定された被験体を指す。偽陰性とは、遺伝的変異を有さないと間違って同定された被験体を指す。任意の所与の方法の性能の２つの尺度を、これらが出現する比率に基づいて算出することができる：（ｉ）一般に、陽性であると正確に同定される予測陽性の分率である感度値；および（ｉｉ）一般に、陰性であると正確に同定される予測陰性の分率である特異度値。感度とは、一般に、真陽性の数を、真陽性の数と偽陰性の数を足した数で割った数であり、感度（ｓｅｎｓ）は０≦ｓｅｎｓ≦１の範囲内であり得る。理想的には、偽陰性の数はゼロと等しいまたはほぼゼロであり、したがって、被験体が実際に少なくとも１つの遺伝的変異を有する場合に、少なくとも１つの遺伝的変異を有さないと間違って同定される被験体はいない。逆に、多くの場合、予測アルゴリズムの、陰性を正確に分類する能力に関して評価を行い、これは感度に対する補完的な測定である。特異度とは、一般に、真陰性の数を、真陰性の数と偽陽性の数を足した数で割った数であり、感度（ｓｐｅｃ）は０≦ｓｐｅｃ≦１の範囲内であり得る。理想的には、偽陽性の数はゼロと等しいまたはほぼゼロであり、したがって、被験体が評価されている遺伝的変異を有さない場合に、少なくとも１つの遺伝的変異を有すると間違って同定される被験体はいない。
ある特定の実施形態では、感度、特異度および／または信頼水準の１つまたは複数は百分率として表される。いくつかの実施形態では、百分率は、各変数について、それぞれ独立に、約９０％超（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、または９９％超（例えば、約９９．５％以上、約９９．９％以上、約９９．９５％以上、約９９．９９％以上））である。いくつかの実施形態では、変動係数（ＣＶ）は百分率として表され、時には、百分率は約１０％以下（例えば、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％、または１％未満（例えば、約０．５％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０１％以下））である。ある特定の実施形態では、確率（例えば、特定のアウトカムが偶然によらない確率）は、Ｚスコア、ｐ値、またはｔ検定の結果で表される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のデータ処理操作を用いて、アウトカムについての測定された分散、信頼区間、感度、特異度など（例えば、集合的に信頼度パラメータと称される）を生成することができる。
時には、感度および特異度が１と等しい、または１００％、またはほぼ１である（例えば、約９０％から約９９％の間）方法を選択する。いくつかの実施形態では、感度が１と等しい、または１００％である方法を選択し、ある特定の実施形態では、感度がほぼ１である方法を選択する（例えば、約９０％の感度、約９１％の感度、約９２％の感度、約９３％の感度、約９４％の感度、約９５％の感度、約９６％の感度、約９７％の感度、約９８％の感度、または約９９％の感度）。いくつかの実施形態では、特異度が１と等しい、または１００％である方法を選択し、ある特定の実施形態では、特異度がほぼ１である方法を選択する（例えば、約９０％の特異度、約９１％の特異度、約９２％の特異度、約９３％の特異度、約９４％の特異度、約９５％の特異度、約９６％の特異度、約９７％の特異度、約９８％の特異度、または約９９％の特異度）。
いくつかの実施形態では、カウントされた、マッピングされた配列読み取りまたはその誘導物に基づくアウトカムにより、表１Ａおよび１Ｂに列挙されている１つまたは複数の状態、症候群または異常の有無が決定される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のデータ処理方法を利用して生成したアウトカムにより、表１Ａおよび１Ｂに列挙されている１つまたは複数の状態、症候群または異常の有無が決定される。いくつかの実施形態では、状態、症候群または異常の有無を決定するアウトカムは、表１Ａおよび１Ｂに列挙されている状態、症候群または異常の検出である、またはそれを含む。
ある特定の実施形態では、アウトカムは、試験試料と参照試料、試験試料と他の試料、２つ以上の試験試料など、およびそれらの組合せの比較に基づく。いくつかの実施形態では、試料間を比較することにより、アウトカムをもたらすことが容易になる。ある特定の実施形態では、アウトカムは、本明細書に記載の通りまたは当技術分野で公知の通り生成されたＺスコアに基づく。いくつかの実施形態では、Ｚスコアは、正規化された試料カウントを使用して生成する。いくつかの実施形態では、アウトカムをもたらすことを容易にするために生成されたＺスコアは、ロバストな推定量を使用して生成したロバストなＺスコアである。ある特定の実施形態では、アウトカムは、正規化された試料カウントに基づく。
１つまたは複数のアウトカムを生成した後、多くの場合、アウトカムを用いて、遺伝的変異の有無および／または関連する医学的状態の決定をもたらす。アウトカムは、一般には、医療専門家（例えば、検査技師または管理者；医師または補助者）に提供される。いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無を決定するアウトカムは、報告書の形態で医療専門家に提供され、ある特定の実施形態では、報告書は、アウトカムの値および関連する信頼度パラメータの提示を含む。一般に、アウトカムは、遺伝的変異の有無および／または医学的状態の決定を容易にする任意の適切な形態で提示することができる。データセットを報告および／もしくは提示する、またはアウトカムを報告するために使用するために適した形式の非限定的な例としては、デジタルデータ、グラフ、２Ｄグラフ、３Ｄグラフ、および４Ｄグラフ、写真、ピクトグラフ、チャート、棒グラフ、円グラフ、図、フローチャート、散布プロット、マップ、ヒストグラム、密度チャート、関数グラフ、回路図、ブロック図、バブルマップ、信号空間ダイヤグラム、コンターダイヤグラム、統計地図、スパイダーチャート、ベン図、計算図表など、および前述のものの組合せが挙げられる。アウトカム表示の種々の例が図に示されており、実施例に記載されている。
アウトカムの使用
遺伝的変異の有無を決定する１つまたは複数のアウトカムを含む報告を受け取る医療専門家、または他の資格のある個体は、報告書において表示されたデータを使用して、試験被験体または患者の状態に関する呼び出しを作成することができる。いくつかの実施形態では、医療専門家は、もたらされたアウトカムに基づいて推奨を行うことができる。いくつかの実施形態では、医療専門家または資格のある個体は、報告書において提供される１つまたは複数のアウトカムの値および関連する信頼度パラメータに基づいて、試験被験体または患者に遺伝的変異の有無に関する呼び出しまたはスコアを提供することができる。ある特定の実施形態では、スコアまたは呼び出しは、医療専門家または資格のある個体によって、提供された報告書を目で観察することを用いて手動で作成される。ある特定の実施形態では、スコアまたは呼び出しは、時にはソフトウェアに埋め込まれた自動化されたルーチンによって作成され、情報を試験被験体または患者に提供する前に、正確を期するために医療専門家または資格のある個体によって精査される。
報告書を受け取ることは、多くの場合、通信手段によって、アウトカムを含むテキスト表示および／またはグラフ表示を入手することを伴い、これにより、医療専門家または他の資格のある個体が試験被験体または患者における遺伝的変異の有無に関する決定を行うことが可能になる。報告書は、コンピュータによってまたは人によるデータ入力によって生成することができ、電子的手段を使用して（例えば、インターネット上で、コンピュータを介して、ファックスを介して、あるネットワークの場所から同じまたは異なる物理的な場所にある別の場所へ）、またはデータを送受信する任意の他の方法によって（例えば、メールサービス、クーリエサービスなど）通信することができる。いくつかの実施形態では、アウトカムを、これだけに限定することなく、口頭、文書、またはファイル形態を含めた適切な媒体で医療専門家に伝達する。ファイルは、例えば、これだけに限定されないが、聴覚的ファイル、コンピュータ可読ファイル、紙ファイル、検査ファイルまたは医療記録ファイルであってよい。アウトカム情報は、検査ファイルから入手することもできる。検査ファイルは、医学的状態の有無を決定するために１つまたは複数のアッセイまたは１つまたは複数のデータ処理ステップを行う研究所で生成することができる。研究所は、検査ファイルから医学的状態の有無を同定する人員と同じ場所にあっても異なる場所（例えば、別の国）にあってもよい。例えば、検査ファイルをある場所で生成し、別の場所に伝達し、そこでそのファイル内の情報を妊婦被験体に伝達することができる。ある特定の実施形態では、検査ファイルは、有形であっても電子形態（例えば、コンピュータ可読の形態）であってもよい。
医療専門家または資格のある個体は、報告書において提供される１つまたは複数のアウトカムに基づいて、任意の適切な推奨を提供することができる。提供されたアウトカム報告書に基づいて提供することができる推奨の非限定的な例としては、外科手術、放射線療法、化学療法、遺伝相談、出生後治療解決（例えば、生活設計、長期補助介護、医薬品、対症療法）、妊娠中絶、臓器移植、輸血など、または前述のものの組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、推奨は、提供されるアウトカムに基づく分類に左右される（例えば、ダウン症候群、ターナー症候群、Ｔ１３遺伝的変異に関連付けられる医学的状態、Ｔ１８遺伝的変異に関連付けられる医学的状態）。
これだけに限定されないが、カウントするステップと、データ処理ステップと、アウトカムを生成するステップと、および／または生成されたアウトカムに基づいて１つまたは複数の推奨を提供するステップを含めた本明細書に記載のプロセスの１つまたは複数のステップは、ソフトウェアを使用して実施することができる。
機械、ソフトウェアおよびインターフェース
本明細書に記載の方法を行うために、装置、ソフトウェアおよびインターフェースを使用することができる。装置、ソフトウェアおよびインターフェースを使用して、ユーザーは、例えば、統計解析アルゴリズム、統計有意性アルゴリズム、統計アルゴリズム、反復ステップと、検証アルゴリズム、およびグラフ表示を実行することを伴ってよい特定の情報、プログラムまたはプロセス（例えば、配列読み取りをマッピングすること、マッピングされたデータを処理すること、および／またはアウトカムをもたらすこと）を使用するためのオプションを入力、要求、問い合わせまたは決定することができる。いくつかの実施形態では、データセットをユーザーがインプット情報として入力することができ、ユーザーは１つまたは複数のデータセットを任意の適切なハードウェア媒体（例えば、フラッシュドライブ）によってダウンロードすることができ、かつ／またはユーザーは、データセットを、その後に処理し、かつ／またはアウトカムをもたらすために、あるシステムから別のシステムに送信する（例えば、配列読み取りをマッピングするために、シークエンサーからの配列読み取りデータをコンピュータシステムに送信する；処理し、アウトカムをもたらし、かつ／または報告するために、マッピングされた配列データをコンピュータシステムに送信する）ことができる。
ユーザーは、例えば、ソフトウェアに問い合わせし、次いでそれによりインターネットアクセスを介してデータセットを取得することができ、ある特定の実施形態では、プログラム可能なプロセッサにより促して、与えられたパラメータに基づいて適切なデータセットを取得することができる。同様に、プログラム可能なプロセッサにより、与えられたパラメータに基づいてプロセッサによって選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーを促すことができる。プログラム可能なプロセッサにより、インターネット、他の内部または外部の情報などを介して見いだされた情報に基づいてプロセッサによって選択された１つまたは複数のデータセットオプションを選択するようにユーザーを促すことができる。オプションは、１つまたは複数のデータの特徴の選択、１つまたは複数の統計アルゴリズム、１つまたは複数の統計解析アルゴリズム、１つまたは複数の統計有意性アルゴリズム、１つまたは複数のロバストな推定量アルゴリズム、反復ステップと、１つまたは複数の検証アルゴリズム、および方法、装置、またはコンピュータプログラムの１つまたは複数のグラフ表示を選択するように選択することができる。
本発明で扱われるシステムは、コンピュータシステムの一般的な構成部分、例えば、ネットワークサーバー、ラップトップシステム、デスクトップシステム、手持ち型システム、携帯情報端末、コンピュータキオスクなどを含んでよい。コンピュータシステムは、キーボード、タッチスクリーン、マウス、音声認識またはユーザーがシステムにデータを入力することを可能にする他の手段などの１つまたは複数のインプット手段を含んでよい。システムは、これだけに限定されないが、表示画面（例えば、ＣＲＴまたはＬＣＤ）、スピーカー、ＦＡＸ装置、プリンター（例えば、レーザー、インクジェット、インパクト、白黒またはカラープリンター）、または情報（例えば、アウトカムおよび／または報告）の視覚的アウトプット、聴覚的アウトプットおよび／またはハードコピーアウトプットをもたらすために有用な他のアウトプットを含めた、１つまたは複数のアウトプットをさらに含んでよい。
システムにおいて、インプット手段およびアウトプット手段は、他の構成部分の中でも、プログラムの命令を実行するためのマイクロプロセッサおよびプログラムコードおよびデータを記憶するためのメモリを含んでよい中央処理装置に接続されていてよい。いくつかの実施形態では、プロセスは、単一の地理的な場所に位置するシングルユーザーシステムとして実行することができる。ある特定の実施形態では、プロセスは、マルチユーザーシステムとして実行することができる。マルチユーザー実行の場合では、多数の中央処理装置をネットワークによって接続することができる。ネットワークは、建物の部分の単一の部門、建物全体を包含するローカルのもの、多数の建物にわたるもの、地域にわたるもの、国全体にわたるもの、または世界的なものであってよい。ネットワークは、プライベートであっても、プロバイダーによって所有および制御されていても、ユーザーがウェブページにアクセスして情報を入力し、検索するインターネットに基づくサービスとして実行されてもよい。したがって、ある特定の実施形態では、システムは、ユーザーに対してローカルであってもリモートであってもよい１つまたは複数の機械を含む。１つの場所または多数の場所にある２つ以上の機械にユーザーがアクセスすることができ、データを順番に、かつ／または並行してマッピングし、かつ／または処理することができる。したがって、ローカルネットワーク、リモートネットワークおよび／または「クラウド」計算プラットフォームなどの多数の機械を使用してデータをマッピングし、かつ／または処理するために、任意の適切な設定および制御を利用することができる。
いくつかの実施形態では、装置は、本明細書に記載されているコンピュータプログラム製品が実行される、ウェブに基づくシステムを含んでよい。ウェブに基づくシステムは、時には、ウェブに基づく機能性のために十分なコンピュータ、通信機器（例えば、通信インターフェース、ルーター、ネットワークスイッチ）などを含む。ある特定の実施形態では、ウェブに基づくシステムは、ネットワーククラウドコンピューティング、ネットワーククラウドストレージまたはネットワーククラウドコンピューティングおよびネットワーククラウドストレージを含む。ネットワーククラウドストレージは、一般に、インターネット上に位置する仮想サーバー上の、ウェブに基づくデータストレージである。ネットワーククラウドコンピューティングは、一般に、リモートネットワーク環境で起こるネットワークに基づくソフトウェアおよび／またはハードウェアの使用である（例えば、リモートサーバー上に位置する少数のために使用するために利用可能なソフトウェア）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているコンピュータプログラム製品の１つまたは複数の機能は、ウェブに基づく環境で実行される。
いくつかの実施形態では、システムは、通信インターフェースを含んでよい。通信インターフェースにより、ソフトウェアおよびデータをコンピュータシステムと１つまたは複数の外部のデバイスの間で移行することが可能になる。通信インターフェースの非限定的な例としては、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、イーサネット（登録商標）カードなど）、通信ポート、ＰＣＭＣＩＡスロットおよびカードなどが挙げられる。通信インターフェースを介して移行されたソフトウェアおよびデータは、一般に、シグナルの形態であり、電子シグナル、電磁気シグナル、光学シグナルおよび／または通信インターフェースが受け取ることができる他のシグナルであってよい。シグナルは、多くの場合、チャネルを介して通信インターフェースに提供される。チャネルは、多くの場合、シグナルを保持し、伝線またはケーブル、光ファイバー、電話線、携帯電話リンク、ＲＦリンクおよび／または他の通信チャネルによって実行することができる。したがって、ある例では、通信インターフェースを用いて、シグナル検出モジュールによって検出することができるシグナル情報を受け取ることができる。
データは、これだけに限定されないが、手動インプットデバイスまたは直接データ入力デバイス（ＤＤＥ）を含めた任意の適切なデバイスおよび／または方法によってインプットすることができる。手動デバイスの非限定的な例としては、キーボード、コンセプトキーボード、タッチセンシティブスクリーン、ライトペン、マウス、トラックボール、ジョイスティック、グラフィックタブレット、スキャナ、デジタルカメラ、ビデオデジタイザおよび音声認識デバイスが挙げられる。ＤＤＥの非限定的な例としては、バーコードリーダー、磁気ストリップコード、スマートカード、磁気インク文字認識、光学式文字認識、光学式マーク認識、およびターンアラウンドドキュメントが挙げられる。
いくつかの実施形態では、配列決定装置からのアウトプットが、インプットデバイスによってインプットすることができるデータとしての機能を果たし得る。ある特定の実施形態では、マッピングされた配列読み取りが、インプットデバイスによってインプットすることができるデータとしての機能を果たし得る。ある特定の実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスによってシミュレートされたデータを生成し、シミュレートされたデータが、インプットデバイスによってインプットすることができるデータとしての機能を果たす。本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」とは、コンピュータを使用して実施される試験および実験を指す。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスは、これだけに限定されないが、本明細書に記載のプロセスに応じて配列読み取りをマッピングすることおよびマッピングされた配列読み取りを処理することを含む。
システムは、本明細書に記載のプロセスを実施するために有用なソフトウェアを含んでよく、ソフトウェアは、そのようなプロセスを実施するための１つまたは複数のモジュール（例えば、データ取得モジュール、データ処理モジュール、データディスプレイモジュール）を含んでよい。ソフトウェアは、多くの場合、コンピュータによって遂行される場合、コンピュータ操作を実施するコンピュータ可読プログラム命令である。モジュールは、多くの場合、より大きなソフトウェアシステムにおいて使用することができる自蔵式機能単位である。例えば、ソフトウェアモジュールは、特定のプロセスまたはタスクを実施するプログラムの一部である。
ソフトウェアは、多くの場合、これだけに限定されないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、および磁気テープを含めた磁気媒体；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、光磁気ディスク、フラッシュドライブ、ＲＡＭ、フロッピー（登録商標）ディスクを含めた光学媒体など、ならびにプログラムの命令を記録することができる他のそのような媒体を含めたコンピュータ可読の媒体上に記録されたプログラムの命令を含有するプログラム製品で提供される。オンライン実行では、組織によって維持されているサーバーおよびウェブサイトを、ソフトウェアダウンロードがリモートユーザーに提供されるように構成することもでき、リモートユーザーが、組織によって維持されているリモートシステムにアクセスして、ソフトウェアにリモートアクセスすることもできる。ソフトウェアは、インプット情報を入手または受け取ることができる。ソフトウェアは、データを特異的に入手または受け取るモジュール（例えば、配列読み取りデータおよび／またはマッピングされた読み取りデータを受け取るデータ受信モジュール）を含んでよく、データを特異的に補正および／または処理するモジュール（例えば、受け取ったデータを補正および／または処理する（例えば、フィルタリングする、正規化する、アウトカムをもたらす、および／または報告する）処理モジュール）を含んでよい。インプット情報を入手および／または受け取ることは、多くの場合、コンピュータ通信手段によってロカールサイトまたはリモートサイトから、人によるデータ入力によって、またはデータを受け取る任意の他の方法によってデータ（例えば、配列読み取り、マッピングされた読み取り）を受け取ることを伴う。インプット情報は、それを受け取る場所と同じ場所で生成することもでき、異なる場所で生成し、受信場所に伝達することもできる。いくつかの実施形態では、インプット情報を処理する前に、それを改変する（例えば、処理に適した形式にする（例えば、表にする））。
いくつかの実施形態では、例えば、コンピュータ可読プログラムコードが組み込まれたコンピュータで使用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、コンピュータ可読プログラムコードが、（ａ）試験被験体由来の試料核酸の配列読み取りを得るステップと、（ｂ）（ａ）で得られた配列読み取りを、ゲノミックセクションに分けられた既知のゲノムにマッピングするステップと、（ｃ）ゲノミックセクション内にマッピングされた配列読み取りをカウントするステップと、（ｄ）（ｃ）で得られたゲノミックセクションについてのカウントまたはカウントの誘導値を補正することにより、補正されたデータセットを生成するステップと、（ｅ）（ｄ）の補正されたカウントプロファイルから遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップとを含む方法の実行が遂行されるように適合されているコンピュータプログラム製品などのコンピュータプログラム製品が提供される。
ある特定の実施形態では、ソフトウェアは１つまたは複数のアルゴリズムを含んでよい。アルゴリズムは、命令の有限列に応じてデータを処理し、かつ／またはアウトカムもしくは報告をもたらすために使用することができる。アルゴリズムは、多くの場合、タスクを完了するための定義済みの命令の一覧である。最初の状態から開始して、命令により、定義済みの一連の連続的な状態を通して進行し、最終的に、最終的な終わりの状態で終結する計算を記述することができる。ある状態から次の状態への移行は、必ずしも確定的ではない（例えば、いくつかのアルゴリズムにはランダム性が組み込まれている）。例として、これだけに限定することなく、アルゴリズムは、探索アルゴリズム、分類アルゴリズム、マージアルゴリズム、数値アルゴリズム、グラフアルゴリズム、ストリングアルゴリズム、モデリングアルゴリズム、計算幾何学アルゴリズム（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、コンビナトリアルアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、暗号化アルゴリズム、データ圧縮アルゴリズム、構文解析アルゴリズムなどであってよい。アルゴリズムは、１つのアルゴリズムまたは組み合わさって動作する２つ以上のアルゴリズムを含んでよい。アルゴリズムは、任意の適切な複雑さのクラスおよび／またはパラメータ化された複雑さのものであってよい。アルゴリズムは、算出および／またはデータ処理のために使用することができ、いくつかの実施形態では、確定的手法または確率的／予測的手法において使用することができる。アルゴリズムは、適切なプログラミング言語を使用することによって計算環境において実行することができ、適切なプログラミング言語の非限定的な例は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｆｏｒｔｒａｎなどである。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、誤差限界、統計解析、統計的有意性、および／または他の情報またはデータセットに対する比較（例えば、ニューラルネットまたはクラスタリングアルゴリズムを使用する場合に適用可能）を含むように構成または改変することができる。
ある特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムは、使用するためにソフトウェアに実装することができる。いくつかの実施形態では、これらのアルゴリズムは、生のデータを用いて訓練することができる。新しい生データ試料のそれぞれについて、訓練されたアルゴリズムにより、代表的な補正および／または処理されたデータセットまたはアウトカムを生じさせることができる。補正または処理されたデータセットは、時には、処理された親データセットと比較して複雑さが低下したものである。いくつかの実施形態では、補正および／または処理されたセットに基づいて、訓練されたアルゴリズムの性能を感度および特異度に基づいて評価することができる。ある特定の実施形態では、感度および／または特異度が最も高いアルゴリズムを同定し、利用することができる。
ある特定の実施形態では、シミュレートされた（またはシミュレーション）データが、例えば、アルゴリズムを訓練することまたはアルゴリズムを検定することにより、データの補正および／または処理の助けになり得る。いくつかの実施形態では、シミュレートされたデータは、配列読み取りの異なる群分けの仮定上の種々の標本抽出を含む。シミュレートされたデータは、実際の母集団から予測することができるものに基づいてもよく、アルゴリズムを検定し、かつ／または正しい分類を割り当てることに偏っていてもよい。シミュレートされたデータは、本明細書では、「仮想」データとも称される。ある特定の実施形態では、シミュレーションをコンピュータプログラムによって実施することができる。シミュレートされたデータセットの使用における１つの可能性のあるステップは、同定された結果の信頼度、例えば、無作為抽出がどのくらいよく元のデータとマッチするまたはそれを最もよく表すかを評価することである。１つの手法は、選択された標本よりもよいスコアを有する無作為標本の確率を推定する確率の値（Ｐ値）を算出することである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標本が参照標本とマッチする（分解された変動を伴う、または伴わない）ことが想定される経験的なモデルを評価することができる。いくつかの実施形態では、例えばポアソン分布などの別の分布を使用して、確率分布を定義することができる。
ある特定の実施形態では、システムは１つまたは複数のプロセッサを含んでよい。プロセッサは通信バスに接続されていてよい。コンピュータシステムは、メインメモリ、多くの場合、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含んでよく、補助メモリも含んでよい。補助メモリは、例えば、ハードディスクドライブおよび／または、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、メモリカードなどを表す取り外し可能なストレージドライブを含んでよい。取り外し可能なストレージドライブは、多くの場合、取り外し可能な記憶装置からの読み取りおよび／またはそれへの書き込みである。取り外し可能な記憶装置の非限定的な例としては、例えば、取り外し可能なストレージドライブによって読み取ることおよび書き込むことができるフロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光ディスクなどが挙げられる。取り外し可能な記憶装置は、コンピュータソフトウェアおよび／またはデータが記憶されたコンピュータ−使用可能な記憶媒体を含んでよい。
プロセッサにより、システム内のソフトウェアを実行することができる。いくつかの実施形態では、プロセッサを、ユーザーが実施することができる本明細書に記載のタスクを自動的に実施するようにプログラミングすることができる。したがって、そのようなプロセッサによって行われるプロセッサ、またはアルゴリズムには、ユーザーからの監督またはインプットをほとんど〜全く必要なくすることができる（例えば、ソフトウェアを、機能を自動的に実行するようにプログラミングすることができる）。いくつかの実施形態では、プロセスの複雑さは、単一の人または人の群がプロセスを遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすために十分に短い時間枠で実施することができないほど大きい。
いくつかの実施形態では、補助メモリは、コンピュータプログラムまたは他の命令をコンピュータシステムにロードすることを可能にするための他の同様の手段を含んでよい。例えば、システムは、取り外し可能な記憶装置およびインターフェースデバイスを含んでよい。そのようなシステムの非限定的な例としては、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（例えば、テレビゲームデバイスに見いだされるものなど）、取り外し可能なメモリチップ（例えば、ＥＰＲＯＭ、またはＰＲＯＭなど）および関連するソケット、ならびにソフトウェアおよびデータを取り外し可能な記憶装置からコンピュータシステムに移行することを可能にする他の取り外し可能な記憶装置およびインターフェースが挙げられる。
変換
上記の通り、時には、データをある形態から別の形態に変換する。「変換された（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語、およびその文法上の派生語または等価な語は、本明細書で使用される場合、物理的な出発材料（例えば、試験被験体試料核酸および／または参照被験体試料核酸）からのデータを物理的な出発材料（例えば、配列読み取りデータ）のデジタル表示に変更することを指し、いくつかの実施形態では、アウトカムをもたらすために利用することができる１つまたは複数のデジタル表示の数値またはグラフ表示にさらに変換することを含む。ある特定の実施形態では、デジタル表示されたデータの数値および／またはグラフ表示の１つまたは複数を利用して、試験被験体の物理的なゲノムの様相を表すことができる（例えば、ゲノムの挿入、重複または欠失の有無を仮想的に表すまたは視覚的に表す；医学的状態に関連付けられる配列の物理量の変動の有無を表す）。時には、仮想表示を、１つまたは複数の、出発材料のデジタル表示の数値またはグラフ表示にさらに変換する。これらの手順により、物理的な出発材料を数値もしくはグラフ表示、または試験被験体のゲノムの物理的様相の表示に変換することができる。
いくつかの実施形態では、データセットを変換することにより、データの複雑さおよび／またはデータの次元性が低下することによって、アウトカムをもたらすことが容易になる。時には、データセットの複雑さを、物理的な出発材料を出発材料の仮想表示（例えば、物理的な出発材料を表す配列読み取り）に変換するプロセスの間に低下させる。適切な特徴または変数を利用して、データセットの複雑さおよび／または次元性を低下させることができる。データを処理するための標的特徴として使用するために選択することができる特徴の非限定的な例としては、ＧＣ含量、胎児の性別予測、染色体異数性の同定、特定の遺伝子またはタンパク質の同定、がんの同定、疾患、遺伝性の遺伝子／形質、染色体異常、生物学的カテゴリー、化学的カテゴリー、生化学的カテゴリー、遺伝子またはタンパク質のカテゴリー、遺伝子オントロジー、タンパク質オントロジー、同時調節される遺伝子、細胞シグナル伝達遺伝子、細胞周期遺伝子、前述の遺伝子に関するタンパク質、遺伝子変異体、タンパク質変異体、同時調節される遺伝子、同時調節されるタンパク質、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、タンパク質の構造データなど、および前述のものの組合せが挙げられる。データセットの複雑さおよび／または次元性の低下の非限定的な例としては、複数の配列読み取りをプロファイルプロットに低下させること、複数の配列読み取りを数値（例えば、正規化された値、Ｚスコア、ｐ値）に低下させること；多数の分析方法を確率プロットまたは単一の点に低下させること；誘導量の主成分分析など、またはそれらの組合せが挙げられる。
ゲノミックセクション正規化のシステム、装置およびコンピュータプログラム製品
ある特定の態様では、１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントを含み、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定するように構成されているシステムが提供される。
ある特定の態様では、１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントを含み、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、（ｄ）（ｃ）における評価に基づいて試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するように構成されているシステムが提供される。
ある特定の態様では、１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、メモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントを含み、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定するように構成されている装置も提供される。
ある特定の態様では、１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、メモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントを含み、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、（ｄ）（ｃ）における評価に基づいて試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するように構成されている装置も提供される。
ある特定の態様では、コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、（ａ）参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた試験被験体由来の循環している無細胞試料核酸の配列読み取りのカウントにアクセスし、（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｃ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定するように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品も提供される。
ある特定の態様では、コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、（ａ）参照ゲノムの部分にマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、（ｂ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品も提供される。
ある特定の実施形態では、システム、装置および／またはコンピュータプログラム製品は、（ｉ）核酸配列読み取りが得られるように構成された配列決定モジュール；（ｉｉ）核酸配列読み取りが参照ゲノムの部分にマッピングされるように構成されたマッピングモジュール；（ｉｉｉ）ゲノミックセクションが重み付けされるように構成された重み付けモジュール、（ｉｖ）ゲノミックセクションまたはゲノミックセクションにマッピングされたカウントがフィルタリングされるように構成されたフィルタリングモジュール、（ｖ）参照ゲノムの部分にマッピングされた核酸配列読み取りのカウントがもたらされるように構成されたカウントモジュール；（ｖｉ）正規化されたカウントがもたらされるように構成された正規化モジュール；（ｖｉｉ）予測カウントまたは予測カウントの誘導値がもたらされるように構成された予測カウントモジュール；（ｖｉｉｉ）高度および／またはプロファイルがグラフ化され表示されるように構成されたプロッティングモジュール；（ｉｘ）アウトカム（例えば、胎児の異数性の有無を決定するアウトカム）が決定されるように構成されたアウトカムモジュール；（ｘ）セグメント染色体異常または胎児の異数性またはその両方の有無が示されるように構成されたデータディスプレイ編成モジュール；（ｘｉ）配列読み取りのマッピング、マッピングされた配列読み取りのカウント、カウントの正規化およびアウトカムの生成の１つまたは複数が実施されるように構成された論理処理モジュール；または（ｘｉｉ）前述のモジュールの２つ以上の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定モジュールおよびマッピングモジュールは、配列読み取りが配列決定モジュールからマッピングモジュールに移行されるように構成されている。マッピングモジュールおよびカウントモジュールは、時には、マッピングされた配列読み取りがマッピングモジュールからカウントモジュールに移行されるように構成されている。カウントモジュールおよびフィルタリングモジュールは、時には、カウントがカウントモジュールからフィルタリングモジュールに移行されるように構成されている。カウントモジュールおよび重み付けモジュールは、時には、カウントがカウントモジュールから重み付けモジュールに移行されるように構成されている。マッピングモジュールおよびフィルタリングモジュールは、時には、マッピングされた配列読み取りがマッピングモジュールからフィルタリングモジュールに移行されるように構成されている。マッピングモジュールおよび重み付けモジュールは、時には、マッピングされた配列読み取りがマッピングモジュールから重み付けモジュールに移行されるように構成されている。時には、重み付けモジュール、フィルタリングモジュールおよびカウントモジュールは、フィルタリングされたおよび／または重み付けされたゲノミックセクションが重み付けモジュールおよびフィルタリングモジュールからカウントモジュールに移行されるように構成されている。重み付けモジュールおよび正規化モジュールは、時には、重み付けされたゲノミックセクションが重み付けモジュールから正規化モジュールに移行されるように構成されている。フィルタリングモジュールおよび正規化モジュールは、時には、フィルタリングされたゲノミックセクションがフィルタリングモジュールから正規化モジュールに移行されるように構成されている。いくつかの実施形態では、正規化モジュールおよび／または予測カウントモジュールは、正規化されたカウントがアウトカムモジュールまたはプロッティングモジュールに移行されるように構成されている。
モジュール
モジュールは、時には、装置、システムまたはソフトウェアの一部であり、情報およびデータの移行および／または処理を容易にすることができる。モジュールの非限定的な例が下に記載されている。
配列決定モジュール
配列決定モジュールによって、または配列決定モジュールを含む装置によって、配列決定、配列決定読み取りの入手をもたらすことができる。「配列受信モジュール」は、本明細書で使用される場合、「配列決定モジュール」と同じである。配列決定モジュールを含む装置は、当技術分野で公知の配列決定技術で核酸の配列を決定する任意の装置であってよい。ある特定の実施形態では、配列決定モジュールを含む装置によって、当技術分野で公知の配列決定反応が実施される。配列決定モジュールにより、一般に、配列決定反応からのデータ（例えば、配列決定装置から生成されたシグナル）に応じて核酸配列読み取りがもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りをもたらすために、配列決定モジュールまたは配列決定モジュールを含む装置が必要である。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールにより、別の配列決定モジュール、コンピュータ周辺機器、オペレーター、サーバー、ハードドライブ、装置から、または適切な供給源から配列読み取りを受け取る、入手する、それにアクセスするまたはそれを回収することができる。時には、配列決定モジュールにより、配列読み取りを操作することができる。例えば、配列決定モジュールにより、アラインメント、集合、断片化、相補配列変換（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、逆相補配列変換（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、誤り検査、または配列読み取りの誤り訂正を行うことができる。配列決定モジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、配列決定モジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。時には、配列決定モジュールにより、別のモジュール、装置、周辺機器、構成部分または特殊化された構成部分（例えば、シークエンサー）からデータおよび／または情報を集める、集合させる、および／または受け取る。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りは、以下の１つまたは複数を含む装置によってもたらされる：１つまたは複数のフローセル、カメラ、光検出器、光電池、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。多くの場合、配列決定モジュールにより、配列読み取りを受け取る、集めるおよび／または集合させる。時には、配列決定モジュールにより、装置のオペレーターからインプットデータおよび／または情報を受け入れ、集める。例えば、時には、装置のオペレーターにより、モジュールに命令、定数、閾値、式または所定の値がもたらされる。時には、配列決定モジュールにより、それが受け取ったデータおよび／または情報を連続した核酸配列に変換することができる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールによってもたらされた核酸配列を印刷または提示する。いくつかの実施形態では、配列読み取りは、配列決定モジュールによってもたらされ、配列決定モジュールから装置、または任意の適切な周辺機器、構成部分または特殊化された構成部分を含む装置に移行される。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールから、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置にデータおよび／または情報がもたらされる。いくつかの場合には、配列読み取りに関連するデータおよび／または情報を、配列決定モジュールから任意の他の適切なモジュールに移行することができる。いくつかの実施形態では、配列決定モジュールにより、配列読み取りをマッピングモジュールまたはカウントモジュールに移行することができる。
マッピングモジュール
マッピングモジュールによって、またはマッピングモジュールを含む装置によって、配列読み取りをマッピングすることができ、マッピングモジュールにより、一般に、読み取りが参照ゲノムまたはそのセグメントにマッピングされる。マッピングモジュールにより、配列決定読み取りを当技術分野で公知の適切な方法によってマッピングすることができる。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列読み取りをもたらすために、マッピングモジュールまたはマッピングモジュールを含む装置が必要である。マッピングモジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列決定読み取りは、マッピングモジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りを、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってマッピングする。いくつかの実施形態では、マッピングモジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。装置は、マッピングモジュールおよび配列決定モジュールを含んでよい。いくつかの実施形態では、配列読み取りを、以下の１つまたは複数を含む装置によってマッピングする：１つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。いくつかの実施形態では、マッピングモジュールにより、配列決定モジュールから配列読み取りを受け取ることができる。いくつかの実施形態では、マッピングされた配列決定読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールまたは正規化モジュールに移行することができる。
カウントモジュール
カウントモジュールによって、またはカウントモジュールを含む装置によって、カウントをもたらすことができる。カウントモジュールにより、当技術分野で公知のカウント方法に従ってカウントを決定し、集合させ、かつ／または提示することができる。カウントモジュールにより、一般に、当技術分野で公知のカウント方法体系に従ってカウントを決定するまたは集合させる。いくつかの実施形態では、カウントをもたらすために、カウントモジュールまたはカウントモジュールを含む装置が必要である。カウントモジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、カウントは、カウントモジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によって読み取りをカウントする。いくつかの実施形態では、カウントモジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、以下の１つまたは複数を含む装置によって読み取りをカウントする：配列決定モジュール、マッピングモジュール、１つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。カウントモジュールにより、配列決定モジュールおよび／またはマッピングモジュールからデータおよび／または情報を受け取り、そのデータおよび／または情報を変換し、カウント（例えば、ゲノミックセクションにマッピングされたカウント）をもたらすことができる。カウントモジュールにより、マッピングされた配列読み取りをマッピングモジュールから受け取ることができる。カウントモジュールにより、正規化されたマッピングされた配列読み取りをマッピングモジュールから、または正規化モジュールから受け取ることができる。カウントモジュールにより、カウント（例えば、カウント、集合カウントおよび／またはカウントの表示）に関連するデータおよび／または情報を任意の他の適切な装置、周辺機器、またはモジュールに移行することができる。時には、カウントに関連するデータおよび／または情報を、カウントモジュールから正規化モジュール、プロッティングモジュール、カテゴリー化モジュールおよび／またはアウトカムモジュールに移行する。
正規化モジュール
正規化モジュールによって（例えば、正規化モジュールを含む装置によって）、正規化されたデータ（例えば、正規化されたカウント）をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りから得た正規化されたデータ（例えば、正規化されたカウント）をもたらすために、正規化モジュールが必要である。正規化モジュールにより、データ（例えば、カウント、フィルタリングされたカウント、生のカウント）を当技術分野で公知の１つまたは複数の正規化手順によって正規化することができる。正規化モジュールにより、予測カウントの変動性の推定値（例えば、予測カウントのＭＡＤおよび／または予測カウント表示のＭＡＤ）をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、多数の実験（例えば、時には、異なる実験、時には、１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた実験）から得た予測カウントから多数の中央値を導出し、多数の中央値の絶対誤差（例えば、偏差、変動性、標準偏差、標準誤差）を導出し、算出された絶対誤差の平均値、アベレージ、または中央値を決定することによって予測カウントのＭＡＤをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、多数の実験（例えば、時には、異なる実験、時には、１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた実験）から得た予測カウント表示から多数の中央値を導出し、次いで、多数の中央値の絶対誤差（例えば、偏差、変動性、標準偏差、標準誤差）を導出することによって予測カウント表示のＭＡＤをもたらすことができる。正規化モジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、正規化モジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、正規化されたデータは、以下の１つまたは複数を含む装置によってもたらされる：１つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。正規化モジュールは、適切な装置またはモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。時には、正規化モジュールにより、配列決定モジュール、正規化モジュール、マッピングモジュールまたはカウントモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。いくつかの実施形態では、正規化モジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ／またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、正規化モジュールにより、別の装置またはモジュールからデータおよび／または情報を受け取り、そのデータおよび／または情報を変換し、正規化されたデータおよび／または情報（例えば、正規化されたカウント、正規化された値、正規化された参照値（ＮＲＶ）など）をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、正規化されたデータおよび／または情報を正規化モジュールから比較モジュール、正規化モジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および／またはアウトカムモジュールに移行することができる。時には、正規化されたカウント（例えば、正規化されたマッピングされたカウント）を正規化モジュールから予測表示モジュールおよび／または実験に基づく表示モジュールに移行する。
予測カウントモジュール
予測カウントモジュールによって（例えば、予測カウントモジュールを含む装置によって）、予測カウントまたは予測カウントの誘導値（例えば、パーセント表示）をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、配列決定読み取りから得た予測カウントまたは予測カウントの誘導値（例えば、マッピングされた配列読み取りのカウント、マッピングされた配列読み取りの所定のサブセット）をもたらすために、予測カウントモジュールが必要である。予測カウントモジュールにより、１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについてカウントを合計することができる。時には、予測カウントモジュールにより、配列読み取りおよび／またはカウントに１つまたは複数の数学的操作または統計学的操作を適用する。予測カウントモジュールにより、予測カウントの誘導値を、パーセント表示（例えば、カウント表示）を決定することによって決定することができる。予測カウントモジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、予測カウントモジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、予測カウントモジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。いくつかの実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値は、以下の１つまたは複数を含む装置によってもたらされる：１つまたは複数のフローセル、カメラ、液体取扱い構成部分、プリンター、ディスプレイ（例えば、ＬＥＤ、ＬＣＴまたはＣＲＴ）など。予測カウントモジュールは、適切な装置またはモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。時には、予測カウントモジュールにより、配列決定モジュール、予測カウントモジュール、マッピングモジュール、正規化モジュールまたはカウントモジュールからデータおよび／または情報を受け取ることができる。いくつかの実施形態では、予測カウントモジュールにより、配列決定モジュールから配列決定読み取りを受け取ることができ、マッピングモジュールからマッピングされた配列決定読み取りを受け取ることができ、かつ／またはカウントモジュールからカウントを受け取ることができる。多くの場合、予測カウントモジュールにより、別の装置またはモジュールからデータおよび／または情報を受け取り、そのデータおよび／または情報を変換し、予測カウントまたは予測カウントの誘導値をもたらす。ある特定の実施形態では、予測カウントまたは予測カウントの誘導値を予測カウントモジュールから比較モジュール、予測カウントモジュール、正規化モジュール、範囲設定モジュール、補正モジュール、カテゴリー化モジュール、および／またはアウトカムモジュールに移行することができる。
アウトカムモジュール
アウトカムモジュールによって、またはアウトカムモジュールを含む装置によって、遺伝的変異の有無（異数性、胎児の異数性、コピー数多型）を同定することができる。時には、遺伝的変異をアウトカムモジュールによって同定する。多くの場合、異数性の有無の決定をアウトカムモジュールによって同定する。いくつかの実施形態では、遺伝的変異（異数性、コピー数多型）を決定するアウトカムをアウトカムモジュールによって、またはアウトカムモジュールを含む装置によって同定することができる。アウトカムモジュールは、特定の遺伝的変異（例えば、トリソミー、２１トリソミー、１８トリソミー）を決定するために特殊化することができる。例えば、２１トリソミーを同定するアウトカムモジュールは、１８トリソミーを同定するアウトカムモジュールとは異なり、かつ／または別個であってよい。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異（例えば異数性、コピー数多型）を決定するアウトカムを同定するために、アウトカムモジュールまたはアウトカムモジュールを含む装置が必要である。アウトカムモジュールを含む装置は、少なくとも１つのプロセッサを含んでよい。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、アウトカムモジュールからの１つまたは複数の命令（例えば、プロセス、ルーチンおよび／またはサブルーチン）を実施および／または実行することができるプロセッサ（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）を含む装置によってもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含んでよい装置によって同定される。いくつかの実施形態では、アウトカムモジュールは、１つまたは複数の外部のプロセッサ（例えば、内部または外部のネットワーク、サーバー、ストレージデバイスおよび／またはストレージネットワーク（例えば、クラウド））と一緒に作動する。時には、アウトカムモジュールを含む装置によって、別のモジュールまたは装置からデータおよび／または情報を集める、集合させる、および／または受け取る。時には、アウトカムモジュールを含む装置によって、別のモジュールまたは装置にデータおよび／または情報をもたらし、かつ／または移行する。時には、アウトカムモジュールにより、構成部分または周辺機器から、またはそれにデータおよび／または情報を移行する、受け取るまたは集める。多くの場合、アウトカムモジュールにより、カウント、高度、プロファイル、正規化されたデータおよび／または情報、参照高度、予測高度、予測範囲、不確実性値、補正、補正された高度、プロット、カテゴリー化された高度、比較および／または定数を受け取る、集めるおよび／または集合させる。時には、アウトカムモジュールにより、装置のオペレーターからインプットデータおよび／または情報を受け入れ、集める。例えば、時には、装置のオペレーターにより、定数、閾値、式または所定の値がアウトカムモジュールにもたらされる。いくつかの実施形態では、協調し、並行して動作するプロセッサなどの多数のプロセッサを含む装置によって、データおよび／または情報がもたらされる。いくつかの実施形態では、適切な周辺機器または構成部分を含む装置によって、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムの同定が提供される。アウトカムモジュールを含む装置によって、正規化モジュール、予測カウントモジュールから正規化されたデータを、範囲設定モジュールから予測高度および／または範囲を、比較モジュールから比較データを、カテゴリー化モジュールからカテゴリー化された高度を、プロッティングモジュールからプロットを、および／または補正モジュールから補正データを受け取ることができる。アウトカムモジュールにより、データおよび／または情報を受け取り、そのデータおよび／または情報を変換し、アウトカムをもたらすことができる。アウトカムモジュールにより、遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムに関連するデータおよび／または情報を適切な装置および／またはモジュールにもたらすまたは移行することができる。本明細書に記載の方法によって同定される遺伝的変異または遺伝的変異を決定するアウトカムは、さらに検査することによって（例えば、母体の核酸および／または胎児核酸の標的化配列決定によって）、それぞれ独立に検証することができる。
１つまたは複数のアウトカムを生成した後、多くの場合、アウトカムを使用して、遺伝的変異の有無および／または関連する医学的状態の決定をもたらす。アウトカムは、一般には、医療専門家（例えば、検査技師または管理者；医師または補助者）に提供される。多くの場合、アウトカムはアウトカムモジュールによってもたらされる。時には、アウトカムはプロッティングモジュールによってもたらされる。時には、アウトカムは装置の周辺機器または構成部分にもたらされる。例えば、時には、アウトカムはプリンターまたはディスプレイによってもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝的変異の有無を決定するアウトカムは、報告書の形態で医療専門家に提供され、ある特定の実施形態では、報告書は、アウトカムの値および関連する信頼度パラメータの表示を含む。一般に、アウトカムは、遺伝的変異の有無および／または医学的状態の決定を容易にする適切な形式で提示することができる。データセットを報告および／もしくは提示する、またはアウトカムを報告するために使用するために適した形式の非限定的な例としては、デジタルデータ、グラフ、２Ｄグラフ、３Ｄグラフ、および４Ｄグラフ、写真、ピクトグラフ、チャート、棒グラフ、円グラフ、図、フローチャート、散布プロット、マップ、ヒストグラム、密度チャート、関数グラフ、回路図、ブロック図、バブルマップ、信号空間ダイヤグラム、コンターダイヤグラム、統計地図、スパイダーチャート、ベン図、計算図表など、および前述のものの組合せが挙げられる。アウトカム表示の種々の例が図に示されており、実施例に記載されている。
ある特定の実施形態では、アウトカムを生成することは、核酸配列読み取りデータなどを被験体の細胞内核酸の表示に変換することとみなすことができる。例えば、被験体由来の核酸の配列読み取りを分析し、染色体プロファイルおよび／またはアウトカムを生成することは、比較的小さな配列読み取り断片を比較的大きな染色体構造の表示に変換することとみなすことができる。いくつかの実施形態では、アウトカムは、被験体（例えば、妊婦）からの配列読み取りを、被験体に存在する実在構造（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）の表示（例えば、母体の核酸および／または胎児核酸）に変換することによって生じる。いくつかの実施形態では、アウトカムは、第１の被験体（例えば、妊婦）からの配列読み取りの構造（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）の複合表示への変換、および第１の被験体（例えば、妊婦）および／または第２の被験体（例えば、胎児）に存在する構造の表示をもたらす複合表示の第２の変換を含む。
下記の実施例は、ある特定の実施形態を例示し、当該技術を限定しない。
（実施例１）
盲検試料を使用した遺伝的変異の有無の決定
ダウン症候群についての有効な出生前スクリーニング検査は、多くの場合、母体の年齢と、第１三半期における項部浮腫の超音波測定および／または第１三半期および第２三半期に得られるいくつかの母体の血清スクリーニングマーカーの測定からの情報を組み合わせる。これらの出生前スクリーニング検査では、多くの場合、実質的に全ての症例の約９０％に至るまでが約２％の偽陽性率で検出される。ダウン症候群の分布率を考慮すると、侵襲的診断検査（例えば、羊水穿刺または絨毛採取）を勧められたスクリーニング陽性の女性１６人に１人で妊娠に影響し、１５人では影響しない。２００例中１例ものそのような侵襲的手順に胎児喪失が伴い、これは出生前診断の著しい有害な結果である。胎児喪失という著しい有害な結果により、時には、偽陽性率が最小限になるように補正されたスクリーニングカットオフが導かれる。実際には、約５％の偽陽性率が一般的である。
母体の血液中の無細胞ＤＮＡの約３〜６％が胎児起源のものであるという発見により、ダウン症候群を非侵襲的に検出することができるかどうかを決定するための試験が促された。数百万のＤＮＡ断片の最初の３６塩基について配列決定して、それらの特異的な染色体起源を決定する技法である大規模並列処理ショットガン配列決定（ＭＰＳＳ）を用いて胎児のダウン症候群を同定した。胎児が第３の第２１染色体を有する場合、第２１染色体断片の百分率は予測よりもわずかに高くなる。その後の報告により、これらの知見が拡張され、約２％以下の偽陽性率で少なくとも約９８％の検出率を実現することができることが示唆されている。これらの試験は有望であるが、以下の因子によって限定された；試験が比較的小さな患者群（１３〜８６のダウン症候群症例および３４〜４１０の正倍数性対照試料の範囲）を利用して実施されたこと；ＤＮＡ配列決定がＣＬＩＡによって認定された研究所で実施されなかったこと；ならびに処理量およびターンアラウンドタイムにより臨床上の実施がシミュレートされなかったこと。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、プロセスおよび装置を利用して、盲検試料を使用し、試験被験体データを正規化するための参照ゲノムデータセットを必要とせずに、遺伝的変異（例えば、トリソミー、ダウン症候群）の有無を決定するアウトカムをもたらすことができる。
材料および方法
全体的な試験デザイン
本明細書で示されている試験（ワールドワイドウェブＵＲＬ ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ００８７７２９２参照）には、世界中で２７か所の出生前診断センター（例えば、以後登録場所と称される）で登録された患者が関与した。母体の年齢、家族歴または同意を得た陽性血清および／もしくは超音波スクリーニング検査、血漿試料、人口統計および妊娠に関連する情報に基づいてダウン症候群のリスクが高い女性。各登録場所で治験審査委員会の認可（または同等のもの）を得た。患者および試料は試験コードによって識別した。侵襲的検査の直前に試料を抜き取り、６時間以内に処理し、−８０℃で保管し、コーディネートセンターにドライアイス輸送した。このコホート内で、ダウン症候群についての盲検ＤＮＡ検査を用いてコホート内症例対照試験を展開した。妊娠期間（最も近い週；同じ三半期）、登録場所、人種（自己宣言）、および冷凍装置に入っていた時間（１ヶ月以内）に基づいて、各症例に対して７つの正倍数性試料をマッチさせた。偽陰性の結果がないと仮定して、２００のダウン症候群妊娠（症例）が８０％の検出力を有し、信頼区間（ＣＩ）が低いために９８％が棄却された。症例は第１三半期および第２三半期の間に同等に分布した。この試験について、ダウン症候群を４７、ＸＹ、＋２１または４７、ＸＸ、＋２１と定義し、ダウン症候群のモザイクおよび双生児妊娠は排除した。試験のコーディネートおよび試料の保管は独立した大学医療センター（例えば、Ｗｏｍｅｎ＆Ｉｎｆａｎｔｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）に基づいた。凍結し、コード付けした試料（４ｍＬ）を検査するためにＳｅｑｕｅｎｏｍ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＳＣＭＭ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に送付した。ＳＣＭＭは、ターンアラウンドタイムを定量することを含めた、核型およびシミュレートされた臨床検査に関する知見を有さなかった。試料のサブセットを、ＤＮＡ配列決定の経験がある独立した学術的研究所であるロサンゼルスのカリフォルニア大学にあるＯｒｐｈａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＣＬＡ；Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）において検査するために送付した。どちらの研究所もＣＬＩＡによって認定されており、どちらもＳＣＭＭによって最初に開発された標準化された書面のプロトコールを使用して臨床的解釈をもたらした。
試験の完全性
この産業界から資金提供された試験の完全性、信頼度、および独立性を確実にすることを最優先した。３人の監督委員会（承認を参照されたい）を創設し、試験のデザイン、実施、分析、および解釈に対する評価および推奨の提供を委ねた。試験プロトコールは、登録場所の検査、登録場所を試験のスポンサーから切り離すこと、独立した学術的研究所による確認検査、診断検査結果を多数のレベルで盲検化すること、アウトカムデータにリモートコンピュータアクセスしないこと、学術的な検査場所で生のデータ全てにアクセスすること、配列決定および解釈の結果をコーディネートセンターに即時にファイル転送すること、およびファイルチェックサムを使用してその後の変化を同定することを含んだ。ＳＣＭＭにより、同様の設備、訓練、解釈用ソフトウェア、および標準の操作プロトコールを備えた独立した研究所が提供された。
研究所で開発された検査（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｅｓｔ）
上記の通り、ＭＰＳＳを利用して無細胞ＤＮＡについて配列決定した。簡単に述べると、循環している無細胞ＤＮＡ断片を母体の血漿から単離し、胎児の寄与（胎児分率）を決定するアッセイを用いて定量する。残りの単離物を使用して、配列決定ライブラリーを生成し、正規化し、多重化して、４つの試料について単一のフローセルレーン（例えば、フローセル１個当たり８レーン）で実行することを可能にした。マイクロフルイディクスプラットフォーム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用してＤＮＡライブラリーを定量し、ｃＢｏｔプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してクラスターを生成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００プラットフォームでフローセルについて配列決定し、生じたデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェアを使用して解析した。コンピュータ解釈により、中央の推定値（ｚスコア）を上回るまたは下回る標準偏差（例えば、ＳＤ）のロバストな推定値がもたらされた；ｚスコア３以上をダウン症候群と一致するとみなした。主要なＣＬＩＡ研究所（ＳＣＭＭ）の指揮者が結果を精査し、第２の一定分量を検査するための要求を開始し、検査された妊娠の全てについて最終的な「サインアウト」された解釈をもたらした。独立したＣＬＩＡ研究所（ＵＣＬＡ）の指揮者も同じことをしたが、第２の試料の一定分量を要求することはできなかった。各研究所は自身の結果にのみアクセスした。
統計解析
暫定的な解析により、１６症例のうち３症例超または１１２例の対照のうち６例超が誤って分類されたことが示された場合には試験を中断する。試験はマッチさせたが、解析はマッチさせないように計画した。ＳＡＳ（商標）Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｐｒｏ（Ｃａｒｙ、ＮＣ；以前は統計解析システムとして公知であった）およびＴｒｕｅ Ｅｐｉｓｔａｔ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ＴＸ）を使用して、Ｘ２検定、ｔ検定、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、および線形回帰（適切な変換後）を使用して群および関連性の間の差異を調査した。二項分布を用いて割合の信頼区間（ＣＩ）を計算した。Ｐ値は両側性であり、有意性は０．０５レベルであった。
結果
試料母集団
２００９年４月からおよび２０１１年２月の間に、登録場所２７か所（以下の表１参照）で適格の妊娠中の女性を同定し、インフォームドコンセントを得、試料を採取した。登録者４６６４人の中で、２１８人の単胎児ダウン症候群および３９３０人の単胎児正倍数性妊娠が起こった。図１には、胎児のアウトカム、血漿試料の状態、および２７９人の女性（６％）が排除された理由に関する詳細が提供される。以前の刊行物または試験に含まれた試料はなかった。合計４３８５人の女性（９４％）が単胎児妊娠、少なくとも２つの適切な血漿試料および診断検査結果を有した。これらのうち、９７％が、両端を含めて１１週から２０週の間の妊娠期間であり、３４％が第１三半期であった。登録された女性５１人を除く全てについて胎児の核型（または同等のもの）が入手可能であった。１１６人の女性については、血漿試料が検査に適するとみなされなかった（例えば、運搬中に解凍された、凍結されるまでに６時間を超えた、一定分量が１つのみである、および体積が不十分である）。さらに１１２人の女性を、多胎妊娠または現存する胎児死亡が原因で排除した。４３８５例の生育可能な単胎児妊娠の中で、３４％が第１三半期後期に得られ、６６％が第２三半期初期に得られた。合計２１２症例のダウン症候群を検査のために選択した。それぞれの症例について、マッチする正倍数性妊娠を７例選択した（例えば、１４８４；正倍数性症例とダウン症候群症例の比率７：１）。２３７例の他のアウトカムは追加的な常染色体異数性、性染色体異数性、モザイクおよび他の染色体異常であった。１つの対照が後で１８トリソミーであることが発見されたが、「正倍数性」対照として含まれていた。
以下の表２では、人口統計および妊娠に関連する情報が症例と対照の間で比較されている。マッチングは上首尾であった。年齢中央値は両群で約３７歳であり、全員が１８歳以上であった。診断検査の徴候は異なり、症例では超音波異常または多数の徴候を有する可能性がより高かった。試料を採取し、平均して１時間以内、全て６時間以内に処理し、凍結した。アウトカムは、第１三半期の２症例（重症の超音波異常を有する生育可能な胎児の中絶後の受胎の産物の、一方は定量的ポリメラーゼ連鎖反応、他方は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）以外は核型分析に基づいた。
循環している遊離のＤＮＡに対する胎児の寄与
ＭＰＳＳの前に、抽出されたＤＮＡを検査して、母体の血漿中の胎児起源の遊離のＤＮＡの割合（胎児分率）を決定した。ほぼ全て（１６８７／１６９６；９９．５％）が、許容できる限界（４〜５０％）の範囲内の最終的な胎児分率を有し、幾何平均は１３．４％であった。偽陰性の結果を最小限にするために、より低いカットオフを選択した。上のカットオフを、研究所の指揮者にこれが稀な事象を表すことを警告するために選択した。９つが許容されないレベルを有した；６つが閾値を下回り、３つが閾値を上回った。ダウン症候群を同定することにおけるＭＰＳＳの成功は、胎児分率に高度に左右されるので、１６の潜在的な共変量（図４〜１９、実施例２参照）を探究した（処理時間、溶血、地理的地域、診断検査の徴候、登録場所、妊娠期間、母体の年齢、母体の体重、膣からの出血、母体の人種、白人民族性、胎児の性別、冷凍装置での保管時間、ならびにＤＮＡライブラリー濃度、マッチする配列の数、および胎児のアウトカムに対する胎児分率の影響）。胎児分率と母体の体重の強力な負の関連が症例女性および対照女性において観察され（図１１、実施例２参照）、１００ポンド、１５０ポンド、および２５０ポンドの体重には、それぞれ１７．８％、１３．２％、および７．３％の予測胎児分率が伴った。妊娠期間、母体の人種、または検査の徴候については関連が見いだされなかった。他の関連は小さく、大抵有意でなかった。
ダウン症候群についての大規模並列処理ショットガン配列決定検査
アッセイプロトコール、および関連する器械使用に関して訓練を受けた３０人の科学者、分子技師／技術者により、９週間（２０１１年の１月から３月まで）にわたって検査が実施された。解釈のために歴史的な基準範囲を使用し、９つが新しいデータのリアルタイムでの精査必要性を伴った。研究所の指揮者による最初のいくつかのフローセルについての精査（サインアウト前）により、参照データに対する補正が必要であったことが明らかになった（実施例２および図２０〜２２参照）。６つのフローセルからのデータを生成した後、結果は監督委員会によって暫定基準に従って評価され、検査を継続することを可能にするために機密決定が行われた。検査の終わりに、しかし非盲検化する前に、ＳＣＭＭにより、１６９６の登録者の中で９０の検査失敗のうち８５について第２の一定分量が要求された（５．３％；９５％ＣＩ、４．３〜６．５；実施例２参照）。第２の結果を最終的な解釈のために使用した。
ダウン症候群の試料では、胎児分率との明白かつ有意な正の関係が示された；試料の２０８がカットオフを上回り、４つが下回った。４つのダウン症候群の試料のｚスコアはカットオフ３を下回った；全ての胎児分率が７％未満であった（例えば、７％、７％、５％、および４％）。胎児分率とｚスコアの間の強力な正の関連が症例については存在したが（対数変換後、傾き＝０．６７６、ｐ＜０．００１）、対照については存在しなかった（傾き＝０．００２２、Ｐ＝０．５０）。胎児分率が低いダウン症候群の試料のうちの１つの最初のｚスコアは５．９であり、１つの境界線上の品質欠陥を伴った；反復試料のｚスコアは２．９であった（最初の陽性の結果と一致する境界線上の値）。反復試料からの情報と最初の試料についての５．９スコア（例えば、境界線上の欠陥）を組み合わせることにより、研究所の指揮者が正しい呼び出しを行うことが可能になる。他の臨床的解釈は全てコンピュータ解釈と合致した。したがって、サインアウトされた結果により、ダウン症候群の胎児２１２人のうち２０９人が正確に同定された（検出率９８．６％；９５％ＣＩ、９５．９〜９９．７）。
試験に使用した全てのダウン症候群試料および正倍数性試料の臨床的解釈は以下の通りである：正倍数性妊娠の中では、１４７１例が陰性であり、３例が陽性であり、１３例が第２の一定分量でも失敗した。ダウン症候群妊娠の中では、２０９例が陽性であり、３例が陰性であった。１４７１の正倍数性試料の中で、３つのｚスコアが胎児分率の範囲にわたって３より大きく、ダウン症候群に不正確に分類され、０．２％の偽陽性率がもたらされた（９５％ＣＩ、０．１未満〜０．６）。女性１３人については（１３／１６９６または０．８％；９５％ＣＩ、０．４〜１．３）、検査結果が利用可能であり、大抵「正常」であったが、最初の試料および反復試料に対する品質管理不足に起因して解釈がもたらされなかった（６人については胎児分率が４％未満であり、１人については胎児分率が５０％超であった）（図２Ｂ参照）。誤って分類された妊娠についての研究所の結果、試料の取扱い、および妊娠のアウトカムを、潜在的な誤差について広範囲にわたって確認し、同定されなかった（表３、実施例２参照）。ｚスコアに対する第１の１５共変量の解析を実施した（図７〜１０、実施例２参照）。症例の間で母体の体重について強力な負の関連が存在し、この関連は対照では弱かった。症例において、妊娠期間について小さいが有意な正の関連が存在し（図７、実施例２参照）、１１週および１９週の妊娠期間でそれぞれ７．２および９．９にｚスコアが回帰した。他の関連は小さく大抵有意ではなかった。
独立した研究所による検査性能の確認
独立した大学研究所（例えば、ＵＣＬＡ）において、最初にＳＣＭＭによって処理および検査された６０５の最初の試料一定分量のサブセットについてのクラスター生成、ＤＮＡ配列決定、および解釈が実施された。このサブセットは、９２の患者試料（例えば、プレート）の完全な群全てからコーディネートセンターによって無作為に選択された。合計５７８の試料がどちらの場所においても首尾よく検査された（９６％）。コンピュータにより解釈されたＭＰＳＳの結果は、ＳＣＭＭ値を用いてｚスコアとしてとして表されている。合計７７例のダウン症候群妊娠および５０１例の正倍数性妊娠がどちらの場所においても首尾よく検査された。一方の場所または両方の場所において最初の試験で失敗した２７の試料は含まれていない。ｚスコアカットオフ３を使用した。これらの試料の中で、不一致が１つだけ起こった。正倍数性試料がＵＣＬＡによっては誤って分類されたが（ｚスコア＝３．４６）、ＳＣＭＭによっては正確に分類された（ｚスコア＝２．０２）。どちらの群でも１つのダウン症候群の試料が誤って分類された。７７例のダウン症候群妊娠および５０１例の正倍数性妊娠のどちらの間でも相関は高かった（例えば、それぞれＲ＝０．８０および０．８３）。この５７８のサブセットにおいて、ＳＣＭＭについての検出率、偽陽性率、および最初の失敗率は、それぞれ９８．７％、０．０％、および４．４％であった。ＵＣＬＡについての対応する率は、９８．７％、０．２％、および３．９％であった（表３、実施例２参照）。登録者５６人の別のサブセットでは、２連の４ｍＬの血漿試料を各研究所で検査した。１つの正倍数性試料が、胎児分率が低いことに起因してどちらの場所においても失敗した。ＵＣＬＡにおいてさらに２つの正倍数性試料の配列決定が失敗し、そのプロトコールでは再検査が可能でなかった。ＳＣＭＭおよびＵＣＬＡにおける失敗率は、それぞれ１．８％および５．３％であった。残りの５３の試料の中で、全ての品質パラメータおよび解釈の結果が２つの場所で合致した（実施例２）。どちらの研究所においても、検出率および偽陽性率はそれぞれ１００％および０％であった。
事後解析
大きなサンプルサイズにより、ＭＰＳＳ結果を解釈する代替的方法を調査するための機会がもたらされた。サインアウト後であるが研究所非盲検化の前に、ＳＣＭＭ研究所で、第２１染色体のパーセント結果について、ＭＰＳＳの性能が改善されることが示されているプロセスであるＧＣ含量についての補正を行い、また、Ｒｅｐｅａｔ Ｍａｓｋ（ＵＲＬワールドワイドウェブｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／ＰｒｅＭａｓｋｅｄＧｅｎｏｍｅｓ．ｈｔｍｌ）に関してフィルタリングし、結果をコーディネートセンターに送って代替の解釈のアルゴリズムをよりよく実施することができるか、よりロバストであるか、またはその両方であるかを決定した。分析により、対照の結果は、フローセルごとまたはプレート（バッチ処理された３つのフローセル）ごとに変動するが（ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１３．５、ｐ＜０．００１）、ＳＤは一定であり（ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１．２、Ｐ＝０．２３）、これにより、ＧＣについて補正された結果をプレート中央値の倍数に変換することが可能になることが示された。ダウン症候群妊娠および正倍数性妊娠におけるプレート中央値の倍数は、１つの持続的な偽陰性の結果以外は完全に分けられた（実施例２参照）。フローセルに特異的なｚスコアを補正することによっても、性能が改善され、２つの偽陰性および１つの偽陽性の結果が残った（実施例２参照）。事後解析は、臨床的解釈を行う時点では利用不可能であった。
臨床的意味
２，１１６の最初の患者試料（１６９６が本発明で報告されたものであり、４２０が他の患者試料である）を、２つのＨｉＳｅｑ２０００プラットフォームを使用して、１週間当たり患者２３５人の処理量で検査した。ターンアラウンドタイム（例えば、試料の解凍からサインアウトまで）が９週間の検査に対して改善され、最終的な２０フローセルのうち１８について１０日の標的に見合った（実施例２参照）。これは、第２の一定分量を必要とした試料の５％を含まないが、失敗は多くの場合、検査プロセスの初期に検出されたので、第２の一定分量を必要とした試料についてのターンアラウンドタイムは倍にはならない。
有用性を評価するために、単純なモデル（実施例２参照）でダウン症候群についての現行の診断プロトコールを、高リスク妊娠の同定と侵襲的診断の間にＭＰＳＳを挿入する診断プロトコールと比較する。ダウン症候群のリスクが高い女性１００，０００人を仮定すると、３２例の正常な妊娠ごとに１例が妊娠に影響を受け、診断検査費用は患者１人当たり＄１，０００であり（実施例２参照）、手順に関連する胎児喪失率は２００例に１例である。高リスクの女性による侵襲的検査の完全な取り込みでは、３，０００症例が検出され、費用が＄１億、手順に関連する喪失が５００例になる。高リスクの女性全てによってＭＰＳＳ検査が完全に取り込まれ、その後にＭＰＳＳ結果が陽性の女性において（検査が失敗した人と一緒に）侵襲的検査を行うことにより、２，９５８の症例が検出され（４２症例が見落とされる）、費用が＄３．９百万、喪失が２０例になる。２つのプロトコールの財務費用の差異は、ＭＰＳＳ検査の費用を相殺する助けになり得る。ドル値を４８０例の潜在的に回避可能な手順に関連する喪失に割り当てることは難しいが、これらは同等に重要な考察である。手順に関連する喪失率は、２００人に１人よりも低く、喪失の絶対数は減少するが、減少率は同じままである。
考察
本明細書において報告されているものを含め、合計３５０例のダウン症候群および２０６１例の対照妊娠が報告された。報告されたダウン症候群および対照妊娠の全体で９９．０％の感度および特異度が実証され（例えば、９５％ＣＩ、９８．２〜９９．８％、Ｉ２＝０％；表５、実施例２参照）、これにより、ＭＰＳＳに基づくダウン症候群についての検査の臨床的な有効性の決定的な証拠がもたらされる。陽性の結果では、時には、ダウン症候群のリスクが４９０倍増加し（例えば、９８．６％検出／０．２％偽陽性率）、陰性の結果では、時には、リスクが７２分の１低下した（例えば、９９．８％／１．４％）。検査は女性１０００人に９９２人で上首尾であった。最初の検査の５．３％で品質確認できなかったが、これらの８２％は第２の一定分量の検査後に解決された。残りの検査失敗は、多くの場合、胎児分率が少ないことに関連し、これは時には、妊娠の１週間または２週間後に反復試料採取することによって解決することができた。ＭＰＳＳの性能は独立した研究所により（例えば、実施例２の表５参照）、元の血漿試料および血漿ＤＮＡ調製物を使用して確認された。
本試験では、複数の試料（採取、処理、凍結、および輸送）を２７か所の登録場所で取り扱い、予測される臨床上の実施をシミュレートした。我々の発見により、広範な妊娠期間の範囲にわたって、種々の人種／民族群の中で、母体の年齢の全てに対して、および診断検査の徴候の全てに対して、ＭＰＳＳの性能が裏付けられる（実施例２参照）。性能は、膣からの出血または試料の溶血の影響を受けず、６時間に至るまでの試料の処理時間に対してロバストである。よく説明されている血液量が増加することの希釈の影響が原因で、１５例の検査失敗は体重の重い女性においてより一般的である。解釈における胎児分率の説明は保証することができる。全体的に、スクリーニング結果が偽陽性である大多数の女性は侵襲的検査を回避するが、影響を受けた妊娠のほぼ全ては、従来の侵襲的手段によって確信的に診断される。本試験により、ダウン症候群のリスクが高いと同定された女性に対して、検査の複雑さおよび必要な供給源を考慮に入れて、ＭＰＳＳを提案することが支持される。検査は少なくとも週２回起こり、患者の結果の９５％についてのターンアラウンドタイムは、羊水細胞および絨毛採取の細胞遺伝学的分析についての現在利用可能なターンアラウンドタイムと同等である。ＭＰＳＳの利用可能性により、血清／超音波スクリーニングカットオフの低下も正当化され、それにより、ダウン症候群がより高く検出される。この試験により、初めて、フローセル間の固有の変動性が実証されている。これらの変化を説明することにより、臨床上の実施が改善される。いかに最良にそのような補正を実施するかには、さらなる試験が必要である。
事後解析により、大部分はＧＣ含量についての補正に起因して偽陰性の結果および偽陽性の結果が減少した。これにより、ＭＰＳＳの性能が、検査を実務に導入した場合により良いものになることの強力な証拠が構成される。この試験により、ＭＰＳＳを研究から臨床的な環境に妥当なターンアラウンドおよび処理量を伴って転換することができることの証拠ももたらされる。ある特定の実行問題は注意に値する。外界温度で無細胞ＤＮＡレベルに影響を及ぼすことなく保管および輸送することを可能にする採取管が役立つ。現在、試料は、我々の試験において従ったものと同様のプロトコールで処理し、凍結し、ドライアイス輸送しなければならない。これは観察に基づく試験であったので、臨床的な環境における有効性を示す実証プロジェクトが保証される。患者およびプロバイダーの両方に対する教育材料を開発し、検証して、十分な情報を得た上での決定を確実に行うことに役立てる必要がある。追加的な懸念としては、払い戻しおよび関連性のある専門家ガイドラインの開発が挙げられる。一部では、胎児ＤＮＡを検査することにより新しい倫理的問題が生じることが示唆されている。リスクが高い女性のＭＰＳＳ検査の推奨される設定では、これらの問題の多くは関係ない。
出生前スクリーニングの分野における主要な目標は、侵襲的手順の必要性を低下させることである。ＭＰＳＳ検査はまだ診断的であるとみなすことはできない。しかし、すでにダウン症候群についてのリスクが高い女性にＭＰＳＳ検査を提案することにより、高い検出を維持しながら、手順に関連する喪失を９６％に至るまで減少させることができる。侵襲的検査による確認はなお必要である。この試験により、以前の報告と一緒に、高い性能が実証されるが、ＣＬＩＡによって認定された研究所において、最初の失敗に対して利用可能な第２の一定分量を有し、ターンアラウンドタイムをモニタリングし、オペレーター間および機械間の変動性を評価し、独立した学術臨床研究所における試料結果のサブセットを検証し、遺伝医学者／研究所の指揮者を報告プロセスに統合する検査を実施することによって証拠を拡張した。この報告は双胎妊娠などの他の染色体異常１３または事象には対処しない。当該技術が前進するにつれ、そのような改良が利用可能になるであろう。なおいくつかの実行問題に対処するする必要があるが、証拠により、この検査を、ダウン症候群のリスクが高い女性に、侵襲的診断検査の前に臨床的に導入することが保証される。
（実施例２）
盲検試料を使用した遺伝的変異の有無の決定：追加的な材料、方法および結果
試験の完全性
試験の独立性および完全性の継続の保証に役立てるために、２００９年２月に試験監督委員会を創設した。委員会の構成は、出生前検査および分子遺伝学的方法の臨床的態様および研究的態様の両方の専門知識を有する産科学および遺伝学の学術コミュニティが代表されるように設計した。委員会は、２００９年および２０１０年の間に平均して年に３回、試験Ｃｏ−Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ（Ｃｏ−ＰＩ’ｓ）と直接または電話によって会合し、２０１１年２月にその任務を完了し、最後の電話会議を開き、活発な試験登録を終えた。委員会のメンバーは、試験のスポンサー（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）と秘密保持契約を結ばないことを選択し、したがって、彼らは独占的な方法または結果の知見を有さず、また、試験の過程中にＳｅｑｕｅｎｏｍの人員と直接やり取りしなかった。監督委員会のインプットは、１）検査用の試料をコード付けおよび選択する安全な方法、２）試験結果の暫定的確認、および３）試験のスポンサーとコーディネートセンターの分離、および動員場所の活動を維持するための規則の実行において必須であった。
試験Ｃｏ−ＰＩまたはコーディネーターによる各登録場所の検査は、手順に対する順守を精査および評価するための現地訪問、作業空間およびリソースの検査、提出されたデータの検証および試験の目的、方法およびタイムラインに関する質問への回答を伴った。各検査の概要を作成し、特定の試験ＰＩおよび登録場所ＰＩがサインし、患者の識別子またはデータを含有しないコピーを試験のスポンサーに送付した。登録場所は試験のスポンサーとは直接接触せず、また、試料の一部が独立した研究所で検査された。
同様に、手順を整備して、検出されずに生のデータを変化させることができないこと、および全ての生の結果を独立した研究所で再解析することができることを確実にした。診断検査結果の盲検化を２つのレベルで実現した。コーディネートセンター内では、試料および人口統計情報をＲｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄに保存し、アウトカムデータは、適切な時間に人口統計データとマージするためにコーディネートセンターの第２の支所に保存した（例えば、Ｍａｉｎｅ）。サーバーはインターネットに接続していなかったので、この情報はいずれも、遠隔地からはアクセス不可能であった。
コーディネートセンター
Ｗｏｍｅｎ＆Ｉｎｆａｎｔｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＷＩＨ）がコーディネートセンターとして機能し、試験の全体的な責任を有した。責任は、試験デザインを実行し、順守すること、登録場所との通信を動員し、確立すること、安全な試験データベースおよびウェブサイトを維持すること、患者データを収集し、検証すること、処理された血漿試料バンクを維持すること、および監督委員会を編成し、利用することを含んだ。センターは２つの場所に位置し、１つはメイン州、スタンディッシュにあり、そこではコンピュータ化されたデータをＣｏ−ＰＩおよび試験コーディネーターの監督の下で保持し、１つはロードアイランド州、プロビデンスにあり、そこでは、登録場所から試料を入手し、−８０℃で保管し、必要に応じて検査研究所に輸送し、また、登録場所に対する行政的支持および供給支持が位置した。試験はＷＩＨにより、連邦のガイドラインに従って施行された。ＷＩＨと試験のスポンサーの間で守秘義務契約が結ばれ、これにより、Ｃｏ−ＰＩが試験全体を通して暫定データおよび研究結果にアクセスすることが可能になった。
登録場所
多数の患者へのサービス、統合スクリーニング、または第１三半期の診断検査を提供している場所を優先的に探した。２７の参加登録場所（表１参照、実施例１）により、第１三半期後期および／または第２三半期初期におけるダウン症候群（または他の常染色体異数性）についての診断検査が提供された。全ての場所が、厳重なプロトコールに従って血漿試料を採取し、処理し、保管し、輸送する能力を有した。場所は治験審査委員会（または同等のもの）の認可を獲得し、試験に登録された各女性のインフォームドコンセントを得た。
研究所の場所
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（ＳＣＭＭ−ＳＤ）は、高複雑度分子遺伝学研究所としてＣＬＩＡによって認定されている。研究所には２つのＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒがあり、この試験ではその両方を使用した。カリフォルニア大学Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＣＬＡ）にあるＯｒｐｈａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒも、ＣＬＩＡによって認定された高複雑度遺伝学研究所であり、この試験の間Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００プラットフォームを１つ有した。ＵＣＬＡは、盲検化された試験試料の大規模並列処理配列決定の実施においてＳＣＭＭ−ＳＤと協力し、ＳＣＭＭ−ＳＤにおいて作成された、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００プラットフォームで使用するために更新された標準化された書面のプロトコールに従って臨床的解釈をもたらした。
試験母集団
診断検査を予定している妊娠中の女性に関する情報を各登録場所で精査して、試験基準に従って異数性のリスクが高く、胎児が妊娠期間２１週６日以下の女性を同定した。高リスクを、血清検査および／または超音波検査によるダウン症候群または他のトリソミーについてのスクリーニング陽性、分娩時の母体の年齢が３８歳以上（試験の初期にはこれは４０歳以上に設定していた）、または異数性の家族歴と定義した。必要条件を満たした女性に、遺伝学カウンセラーまたは医師によって試験に関する情報が与えられ、参加することを選択した場合はサインされたインフォームドコンセントがもたらされた。各女性のサインおよび完全な同意書を現地で保存した。選択された人口統計および妊娠に関連する情報を、標準化された形態で入手し、併せて、診断手順の前に抜き取った静脈血が入った少なくとも２つ（最大５つ）の上部が紫色の１０ｍＬチューブを入手した。データ形態上、および処理された血漿チューブ上の検査コードによってのみ参加者を識別した。多胎妊娠および現存する胎児死亡を伴う妊娠は、全ての胎児について診断検査が計画されていたのであれば適格であった。
検出力分析
この試験は、現行の実施を変化させるべきかを決定することを意図していた。したがって、検出率（検査陽性のダウン症候群妊娠の割合、または感度）および偽陽性率（検査陽性の影響を受けていない妊娠の割合、または１−特異度）のどちらの推定にも高信頼度の水準が必要とされた。偽陰性がないという仮定の下で、９８％よりも有意に高い検出率を見いだすために検出力が少なくとも８０％になるように十分な症例を含めるべきである。２００症例を分析することにより、９０％の検出力がもたらされ、この下限が棄却される。これらの症例のそれぞれに対して７例の正倍数性妊娠（対照）を選択して、偽陽性率の妥当な信頼度を確実にする。
試料／データ採取
羊水穿刺または絨毛採取の前に血漿試料を抜き取り、Ｅｈｒｉｃｈら、（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２０１１年）２０４巻：２０５．ｅ１−１１頁）のプロトコールに従って処理した。簡単に述べると、１０ｍＬの血漿チューブ（ＥＤＴＡを含有する、上部が紫色）を４℃、２，５００×ｇで１０分遠心分離し、血漿を５０ｍＬの遠心管にプールし、４℃、１５，５００×ｇで１０分遠心分離した。次いで、血漿を２つ以上の１５ｍＬの円錐チューブに、チューブ１個当たり４ｍＬで移し、最後のチューブは残りの体積全てを含有した。これらのチューブを、長期保管するために登録場所で−７０℃以下の冷凍装置に入れた、または、コーディネートセンターへの１〜２日の配送のためにドライアイス輸送する前に２４時間以下にわたって−２０℃に置いた。−８０℃で保管した場合、試料は、コーディネートセンターへの１〜２日の配送のために、通常は月に１回ベースで、バッチでドライアイス輸送した。場所特異的な試験ＩＤを添えた予め印刷したバーコード標識を使用して全ての血漿チューブを識別した。国際輸送のためにＱｕｉｃｋ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｕｒｉｅｒ、Ｉｎｃ．を使用して、適切な追跡、パッケージ内のドライアイスの維持、および配送を確実にした。
データ収集には標準化された多成分形態を使用し、予め印刷したバーコード試験標識、収集日、妊娠期間、母体の年齢、体重、人種および民族、手順の徴候、胎児の数、胎児の性別、試料抜き取りの日時、抜き取ったチューブの数、研究所で受け取った時間、および冷凍装置内に置かれていた時間を含めた。１つのコピーをその場所で保持し、他を試料と一緒にコーディネートセンターに輸送した。核型情報を得るために、各女性に対して電子申請書を作成し、各申請書は、手順の日付、妊娠期間、手順（例えば、羊水穿刺、ＣＶＳ）、診断検査（例えば、核型、ｑｆＰＣＲ）、解釈された試験結果（ならびに胎児の性別）、および追加的な胎児に関する結果および所見を含めるために十分な空間を含んだ。処理された血漿チューブとデータ形態のどちらについても、検査コードによってのみ参加者を識別した。
分析用の試料の選択
選択の判断基準は、完全な４ｍＬの処理された試料へのアクセス、女性の年齢が１８歳以上であること、および重要なデータの欠けがないまたは限られていることを含んだ。最後にいくつか登録された第１三半期後期（１４週以内の妊娠期間）および第２三半期初期（１５〜２２週の妊娠期間）からの症例は、三半期ごとに１００症例の標的が妥当なクッションを伴って達せられたので含めなかった。マッチングは、妊娠期間、母体の人種、母体の民族、登録場所、および冷凍装置内にあった時間に基づいた。試料は、研究所で開発された検査（ＬＤＴ）が最終的な内部検証、刊行物の提出、および監督委員会の同意を通った後のみに、処理および検査のためにドライアイス輸送した。選択状況（例えば、一定分量の破損、抽出失敗）では、第２の一定分量を要求することができた。第２の一定分量の数および送付の指標を追跡した。
研究所での検査
ライブラリー調製
ライブラリーを調製するために、抽出された、循環している無細胞（ｃｃｆ）ＤＮＡを、さらなる断片化またはサイズ選択をせずに使用した。ｃｃｆ ＤＮＡは、一般に、アベレージの長さ約１６０塩基対に天然に断片化している。ＤＮＡ溶出液５５μＬを、抽出後、ライブラリー調製を開始するまで、低結合性エッペンドルフチューブに入れ４℃で保管した。保管時間は２４〜７２時間にわたった。ライブラリー調製を製造者の仕様書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、本明細書に記載のいくつかの改変を伴って行った。酵素および緩衝液はＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ、ＭＡ（Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ −ＬＣ；ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各２５ｍＭ）；Ｅｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ；１０×Ｂｌｕｅ Ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭのｄＡＴＰ；Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ；２×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ＭＭ）から供給された。アダプターオリゴヌクレオチド、指標オリゴヌクレオチド、およびＰＣＲプライマーはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ、ＣＡから入手した。
４０μＬのｃｃｆ ＤＮＡを末端修復のために取得することによってライブラリー調製を開始し、１５μＬを胎児定量器アッセイ（ＦＱＡ）品質管理（ＱＣ）のために保持した。試料の末端修復を、１×末端修復緩衝液、２４．５μＭの各ｄＮＴＰ、および末端修復酵素ミックス１μＬの最終濃度を用いて実施した。末端修復反応を室温で３０分行い、産物をＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムで浄化し、溶出緩衝液（ＥＢ）３６μＬ中に溶出させた。末端修復された試料を１×Ｂｌｕｅ Ｂｕｆｆｅｒ、１９２μＭのｄＡＴＰ、および５ＵのＥｘｏ（−）Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの最終濃度と混合することによって、末端修復された試料の３’モノ−アデニル化を実施した。反応物を３７℃で３０分インキュベートし、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムで浄化し、産物を１４μＬのＥＢ中に溶出させた。１×Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、４８．３ｎＭのＩｎｄｅｘ ＰＥ Ａｄａｐｔｅｒ Ｏｌｉｇｏｓ、および６００ＵのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅと一緒に室温で１０分インキュベートすることによってアダプターを断片にライゲーションした。ライゲーション反応物をＱｉａＱｕｉｃｋカラムで浄化し、試料を２３μＬのＥＢ中に溶出させた。忠実度の高いポリメラーゼを用いて増幅することによって、アダプターで修飾された試料を濃縮した。各試料の溶出液２３μＬ全体を、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＭＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＥ １．０および２．０プライマー、ならびに１２種の指標プライマーのうちの１種と混合して総ＰＣＲ反応体積５０μＬにした。本明細書に記載されている方法およびプロセスは、１２種の指標プライマーの使用に限定されない。プラットフォームおよび／または製造者の利用可能性に応じて、任意の数の追加的な指標プライマーを本明細書に記載の方法およびプロセスと一緒に使用することができる。指標プライマーの数が多いほど、フローセルレーンで実行することができる試料の数が多くなる。本明細書に記載の方法およびプロセスでは、試験時に市販されていた指標プライマーを利用した。
ＡＢ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００サーマルサイクラーを使用し、０．６５ｍＬのＰＣＲチューブで試料を増幅した。増幅するために利用したＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒の最初の変性、９８℃で１０秒の変性、６５℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸長を１５サイクル含んだ。７２℃で５分の最終的な伸長の後に４℃で保持した。ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅカラムで浄化し、ライブラリーを１７μＬのＥＢ中に溶出させた。
配列決定ライブラリーの品質管理（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ）
マイクロフルイディクスプラットフォームにおける電気泳動による分離によってライブラリーを定量した。各ライブラリーを１：１００希釈し、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用い、ＨＴ ＤＮＡ１Ｋ ＬａｂＣｈｉｐ、ｖ２およびＨｉＳｅｎｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて３連で分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアｖ２．２により、２００〜４００ｂｐからのスメア分析を用いて濃度を算出した。
クラスタリングおよび配列決定
標準のＩｌｌｕｍｉｎａプロトコールに従ってクラスタリングおよび配列決定を実施した。個々のライブラリーを、２ｎＭの濃度に対して正規化し、次いで、４プレックス形式で試料１つ当たり１．２ｐＭまたはフローセル１レーン当たり４．８ｐＭの最終的なフローセルローディング濃度にクラスタリングした。ｃＢＯＴ計器およびｖ４Ｓｉｎｇｌｅ−Ｒｅａｄ ｃＢＯＴ試薬キットを使用した。ＨｉＳｅｑ ２０００において、ｖ１ＨｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔキットおよび補足的なＭｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｉｍｅｒキットを使用して単一読み取り多重化配列決定を３６サイクル実施した。ＩｌｌｕｍｉｎａのＲＴＡ１．７／ＨＣＳ１．１ソフトウェアを用いて画像解析および塩基呼び出しを実施した。ＣＡＳＡＶＡバージョン１．６を使用して配列をＵＣＳＣｈｇ１９ヒト参照ゲノム（反復マスキングしていない）に対してアラインメントした。クラスタリングおよび配列決定は、独特の指標プライマーの利用可能性に応じて、８プレックス、１２プレックス、１６プレックス、２４プレックス、４８プレックス、９６プレックス、またはそれ以上を用いて実施することもできる。
データ解析
試料を第２１染色体トリソミーと二染色体に分類するために、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉｕら、（ＢＭＪ（２０１１年）３４２巻：ｃ７４０１頁）およびＥｈｒｉｃｈら、（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２０１１年）２０４巻：２０５．ｅ１−１１頁）に記載されている方法と同様の方法を利用した。これらの試験に使用された方法とは異なり、本明細書で適用する分類は、臨床診察をシミュレートするために、「オンライン」様式で行った。１つのフローセルが処理されたらすぐに試料を呼び出した。この「オンライン」バージョンの分類予測では、ロバストな位置の推定値および染色体表示の尺度を使用することによって、標準化された染色体表示（例えば、フローセルに対してロバストなｚスコア、またはＦＣに対してロバストなｚスコア）を確立するために、フローセルに関連する全てのデータを使用した。染色体ｉについての染色体表示を示すｃｈｒｉ、

（式中、カウントｊは染色体ｊ上のアラインメントされた読み取りの数である）を用いて、染色体ｉを伴う試料ＮについてのＦＣに対してロバストな染色体のｚスコアの方程式は、
である。尺度のロバストな推定値について中央絶対偏差（ＭＡＤ）の正規化された形態を使用し、
正規分布したランダムな変数の標準偏差に近づくように乗法定数を選択した。試料は、ＺＮ＞３の場合は第２１染色体に関してトリソミーであると呼び出され、他の場合は二染色体であると呼び出された。
反復領域のフィルタリングおよびＧＣ正規化
ヒトゲノムでは、現行の検出方法を用いて推定することができる反復ゲノム配列は、最大でゲノム全体の半分を表す。これらの反復性の領域は、単純な反復、またはタンデムな反復（例えば、大部分は染色体のセントロメアおよびテロメアにおいて見いだされるサテライトＤＮＡ、ミニサテライトＤＮＡ、マイクロサテライトＤＮＡ）、またはセグメント重複および分散反復（例えば、ＳＩＮＥＳ、ＬＩＮＥＳ、ＤＮＡトランスポゾン）の形態をとり得る。そのような重複のサイズは、数塩基対（ｂｐ）から、数百ｂｐまで、およびはるか１０〜３００キロベース対までにわたり得る。これらの領域の反復性は、次世代シークエンシング技法のいくつか、例えば大規模並列処理ショットガン配列決定に存在するＰＣＲ増幅ステップの変動性の原因であると考えられている。
そのような反復性の領域にマッピングされた読み取りの、分類の正確度に対する影響を評価するために、全ての試料を、そのような読み取りを染色体表示の図表化に含めて、または含めずに分析した。試料を、反復ゲノム配列の寄与を除去することの利益を伴って、または伴わずに分析した。効率的なコンピュータ処理のために、短い読み取りをアラインメントするために使用する参照ゲノムは「反復マスキングされた」バージョンではなく、そのような反復性の領域を含むものであった。アラインメント後、基礎を有するフィルタリング手順をＲｅｐｅａｔ Ｌｉｂｒａｒｙ ２００９０６０４（ＵＲＬワールドワイドウェブｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）に含有される情報に対して利用した。次いで、反復マスキング認識分類のために、反復された領域とオーバーラップしていない読み取りのみを染色体表示の推定について考慮に入れた。
ＧＣ含量が異なるゲノム配列により、時には、ＰＣＲステップの間に異なる増幅効率がもたらされ、今度はこれにより、時には、元のゲノムの材料の試料採取が偏ったものになる。この潜在的な増幅の偏りを補償するために、各５０Ｋｂのビンについてのカウントを集約し、Ａｌｋａｎら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２００９年）４１巻：１０６１〜１０６７頁）に記載されているものと同様のＬＯＥＳＳ技法を用いることによって、ビンに特異的なＧＣ含量に関してさらに正規化した。次いで、推定のＧＣの偏りに関して正規化された、フィルタリングされたカウントを、染色体表示を決定するために使用する。
本明細書に記載の読み取りのフィルタリングおよびカウントの正規化手順は第２１染色体の倍数性の「オンライン」分類には使用されなかったが、その後の解析の一部として使用され、全ての試料についてのデータセットが、非盲検化される前にＳＣＭＭからコーディネートセンターに送達された。反復マスキングに関するフィルタリングならびにＧＣ正規化手順の両方を適用した後に算出された染色体表示は、この試験では、「ＧＣについて補正された染色体表示」と称され、そのような染色体表示から算出されたｚスコアは「ＧＣについて補正されたｚスコア」と称される。
ＳＣＭＭ−ＳＤ研究所では、１，６４０の試料の全てについてステップの全てが実施された。ＵＣＬＡ研究所では、これらの試料の約４０％についてライブラリー調製物が受け取られ、次いで、検査プロトコールが完了した。７例のダウン症候群症例および対照を含有する１つの試料のセット（例えば、１つのプレート；３つのフローセル；約９６の試料）について、別々の４ｍＬの処理された血漿試料がＳＣＭＭ−ＳＤ研究所およびＵＣＬＡ研究所の両方に輸送され、ＬＤＴ全体が２連で実施された。両方の研究所からの試験結果を有する試料のいずれについても、ＳＣＭＭ−ＳＤからの結果を一次結果とみなした。
結果および考察
本明細書の図４〜図１９に示されている表にしたグラフデータは、２１２例のダウン症候群妊娠および１，４８４例の正倍数性妊娠の全てについての胎児分率の共変量分析（胎児に由来する遊離型の循環しているＤＮＡの百分率）を含む。データの可視性を改善するために、カテゴリーデータを標識した目盛の左側および右側に「ディザー処理」した。試験された妊娠の全てについて試料採取時に生育可能であり、また、全てが、診断検査結果（例えば、核型）が入手可能な単胎児妊娠であることが検証された。ディザー処理は、多くの場合、オーバープロットを回避するためにデータ点をランダムにジッタリングするまたはわずかにシフトさせることである。Ｘ軸座標をわずかに変動させて、プロットの全体的な見え方は変化させずに、そのカテゴリーについての個々の点を可視化することを可能にした。配列決定の前に胎児分率の検査結果が入手可能であったので、それらを使用して、試料の妥当性を決定した。許容できる胎児分率は両端を含めて４％から５０％の間であった（グラフの薄い横破線）。臨床診察では、この範囲の外側の試料を、配列決定するために許容されないとみなすことができる。全体的な胎児分率中央値１４．０％（幾何平均１３．４％、算術平均１５．０％）が図１〜図３に薄い横の実線として示されている。胎児分率が４％未満の場合、ダウン症候群由来の循環しているＤＮＡと正倍数性妊娠由来の循環しているＤＮＡの間の小さな差異を分解することが難しい。より高レベルでは、試料の取扱いの潜在的な問題が示される。胎児分率の分布は右側に歪んでいる。このような理由で、表示および分析は対数変換後に行う。回帰分析を用いて探究される共変量については、結果が統計的有意性に達しなかった場合は回帰直線のみが示されている。他の点では、９５％予測限界も示されている。
胎児分率を、試料の抜き取りと冷凍装置での保管の間の時間に応じて分析した。正倍数性妊娠についての分析の結果を使用すると、冷凍装置に入れるまで１時間、２時間、３時間、４時間および５時間についての予測される胎児分率は、それぞれ１３．５％、１３．２％、１２．８％、１２．５％および１２．２％になる。
試料の溶血の状態を、凍結する前に登録場所で評価した。全くなし、わずか、中程度、および著しいの標準のスキームを使用した。全くなしおよびわずかを、その後「なし」カテゴリーに群分けし、中程度および著しいを「あり」カテゴリーに群分けした。溶血を伴う胎児分率について有意差はなかった（なし、およびありについて、それぞれ、平均＝１３．２％および１３．６％、ｔ＝−０．４６、ｐ＝０．６４）。ダウン症候群妊娠については、溶血を伴うものについて差異はあったとしてもわずかであった（それぞれ平均＝１５．４％および１５．０％、ｔ＝０．１４、ｐ＝０．８９）。
地理的地域によって層別化された（左から右に、１３．９％、１３．１％、１２．８％および１３．４％の平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．９３、ｐ＝０．１２）またはダウン症候群妊娠の中で（左から右に１７．４％、１５．０％、１４．５％および１５．９％の平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．４５、ｐ＝０．２３）、パーセント胎児分率（正倍数性妊娠）に有意な関係はなかった。
診断検査の徴候によって層別化された（左から右に１３．０％、１３．２％、１３．４％、１２．７％、１３．１％、１４．１％、１５．６％、および１３．３％の平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．６１、ｐ＝０．７５）、またはダウン症候群妊娠の中で、（左から右に１４．９％、１５．０％、１５．６％、１５．３％、１４．８％、ＮＡ、１３．０％、および１５．７％の平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．１１、ｐ＝０．９９）パーセント胎児分率について有意な関連はなく、再度関連は示されなかった。
少なくとも５０の試料を用いた、登録場所によって層別化されたパーセント胎児分率については有意差があり（１０．２％〜１８．７％にわたる平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝５．５９、ｐ＜０．０００１）、ダウン症候群妊娠の中での同じ分析については有意差がない（１２．７％〜１６．９％にわたる平均胎児分率、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．３５、ｐ＝０．９７）。最も高い胎児分率を有する５つの登録場所におけるアベレージ体重は１５１ポンドであり、それと比較して、より低い胎児分率を有する６つの場所では１５０ポンドであったので、これは、母体の体重が異なることでは説明されない（図Ｂ８参照）。
図１：ｘ軸は、試料の抜き取り時の妊娠期間を示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、妊娠期間による胎児分率を示す。線形回帰によって有意な関係は見いだされなかった（太い破線、ｐ＝０．２３、傾き＝−０．００２４）。ダウン症候群妊娠の分析（下のパネル）では同様の結果が見いだされた、（ｐ＝０．１０、傾き＝０．００８４）。
図２：ｘ軸は、推定分娩日における母体の年齢を示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、母体の年齢による胎児分率を示す。線形回帰によって有意な関係は見いだされなかった（太い破線、ｐ＝０．２３、傾き＝−０．００１３）。ダウン症候群妊娠の分析（下のパネル）では同様の結果が見いだされた（ｐ＝０．２６、傾き＝−０．００３１）。
図３：ｘ軸は、試料の抜き取り時の母体の体重をポンド単位で示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、正倍数性妊娠からの、母体の体重による胎児分率を示す。線形回帰によって有意な関係が見いだされた（太い破線、薄い破線で示されている９５％予測限界を伴う、ｐ＜０．０００１、傾き＝−０．００２６）。ダウン症候群妊娠について同様の結果（下のパネル）が見いだされた（ｐ＝０．０００２、傾き＝−０．００１７）。例として正倍数性の結果を使用して、体重が１００ポンド、１５０ポンド、２００ポンド、２５０ポンドおよび３００ポンドの女性は、それぞれ１７．８％、１３．２％、９．８％、７．３％および５．４％のアベレージ胎児分率を有することが予測される。
膣からの出血が報告された女性（正倍数性妊娠）について、わずかであるが有意な胎児分率の減少があった（なしおよびありについて、それぞれ平均＝１３．３％および１２．３％、ｔ＝２．０４、ｐ＝０．０４）。ダウン症候群妊娠の中での同じ分析については、出血が報告された女性について有意な増加があった（それぞれ平均＝１４．７％および１７．６％、ｔ＝−２．０７、ｐ＝０．０４）。
男の正倍数性胎児と女の正倍数性胎児の間で（それぞれ平均１３．４％および１２．９％、ｔ＝１．６８、ｐ＝０．０９４）、またはダウン症候群妊娠の中で（平均＝１５．２％および１５．３％、それぞれ、ｔ＝−０．０５、ｐ＝０．９６）、胎児分率に差はなかった。
ダウン症候群妊娠では正倍数性妊娠よりも胎児分率が高く、これは統計的に有意であった（平均１５．２％対１３．２％、ｔ＝−４．１１、ｐ＜０．０００１）。これをダウン症候群についてのスクリーニング検査として用いる場合、５％および１０％の偽陽性率で、対応する検出率は、それぞれ９．０％および１７．５％になる。これらは、約１．８の累積オッズ比に対応する。
胎児分率の共変量分析により、母体の体重が遺伝的変異の決定における有意な因子であることが明らかになった。アベレージ体重１００ポンドおよび２５０ポンドでは、予測される胎児分率は、それぞれ１７．８％および７．３％である。母体の体重の影響により、母体の人種および民族性に対して、胎児分率について見いだされた小さいが有意な影響を説明することができる。試料の抜き取りから冷凍装置での保管までの時間も、胎児分率に有意に影響を及ぼし、時間が長いことにより、胎児分率がわずかに低くなる。しかし、試料の抜き取りから冷凍装置での保管までについて見られる影響は、母体の体重についてよりも実質的に小さい。残りの関連は、一般に、小さく、大抵は有意ではない。
図４〜図６においてグラフで示されているデータには、第２１染色体表示（例えば、パーセント第２１染色体）とアッセイの変動性の間の関係が要約されている。患者４人由来の試料は、一般に、単一のフローセルレーンにおいて４プレックスにした（例えば、８レーンは３２の患者と等しい）。しかし、大抵は、３０の患者試料についてのみ実行し、追加的な位置保持対照を伴った。９２の患者について９６ウェルプレートで一緒に処理した。各プレートについて３つのフローセルで実行した（例えば、レーンごとに４プレックスおよび４指標プライマーを使用する場合、１つの試料プレートについて３つのフローセルで実行した）。一般に、７つのデータのプレートを一緒に群分けしてバッチを形成した。各バッチは、順不同で配分された試料を含有した。したがって、バッチ内の症例および対照は必ずしも同じ試料プレートまたはフローセルで実行されなかった。症例および対照を一緒に実行することは、時には、マッチさせた分析における総分散の推定の下であり得る。２１２例のダウン症候群全て、および１，４８４例のうち１３例を除く全ての正倍数性の結果が図４〜図６に示されている。試料が、最初は失敗したが、第２の結果は上首尾であった場合は、第２の結果が示されている。反復試料において使用できる結果を生じさせることができなかった試料は示されていない。試験された妊娠の全てについて試料採取時に生育可能であり、また、全てが、診断検査結果（例えば、核型分析）が入手可能な単胎児妊娠であることが検証された。
図４は、フローセルによるＣ２１％の結果を示す。第２１染色体のマッチした読み取りの百分率を常染色体の読み取りの総数で割ったものを、正倍数性（小さな丸）およびダウン症候群（より大きな丸）についてフローセル数（ｘ軸）によってプロットした。各フローセルでは３２の試料（４プレックスで）検査することができ、それにより、２８〜３０の患者試料が対照試料と一緒にもたらされる（各フローセルにおいて実行した患者試料が全てこの報告に含まれるとは限らない）。一般に、それぞれについて、２０〜２５例の正倍数性妊娠および２〜７例のダウン症候群妊娠が示されている。いくつかの場合には（例えば、反復を伴うフローセル）、数ははるかに小さい。全体的に、７６のフローセルが、追加的な一定分量の検査を含めた本試験と関連性のあるデータを含有した。フローセルに連続して番号を付し、欠けているフローセルは独立した研究所での検査を含めた他の試験のために使用した。平均レベルでのフローセル間の変化を見ることができる。また、初期フローセルでは正倍数性の平均１．３５５％を上回る明白な傾向があるが、後期のフローセルでは低くなる傾向がある。フローセルの中で、正倍数性の結果の標準偏差に差異は存在しない。基準線を、正倍数性試料についての全体的なアベレージ胎児分率である１．３５５％で引いた。平均レベルでのフローセル間の変動性を見ることができるが（ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝４．９３、ｐ＜０．００１）、標準偏差は一定である（Ｆ＝１．１、ｐ＝０．３１）。
図５は、図４と同じデータを含有するが、データがフローセルではなくプレートによって層別化されている。処理を９６ウェルプレートで実施する。次いで、１つのプレートからの処理された試料について、３つのフローセルで実行する。基準線は１．３５５％にある。平均レベルでのプレート間の変動性を見ることができるが（ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝１３．５、ｐ＜０．００１）、標準偏差は一定である（Ｆ＝１．２、ｐ＝０．２３）。この図において、図４で明らかになったものと同じ傾向を見ることができる。全体的な分散の減少は、プレート間の差異を考慮した場合、フローセル間と比較していくらか少ない。しかし、プレートの差異を考慮すると、フローセルの差異について有意な影響はない。図４において見られるように、プレートの中で正倍数性の結果の標準偏差に差異は存在しない。
図６は、図４および図５と同じデータを含有するが、データが配列決定するために使用したＩｌｌｕｍｉｎａ計器に応じて層別化されている。４２および３４のプレートをそれぞれ２番および３番で処理した。基準線は１．３５５％にある。正倍数性（それぞれ平均１．３５５および１．３５４、ｔ＝２．０、ｐ＝０．１６）またはダウン症候群妊娠（それぞれ平均１．４３６および１．４３８、ｔ＝０．３２、ｐ＝０．５７）において、計器による第２１染色体のパーセントに差異は存在しない。２つの機械によりもたらされたＣ２１％に系統的な差異は存在しない。
２１２例のダウン症候群の結果全ておよび１，４８４例のうち１３例を除く正倍数性の結果の全てについての１５の潜在的な共変量が、臨床的に報告された第２１染色体のｚスコアに対して要約されている。試験された妊娠の全てについて試料採取時に生育可能であり、また、全てが、診断検査結果（例えば、核型分析）が入手可能な単胎児妊娠であることが検証された。１つのダウン症候群の試料のｚスコアが２５をわずかに超えたが、２４．９にプロットした。正倍数性試料の範囲は−３から＋３の間である。症例の中で、カットオフレベル３を使用した。ｚスコアの分布は、症例では右側に歪んでいるが、対照ではガウス分布である。しかし、それでもデータを線形尺度でプロットした。症例における回帰分析は対数変換後に行った。
検査のために選択された全ての試料を採取してから６時間以内に処理し、冷凍装置に保管した。試料の抜き取りから冷凍装置での保管までの時間による第２１染色体のｚスコアについては、正倍数性妊娠またはダウン症候群妊娠のいずれについても、線形回帰によって有意な関係は見いだされなかった（それぞれｐ＝０．９０、傾き＝−０．００２５；およびｐ＝０．５０、傾き＝−０．２０）。
溶血の状態を、凍結する前に登録場所で評価した。いずれの群についても溶血の状態によって層別化した後のｚスコアに有意差はなかった（正倍数性妊娠およびダウン症候群妊娠について、それぞれｔ＝−０．０１、ｐ＝０．９９およびｔ＝−０．１２、ｐ＝０．９０）。
地理的地域によって層別化されたｚスコアについて、正倍数性妊娠について（左から右に、平均ｚスコア−０．２２、−０．１４、−０．１２および−０．０１、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．８４、ｐ＝０．１４）またはダウン症候群妊娠の中で（左から右に、平均ｚスコア１０．１、９．９、８．９および１０．２、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．００、ｐ＝０．３９）有意な関係はなかった。
診断検査の徴候によって層別化されたｚスコアについて、正倍数性妊娠についてはわずかだが有意な影響があったが（左から右に、平均ｚスコア−０．１５、−０．１４、−０．２４、−０．０５、−０．１１、０．２０、−０．５２および−０．２０、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝２．０２、ｐ＝０．０４９）ダウン症候群妊娠については有意な影響はなかった（左から右に、平均ｚスコア８．９、９．１、９．７、９．８、１０．０、ｎ／ａ、１０．７および９．５、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．２５、ｐ＝０．９６）。
少なくとも５０の試料を用いた、１つまたは複数の登録場所によって層別化されたｚスコアについては、正倍数性妊娠（−０．２１〜０．０２にわたる平均ｚスコア、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．５７、ｐ＝０．８４）またはダウン症候群妊娠（６．９０〜１２．３４にわたる平均ｚスコア、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．４５、ｐ＝０．１６）について影響はない。
図７：ｘ軸は、試料の抜き取り時の妊娠期間を示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、妊娠期間によるｚスコアを示す。線形回帰によって有意な関係は見いだされなかった（ｐ＝０．７９、傾き＝０．００２３）。ダウン症候群妊娠（下のパネル参照）では、妊娠期間との有意な正の関連が見いだされた（ｐ＝０．００２３、傾き＝０．０１７、ｚスコアの対数で）。
図８：ｘ軸は、推定分娩日における母体の年齢を示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、母体の年齢によるｚスコアを示す。線形回帰によって有意な関係は見いだされなかった（太い破線、ｐ＝０．６２、傾き＝−０．００２３。ダウン症候群妊娠の分析（下のパネル）では同様の結果が見いだされた（ｐ＝０．１４、傾き＝−０．００４６）。
図９：ｘ軸は、試料の抜き取り時の母体の体重をポンド単位で示す。上のパネル（正倍数性妊娠）は、正倍数性妊娠についての試料についての母体の体重によるｚスコアを示す。線形回帰によって、有意な負の傾きが見いだされた（太い破線、薄い破線によって示されている９５％予測限界を伴う、ｐ＝０．０２９、傾き＝−０．００１６）。ダウン症候群妊娠について、同様であるが、はるかに大きな影響が見られた（下のパネル、ｐ＝０．０００３、傾き＝−０．０３８）。この後者の影響は、おそらく胎児分率に対する母体の体重の影響に起因する（図１１を参照されたい）。
正倍数性妊娠については、報告された膣からの出血の状態によるｚスコアに有意差はなかった（なしおよびありについて、それぞれ平均＝−０．１４および−０．０９、ｔ＝−０．６５、ｐ＝０．５２）。ダウン症候群妊娠の中での同じ分析については、出血が報告された女性について有意な増加があった（それぞれ平均＝９．０３および１１．７０、ｔ＝−３．１４、ｐ＝０．００１９）。
母体の人種によって層別化されたｚスコアについて、正倍数性妊娠について（左から右に平均ｚスコア−０．１４、−０．１５、０．２８および−０．２１；ＡＮＯＶＡ Ｆ＝２．４４、ｐ＝０．０６３）またはダウン症候群妊娠について（左から右に平均ｚスコア９．５５、８．９０、９．６３および１０．２４、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．１２、ｐ＝０．９５）有意な影響はない。
白人民族性によって層別化されたｚスコアについて、正倍数性妊娠について（左から右に平均ｚスコア−０．１６、−０．０６および０．００、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝１．７０、ｐ＝０．１８）またはダウン症候群妊娠について（左から右に平均ｚスコア９．５、９．４および１１．９、ＡＮＯＶＡ Ｆ＝０．３８、ｐ＝０．６８）有意な影響はない。
胎児の性別によって層別化されたｚスコアには、正倍数性妊娠について（それぞれ平均＝−０．１３および平均＝−０．１３、ｔ＝−０．０４、ｐ＝０．９７）またはダウン症候群妊娠について（それぞれ平均＝９．２５および平均＝９．８０、ｔ＝−０．８５、ｐ＝０．３９）、男と女との間に差異はない。
冷凍装置での保管時間によるｚスコアについて、正倍数性妊娠について（太い破線、ｐ＝０．７２、傾き＝０．００００５７）またはダウン症候群妊娠について（下のパネル、ｐ＝０．２５、傾き＝−０．００２２）、線形回帰によって有意な傾きは見いだされなかった。
図１０：上のパネル（正倍数性妊娠）は、ＤＮＡライブラリー濃度に対するｚスコアを示す。線形回帰により、統計的に有意な正の傾きが示されている（太い破線、薄い破線によって示されている９５％ 予測限界を伴う、ｐ＜０．０００１、傾き＝０．００３４）。ダウン症候群妊娠については、同様であるが有意ではない影響が見られる（下のパネル、ｐ＝０．８２、傾き＝０．００２４）。
数百万のマッチしたＤＮＡ配列によるｚスコアについての線形回帰では、正倍数性妊娠について（太い破線、ｐ＝０．４７、傾き＝０．００７２）およびダウン症候群妊娠について（下のパネル、ｐ＝０．９４、傾き＝０．００９９）、有意でない正の傾きが見いだされた。
胎児分率の共変量分析について記載の通り、第２１染色体のｚスコアの共変量分析により、母体の体重も遺伝的変異の決定における有意な因子であることが明らかになったが、見られる影響はダウン症候群妊娠の中でより大きかった。いくつかの場合には、妊娠期間も有意な正の関連を有する。しかし、妊娠期間と共にみられる影響は、母体の体重に関して見られる影響よりも有意に小さい。残りの関連は、一般に、小さく、大抵有意でない。
以下の表３には、ＭＰＳＳ検査によって最初に誤って分類された６つの試料に関する追加的な詳細な情報が提供される。３つの場合では、ダウン症候群と確認された被験体は、最初にダウン症候群を有さないと分類され（試料ＩＤ番号１６２、１６７および３７１）、３つの場合では、健康な子であると確認された被験体は、最初にダウン症候群に分類された。
大規模並列処理ショットガン配列決定のプロセス全体についてのフローセルによる日数単位の総ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）を分析した。処理されたフローセルの最初の３分の１について、総ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）は、我々の刊行物に記載の臨床サインアウトの前にアルゴリズムに行った改変に起因して、コンピュータ解釈時間が優位を占めた。臨床サインアウトのプロセスは経時的に改善された。２つのフローセル（試験の最初から最後までの約３分の２）は完全に再配列決定する必要があり、この結果、ＴＡＴが増加した。最後の２０フローセルの間、ＴＡＴは、１８について１０日標的の範囲内であった（９０％）。真の臨床的環境でのＴＡＴは、２つの潜在的な改善に基づいていくらかより良い可能性がある：本試験では、試料を週末にかけて処理せず、また、所与の日に専任の臨床医が常にサインアウトのために対応できたわけではなかった。試料の約５％について反復し、それにより、それらの試料についてはＴＡＴがおよそ倍になった。
正倍数性試料およびダウン症候群の試料の同定についての成功／失敗率により、ダウン症候群妊娠由来の２１２の試料の中で、解釈成功率（９２％）ならびに検査失敗の理由がもたらされた。これらの１７人の女性由来の新しい一定分量の反復検査により、試料の１００％が解釈成功を有した。１，４８４の検査された正倍数性妊娠について分析を反復した。合計１３の試料が、第２の一定分量を試験した後にも検査失敗とみなされた。全体的に、ＭＰＳＳの実施の成功率は９９．２％であり、最初の試料の５％で第２の一定分量が必要であった。
以下に示されている表４には、ＳＣＭＭおよびＵＣＬＡ研究所において試験された７９のダウン症候群試料および５２６の正倍数性試料についての最終的なＭＰＳＳによる解釈の比較に関する追加的な詳細な情報が提供される。６０５の試料についての混合ライブラリーがＳｅｑｕｅｎｏｍ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＳＣＭＭ）において調製され、検査され、凍結され、次いで、再検査のために、独立したＵＣＬＡ研究所に輸送された。ＳＣＭＭ（それぞれ９８．７％および０％）における検出率および偽陽性率は、有意ではないがわずかに、ＵＣＬＡにおける検出率および偽陽性率（それぞれ９７．５％および０．２％）よりも良かった。しかし、失敗率は、有意ではないがわずかに、ＵＣＬＡではＳＣＭＭに対して低かった（それぞれ、ダウン症候群において０％および２．５％；正倍数性妊娠において３．９％および４．４％）。
第２１染色体のパーセント表示スコアをＧＣ含量およびプレートに基づく実験条件について補正することの影響を分析した。ＧＣ補正により、正倍数性妊娠の中で高い（および低い）外れ値の存在が減少し、同時にデータの広がりが減少した。いかなる補正（ｘ軸）も伴わずに、１．３８％のカットオフにより、４つの偽陰性の結果および３つの偽陽性の結果がもたらされた。ＧＣ補正を用いると、４つの偽陰性の結果のうちの２つ、および３つの偽陽性の結果の全てが、同じ１．３８％のカットオフを使用して分解された。しかし、偽陰性の結果のうちの１つおよび新しい偽陽性の結果がカットオフライン上にかかった。残りの第４の偽陰性の解釈は変化しない。ＭｏＭを創出するためにプレート補正を加えることによって、３つの偽陽性の全て、および４つの偽陰性のうちの３つが、灰色の帯域の水平な四角形に入る任意のカットオフによって潜在的に分解された。
１，４７１の正倍数性の例および２１２のダウン症候群の症例について、ＧＣ含量およびフローセルの変動性について補正した第２１染色体のｚスコアを使用することにより、２つの偽陰性および３つの元の偽陽性がｚスコアカットオフ３（「オンライン」呼び出しアルゴリズムと等しい）を使用して分解された。しかし、新しい偽陽性が１つ生じた。
下に示されている表５では、この試験プロトコールおよび結果が、同じくダウン症候群についてスクリーニングするために母体の血漿の大規模並列処理配列決定を用いる以前公開された試験と比較されている。


（実施例３）
循環している無細胞ＤＮＡを利用した微小欠失の検出
出生前診断の分野は、母体の血漿から単離された循環している無細胞（ｃｃｆ）胎児ＤＮＡの分子キャラクタリゼーションを可能にする技法を実行することを通じて進歩してきた。次世代シークエンシング方法体系を使用して、染色体異常を検出することができることが示されている。２１トリソミーの検出は、分析的に、および大規模臨床試験においての両方で検証されている。１３トリソミーおよび１８トリソミー、性異数性、および他の稀な染色体異常に関する同様の検証がおそらく近い将来後に続くであろう。
ｃｃｆ胎児ＤＮＡを分析物として使用して未だ徹底的には対処されていない遺伝子異常（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｏｍａｌｙ）の一面は、染色体領域内での（ｓｕｂ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）コピー数多型（ＣＮＶ）である。原因不明の発達遅延／知的障害（ＤＤ／ＩＤ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または多数の先天性異常（ｃｏｎｇｅｎｔｉｔａｌ ａｎｏｍａｌｙ）（ＭＣＡ）の個体のおよそ１２％で、臨床的に関連性のあるＣＮＶが診断されている。
そのような臨床的に関連性のある状態の１つの例は、ディジョージ症候群、口蓋心臓顔面症候群、および円錐動脈幹異常顔貌症候群を含めた多数の状態で構成される障害である２２ｑ１１．２欠失症候群である。これらの状態の正確な顕在化はわずかに変動するが、それぞれが、相同組換えを可能にする反復エレメントが存在することに起因して重複および微小欠失がどちらも高レベルである傾向があることが示されている第２２染色体上の約３百万塩基対（ｂｐ）の遺伝子リッチ領域のヘテロ接合性欠失に関連付けられている。染色体２２ｑ１１．２欠失症候群は、およそ４０００件に１件の生児出生に影響を及ぼし、また、頻繁な心臓欠陥、口蓋裂、発達遅延、および学習障害を特徴とする。
本明細書には、母体の血漿由来のｃｃｆ ＤＮＡの配列決定によって染色体領域内でのＣＮＶを検出することの技術的な実現性を決定するために実施された調査の結果が記載されている。核型分析によって２２ｑ１１．２欠失症候群の影響を受けることが確認された、それぞれ胎児を有する２人の女性由来の母体の血漿、および対照として、胎児の異数性のリスクが低い１４人の女性由来の母体の血漿を検査した。各試料由来のｃｃｆ ＤＮＡについて、ＨｉＳｅｑ２０００計器において２つの個々のレーンを使用して配列決定し、その結果、およそ４×ゲノムのカバレッジがもたらされた。２つの検証された症例における既知の影響を受けた領域に対応する第２２染色体上の３百万ｂｐの領域の表示の、対照と比較して統計的に有意な減少が検出され、これにより、母体の血漿由来のｃｃｆ ＤＮＡの配列決定によって染色体領域内でのＣＮＶを検出することの技術的な実現性が確認されている。
材料および方法
試料の獲得
２つの別々の治験審査委員会（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ）に認可された臨床試験実施計画書（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ＩＤ ２００９１３９６およびＣｏｍｐａｓｓ ＩＲＢ ００４６２）の下で試料を採取した。侵襲的手段の前に、２つの影響を受けた血液試料を採取した。これらの試料に２２ｑ１１．２微小欠失が存在することを、非経胎盤羊水穿刺によって得られた材料に対する核型分析によって確認した。１４の対照試料を、その後の侵襲的手順を伴わずに採取し、したがって、対照試料については核型情報が利用不可能であった。全ての被験体は、ＥＤＴＡ−Ｋ２噴霧乾燥１０ｍＬバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に全血３０〜５０ｍＬを採取するための静脈穿刺を含めた試験に関連するいずれの手順も書面のインフォームドコンセントをもたらされた後に受けた。試料を、処理するまで冷蔵した、または湿った氷上で保管した。採血の６時間以内に、母体の全血をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒプラススイングローターを使用して４℃、２５００ｇで１０分遠心分離し、血漿を採取した（例えば、約４ｍＬ）。血漿について、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒプラス固定角ローターを使用して、４℃、１５，０００ｇで１０分、２回目の遠心分離を行った。２回目の回転後、血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、４ｍＬの血漿バーコード一定分量に分配し、すぐに−８０℃で凍結して ＤＮＡ抽出まで保管した。
核酸抽出
ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従って使用して、ｃｃｆＤＮＡを母体の血漿から抽出し、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＶＥ（Ｑｉａｇｅｎ）５５μＬ中に溶出させた。
胎児定量器アッセイ
ｃｃｆＤＮＡの相対的な品質および量を、当技術分野で公知の方法に従って胎児定量器アッセイ（ＦＱＡ）によって評価した。ＦＱＡでは、母体のｃｃｆＤＮＡおよび胎児のｃｃｆＤＮＡの間のＤＮＡのメチル化の差異を、定量するための基礎として用いる。１６の分析された試料のそれぞれに対して、これによりその全体が参照により組み込まれるＥｈｒｉｃｈらおよびＰａｌｏｍａｋｉら（Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．（２０１１年）１３巻（１１号）：９１３〜２０頁およびＧｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２年）１４巻：２９６〜３０５頁）において以前に記載されている通りＦＱＡ分析を実施した。
配列決定ライブラリー調製
ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）用の推奨される製造者のプロトコールの改変バージョンを使用してライブラリーを創出した。抽出されたｃｃｆＤＮＡ（例えば、約４０μＬ）をライブラリー調製用の鋳型として使用した。全てのライブラリーを、液体ハンドリング装置使用（ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｚｅｐｈｙｒ；Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、末端修復、ライゲーション、およびＰＣＲ生化学的プロセスの後に磁気ビーズに基づく（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）浄化ステップを伴う半自動化プロセスを用いて創出した。ｃｃｆＤＮＡは、母体の血漿中に小さな範囲内の断片サイズで存在することがよく特徴付けられているので、抽出されたｃｃｆＤＮＡまたは調製されたライブラリーのいずれに対してもサイズ選択は実施しなかった。各ライブラリーのサイズ分布および量を、キャピラリー電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ；Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて測定し、各ライブラリーを約２ｎＭの標準濃度に対して正規化した後に、ＣＢｏｔ計器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してクラスタリングした。各試料を、ＨｉＳｅｑ２０００ｖ３フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の２つのレーンを使用した合成による配列決定３６サイクルに供した。
データ解析
配列決定データの解析を、これによりその全体が参照により組み込まれるＰａｌｏｍａｋｉら（Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．（２０１１年）１３巻（１１号）：９１３〜２０頁およびＧｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２年）１４巻：２９６〜３０５頁）に記載の通り実施した。簡単に述べると、ＨｉＳｅｑ２０００計器からの全てのアウトプットファイル（例えば、．ｂｃｌ ｆｉｌｅｓ）をｆａｓｔｑ形式に変換し、２００９年２月に築かれたヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してＣＡＳＡＶＡ ｖ１．７（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してアラインメントした。その後の算出に対する反復配列の影響を最小限にするために、アラインメントした後、Ｒｅｐｅａｔ Ｌｉｂｒａｒｙ２００９０６０４（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌｏｃａｔｏｒ（ＵＲＬ）ワールドワイドウェブｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）に含有される情報に基づいてゲノムの反復性の領域とオーバーラップしている読み取りを全て除去した。解析のために、各染色体を別個の５０ｋｂのビンに分け、これらのビンのそれぞれにマッピングされた読み取りの数を合計した。その後の算出に対するＧ／Ｃ含量の偏りの影響を最小限にするために、各ビン内の読み取りを当技術分野で公知のＬＯＥＳＳ法を使用してビンに特異的なＧＣ含量に関して正規化した。次いで、ビンによる反復マスキングされ、ＧＣについて正規化された読み取りカウントを、統計的有意性およびカバレッジを算出するために使用する。
目的の領域にマッピングされたアラインメントされた常染色体の読み取りの総数の分率について、アラインメントされた常染色体の読み取りの総数と比較してｚスコアを算出することによって統計的有意性を決定した。ロバストな方法を使用してＺスコアを算出し、それにより、式Ｚ試料＝（分率試料−分率中央値母集団）／中央絶対偏差母集団を使用することによって所与の試料についてのｚスコアを算出した。式、カバレッジ＝ＬＮ／Ｇ（式中、Ｌは読み取り長（３６ｂｐ）であり、Ｎは反復マスキングされ、ＧＣについて正規化された読み取りの数である、Ｇは反復マスキングされた一倍体ゲノムのサイズである）によってカバレッジを算出した。
結果
妊婦１６人の血漿から単離されたｃｃｆ ＤＮＡに対して次世代シークエンシングを実施した。１６人のうちの２人については、羊水穿刺後の核型分析により、染色体２２ｑ１１．２欠失症候群の影響を受けた胎児を有することが確認された。１４の対照試料の胎児の核型情報は入手不可能であった。影響を受けた試料２つから、対照試料と比較して同様の妊娠期間（１９週および２０週）に血漿を採取した（中央値＝２０週間；下の表６参照）。配列決定の前に、総ｃｃｆＤＮＡに対する胎児の寄与を当技術分野で公知の通り測定した。全ての試料が１０％超の胎児ＤＮＡを含有し、寄与の中央値は１８％であり、胎児の微小欠失を有する２つの試料は１７％および１８％の胎児ＤＮＡを含有した（下の表６参照）。


各試料について、ＨｉＳｅｑ２０００フローセルの２つのレーンを使用して配列決定し、約３．１×から約４．４×の間のゲノムのカバレッジがもたらされた（上の表６参照）。５０ｋｂのビンサイズを使用して読み取りをビンに入れ、影響を受けた微小欠失試料について第２２染色体にわたってビンを可視化して、影響を受けた試料について微小欠失の位置を同定した。確認された２２ｑ１１．２微小欠失を保有する試料はどちらも、このゲノムの領域の表示の減少を示した（図４７を参照されたい）。各試料について、第２２染色体上の影響を受けた領域について、全ての試料の中央値と比較してＺスコアを算出した。リスクが低い女性由来の血漿に対応する値は黒色で示されており、既知の２２ｑ１１．２欠失症候群の症例を示す値は灰色で示されている。−３における破線は、分析された試料全てにわたるこの領域についての中央値表示よりも低い中央絶対偏差の３倍であるｚスコアを表し、胎児の異数性の検出において伝統的に使用される分類カットオフである。
ゲノムの欠失の正確な位置は、症例ごとにわずかに変動する可能性があるので、Ｃｈｒ２２：１９００００００から２２００００００の間に位置する３百万塩基対の領域を検査することを選択した（上の表６参照）。染色体異数性の検出に使用される方法と同様の方法を使用して、標的領域にマッピングされた全ての常染色体の読み取りの分率を算出した。対照試料は、２２ｑ１１に位置する読み取りの０．０７５％を含有したが、既知の胎児の微小欠失を伴う影響を受けた試料では、この領域における読み取りの０．０７３％を示しただけであった。この差異の統計的有意性を検定するために、各試料について、ロバストな方法を使用してｚスコアを算出した。影響を受けた試料はどちらも−３未満のｚスコアを示したが（例えば、それぞれ−５．４および−７．１）、全ての低リスク対照試料のｚスコアが−３よりも高かった（図４７を参照されたい）。低リスク試料のうちの１つは＋３よりも高いｚスコアを示した。２２ｑ１１のゲノム領域は、以前にゲノムの不安定性に関連付けられており、この結果により、起こることが以前報告された潜在的な重複が示される可能性があるが、低リスク試料については核型情報が入手不可能であったので、観察された結果が胎児のＣＮＶと関連付けられるかどうかは不明のままである。
考察
非侵襲的な出生前診断の分野における最近の進歩により、母体の血漿中に存在するｃｃｆＤＮＡについて配列決定することによって胎児の異数性を検出することが可能になった。異数性を検出するために使用するものと同様の手法を使用して、本明細書で示されている結果により、発達中の胎児における染色体領域内レベルのＣＮＶを、母体の血漿中の対応するｃｃｆＤＮＡについて配列決定することによって非侵襲的に検出することの実現性が確認される。少数の症例ではあるが、本明細書で示されているデータにより、単一の染色体よりも小さな領域、この場合は２２ｑ１１．２の欠失を母体の血漿から確実に検出することができることが示されている。Ｐｅｔｅｒｓら（２０１１年）により、同様の方法体系を使用して検出された第１２染色体の４．２Ｍｂの欠失が報告された。Ｐｅｔｅｒｓらは、妊娠期間の後期（３５週）に検出された胎児の微小欠失の単一の症例を検査し、それを、第１２染色体および第１４染色体について二倍体であることが分かっている７つの試料と比較した。対照的に、上記の試験が公開される前に得られた、より早い妊娠期間（１９週および２０週）において影響を受けた試料を検査したものである本明細書で示されている結果では、利用した影響を受けた試料および影響を受けていない試料の数が２倍であり、上記よりも２８％小さな（３Ｍｂ）微小欠失が検出された。さらに、本明細書で示されている結果では、４×ゲノムのカバレッジを利用して３Ｍｂの胎児の欠失が首尾よく検出されており、これは、現行の標準の異数性検出に対しておよそ２０倍のカバレッジの増加である。潜在的に０．５Ｍｂに至るまでのより小さな欠失、または含有する胎児のｃｃｆＤＮＡが少ない試料には、さらに高いカバレッジが必要になり得る。
（実施例４）
ライブラリー調製の自動化、多重化レベルの増加およびバイオインフォマティクス
臨床的な正確度を維持しながら、処理量を３倍に増加させ、実践時間を４分の１に低下させるプロセスの変化のセットの実行が以下に提供される。この改変アッセイの３つの主要な変化は、多重化レベルがより高くなったこと（４プレックスから１２プレックスへ）、配列決定ライブラリー調製が自動化されたこと、および新規のバイオインフォマティクス方法を実行することを含む。結果により、このプロトコールにより、２１トリソミー、１８トリソミーおよび１３トリソミーを検出するための高い感度および特異度を維持しながら、より多くの処理量に適したより簡易化されたワークフローがもたらされることが確認される。
材料および方法
試料の獲得および血液の処理
３つの別々の治験審査委員会（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ）に認可された臨床試験実施計画書（ＢｉｏＭｅｄ ＩＲＢ ３０１−０１、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＩＲＢ ２００９１３９６、およびＣｏｍｐａｓｓ ＩＲＢ ００４６２）の下で、ハイスループットなアッセイの最初の評価（ライブラリー調製の開発およびアッセイの検証）のための試料を採取した。全ての被験体は、ＥＤＴＡ−Ｋ２噴霧乾燥１０ｍＬバキュテナー（ＥＤＴＡチューブ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に最大２０ｍＬの全血、およびＣｅｌｌ−Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴ１０ｍＬバキュテナー（ＢＣＴチューブ；Ｓｔｒｅｃｋ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）中に３０ｍＬの全血を採取するための静脈穿刺を含めた試験に関連するいずれの手順も、書面のインフォームドコンセントをもたらされた後に受けた。ＥＤＴＡチューブ中に採取された試料を、冷蔵、または湿った氷上で保管し、採血の６時間以内に血漿を処理した。ＢＣＴチューブ中に採取された試料を外界温度で保管し、採血の７２時間以内に血漿を処理した。ＥＤＴＡチューブ中の母体の全血を遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒプラススイングローター）、２５００ｇで１０分冷却し（４℃）、血漿を採取した。ＥＤＴＡ血漿について、４℃、１５，５００ｇで１０分、２回目の遠心分離を行った（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒプラス固定角ローター）。２回目の回転後、ＥＤＴＡ血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、４ｍＬのバーコード付けした血漿一定分量に分配し、すぐに−７０℃以下で凍結してＤＮＡ抽出まで保管した。ＢＣＴチューブ中の母体の全血を遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒプラススイングローター）、１６００ｇで１５分温め（２５℃）、血漿を採取した。ＢＣＴ血漿について、２５℃、２，５００ｇで１０分、２回目の遠心分離を行った（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒプラススイングローター）。２回目の回転後、ＢＣＴ血漿をチューブの底に形成されたペレットから取り出し、４ｍＬのバーコード付けした血漿一定分量に分配し、すぐに凍結して−７０℃以下でＤＮＡ抽出まで保管した。
多重化展開および臨床評価のための試料を以前に記載されている通り採取した（Ｐａｌｏｍａｋｉ ＧＥら（２０１２年）Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｄ． １４巻：２９６〜３０５頁、およびＰａｌｏｍａｋｉ ＧＥら（２０１１年））。簡単に述べると、登録された患者から、侵襲的手段の前に全血を採取した。全ての試料を、妊娠第１三半期または妊娠第２三半期において胎児の異数性のリスクが増加している妊婦から、国際共同研究（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ００８７７２９２）の一部として採取した。２７か所の採取場所のそれぞれにおいて、この共同研究についてＩＲＢによる認可（または同等のもの）を得た。本発明で４プレックス形式で生成し、使用したいくつかのデータは、本明細書で以前に示されているが、１２プレックス配列決定からの全てのデータは、それぞれ独立に１２プレックス形式で今回配列決定した同じライブラリーを使用して生成した。さらに、ハイスループットな方法を独立して確認するために、患者１２６９人のそれぞれ由来の血漿一定分量を処理した。これらの患者のそれぞれが、以前に公開された試験に対する別個の血漿一定分量に寄与し、胎児の核型は既知であった。単純な２１トリソミー、１８トリソミー、および１３トリソミーであることが確認された単胎児妊娠由来の試料または正倍数性の対照由来の試料のみを使用した。循環している無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を本明細書に記載の通り使用して母体の血漿から抽出した。各試料について、胎児定量器アッセイ（ＦＱＡ）によってｃｃｆ ＤＮＡの量を評価した。抽出されたｃｃｆ ＤＮＡ（４０μＬ）を全てのライブラリー調製用の鋳型として使用した。最初に増加させた（１２プレックス）マルチプレックス実験についてのライブラリーを、上記の方法を使用して調製した。簡単に述べると、ｃｃｆ ＤＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、酵素（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、および各酵素反応の間にカラムに基づく方法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した手動の精製プロセスを使用して配列決定ライブラリーを調製した。この試験において使用した、新しく創出されたライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）についての製造者のプロトコールの改変バージョンならびに液体ハンドリング装置使用（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｚｅｐｈｙｒ；Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を利用し、末端修復、ライゲーション、およびＰＣＲ生化学的プロセス後に磁気ビーズに基づく（ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）浄化ステップを伴う半自動化プロセスを使用して、９６ウェルプレート形式で創出した。ｃｃｆ ＤＮＡは、母体の血漿中に小さな範囲内の断片サイズで存在することがよく特徴付けられているので、抽出されたｃｃｆ ＤＮＡまたは調製されたライブラリーのいずれにおいてもサイズ選択は実施しなかった。ライブラリーのサイズ分布および定量の評価を、本明細書において以前に記載されている通り実施した。１２イソモル（ｉｓｏｍｏｌａｒ）の配列決定ライブラリーをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００においてＩｌｌｕｍｉｎａ ｖ３つのフローセルの同じレーンで一緒に配列決定した（１２プレックス）。合成による配列決定を３６サイクル実施し、その後、７サイクルを実施して、各試料指標を読み取った。プールされた、２１トリソミーと診断された成人男性ボランティア２人または妊娠していない正倍数性の女性２人の血漿から単離されたｃｃｆ ＤＮＡから配列決定ライブラリーを調製した。ライブラリーを定量し、母体の血漿中のｃｃｆ胎児ＤＮＡのおおよその寄与に対して２つの濃度（２１トリソミー４％および２１トリソミー１３％）で混合した。これらの対照を臨床評価試験に組み込む前にライブラリー性能を検査した。
データ解析
ＨｉＳｅｑ２０００からのＢＣＬ（塩基呼び出し）アウトプットファイルの全てを、ＦＡＳＴＱ形式に変換し、２００９年２月に築かれたヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してアラインメントした。マルチプレックス展開のためのライブラリーを以前のバージョンの生化学を用いて手動で調製したので、分析方法を以前に記載されている通り適用した（Ｐａｌｏｍａｋｉら、２０１２年および本明細書）。その後の試験の全てについて、Ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ、Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ（２０１２年）Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ９巻：３５７〜３５９頁）を使用して読み取りをｈｇ１９に対してアラインメントし、シード配列内の完全な一致のみを可能にした。解析のために、近接する、オーバーラップしていない５０ｋｂｐ長のゲノムのセグメントを含む標準のヒストグラムを使用して各染色体にマッピングされた読み取りを定量した。ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）後、含まれた５０ｋｂｐのゲノムのセグメントの選択を、以前に記載されている交差検証方法（Ｂｒｕｎｇｅｒ ＡＴ（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ ３５５巻：４７２〜４７５頁）を使用して決定した。高い試料間の分散、低いマッピング可能性（Ｄｅｒｒｉｅｎ Ｔら（２０１２年）ＰＬｏＳ ｏｎｅ ７：ｅ３０３７７頁）、または高い反復エレメントの百分率（Ｒｅｐｅａｔ Ｌｉｂｒａｒｙ ２００９０６０４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ）を示すことに基づいて領域をさらなる解析から排除した。最後に、残りの５０ｋｂｐのゲノムのセグメントに対応するアラインメントされた読み取りを正規化してＧＣの偏りを考慮に入れ（Ａｌｋａｎ Ｃら（２００９年）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４１巻：１０６１〜１０６７頁）、各染色体に由来するアラインメントされた読み取りの分率を算出するために使用した。ロバストなｚスコアを、記載の通り、式、Ｚ染色体＝（染色体分率試料−染色体分率フローセル中央値）／絶対偏差中央値を使用して算出した。染色体分率中央値は、各フローセルに特異的に算出され、中央絶対偏差（ＭＡＤ）は静的ＭＡＤに由来する定数値であった。
結果
非侵襲的に胎児の異数性を検出するためのＭＰＳＳを使用したいくつかの臨床試験により、９２〜１００％の範囲の検出率が示され、同時に偽陽性率が１％未満に維持された。我々の目標は、プロトコールを合理化し、試料の処理量を増加させながら、この性能を維持または改善することであった。改善は、３つの態様に焦点を合わせた：Ｉ）ロバストな収率が可能になり、処理量が増加するようにライブラリー調製を最適化すること、ＩＩ）単一のフローセルレーンに一緒にプールされる個別に分子的に指標された試料の数を増加させること（マルチプレックスレベル）、およびＩＩＩ）異数性を分類するための分析的方法を改善すること。
従来の配列決定ライブラリー調製は、労働集約的であり、時間がかかり、また、オペレーター間で変動しやすい。これらの問題を緩和するために、９６チャネル液体取扱いプラットフォームを利用する半自動化プロセスを開発した。ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製生化学を、ＴｒｕＳｅｑライブラリー調製キットに対して推奨されるインプット量である１μｇの５０分の１である、存在量が少ないｃｃｆ ＤＮＡ（１０〜２０ｎｇ）を血漿４ｍＬから回収するために最適化した。さらに、手動の精製手順を、スピード、再現性およびｃｃｆ ＤＮＡ回収について最適化された自動化ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製プロセスと交換した。この方法を使用して調製した２８７ライブラリーのセットと、記載されている（本明細書およびＰａｌｏｍａｋｉら２０１１年およびＰａｌｏｍａｋｉら２０１２年）手動の方法を使用して作製したライブラリーを比較することにより、溶出液の体積について標準化した後、ライブラリー濃度中央値が１２４ｎＭから２２５ｎＭに増加することが明らかになった（図１１Ａ）。組み合わせた半自動化プロセスにより、５時間で９６ライブラリーが作製され、単一の技師および１．５時間の実践労働時間のみが必要である。これにより、ライブラリー収率または品質を犠牲にすることなく処理量が４倍に増加したと同時に、労力が４分の１に減少した。９３のライブラリー（８３の確認された正倍数性試料および１０の確認された２１トリソミー試料；表７）を、この方法を使用して調製し、配列決定し、分析し、この小さなデータセットにおいて正確な分類性能が実証された（図１１Ｂ；表８）。
以前の試験の間に４プレックスで調製し、配列決定したライブラリーについて、１２プレックスで配列決定して、多重化の増加の実現性を決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｖ３つのフローセルおよび配列決定生化学をＨＣＳソフトウェアの改善と組み合わせることにより、１レーン当たりの読み取りカウントの総数が２．２３倍増加した（７，２００万から１億６，１００万）。１６２９の正倍数性試料、２０５の２１トリソミー試料、５４の１８トリソミー試料、および１２の１３トリソミー試料（表７）を含めた１９００ライブラリーを１２プレックスで配列決定し、分析し、第２１染色体、第１８染色体、および第１３染色体についてのｚスコアを４プレックスの結果と比較した（図１２）。以前の試験により、ｚスコアカットオフの上昇を使用したアッセイの性能の増加が示されているので、第１８染色体および第１３染色体染色体について分類はｚ＝３．９５に基づいた。第２１染色体についての分類は、ｚ＝３のままであった。これらの分類カットオフを使用して、４プレックス配列決定と１２プレックス配列決定の間で合計７つの分類結果が一致しなかった。第２１染色体について、以前誤って分類された（１つが偽陽性、１つが偽陰性）２つの試料は正確に分類されたが、以前示された真陽性は検出されなかった。第１８染色体について４つの試料が偽陽性試料と誤って分類されたが、これらは、以前は正確に分類されていた；これらのライブラリーのそれぞれはＧＣの偏りが高度であった。１３トリソミーの分類については全ての試料が合致した。１２プレックスで配列決定した場合、異数性試料の９９．３％（２０４／２０５の２１トリソミー、５４／５４の１８トリソミー、および１１／１２の１３トリソミー）が、２１トリソミー、１８トリソミー、および１３トリソミーについて、それぞれ０％（０／１９００）、０．２６％（５／１９００）、および０．１６％（３／１９００）の偽陽性率で検出された（表８）。全体的に、これらのデータにより、１２プレックス多重化で遂行した場合のアッセイの性能が以前得られた結果と同様であることが示唆される。
最適化されたライブラリー調製方法を１２プレックス配列決定（ハイスループットなアッセイ設定）と組み合わせて使用して検証試験を実施して、プロセスの完全性を確実にした。合計２８５６試料からの配列決定の結果のうち、核型が分かっている１２６９を解析した。これらの１２６９の臨床的な試料は、１０９３の正倍数性試料、１３４の２１トリソミー試料、３６の１８トリソミー試料、および６の １３トリソミー試料で構成された（表７）。試料についての胎児ＤＮＡ分率中央値は０．１４（範囲：０．０４〜０．４６）であった。ライブラリーのライブラリー濃度中央値は２８．２１ｎＭ（範囲：７．５３〜４２．１９ｎＭ）であり、これにより、本明細書に記載の他の方法と同様の総収率がもたらされた。最後に、試料１つ当たりのアラインメントされた常染色体の読み取りの数の中央値は１６，２９１，３９０（範囲：８，８２５，８８６〜３５，２５９，５６３）であった。
胎児の核型が分かっている１２６９の試料から生成されたデータと、以前配列決定された同じ被験体由来の別個の血漿一定分量の最初の比較により、ＧＣ含量について正規化し、反復領域とオーバーラップしている読み取りを除去する、以前確立された方法（例えば、ＧＣＲＭ）を用いて分析した場合、差別的な距離（正倍数性試料の９５パーセンタイルと２１トリソミー試料の５パーセンタイルとの間の差異）が４．９から３．０９に減少することが明らかになった。この影響を減らし、同時に全体的な分析時間を減少させるために、ハイスループットなアッセイデータに特異的な新規のバイオインフォマティクスのアルゴリズムを開発した。これらの方法は、個体にわたって安定な表示を有する５０ｋｂｐのゲノムのセグメントのみを分類するための算出に基づく。同じハイスループットなデータセットに適用する場合、正倍数性試料と２１トリソミー試料との間の差別的な距離は６．４９に増加する。全体的に、新規のバイオインフォマティクス手法により、以前に記載された方法と比較して、正倍数性試料と２１トリソミー試料との間の差別的な距離が増加する。
６７の対照試料および１２６９の患者試料についてのハイスループットなアッセイからの結果を、新規の解析方法を使用して解析した。プールされた正倍数性血漿（０％Ｔ２１ライブラリー）から調製した３３のライブラリー、４％の２１トリソミーＤＮＡを含有する１７の対照ライブラリー、および１３％の２１トリソミーＤＮＡを含有する１７の対照ライブラリーについて配列決定した。全ての場合において、プールされた正倍数性試料のｚスコアは３未満であったが、４％および１３％２１トリソミー対照試料のｚスコアは、３を超えた。次いで、核型情報が分かっている１２６９の患者試料の分類の正確度を比較した。上記の分類限界に基づいて（第２１染色体についてはｚスコア＝３、第１８染色体および第１３染色体についてはｚスコア＝３．９５）、確認された胎児の異数性（１３４の２１トリソミー、３６の１８トリソミー、６の１３トリソミー）の全てが、２１トリソミー、１８トリソミー、および１３トリソミーについて、それぞれ０．０８％、０％、および０．０８％の偽陽性率で検出された（図１３；表８）。胎児分率とｚスコアの大きさの間に正の相関があったが、正倍数性試料についてはこれらの測定基準に相関はなかった。
１２６９人のドナーのそれぞれ由来の別個の血漿試料が以前配列決定されており、したがって、性能についての比較として機能する。同等の評価を確実にするために、以前の試験からのｚスコアを、中央値を算出するために使用した試料数と等しい９６の試料のＧＣＲＭ値および母集団のサイズを使用して、ハイスループットな分析を使用して算出した（中央値およびＭＡＤ算出について）。２つの試験を比較することにより、以前報告された偽陰性の２１トリソミー試料および以前報告された偽陽性の２１トリソミー試料の正しい分類が明らかになったが、この試験の間に１つの追加的な偽陽性が存在した（図１４）。１３トリソミー分類および単一の１８トリソミー試料についての正しい分類を以前のわずかに３．９５を下回るｚスコアと比較した場合に、一致しない試料はなかった。対応のあるｚスコアを異数性試料について評価することにより、平均差異が、２１トリソミーについては２．１９であり、１８トリソミーについては１．５６であり、１３トリソミーについては１．６４であることが明らかになり、これには、ハイスループットな方法を使用すると、影響を受けた試料についてのｚスコアが増加したことが反映されている。ハイスループットなアッセイを使用すると、確認された２１トリソミー試料および１８トリソミー試料について、以前の試験と比較してｚスコアが統計的に有意に増加したが（それぞれｐ＝４．２４×１０−１２およびｐ＝０．０００２；対応のあるウィルコクソン検定）、確認された１３トリソミー試料についてはｚスコアに有意差はなかった（ｐ＝０．３１；対応のあるウィルコクソン検定）。非異数性試料について、第２１染色体、第１８染色体、または第１３染色体のｚスコアに統計的有意差はなかった（ｐ＝０．０６、ｐ＝０．９０、ｐ＝０．８２、それぞれ；対応のあるウィルコクソン検定）。この正倍数性試料に有意に影響を及ぼすことなく異数性のｚスコアが有意に増加することにより、ハイスループットなアッセイ設定および新規のバイオインフォマティクス方法を使用した場合に、第２１染色体および第１８染色体について、正倍数性試料と異数性試料との間の分析的な距離が伸びたことがさらに示される。
考察
本明細書に示されている開発には研究活動が先行し、その後に、ＣＬＩＡによって認定された研究所において追加的な検証および検証試験が行われた。全体で、新しい研究所検査をもたらす研究から検証までのプロセス全体は、５０００を超える試験試料によって支持される。この試験では、研究、最適化、開発の間に３４００を超える試料について配列決定した。次いで、１２６９の試料を利用して臨床評価試験を実施し、その中で、各トリソミーについて０．０８％以下の偽陽性率を維持しながら１７６の異数性試料全てを検出した。
ライブラリー調製の処理量を４倍増加させることを可能にするアッセイを開発し、それを試料多重化による３倍の増加と併せて、ハイスループットなｃｃｆ ＤＮＡ試料処理を可能にした。これらの方法を改善された分析論と組み合わせて使用すると同時に、非侵襲的な異数性の検出の感度および特異度を改善し、技師および計器の必要性を減少させた。全体的に、これらのデータにより、開発されたハイスループットなアッセイが技術的にロバストであり、臨床的に正確であり、それにより、検査された胎児の異数性の全て（１７６／１７６）を低い偽陽性率（０．０８％）で検出することを可能にすることが示唆される。
実施例５：実施形態の例
Ａ１． 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ａ２． 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｇ）正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ａ３． 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）正規化された試料カウントに基づいて、胎児の異数性の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ａ３．１． 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｃ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を検出するステップとを含む、方法。
Ａ４． 試料核酸が妊婦由来の血漿由来のものである、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ５． 試料核酸が妊婦由来の血清由来のものである、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ６． 胎児の異数性が１３トリソミーである、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７． 胎児の異数性が１８トリソミーである、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ８． 胎児の異数性が２１トリソミーである、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９． 無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、実施形態Ａ１からＡ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０． ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、実施形態Ａ９に記載の方法。
Ａ１１． ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、実施形態Ａ１０に記載の方法。
Ａ１２． 予測カウントがカウント中央値である、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３． 予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４． カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、実施形態Ａ１からＡ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５． カウントを、正規化モジュールによって正規化する、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１６． 核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、実施形態Ａ１からＡ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１７． 核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、実施形態Ａ１からＡ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８． 核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、実施形態Ａ１７に記載の方法。
Ａ１９． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、実施形態Ａ１からＡ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０． 配列読み取りを配列決定モジュールからマッピングモジュールに移行する、実施形態Ａ１８またはＡ１９に記載の方法。
Ａ２１． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールに移行する、実施形態Ａ１９またはＡ２０に記載の方法。
Ａ２２． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りのカウントを、カウントモジュールから正規化モジュールに移行する、実施形態Ａ１９からＡ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３． カウントを正規化するステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、実施形態Ａ１からＡ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４． 正規化されたカウントがｚスコアである、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５． 正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、実施形態Ａ１からＡ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６． 第１のゲノミックセクションについてのカウントの誘導値が第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、実施形態Ａ１からＡ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７． 中央値がパーセント表示の中央値である、実施形態Ａ１２からＡ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８． パーセント表示が染色体表示である、実施形態Ａ２３からＡ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｂ２． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｇ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｂ３． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｂ３．１． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｂ４． 試料核酸が試験被験体由来の血漿由来のものである、実施形態Ｂ１からＢ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５． 試料核酸が試験被験体由来の血清由来のものである、実施形態Ｂ１からＢ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６． 遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、実施形態Ｂ１からＢ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ７． 医学的状態ががんである、実施形態Ｂ６に記載の方法。
Ｂ８． 医学的状態が異数性である、実施形態Ｂ６に記載の方法。
Ｂ９． 試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、実施形態Ｂ１からＢ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１０． ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、実施形態Ｂ９に記載の方法。
Ｂ１１． 無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、実施形態Ｂ１からＢ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１２． ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｂ１１に記載の方法。
Ｂ１３． ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｂ１２に記載の方法。
Ｂ１４． 予測カウントがカウント中央値である、実施形態Ｂ１からＢ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５． 予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、実施形態Ｂ１からＢ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１４． カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、実施形態Ｂ１からＢ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５． カウントを、正規化モジュールによって正規化する、実施形態Ｂ１からＢ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６． 核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、実施形態Ｂ１からＢ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１７． 核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、実施形態Ｂ１からＢ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１８． 核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、実施形態Ｂ１７に記載の方法。
Ｂ１９． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、実施形態Ｂ１からＢ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２０． 配列読み取りを配列決定モジュールからマッピングモジュールに移行する、実施形態Ｂ１８またはＢ１９に記載の方法。
Ｂ２１． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールに移行する、実施形態Ｂ１９またはＢ２０に記載の方法。
Ｂ２２． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りのカウントを、カウントモジュールから正規化モジュールに移行する、実施形態Ｂ１９からＢ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２３． カウントを正規化するステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、実施形態Ｂ１からＢ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２４． 正規化されたカウントがｚスコアである、実施形態Ｂ１からＢ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２５． 正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、実施形態Ｂ１からＢ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６． 第１のゲノミックセクションについてのカウントの誘導値が第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、実施形態Ｂ１からＢ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７． 中央値がパーセント表示の中央値である、実施形態Ｂ１２からＢ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２８． パーセント表示が染色体表示である、実施形態Ｂ２３からＢ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）（ｃ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｇ）（ｆ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｃ２． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｃ３． 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）（ｂ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｆ）（ｅ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｃ３．１ 遺伝的変異の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）（ａ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｃ４． 補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、残ったカウントを正規化する、実施形態Ｃ１からＣ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５． 遺伝的変異が微小欠失である、実施形態Ｃ１からＣ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６． 微小欠失が第２２染色体上にある、実施形態Ｃ５に記載の方法。
Ｃ７． 微小欠失が第２２染色体の領域２２ｑ１１．２において起こっている、実施形態Ｃ６に記載の方法。
Ｃ８． 微小欠失が、参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間で起こっている、実施形態Ｃ６に記載の方法。
Ｃ９． 正規化されたカウントの誘導値がＺスコアである、実施形態Ｃ１からＣ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１０． ＺスコアがロバストなＺスコアである、実施形態Ｃ９に記載の方法。
Ｃ１１． 試料核酸が試験被験体由来の血漿由来のものである、実施形態Ｃ１からＣ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１２． 試料核酸が試験被験体由来の血清由来のものである、実施形態Ｃ１からＣ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１３． 遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、実施形態Ｃ１からＣ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１４． 医学的状態ががんである、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
Ｃ１５． 医学的状態が異数性である、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
Ｃ１６． 試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、実施形態Ｃ１からＣ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１７． ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、実施形態Ｃ１６に記載の方法。
Ｃ１８． 無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、実施形態Ｃ１からＣ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１９． ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｃ１８に記載の方法。
Ｃ２０． ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｃ１９に記載の方法。
Ｃ２１． 予測カウントがカウント中央値である、実施形態Ｃ１からＣ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２２． 予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、実施形態Ｃ１からＣ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２３． カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、実施形態Ｃ１からＣ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２４． カウントを、正規化モジュールによって正規化する、実施形態Ｃ１からＣ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２５． 核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、実施形態Ｃ１からＣ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２６． 核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、実施形態Ｃ１からＣ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２７． 核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、実施形態Ｃ２６に記載の方法。
Ｃ２８． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、実施形態Ｃ１からＣ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２９． 配列読み取りを配列決定モジュールからマッピングモジュールに移行する、実施形態Ｃ２７またはＣ２８に記載の方法。
Ｃ３０． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールに移行する、実施形態Ｃ２８またはＣ２９に記載の方法。
Ｃ３１． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りのカウントを、カウントモジュールから正規化モジュールに移行する、実施形態Ｃ２８からＣ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３２． カウントを正規化するステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、実施形態Ｃ１からＣ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３３． 正規化されたカウントがｚスコアである、実施形態Ｃ１からＣ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３４． 正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、実施形態Ｃ１からＣ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３５． 第１のゲノミックセクションについてのカウントの誘導値が第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、実施形態Ｃ１からＣ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３６． 中央値がパーセント表示の中央値である、実施形態Ｃ２１からＣ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３７． パーセント表示が染色体表示である、実施形態Ｃ３２からＣ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１． 微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）（ｃ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｅ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｄ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｆ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｇ）（ｆ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｄ２． 微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｄ３． 微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得たヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）（ｂ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｄ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｃ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｆ）（ｅ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｄ３．１． 微小欠失の有無を検出するための方法であって、
（ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料核酸から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
（ｂ）（ａ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｄ４． 補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、残ったカウントを正規化する、実施形態Ｄ１からＤ３．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ５． 微小欠失が第２２染色体上にある、実施形態Ｄ４に記載の方法。
Ｄ６． 微小欠失が第２２染色体の領域２２ｑ１１．２において起こっている、実施形態Ｄ５に記載の方法。
Ｄ７． 微小欠失が、参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間で起こっている、実施形態Ｄ５に記載の方法。
Ｄ８． 正規化されたカウントの誘導値がＺスコアである、実施形態Ｄ１からＤ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ９． ＺスコアがロバストなＺスコアである、実施形態Ｄ８に記載の方法。
Ｄ１０． 試料核酸が試験被験体由来の血漿由来のものである、実施形態Ｄ１からＤ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１１． 試料核酸が試験被験体由来の血清由来のものである、実施形態Ｄ１からＤ９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１２． 遺伝的変異が医学的状態に関連付けられる、実施形態Ｄ１からＤ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１３． 医学的状態ががんである、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１４． 医学的状態が異数性である、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１５． 試験被験体がヒト、動物、および植物から選択される、実施形態Ｄ１からＤ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１６． ヒト試験被験体が、女性、妊婦、男性、胎児、または新生児を含む、実施形態Ｄ１５に記載の方法。
Ｄ１７． 無細胞試料核酸の配列読み取りがポリヌクレオチド断片の形態である、実施形態Ｄ１からＤ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１８． ポリヌクレオチド断片の長さが約２０ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｄ１７に記載の方法。
Ｄ１９． ポリヌクレオチドの長さが約３０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの間である、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２０． 予測カウントがカウント中央値である、実施形態Ｄ１からＤ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２１． 予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、実施形態Ｄ１からＤ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２２． カウントを、ＧＣ含量、ビン様式での正規化、ＧＣ ＬＯＥＳＳ、ＰＥＲＵＮ、ＧＣＲＭ、またはそれらの組合せによって正規化する、実施形態Ｄ１からＤ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２３． カウントを、正規化モジュールによって正規化する、実施形態Ｄ１からＤ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２４． 核酸配列読み取りを、配列決定モジュールによって生成する、実施形態Ｄ１からＤ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２５． 核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションまたは参照ゲノム全体にマッピングするステップを含む、実施形態Ｄ１からＤ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２６． 核酸配列読み取りをマッピングモジュールによってマッピングする、実施形態Ｄ２５に記載の方法。
Ｄ２７． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをカウントモジュールによってカウントする、実施形態Ｄ１からＤ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２８． 配列読み取りを配列決定モジュールからマッピングモジュールに移行する、実施形態Ｄ２６またはＤ２７に記載の方法。
Ｄ２９． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りをマッピングモジュールからカウントモジュールに移行する、実施形態Ｄ２７またはＤ２８に記載の方法。
Ｄ３０． 参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた核酸配列読み取りのカウントを、カウントモジュールから正規化モジュールに移行する、実施形態Ｄ２７からＤ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３１． カウントを正規化するステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、実施形態Ｄ１からＤ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３２． 正規化されたカウントがｚスコアである、実施形態Ｄ１からＤ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３３． 正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、実施形態Ｄ１からＤ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３４． 第１のゲノミックセクションについてのカウントの誘導値が第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、実施形態Ｄ１からＤ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３５． 中央値がパーセント表示の中央値である、実施形態Ｄ２０からＤ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３６． パーセント表示が染色体表示である、実施形態Ｄ３１からＤ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１． 正規化された試料カウントが、カウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化することを含むプロセスによって得られ、誘導値が第１のゲノムセクションについてのカウントを第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについてのカウントで割ることによって決定される第１のゲノムセクションカウント表示である、実施形態Ａ１からＤ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２． 第１のゲノムセクションについてのカウントの誘導値を予測カウントの誘導値に従って正規化し、予測カウントの誘導値が、第１のゲノムセクションについての予測カウントを第１のゲノムセクションを含む複数のゲノムセクションについての予測カウントで割ることによって決定される予測された第１のゲノムセクションカウント表示である、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３． 第１のゲノムセクションが染色体または染色体の部分であり、複数のゲノムセクションが常染色体を含む、実施形態Ａ１からＥ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４． 染色体が第２１染色体、第１８染色体または第１３染色体である、実施形態Ｅ３に記載の方法。
Ｅ５． 正規化された試料カウントが、第１のゲノムセクションについてのカウントから予測カウントを引き算し、それにより減算値を生成し、減算値をカウントの変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、実施形態Ａ１からＤ２１、実施形態Ｅ３および実施形態Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．１． 予測カウントの変動性の推定値がカウントの中央絶対偏差（ＭＡＤ）である、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ５．２． カウントの変動性の推定値が、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｘによって導入されるＭＡＤの代替値、またはブートストラップ推定値である、実施形態Ｅ５に記載の方法。
Ｅ５．３． 変動性の推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、実施形態Ｅ５からＥ５．２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．４． 変動性の推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、実施形態Ｅ５からＥ５．２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．５ 変動性の推定値および予測カウントが、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、実施形態Ｅ５からＥ５．４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６． 正規化された試料カウントが、第１のゲノムセクションカウント表示から予測された第１のゲノムセクションカウント表示を引き算し、それにより減算値を生成し、減算値を第１のゲノムセクションカウント表示の変動性の推定値で割ることを含むプロセスによって得られる、実施形態Ａ１からＥ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．１． 予測カウント表示の変動性の推定値がカウント表示の中央絶対偏差（ＭＡＤ）である、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ６．２． カウント表示の変動性の推定値が、ＲｏｕｓｓｅｅｕｗおよびＣｒｏｕｓによって導入されるＭＡＤの代替値またはブートストラップ推定値である、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ６．３． 予測カウント表示の変動性の推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、実施形態Ｅ６からＥ６．２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．４． 予測カウント表示の変動性の推定値が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成されたものではない試料データについて得られる、実施形態Ｅ６からＥ６．２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．５ 予測カウント表示の変動性の推定値および予測された第１のゲノムセクションカウント表示が、１つまたは複数の共通の実験条件から生成された試料データについて得られる、実施形態Ｅ６からＥ６．４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７． １つまたは複数の共通の実験条件がフローセルを含む、実施形態Ａ１からＥ６．６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ８． １つまたは複数の共通の実験条件がフローセルのチャネルを含む、実施形態Ａ１からＥ６．６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９． １つまたは複数の共通の実験条件が試薬プレートを含む、実施形態Ａ１からＥ６．６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ９．１． 試薬プレートを使用して配列決定のために核酸を段階分けする、実施形態Ｅ９に記載の方法。
Ｅ９．２． 試薬プレートを使用して配列決定のために核酸ライブラリーを調製する、実施形態Ｅ９に記載の方法。
Ｅ１０． １つまたは複数の共通の実験条件が同定タグ指標を含む、実施形態Ａ１からＥ６．６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１１． 正規化された試料カウントを、ヌクレオチド配列読み取りまたは試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正する、実施形態Ａ１からＥ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２． カウントまたは正規化された試料カウントを局所重み付け多項式回帰に供するステップを含む、実施形態Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１２．１ 局所重み付け多項式回帰がＬＯＥＳＳ回帰である、実施形態Ｅ１２に記載の方法。
Ｅ１３． 正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、実施形態Ａ１からＥ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４． カウントまたは正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列について補正する、実施形態Ｅ１３に記載の方法。
Ｅ１５． 正規化された試料カウントを得る前にカウントをフィルタリングするステップを含む、実施形態Ａ１からＥ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６． 試料核酸が一本鎖核酸を含む、実施形態Ａ１からＥ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７． 試料核酸が二本鎖核酸を含む、実施形態Ａ１からＥ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８． ヌクレオチド配列読み取りを得るステップが、試料核酸を、配列決定デバイスを使用した配列決定プロセスに供するステップを含む、実施形態Ａ１からＥ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９． アウトカムをもたらすステップが、試料核酸中の胎児核酸の分率をファクタリングするステップを含む、実施形態Ａ１からＥ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０． 試料核酸中の胎児核酸の分率を決定するステップを含む、実施形態Ａ１からＥ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２１． 正規化された試料カウントを、ヌクレオチド配列読み取りまたは試料核酸のグアニンおよびシトシンの含量について補正せずに得る、実施形態Ａ１からＥ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２２． 正規化された試料カウントを１つの実験条件について得る、実施形態Ａ１からＥ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３． 実験条件がフローセルである、実施形態Ｅ２２に記載の方法。
Ｅ２４． 正規化された試料カウントを２つの実験条件について得る、実施形態Ａ１からＥ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５． 実験条件がフローセルおよび試薬プレートである、実施形態Ｅ２４に記載の方法。
Ｅ２６． 実験条件がフローセルおよび同定タグ指標である、実施形態Ｅ２４に記載の方法。
Ｅ２７． 正規化された試料カウントを３つの実験条件について得る、実施形態Ａ１からＥ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２８． 実験条件がフローセル、試薬プレートおよび同定タグ指標である、実施形態Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２９． 正規化された試料カウントを、（ｉ）グアニンおよびシトシンの含量に従って補正し、（ｉ）の後に、（ｉｉ）実験条件に従って補正した後に得る、実施形態Ａ１からＥ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３０． 正規化された試料カウントを、（ｉ）の前に参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正した後に得る、実施形態Ｅ２９に記載の方法。
Ｅ３１． （ｉｉ）が、フローセルに従って補正することからなる、実施形態Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
Ｅ３２． （ｉｉ）が、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、実施形態Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
Ｅ３３． （ｉｉ）が、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、実施形態Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
Ｅ３４． （ｉｉ）が、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる、実施形態Ｅ２９またはＥ３０に記載の方法。
Ｅ３５． 正規化された試料カウントを、フローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ３６． 正規化された試料カウントを、同定タグ指標に従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ３７． 正規化された試料カウントを、試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ３８． 正規化された試料カウントを、同定タグ指標および試薬プレートに従って補正し、次いでフローセルに従って補正することからなる実験条件に従った補正の後に得る、実施形態Ｅ２１に記載の方法。
Ｅ３９． 正規化された試料カウントを、参照ゲノムセクションにおいて反復するヌクレオチド配列に従って補正し、その後に実験条件に従って補正した後に得る、実施形態Ｅ３２からＥ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４０． 正規化された試料カウントがＺスコアである、実施形態Ｅ１からＥ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４１． （ｉ）が、
（ａ）各試料について（ｉ）参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）部分のそれぞれについてのＧＣ含量との間のフィッティングした関係から、複数の試料について参照ゲノムの部分のそれぞれについてのグアニンおよびシトシン（ＧＣ）の偏りを決定することと、
（ｂ）（ｉ）ＧＣの偏りと（ｉｉ）参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントとの間のフィッティングした関係から参照ゲノムの部分のそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出し、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度をもたらし、それにより、算出されたゲノミックセクションの高度における参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントの偏りが減少することと
を含む、実施形態Ｅ２９からＥ４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４２． 参照ゲノムの部分が染色体内にある、実施形態Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４３． 参照ゲノムの部分が染色体の部分内にある、実施形態Ｅ４１に記載の方法。
Ｅ４４． 染色体が第２１染色体である、実施形態Ｅ４１からＥ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４５． 染色体が第１８染色体である、実施形態Ｅ４１からＥ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４６． 染色体が第１３染色体である、実施形態Ｅ４１からＥ４３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４７． （ｂ）の前に、参照ゲノムの部分のいくつかまたは全部にマッピングされた配列読み取りのカウントについて誤差の尺度を算出し、参照ゲノムの特定の部分についての配列読み取りのカウントを誤差の尺度の閾値に従って除去または重み付けするステップを含む、実施形態Ｅ４１からＥ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４８． 閾値を、第１のゲノミックセクションの高度と第２のゲノミックセクションの高度との間の標準偏差ギャップ３．５以上に応じて選択する、実施形態Ｅ４７に記載の方法。
Ｅ４９． 誤差の尺度がＲ因子である、実施形態Ｅ４７または実施形態Ｅ４８に記載の方法。
Ｅ５０． Ｒ因子が約７％〜約１０％である参照ゲノムの部分についての配列読み取りのカウントを（ｂ）の前に除去する、実施形態Ｅ４９に記載の方法。
Ｅ５１． （ｂ）のフィッティングした関係がフィッティングした線形関係である、実施形態Ｅ４１からＥ５０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５２． 関係の傾きを線形回帰によって決定する、実施形態Ｅ５１に記載の方法。
Ｅ５３． 各ＧＣの偏りがＧＣの偏り係数であり、このＧＣの偏り係数が（ｉ）参照ゲノムの部分のそれぞれにマッピングされた配列読み取りのカウントと（ｉｉ）部分のそれぞれについてのＧＣ含量との間の線形関係の傾きである、実施形態Ｅ５１またはＥ５２に記載の方法。
Ｅ５４． （ｂ）のフィッティングした関係がフィッティングした非線形関係である、実施形態Ｅ４１からＥ５０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５５． 各ＧＣの偏りが、ＧＣ曲率推定値を含む、実施形態Ｅ５４に記載の方法。
Ｅ５６． （ｃ）のフィッティングした関係が線形である、実施形態Ｅ４１からＥ５５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５７． 関係の傾きを線形回帰によって決定する、実施形態Ｅ５６に記載の方法。
Ｅ５８． （ｂ）のフィッティングした関係が線形であり、（ｃ）のフィッティングした関係が線形であり、ゲノミックセクションの高度Ｌｉが、参照ゲノムの部分のそれぞれについて、方程式α：
Ｌｉ＝（ｍｉ−ＧｉＳ）Ｉ−１ 方程式α
（式中、ＧｉはＧＣの偏りであり、Ｉは（ｃ）のフィッティングした関係の切片であり、Ｓは（ｃ）の関係の傾きであり、ｍｉは測定された、参照ゲノムの各部分にマッピングされたカウントであり、ｉは試料である）
に従って決定される、実施形態Ｅ４１からＥ５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５９． 参照ゲノムの部分の数が約４０，０００以上の部分である、実施形態Ｅ４１からＥ５８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６０． 参照ゲノムの各部分が所定の長さのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｅ４１からＥ５９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６１． 所定の長さが約５０キロベースである、実施形態Ｅ６０に記載の方法。
Ｅ６２． （ｂ）のＧＣの偏りをＧＣの偏りモジュールによって決定する、実施形態Ｅ４１からＥ６１のいずれか１つに記載の方法。
Ｆ１． コンピュータ可読プログラムコードが組み込まれたコンピュータで使用可能な媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、コンピュータ可読プログラムコードが、配列受信モジュール、論理処理モジュール、およびデータディスプレイ編成モジュールを含む別個のソフトウェアモジュールを含み、かつ、試料核酸における遺伝的変異の有無を同定するための方法であって、
（ａ）配列受信モジュールによって、試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｂ）論理処理モジュールによって、ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｃ）論理処理モジュールによって、各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｄ）論理処理モジュールによって、１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｅ）論理処理モジュールによって、正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムを生成するステップと、
（ｆ）データディスプレイ編成モジュールによって、論理処理モジュールによって決定されるのに応じて試料核酸における遺伝的変異の有無を示すデータディスプレイを編成するステップと
を含む方法の実行が遂行されるように適合されている、コンピュータプログラム製品。
Ｆ２． 実施形態Ｆ１のコンピュータプログラム製品が記憶されているメモリを含む装置。
Ｆ３． 実施形態Ｆ１に記載のコンピュータプログラム製品の１つまたは複数の機能を実行するプロセッサを含む、実施形態Ｆ２に記載の装置。
Ｆ４． 核酸配列決定装置および処理装置を含むシステムであって、配列決定装置によって試料核酸からのヌクレオチド配列読み取りが得られ、処理装置によって配列決定装置からのヌクレオチド配列読み取りが得られ、かつ
（ａ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｂ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｄ）正規化された試料カウントに基づいて試料核酸における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む方法が実施されるシステム。
Ｇ１． ヒト参照ゲノムｈｇ１９による第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間の２２ｑ１１．２微小欠失の有無を同定する方法であって、
（ａ）試験被験体由来の循環している無細胞核酸を含む試料を得るステップと、
（ｂ）試料から試料核酸を単離するステップと、
（ｃ）試料核酸からヌクレオチド配列読み取りを得るステップと、
（ｄ）ヌクレオチド配列読み取りを参照ゲノムセクションにマッピングするステップと、
（ｅ）各参照ゲノムセクションにマッピングされたヌクレオチド配列読み取りの数をカウントし、それにより、カウントを得るステップと、
（ｆ）（ｅ）のカウントされ、マッピングされた配列読み取りを、反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って補正するステップと、
（ｇ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って（ｆ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
（ｈ）第２２染色体のヌクレオチド１９，０００，０００位と２２，０００，０００位の間に対応する１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価するステップと、
（ｉ）（ｈ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定するアウトカムをもたらすステップと
を含む、方法。
Ｇ２． 補正され、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを、１つまたは複数の実験条件についてさらに補正した後に、残ったカウントを正規化する、実施形態Ｆ１からＦ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｈ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、この配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されているシステム。
Ｉ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、この配列読み取りが、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている装置。
Ｊ１． コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）正規化された試料カウントに基づいて胎児の異数性の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
Ｋ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、この配列読み取りが胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されているシステム。
Ｌ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、この配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｂ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている装置。
Ｍ１． コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、カウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）正規化された試料カウントに基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
Ｎ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含むシステムであって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングされた配列読み取りのカウントを含み、この配列読み取りが、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りであり、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
（ｄ）（ｃ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されているシステム。
Ｏ１． １つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含む装置であって、このメモリが、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令を含み、かつ、参照ゲノムの部分にマッピングされた、胎児を有する妊婦由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントを含み、１つまたは複数のプロセッサによって遂行可能な命令が、
（ａ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｂ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ａ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｃ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
（ｄ）（ｃ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている装置。
Ｐ１． コンピュータ可読媒体上に有形的に組み込まれているコンピュータプログラム製品であって、１つまたは複数のプロセッサによって遂行される際に、
（ａ）参照ゲノムの部分にマッピングされた、試験試料由来の循環している無細胞核酸の読み取りである配列読み取りのカウントにアクセスし、
（ｂ）反復配列および／または過大表示もしくは過小表示された配列の影響を最小限にするまたは排除する、選択された変数または特徴に従って、カウントされ、マッピングされた配列読み取りを補正し、
（ｃ）１つまたは複数の共通の実験条件に曝露させた試料、参照、または試料および参照を含む群について得られる予測カウントまたは予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）で残ったカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、またはカウントの誘導値を第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得、
（ｄ）１つまたは複数の選択されたゲノミックセクションについて、試験被験体と参照被験体についての、正規化されたカウントまたは正規化されたカウントの誘導値の間の差異の統計的有意性を評価し、
（ｅ）（ｄ）における評価に基づいて、試験被験体における遺伝的変異の有無を決定する
ように構成されている命令を含むコンピュータプログラム製品。
本明細書において参照されている特許、特許出願、刊行物および文書のそれぞれの全体が、これによって参照により組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書を引用することは、前述のいずれもが先行技術に関係することを認めるものではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関してどんな容認も構成するものでもない。
当該技術の基本的な態様から逸脱することなく前述のものに改変を行うことができる。当該技術は、１つまたは複数の特定の実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが、当業者は、本出願に詳細に開示されている実施形態に変化を生じさせてよく、それでもこれらの改変および改良は当該技術の範囲および主旨であることを理解されよう。
本明細書において適切に例示的に記載されている技術は、本明細書に詳細に開示されていない要素（複数可）のいずれがなくとも実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語はいずれも 他の２つの用語と置き換えることができる。使用されている用語および表現は、説明する用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現を使用することによって、示され、記載されている特徴の等価物またはその一部は排除されず、特許請求された技術の範囲内で種々の改変が可能である。用語「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は、要素のうちの１つ、または要素のうちの２つ以上のいずれかについて記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素の１つまたは複数を指す場合がある（例えば、「ａ（１つの）試薬」という用語は、１つまたは複数の試薬を意味し得る）。「約」という用語は、本明細書で使用される場合、基になるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラス１０％またはマイナス１０％）を指し、一連の値の最初に「約」という用語を使用することにより、値のそれぞれが修飾される（すなわち、「約１、２および３」とは、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラムから１１０グラムの間の重量を含んでよい。さらに、値の列挙が本明細書に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）その列挙は、それらの中間の値および小数値の全てを含む（例えば、５４％、８５．４％）。したがって、本技術は代表的な実施形態および任意選択の特徴によって詳細に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変および変形を用いることができ、そのような改変および変形は本技術の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
当該技術のある特定の実施形態は、続く特許請求の範囲に記載されている。

Claims (16)

  1. 胎児の異数性の有無を検出するための方法であって、
    （ａ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦から得られた循環している無細胞核酸を含む試験試料から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップと、
    （ｂ）グアニンおよびシトシンの含量に従って（ａ）における前記カウントを補正し、それによって補正されたカウントを提供するステップであって、前記補正は、
    （ｉ）（１）前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントと（２）前記セクションのそれぞれについてのＧＣ含量との間のフィッティングした関係に基づいて、前記試験試料についてのグアニンおよびシトシン（ＧＣ）の偏り係数を決定することであって、前記ＧＣの偏り係数が、フィッティングした線形関係の傾き、またはフィッティングした非線形関係についての曲率推定値である、ことと、
    （ｉｉ）方程式α：
    Ｌ ｉ ＝（Ｍ ｉ −Ｇ ｉ Ｓ）／Ｉ 方程式α
    （式中、Ｌ ｉ が前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションレベルであり、Ｍ ｉ が前記試験試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントであり、Ｇ ｉ が（ｉ）で決定された前記試験試料についてのＧＣの偏り係数であり、Ｉが、（１）複数の試料のそれぞれについての前記ＧＣの偏り係数と（２）前記複数の試料についての前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントとの間の、前記セクションのそれぞれについてのフィッティングした線形関係の切片であり、Ｓが前記セクションのそれぞれについてのフィッティングした線形関係の傾きである）
    に従って前記セクションのそれぞれについてのゲノミックセクションの高度を算出することと
    を含むステップと、
    （ｃ）参照ゲノムセクションにマッピングされた、妊婦の群から得られた循環している無細胞核酸を含む試料の群における各群から得られるヌクレオチド配列読み取りのカウントを得るステップであって、（ａ）における前記試験試料と（ｃ）における前記試料の群は、共通のフローセルユニット、コンテナに共通のフローセル、ロットまたは製造の連続運転に共通のフローセル、共通の試薬プレートユニット、コンテナに共通の試薬プレート、あるいはロットまたは製造の連続運転に共通の試薬プレートから選択される１つまたは複数の共通の実験条件に曝露される、ステップ
    （ｄ）（ｃ）における前記試料の群から得られる前記カウントに従って得られる予測カウントまたは前記予測カウントの誘導値に従って、（ｂ）における前記補正されたカウントを第１のゲノムセクションについて正規化、または（ｂ）における前記補正されたカウントの誘導値を前記第１のゲノムセクションについて正規化し、それにより、正規化された試料カウントを得るステップと、
    （ｅ）前記正規化された試料カウントに基づいて、前記試験試料について胎児の異数性の有無を検出するステップと
    を含む、方法。
  2. 前記試料核酸が前記妊婦由来の血漿由来のものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料核酸が前記妊婦由来の血清由来のものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記胎児の異数性が１３トリソミーである、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 前記胎児の異数性が１８トリソミーである、請求項１、２または３に記載の方法。
  6. 前記胎児の異数性が２１トリソミーである、請求項１、２または３に記載の方法。
  7. 前記予測カウントがカウント中央値である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記予測カウントが、トリムもしくは刈り込み平均、ウィンザー化平均またはブートストラップ推定値である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記カウントを正規化する前記ステップが、パーセント表示を決定するステップを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記正規化されたカウントがｚスコアである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記正規化されたカウントがロバストなｚスコアである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１のゲノミックセクションについての前記カウントの前記誘導値が前記第１のゲノミックセクションのパーセント表示である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記中央値がパーセント表示の中央値である、請求項７に記載の方法。
  14. 前記パーセント表示が染色体表示である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記核酸を配列決定し、それによって、核酸配列読み取りを提供するステップ、および前記核酸配列読み取りを、参照ゲノムのゲノミックセクションにマッピングするステップを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. （ｂ）（ｉｉ）（１）における前記複数の試料のそれぞれについての前記ＧＣの偏り係数が、前記セクションのそれぞれにマッピングされた前記配列読み取りのカウントと、前記セクションのそれぞれについてのＧＣ含量との間の、前記複数の試料のそれぞれについてのフィッティングした線形関係の傾きである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

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