PT2716766T

PT2716766T - Dispositivo para detectar o número de cópias de cromossomas fetais ou células tumorais

Info

Publication number: PT2716766T
Application number: PT118669142T
Authority: PT
Inventors: Gao Yang; Zhou Daixing; Zhang Jianguang; Tian Feng
Original assignee: Berry Genomics Co Ltd
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2016-11-21
Also published as: WO2012162884A1; EP2716766A1; JP2014516541A; EP2716766B1; PL2716766T3; ES2605372T3; CN103080336B; US9885080B2; EP2716766A4; HUE031239T2; CN103080336A; RS55518B1; JP5926795B2; US20130130921A1; DK2716766T3

Description

DESCRIÇÃO "DISPOSITIVO PARA DETECTAR O NÚMERO DE CÓPIAS DE CROMOSSOMAS FETAIS OU CÉLULAS TUMORAIS"

Campo de invenção A invenção refere-se a dispositivo para detectar o número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais.

Antecedentes da invenção A anormalidade do número de cópias de cromossomas está intimamente ligada a doenças humanas. A anomalia cromossómica ocorre em células fetais portadoras de doenças genéticas e células tumorais. Em média, 9 de 1.000 recém-nascidos podem ser portadores de doenças causadas por anormalidade do número de cópias de cromossomas (1) . Desse modo, é importante detectar o número de cópias de cromossomas antes das crianças terem nascido. No entanto, os métodos de diagnóstico utilizados actualmente, incluindo a amniocentese e coriônica ovina pertencem a métodos invasivos, que trazem certos riscos para as mulheres grávidas e os fetos. São usados marcadores de proteína do soro e ondas ultra-sónicas para detectar se os fetos sofrem de doenças devido à anormalidade do número de cópias de cromossomas, embora sejam não invasivos, factores patogénicos, não são detectados directamente, de modo que a precisão e a sensibilidade não são boas (2). Há também um problema de que as doenças devido à anormalidade do número de cópias de cromossomas não podem ser encontradas o mais rapidamente possível. Esta situação incentiva os pesquisadores a desenvolver um método de diagnóstico e detecção preciso não invasivo e altamente sensível.

Uma vez que foi encontrado ADN fetal no sangue materno (3), o diagnóstico e a detecção da anormalidade de cromossomas fetais de forma não invasiva e directa, torna-se um importante tópico de estudo. Em 2007, o Professor LO Yuk Ming Dennis e seus colegas demonstraram que a percentagem de local de mutação do gene especifico da placenta 4 em ARNm do plasma materno pode ser utilizada para julgar se o feto tem o cromossoma 21 que era um triplóide (4) . A percentagem do local da mutação é ao mesmo tempo utilizada para julgar se o cromossoma 18 é um triplóide (5) . A sua limitação é que o local de mutação não é comum na população, então estes métodos são adequados apenas para uma parte da população. Durante o mesmo período, a PCR digital (dPCR) é utilizada para detectar se o cromossoma fetal é triplóide (6), (7) . A PCR digital tem a vantagem de independência de qualquer local de mutação, mas a sua precisão é insuficiente, e requer muitas amostras de sangue, o que aumenta a dificuldade de amostragem.

Em anos recentes, os problemas acima mencionados foram resolvidos por técnicas de sequenciação de ADN de alto rendimento rapidamente desenvolvidas. Essas técnicas incluem Genome Analyzer da Illumina (8), SOLiD da Life Technologies (9) e Heliscope da Helicos (10), através das quais centenas de milhões ou até milhares de milhões de sequências podem ser detectadas uma vez. Quando estas técnicas são utilizadas para a detecção de ADNs no plasma materno, pode-se detectar a mudança do número de cromossomas de quantidades vestigiais de ADN fetal no plasma (11), (12), (13). No entanto, devido ao elevado custo da sequenciação, estas técnicas não têm sido utilizadas habitualmente. Ao mesmo tempo, há ainda um problema por resolver, que é detectar a mudança do número parcial de cópias de cromossomas fetais a partir do plasma materno. É vantajoso detectar a variação do número de cópias de cromossomas fetais a partir do plasma materno por sequenciação de elevado rendimento, mas esta técnica é de elevado custo e não pode ser popularizada. Além disso, a sequenciação Coeficiente de Variação (CV) é alta, e a precisão de detecção e a estabilidade também precisam ser melhoradas. A sequenciação CV também decide que este método só é adequado para alguns cromossomas, como o cromossoma 21, o cromossoma 18, e é inadequado para detectar a mudança do número parcial de cópias de cromossomas. É muito dispendioso e difícil detectar a alteração do número de cromossomas por sequenciação de elevado rendimento, a razão principal é que o teor de ADN fetal no plasma materno é baixo, apenas 5% quando é baixo, em especial durante o desenvolvimento fetal inicial. A maior parte do ADN no plasma materno é ADN materno. 0 antecedente de ADN materno facilmente engloba a alteração do número de cromossomas fetais ou número parcial de cópias. Desse modo, o método para separar o ADN das mulheres grávidas e o ADN fetal torna-se o assunto estudado há anos com pouco progresso. Um método bem sucedido deveria pertencer ao método de separação de histona inventado por Baylor Medical College (14). A quantidade de ADN separada é muito pequena, de modo que o método é somente adequado para detectar o local de mutação, não adequado para detectar a alteração do número de cópias de cromossomas. 0 documento US 2010/216153 Al (Lapidus Stanley et al.) divulga um método para detectar ácidos nucleicos fetais e métodos para diagnosticar anormalidades fetais.

Sumário da invenção

Tendo em vista os problemas acima mencionados no método para detectar o número de cópias de cromossomas fetais, o inventor concebe um kit, um dispositivo e um método para detectar o número inteiro ou parcial de cópias de cromossomas fetais, eficazmente, a baixo custo.

Os dispositivos da presente invenção são definidos nas reivindicações 1-5 em anexo. A invenção baseia-se nos seguintes factos: o inventor constata que o teor de GC dos segmentos de ADN de cada cromossoma tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma do total de segmentos de ADN, os fenómenos acima podem estar relacionados com o método de detecção, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção do número de segmentos de ADN do cromossoma de ser detectado para o ADN total, a e b são constantes, a e b podem ser valores diferentes para diferentes cromossomas, a proporção pode ser corrigida de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, e é calculada a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada, e o número de cópias dos cromossomas a serem detectados é determinado de acordo com o grau de variação. Ao corrigir o teor de GC, muitos resultados falsos negativos que não só podem ser detectados pelo método de julgamento da proporção entre os segmentos de ADN de cada cromossoma de segmentos de ADN total podem ser detectados de forma eficaz. As experiências especificas são tomadas como evidências na descrição detalhada das formas de realização. Além disso, como foi relatado no documento (15), a maior parte do ADN fetal no plasma materno é de 100 pb a 250 pb segmentos, em particular na grande maioria de 150 pb a 170 pb. Embora apenas uma pequena parte do ADN materno seja distribuído na gama de segmento, os segmentos de ADN de mais de 250 pb, basicamente, pertencem ao ADN materno. O inventor constata que, embora a razão seja desconhecida, a proporção dos segmentos de ADN de cada cromossoma para os segmentos de ADN total é uniformemente distribuída com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, isto é, cada cromossoma tem um comprimento em qualquer ponto dentro da gama de 100 pb a 250 pb, tal como 110 pb ou 167 pb (a quantidade de ADN no local é a maior) , a proporção com o ADN total representa a proporção entre outros pontos, representando, assim, a proporção de cada cromossoma de todo o ADN dentro da gama de 100 pb a 250 pb. Através da sequenciação do ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb no ADN, os resultados de sequenciação de todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 2 50 pb do ADN são comparados com o mapa de sequência genómica para determinar de qual cromossoma é proveniente cada sequência de ADN da sequência de ADN de todo o ADN ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb e o comprimento de cada segmento de ADN; a proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na mesma amostra para todos os segmentos de ADN com um comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb é calculada para obter a proporção de cada cromossoma fetal em relação ao ADN total. Isto reduz significativamente os resultados de detecção. A proporção é corrigida de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em conjunto com o método de correcção com base em GC acima, e a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada é calculada para determinar o número de cópias de cromossomas de serem detectados de acordo com o grau de variação.

Ao mesmo tempo, o inventor constata que, de forma semelhante, durante o desenvolvimento de tumores, o mesmo acontece tanto no sangue do doente como no sangue materno durante o desenvolvimento de tumores, isto é, no sangue do doente com tumor, pode-se detectar ADN de células tumorais livres. A relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN de cada cromossoma medido com o método da invenção com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação aos segmentos de ADN total é do mesmo modo adequado para a detecção de aneuploidia de células tumorais. Além disso, o ADN das células tumorais livre no plasma está presente na forma de nucleossomas, portanto, são principalmente segmentos de 100 pb a 250 pb, a proporção entre os segmentos de ADN de cada cromossoma para os segmentos de ADN total é uniformemente distribuída com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, isto é, cada cromossoma tem um comprimento em qualquer ponto dentro da gama de 100 pb a 250 pb, representando, assim, a proporção de cada cromossoma de todo o ADN dentro da gama de 100 pb a 250 pb. Desse modo, o dispositivo da invenção também é adequado para detectar o número de cópias de cromossomas de células tumorais ou cromossomas parciais.

Com base nas constatações acima, o inventor proporciona um kit, um dispositivo e um método para detectar o número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais ou cromossomas parciais de forma não invasiva e económica.

Um kit para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais proporcionados pela divulgação inclui: um instrumento de colheita de sangue de uma mulher grávida ou um doente com tumor; um instrumento para a separação de células sanguíneas do plasma no sangue; um reagente e um instrumento para a extracção de ácido desoxirribonucleico (ADN) no plasma; um reagente e um instrumento para a separação do ADN com um método físico de acordo com o tamanho dos segmentos de ADN; e um reagente e um instrumento para a sequenciação do ADN com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb.

De preferência, os cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais são cromossomas inteiros ou cromossomas parciais.

De preferência, o kit inclui ainda: um reagente e um instrumento para a preparação de todo o ADN numa biblioteca de sequenciação.

De preferência, o kit inclui ainda: um reagente e um instrumento para realizar a amplificação por PCR do ADN extraído do plasma ou da biblioteca de sequenciação.

De preferência, o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 10 0 pb a 250 pb é o ADN de 150 pb a 170 pb, mais preferencialmente, é o ADN de 167 pb.

Um outro kit para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais proporcionado pela divulgação inclui: um instrumento de colheita de sangue de uma mulher grávida ou um doente com tumor; um instrumento para a separação de células sanguíneas do plasma no sangue; um reagente e um instrumento para a extracção do ADN do plasma; um reagente e um instrumento para a preparação do ADN numa biblioteca de sequenciação; e um reagente e um instrumento para a sequenciação do ADN, em que os cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais são cromossomas inteiros ou cromossomas parciais.

De preferência, o kit da invenção inclui ainda: um reagente e um instrumento para realizar a amplificação por PCR no ADN extraído do plasma.

Um dispositivo para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais proporcionado pela invenção inclui: um módulo de detecção, que é adaptado para a sequenciação do ADN numa amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor, em que a sequenciação inclui a preparação de todo o ADN na amostra de plasma materno ou do plasma de doente com tumor numa biblioteca de sequenciação; um módulo de comparação, que é adaptado para comparar um resultado de sequenciação do ADN com um mapa de sequência genómica para determinar de qual cromossoma cada sequência de ADN é proveniente e o comprimento de cada sequência de ADN; um módulo de cálculo, que é adaptado para calcular a proporção do número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação ao número total de segmentos de ADN na mesma amostra, corrigir a proporção de acordo com um teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados numa amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação; e um módulo de saída, que é adaptado para emitir o número de cópias dos cromossomas a serem detectados.

De preferência, o módulo de cálculo no dispositivo da invenção corrige as proporções dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma do total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é negativo.

De preferência, a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN é como mostrado na Tabela 1. De preferência, o módulo de cálculo no dispositivo da invenção corrige as proporções dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é positivo.

De preferência, a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN é como mostrado na Tabela 2.

De preferência, a sequência inclui o processo de preparação de todo o ADN na amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor numa biblioteca de sequenciação.

De preferência, a sequenciação do ADN na amostra de plasma materno ou plasma de doente com tumor é realizada por sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, sequenciação de sequência de longa de extremidade simples, ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples.

De preferência, a amplificação do ADN por PCR na amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor é realizada no ADN antes da sequenciação.

De preferência, no dispositivo da invenção, o módulo de cálculo é adaptado para calcular a proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na mesma amostra em relação ao número total de todos os segmentos de ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, que corrige a proporção de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada, e determinar do número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação.

De preferência, todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor, é preparado na biblioteca de sequenciação.

De preferência, a amplificação do ADN por PCR na amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor é realizada antes ou depois do ADN ser preparado para a biblioteca de sequenciação.

De um modo preferido, o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb é o ADN de 150 pb a 17 0 pb, mais preferencialmente o ADN de 167 pb.

Um método para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais proporcionadas pela divulgação inclui as seguintes etapas: recolha de plasma materno ou de plasma de doente com tumor; separar o plasma das células sanguíneas no sangue; preparar ADN no plasma numa biblioteca de sequenciação; sequenciar a biblioteca de sequenciação de ADN; comparar um resultado de sequenciação com um mapa de sequência genómica para determinar de qual cromossoma cada sequência de ADN é proveniente e o comprimento de cada segmento de ADN; e calcular a proporção dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação ao número total dos segmentos de ADN por sequenciação e comparação dos resultados de ADN, corrigir a proporção de acordo com um teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados numa amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação.

De preferência, o método da divulgação inclui ainda corrigir as proporções dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é negativo.

De preferência, a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total dos segmentos de ADN é como mostrado na Tabela 1.

De preferência, o método da divulgação inclui ainda corrigir as proporções dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma para o total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é positivo.

De preferência, a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total dos segmentos de ADN é como mostrado na Tabela 2.

De preferência, o método inclui calcular a proporção do número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na mesma amostra em relação ao número total de todos os segmentos de ADN com um comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb apenas por sequenciação e comparação dos resultados de todos os ADN com um comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, corrigir a proporção de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação.

De preferência, a sequenciação da biblioteca de sequenciação de ADN é realizada por sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, sequenciação de sequência longa de extremidade simples ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples.

De preferência, o ADN com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb é o ADN de 150 pb a 170 pb, mais preferencialmente o ADN de 167 pb.

Breve descrição dos Desenhos A fig. 1 é uma imagem obtida por electroforese em gel de agarose a 1% depois de preparar o ADN no plasma materno numa biblioteca por sequenciação de extremidade emparelhada. O canal esquerdo é uma imagem de marcador de ADN de 100 pb, o canal direito é uma imagem da biblioteca para sequenciação de extremidade emparelhada, e a faixa mais óbvia está localizada a cerca de 280 pb, contendo iniciadores de ligação de 120 pb. A fig. 2 é um gráfico da distribuição de tamanho do segmento de ADN da amostra de G356. A fig. 3 é um gráfico da distribuição do segmento de ADN do cromossoma X na amostra de comparação G356 feita de acordo com o tamanho do segmento. A fig. 4 é um gráfico de distribuição de segmentos de ADN calculados e efectivamente medidos do cromossoma X de G356 de acordo com o tamanho do segmento, em que a linha com asterisco representa um gráfico obtido multiplicando o número total de sequências de ADN da amostra G356 pela percentagem do cromossoma X, o círculo representa o número de sequências do cromossoma X realmente medido. Como mostrado na figura, a distribuição do segmento de ADN do cromossoma X de G356 calculada é a mesma que a distribuição realmente medida essencialmente, estas duas linhas são basicamente consistente uma com a outra.

As Figs. 5A-5H são curvas padrão desenhadas de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em G356, G397 (repetido durante 8 vezes), G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 e G825 e as proporções dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação aos segmentos de ADN total, em que as amostras G356, G397, G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 e G825 sao identificadas como amostras normais de feto do sexo feminino [46, XX] através de amniocentese por cariótipo de cromossoma no Xiangya Medical College of Central South University. O eixo X apresenta a proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação ao total de segmentos de ADN, o eixo Y representa o teor de GC de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados. Cada uma das figuras 5A-5F mostra curvas padrão de três cromossomas, mostrando curvas padrão ordenadas do Io até o 18° cromossoma, a fig. 5G mostra uma curva padrão do 19° até o 22° cromossoma, a fig. 5H mostra uma curva padrão do cromossoma X. As funções das curvas padrão de cada cromossoma são como apresentado na Tabela 1 e Tabela 2. A fig. 6 é um diagrama esquemático de uma amostra de trissomia 13 detectada pelo método da invenção, em que o eixo X representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 13 em relação ao total de segmentos de ADN, o eixo Y representa o teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma 13. 0 diamante no eixo X mostra a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 13 e o total de segmentos de ADN em cada amostra, o rectângulo indicado pela seta representa uma amostra de trissomia 13 detectada após a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma 13. Se a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados da presente invenção não for realizada, três amostras anormais indicadas pela seta não podem ser encontradas somente pela proporção dos segmentos de ADN do cromossoma 13 e o total de segmentos de ADN, e haveria um resultado falso negativo. A fig. 7 é um diagrama esquemático de uma amostra de trissomia 18 detectada pelo método da invenção, em que o eixo X representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 18 e o total de segmentos de ADN, o eixo Y representa o teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma 18. 0 diamante no eixo dos X mostra a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 18 e o total de segmentos de ADN em cada amostra, o rectângulo indicado pela seta representa uma amostra de trissomia 18 detectada após a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma 18. Se a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados da presente invenção não for realizada, só pode ser encontrado que 5 amostras em que a proporção entre o segmento de ADN do cromossoma 18 e o total de segmentos de ADN é superior ou igual a 0,031, é a trissomia 18, e não se pode constatar que duas amostras com uma proporção de cerca de 0,03 sejam anormais, apenas pela proporção entre os segmentos de ADN do cromossoma 18 e o total de segmentos de ADN, em relação às duas amostras, haveria um resultado falso negativo. A fig. 8 é um diagrama esquemático de uma amostra de monossomia ou trissomia do cromossoma X detectada pelo método da divulgação, em que o eixo X representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma X em relação ao total de segmentos de ADN, o eixo Y representa o teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma X. O diamante no eixo X mostra a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma X em relação ao total de segmentos de ADN em cada amostra, o rectângulo indicado pela seta na parte esquerda da curva padrão representa uma amostra de monossomia do cromossoma X detectada depois de corrigir o teor de CG de segmentos de ADN do cromossoma X, o rectângulo indicado pela seta no lado direito da curva padrão representa uma amostra de trissomia do cromossoma X detectada após a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma X. Se a correcção do teor de GC de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados da presente invenção não for realizada, só pode ser encontrada uma amostra de trissomia do cromossoma X e a amostra de monossomia do cromossoma X não pode ser facilmente encontrada apenas pela proporção entre os segmentos de ADN do cromossoma X em relação ao total de segmentos de ADN, e haveria um resultado falso negativo.

As figs. 9A a 9B são diagramas esquemáticos de uma amostra de trissomia 21 detectada pelo método da divulgação, em que o eixo X representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 21 em relação ao total de segmentos de ADN, o eixo Y representa o teor de GC dos

segmentos de ADN do cromossoma 21. 0 diamante no eixo X mostra a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma 21 e o total de segmentos de ADN em cada amostra, o rectângulo indicado pela seta representa uma amostra de trissomia 21 detectada após a correcção do teor de GC dos segmentos de ADN do cromossoma 18. Se for encontrado que apenas 4 amostras em que a proporção entre o segmento de ADN do cromossoma 21 na fig. 9 em relação ao total de segmentos de ADN é a máxima, é a trissomia 21, e não pode ser encontrado que as amostras com uma proporção de cerca de 0,0138 são anormais, apenas pela proporção entre os segmentos de ADN do cromossoma 18 e o total de segmentos de ADN em vez de por correcção do teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, no que diz respeito às amostras, há um resultado falso negativo.

Descrição detalhada das formas de realização

Deve notar-se que, sem contradição, as formas de realização da aplicação e as caracteristicas nas formas de realização podem ser combinadas. A invenção é descrita abaixo com referência aos desenhos junto com formas de realização. Os desenhos da presente invenção e as formas de realização são utilizados apenas para explicar a invenção, e não se destinam a limitar a invenção.

Definição dos termos

Sequência curta de extremidade emparelhada refere-se a uma sequência de menos de 50 pb ao lado do iniciador de ligação ao 5'-terminal e uma sequência de menos do que 50 pb ao lado do iniciador de ligação ao 3'-terminal. De um modo preferido, sequência curta de extremidade emparelhada refere-se a uma sequência de não mais de 36 pb ao lado do iniciador de ligação ao 5'-terminal e uma sequência de não mais de 36 pb ao lado do iniciador de ligação ao 3'-terminal.

Sequência curta de extremidade simples refere-se a uma sequência de menos do que 50 pb ao lado do iniciador de ligação ao 5'-terminal ou uma sequência de menos do que 50 pb ao lado do iniciador de ligação ao 3'-terminal. De preferência, sequência curta de extremidade simples refere-se a uma sequência de não mais de 36 pb ao lado ao lado do iniciador de ligação ao 5'-terminal ou uma sequência de não mais de 36 pb ao lado ao lado do iniciador de ligação ao 3'-terminal.

Sequência longa de extremidade simples refere-se a uma sequência de mais de 99 pb ao lado ao lado do iniciador de ligação ao 5'-terminal ou uma sequência de mais de 99 pb ao lado ao lado do iniciador de ligação ao 3'-terminal. Sequenciação de extremidade emparelhada refere-se a testar a sequência em ambas as extremidades da sequência. Sequenciação de extremidade simples refere-se a testar a sequência numa das extremidades da sequência.

Agrupamento (cluster) de ADN refere-se a múltiplas moléculas de ADN formadas pela amplificação de uma molécula de ADN e localizada numa área de superfície fixa. Nas formas de realização do pedido, agrupamento de ADN refere-se a cerca de 1000 moléculas de ADN formadas por amplificação de uma molécula de ADN e localizadas dentro de 1 micrómetro quadrado.

Emulsão de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) refere-se a realizar a reacção de PCR, colocando os reagentes de PCR, incluindo ADN molde de PCR, iniciador de PCR, PCR polimerase e bases livres dentro de uma goticula de óleo.

Normalmente, dentro de uma gota de óleo, o molde de emulsão de PCR tem apenas uma molécula de ADN.

Teor de GC refere-se à proporção do número de guanina e citosina em relação ao número total de todas as bases em ácidos nucleicos ou ácidos desoxirribonucleicos.

Forma de realização 1: Um método para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais

Etapa 1: Colecta de sangue materno para preparar plasma.

Na forma de realização, 14 amostras de sangue materno são extraídas, códigos de amostra: G356, G397, G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 e G825, todas identificadas como amostras fetos normais do sexo feminino [46, XX] pelo Professor Wu Lingqian do Xiangya Medical College of Central South University através da amniocentese por cariótipo de cromossomas. Os dados detectados das amostras acima são utilizados para desenhar uma curva padrão e as amostras acima também são utilizadas como amostras padrão. As amostras de plasma das quais as células sanguíneas são removidas são obtidas após centrifugação das amostras de sangue a alta velocidade, e cada amostra tem um volume de plasma de cerca de 1 mL.

Etapa 2: Extracção do ADN do plasma. 0 ADN no plasma é extraído utilizando o kit de extracção de ADN produzido pela Qiagen (número de produto: 57704). Etapa 3: Preparação do ADN no plasma numa biblioteca de sequenciação. O ADN do plasma pode ser preparado numa biblioteca para sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples.

0 processo para preparar a biblioteca para sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada é como a sequir. 0 ADN extraído tem a extremidade feita cega e é submetido a fosforilação do 5'-terminal: 30 pL de ADN, 45 pL de água pura, 10 pL de tampão T4 ADN ligase com ATP 10 mM, 4 pL de mistura de dNTP 10 mM, 5 pL de polimerase de ADN T4, 1 pL de enzima de Klenow e 5 pL de PNK T4 são tratados num banho aquecido durante 30 min a 20 °C após a mistura (os reagentes são fornecidos pelo kit de preparação de amostra da Illumina PE-102-1001) . O ADN é purificado pelo kit de purificação de PCR QIAquick da QIAGEN (Part # 28104) depois de tratamento em banho morno.

Suspensão de A no terminal: o produto resultante da etapa acima é dissolvido em 32 pL de tampão, 5 pL de tampão Klenow, 10 pL de dATP 1 mM e 3 pL de Klenow Exo são adicionados à mistura, e mantidos durante 30 min a 37 °C (os reagentes são fornecidos pelo kit de preparação de amostra da Illumina PE-102-1001), o produto resultante é purificado pelo kit de purificação de PCR Qiagen MinElute (parte # 28004).

Ligação: o ADN é dissolvido em 10 pL de tampão, 2 x 25 pL de tampão ADN ligase, 10 pL de mistura PE Adapter Oligo e 5 pL de ADN ligase são adicionados à mistura, e mantidos durante 15 min a 20 °C (os reagentes são fornecidos pelo kit de preparação de amostra da Illumina PE-102-1001). O ADN é purificado pelo kit de purificação QIAGEN QIAquickPCR (Part # 28104) depois de tratamento em banho morno. A fig. 1 é uma imagem de electroforese em gel, em que os ADN numa amostra são preparados numa biblioteca por sequenciação de extremidade emparelhada, os ADN na biblioteca que estão submetidos a electroforese em 1% de gel de agarose, a faixa mais óbvia está localizada em 280 pb, pelo facto de conter 120 pb de iniciadores de ligação, os principais segmentos de ADN no plasma materno concentram-se principalmente em cerca de 160 pb.

De preferência, a amplificação por PCR também pode ser realizada na biblioteca por sequenciação de extremidade emparelhada: 1 yL de ADN, 22 yL de água pura, 1 pL de iniciador de PCR PE PE 2,0, 1 pL de iniciador PE PCR PE 1,0 e 2x Phusion ADN polimerase (Finnzymes Oy) (os reagentes são fornecidos pelo kit de preparação de amostra da Illumina PE-102-1001). O ADN é amplificado através de instrumento PCR, o processo tem ciclos de 98 °C, 30 s, 98 °C, 40 s, 65 °C, 30 s, 72 °C, 30 s, 12 ciclos no total, 72 °C, 5 min.

Etapa 4: Sequenciação da biblioteca de sequenciação de ADN. De acordo com as diferentes bibliotecas preparadas na Etapa 3, a sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, sequenciação de sequência longa de extremidade simples ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples podem ser realizadas respectivamente. O processo para a realização da sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada é como se segue.

Molécula única de ADN em biblioteca de sequenciação de extremidade emparelhada é preparada em agrupamento de ADN por instrumento cBOT da Illumina, esta etapa pode também ser uma etapa de alteração da molécula única de ADN em polimolécula numa goticula por emulsão de PCR. O agrupamento de ADN gerado ou goticula de ADN obtida por emulsão de PCR é submetido a sequenciação de extremidade emparelhada no Genome Analyzer ou sequenciador HiSeq2000 da Illumina. O processo é concluído automaticamente pelo próprio instrumento.

Alternativamente, o agrupamento de ADN gerado ou goticula de ADN obtida por PCR em emulsão é submetido a sequenciação de sequência longa de extremidade simples no Genome Analyzer ou HiSeq2000 da Illumina, ou sequenciador SOLiD da Life Technologies. As etapas de sequenciação e condições de reacção no Genoma Analyzer ou HiSeq2000 da Ilumina, ou sequenciador SOLiD de Life Technologies são as mesmas como acima descrito.

Etapa 5: Determinação de qual cromossoma o segmento de ADN no plasma é proveniente e determinação se o número de cópias dos cromossomas a serem detectados é normal.

Depois de realizar a sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada da biblioteca de ADN (em alternativa, medir a sequenciação de sequência longa de extremidade simples ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples), quando cada sequência de base de 36 pb em cada extremidade de um segmento de ADN é conhecida, as sequências em ambas as extremidades podem ser comparadas com a sequência padrão 37.1 do genoma humano (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/ human/data/?build=37), que também é chamada hgl9 para determinar a respectiva posição das sequências em ambas as extremidades no cromossoma. A distância entre as sequências em ambas as extremidades é o comprimento do segmento de ADN, ao mesmo tempo, a posição cromossómica das sequências em ambas as extremidades determina de qual cromossoma o segmento de ADN é proveniente. A fig. 2 é um gráfico da distribuição de tamanho de segmento de ADN da amostra G356 determinada de acordo com o método acima, a partir do qual o ADN curto no plasma materno principalmente foca entre 100 pb e 220 pb. A fig. 3 é um gráfico de distribuição do segmento de ADN a do cromossoma X na amostra de comparação G356 feita de acordo com o tamanho do segmento. O gráfico obtido é substancialmente o mesmo que na fig. 2.

Etapa 6: Cálculo da proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados a todos os segmentos de ADN no ADN da mesma amostra, correcção da proporção de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, e cálculo da variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados numa amostra a ser detectada, e determinação do número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação.

De preferência, o método inclui o cálculo da proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na mesma amostra para o número total de todos os segmentos de ADN com um comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb por sequenciação e comparação dos resultados de todos os ADN com um comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb de comprimento da sequência de ADN, correcção da proporção de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados, e cálculo da variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada, e determinação do número de cópias dos cromossomas serem detectados de acordo com o grau de variação.

Em experiências, constatou-se que a precisão do resultado experimental pode ser melhorada por sequenciação e comparação dos resultados de todos os ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb de comprimento da sequência de ADN. 0 algoritmo específico é como se segue: Utilizando amostras padrão, calcular a proporção entre os segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na mesma amostra para todos os segmentos de ADN, obter o teor de GC do segmento de ADN dos cromossomas a serem detectados de acordo com o resultados de sequenciação; desenhar uma curva padrão do teor de GC (eixo Y) e a percentagem (eixo X) de cada cromossoma ou cromossoma parcial para todos os cromossomas de acordo com a proporção acima e teor de GC; corrigir a proporção medida do cromossoma da amostra a ser detectada num valor de GC fixo (normalmente média aritmética do valor de GC) de acordo com a sua própria função do cromossoma; e calcular o valor da variação de Z da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectadas na amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o valor Z.

As Figs. 5A-5H são curvas padrão desenhadas de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em amostras medidas e as proporções dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação ao total de segmentos de ADN. Pode ser visto nas figuras que o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 18 e X estão, respectivamente, na proporção inversa das proporções entre os segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN, as relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é negativo. Deve notar-se que, no que diz respeito às amostras de referência diferentes, pequenas alterações podem ocorrer em parâmetros específicos da fórmula, mas a tendência geral é inalterada. As funções dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 18 e X são apresentados na Tabela 1:

Tabela 1

0 teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 estão, respectivamente, na proporção das relações dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total os segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é positivo.

Tabela 2

Em seguida, a proporção medida do cromossoma da amostra a ser detectada é corrigida para um valor fixo de GC (geralmente média aritmética do valor de GC) de acordo com a sua própria função do cromossoma.

Por exemplo, pode-se observar pela função y = ax + b representada pelo teor de GC dos segmentos de ADN de cada cromossoma e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN que, a proporção x dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN em cada amostra pode ser corrigida através da função de acordo com o valor de GC. A fórmula de correcção pode ser

* em que x é a proporção corrigida dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN; e é a proporção do segmento de cromossoma especificado em relação ao total de segmentos de ADN na amostra detectada; y é o teor de GC do segmento de cromossoma especificado na amostra a ser detectada; é a média aritmética do valor de CG do segmento de cromossoma na amostra padrão detectada (amostra normal conhecida, tal como 14 amostras padrão normais conhecidas detectadas na forma de realização 1). a é o declive desta curva. Para a função de cada cromossoma, ver Tabela 1 e Tabela 2; para diferentes amostras, e e são valores medidos deste teste, que variam juntamente com amostras diferentes a serem detectadas.

Através de cálculo dos valores médios desses valores X corrigidos e erros padrão, valor de Z é obtido; Z = (proporção corrigida x de amostra a ser detectada - valor médio corrigido da proporção de cada amostra padrão)/erro padrão. É calculada a variação da proporção x corrigida em cada amostra a ser detectada, e o número de cópias dos cromossomas a serem detectados ou cromossomas parciais a serem detectados é determinado de acordo com o valor de Z de variação. Em geral, o valor absoluto de Z inferior a 3 é considerado como um erro de detecção normal, e o valor absoluto de Z superior a 3 é considerado como sendo anormal.

As Tabelas 3, 4 e 5 a seguir mostram resultados de detecção e correcção dos cromossomas 13, 18 e 21 calculados através da detecção das amostras G356, G397 (repetida por 8 vezes), G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778 , G779, G780, G781, G824 e G825 com o método da forma de realização 1.

Tabela 3: Tabela de correcção do cromossoma 13

Tabela 4: Tabela de correcção do cromossoma 18

Tabela 5: Tabela de correcção do cromossoma 21

Note-se que, o método de detecção e cálculo acima não só é adequado para detectar a anormalidade do número de cópias de todo o cromossoma, mas é também adequado para detectar a anormalidade do número de cópias do cromossoma parcial. Encontra-se abaixo uma forma de realização em que é detectado o número de cópias do cromossoma 13 fetal numa amostra a ser detectada.

Como descrito acima, é extraído um total de 15 amostras de sangue materno, amostras de plasma das quais as células sanguíneas são removidas são obtidas após centrifugação das amostras de sangue a alta velocidade, e cada amostra tem um volume de plasma de cerca de 1 mL. 0 código de amostra é G352, G362, G372, G383, G397 (repetida por 8 vezes), G402, G409, G415, G424, G445, G440, G503, G588, G735 e G783. As amostras acima são colectadas pelo

Professor Wu Lingqian do Xiangya Medical College of Central South University. É detectada a trissomia 13, que possivelmente está presente. 0 resultado da detecção é verificado por meio da curva padrão do cromossoma 13 obtida acima. Como mostrado na fig. 6, na ausência de correcção de GC (marcado com diamante no eixo X na figura), é impossível distinguir as amostras de trissomia 13 G445, G352 e G402 (amostras marcadas com 3 círculos no eixo X) das amostras normais (amostras sem marcas no eixo x) . No entanto, na presença de correcção de GC (representado pelo rectângulo na figura), é possível distinguir claramente as amostras de trissomia 13 G445, G352 e G402 (amostras marcadas com 3 setas na figura) das amostras normais (outras amostras representadas por rectângulo na figura). 0 resultado da correcção de GC é o mesmo resultado que foi identificado pelo Professor Wu Lingqian do Xiangya Medical College of Central South University através da amniocentese por cariótipo de cromossoma. Como resultado, a correcção do teor de GC pode ser usada para a detecção de trissomia 13, para reduzir a ocorrência de resultado falso negativo. A Tabela 6 a seguir apenas ilustra o resultado da detecção e cálculo de parte de amostras a serem detectadas, e não ilustra o resultado de outras amostras.

Tabela 6: Tabela de Cálculo do valor de Z do cromossoma 13 corrigido

Pode ser visto pela tabela acima que, o valor de Z das amostras G445, G352, G402 é superior a 3, que pode ser julgado como trissomia 13. 0 valor de Z de outras amostras é entre -3 e +3.

Encontra-se abaixo uma forma de realização em que foi detectado o número de cópias do cromossoma 18 fetal numa amostra a ser detectada.

Como descrito acima, é extraído um total de 16 amostras de sangue materno, amostras de plasma das quais as células sanguíneas são removidas são obtidas após centrifugação das amostras de sangue a alta velocidade, e cada amostra tem um volume de plasma de cerca de 1 mL. 0 código de amostra é G362, G372, G383, G397 (repetida por 8 vezes), G407, G409, G415, G424, G442, G432, G445, G440, G595, G588, G735 e G783. As amostras acima são colectadas pelo Professor Wu Lingqian de Xiangya Medical College of Central South University. É detectada a trissomia 18, que possivelmente está presente. Como mostrado na fig. 7, o resultado da detecção é verificado por meio de curva padrão do cromossoma 18 obtida acima. Na ausência de correcção de GC (marcado com diamante no eixo X na figura), é impossível distinguir algumas amostras de trissomia 18 (amostras marcadas com um círculo no eixo x) das amostras normais (amostras sem marcas no X eixo representadas por diamante) , que resultam em amostras negativas falsas. Outros amostras de trissomia 18 (amostras marcados com seta para baixo no eixo X) podem ser detectadas sem correcção de GC. No entanto, na presença de correcção de GC (representado por rectângulo na figura) , é possível distinguir claramente todas as amostras de trissomia 18 (amostras marcadas com setas horizontais na figura) das amostras normais (outras amostras representadas por rectângulo na figura). 0 resultado da correcção de GC é o mesmo que o resultado identificado pelo Professor Wu Lingqian de Xiangya Medicai College of Central South University amniocentese por cariótipo de cromossoma. Como resultado, a correcção do teor de GC pode ser usada para a detecção de trissomia 18, para reduzir a ocorrência de resultado falso negativo. A tabela 7 a seguir ilustra apenas o resultado de detecção e cálculo de parte das amostras a serem detectadas, e não ilustram o resultado de outras amostras.

Tabela 7: Tabela de Cálculo do valor de Z do cromossoma 18 corrigido

Pode ser visto pela tabela acima que, o valor de Z das amostras G424, G442, G432, G415, G595, G407 é superior a 3, que podem ser julgadas como trissomia 18. O valor de Z de outras amostras é entre -3 e +3.

Encontra-se abaixo uma forma de realização em que é detectado o número de cópias do cromossoma 21 fetal numa amostra a ser detectada.

Como descrito acima, é extraído um total de 14 amostras de sangue materno, amostras de plasma das quais as células sanguíneas são removidas são obtidas após centrifugação das amostras de sangue a alta velocidade, e cada amostra tem um volume de plasma de cerca de 1 mL. 0 código de amostra é G267, G387, G393, G376, G397 (repetida por 8 vezes), G405, G408, G409, G440, G491, G588, G641, G735 e G783. As amostras acima são colectadas pelo Professor Wu

Lingqian do Xiangya Medical College of Central South University. É detectada a trissomia 21 (ou seja, amostra da sindrome de Down), que possivelmente está presente. Como mostrado na fig. 9A, o resultado da detecção é verificado por meio de curva padrão do cromossoma 21 obtida acima. Na ausência de correcção de GC (marcado com diamante no eixo X na figura), a amostra de trissomia 21 (uma amostra marcada por círculos pretos e 3 setas verticais no eixo X) pode ser detectada apenas pela percentagem da trissomia 21 em todos os cromossomas. A diferença entre uma amostra (uma amostra marcada com o círculo sobre o eixo x) e amostra normal (outras amostras comercializadas com diamante) não é óbvia, o que pode resultar em amostras negativas falsas. No entanto, na presença de correcção de GC (representado por rectângulo na figura), é possível distinguir claramente as amostras de trissomia 21 (amostras marcadas com 4 setas horizontais na figura) das amostras normais (outras amostras representadas por rectângulo na figura). 0 resultado da correcção de GC é o mesmo que o resultado identificado pelo Professor Wu Lingqian do Xiangya Medicai College of Central South University através de amniocentese por cariótipo de cromossoma. A melhoria da precisão de trissomia 21 por correcção do teor de GC pode ser medida pela distância mínima entre a trissomia 21 e a amostra normal. Como mostrado na fig. 9B, a distância mínima corrigida dl é mais do que a distância mínima d2 que não foi corrigida. Como resultado, a correcção do teor de GC pode ser usada para a detecção de trissomia 21, para reduzir a ocorrência de resultado falso negativo. A Tabela 8 a seguir ilustra somente o resultado da detecção e cálculo de parte das amostras a serem detectadas, e não ilustra o resultado de outras amostras.

Tabela 8: Tabela de Cálculo do valor de Z do cromossoma 21 corrigido

Pode ser visto pela tabela acima que o valor de Z das amostras G405, G387, G376, G393 é superior a 3, que podem ser julgadas como trissomia 21. 0 valor de Z de outras amostras é entre -3 e + 3.

Forma de realização 2: Um kit para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais

No que diz respeito ao método de detecção da forma de realização 1, o inventor do pedido desenvolve um kit para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais, que inclui: um instrumento de colheita de sangue de uma mulher grávida ou um doente com tumor, que pode ser qualquer agulha de colecta de sangue para colecta de sangue, seringa ou outros semelhantes; um instrumento para a separação de células sanguíneas do plasma no sangue, que pode ser um micro-tubo adequado para conter sangue numa centrífuga ou qualquer outro recipiente ou instrumento para separação.

Reagentes e instrumentos para a extracção de ADN do plasma, que podem incluir proteases, fenol saturado, clorofórmio: isoamilol (24:1), acetato de sódio, álcool anidro, etanol a 70%, solução de TE, etc., o ADN no plasma pode ser extraído utilizando o kit de extracção de ADN produzido pela Qiagen (número de produto: 57704) e quaisquer outros reagentes ou recipientes para extracção de ADN;

Um reagente e um instrumento para a preparação do ADN numa biblioteca de sequenciação, a biblioteca de sequenciação pode ser uma biblioteca para sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, uma biblioteca para sequenciação de sequência longa de extremidade simples ou uma biblioteca para sequenciação de sequência curta de extremidade simples, um reagente e um instrumento para a preparação do ADN na biblioteca para sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada inclui: tampão T4 ADN ligase com ATP 10 mM, mistura de dNTP 10 mM, T4 ADN polimerase, enzima Klenow e T4 PNK (os reagentes acima são fornecidos pelo kit de preparação de amostra PE-102-101 da Illumina), bem como resina de troca iónica com afinidade ao ADN em certas circunstâncias para realizar a separação do ADN, também podem ser seleccionados o kit de separação de produto por PCR QIAGEN QIAquick (número do produto: # 28104) ou QIAGEN MinElute PCR (número do produto: # 28004);

Um reagente e um instrumento para a sequenciação do ADN, que pode ser utilizado para a realização de sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada, sequenciação de sequência longa de extremidade simples ou sequenciação de sequência curta de extremidade simples no ADN. Um reagente e um instrumento para realizar sequenciação de sequência curta de extremidade emparelhada pode incluir o iniciador PE PCR PE 2.0, o iniciador PE PCR PE 1.0, Phusion DNA polimerase (Finnzymes Oy) (os reagentes são fornecidos pelo kit de preparação de amostra PE-102-1001 da Illumina.

Forma de realização 3: Outro kit para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais O inventor do pedido desenvolve outro kit para a detecção do número de cópias do cromossoma fetal ou cromossomas de células tumorais, que inclui: um instrumento de colheita de sangue de uma mulher grávida ou um doente com tumor, que pode ser qualquer agulha de recolha de sangue para recolha de sangue, seringa ou outros semelhantes; um instrumento para a separação das células sanguíneas do plasma no sangue, que pode ser um micro-tubo adequado para conter sangue numa centrífuga ou qualquer outro recipiente ou instrumento para a separação;

Um reagente e um instrumento para a extracção do ADN do plasma, que pode incluir protease, fenol saturado, clorofórmio: isoamilol (24:1), acetato de sódio, álcool anidro, etanol a 70%, solução de TE, etc., o ADN no plasma pode ser extraído utilizando o kit de extracção de ADN produzido pela Qiagen (número de produto: 57704) e quaisquer outros reagentes ou recipientes para extracção do ADN;

Um reagente e um instrumento para a separação do ADN com um método físico de acordo com o tamanho dos segmentos de ADN, que podem incluir: pó de agarose (Biowest 11860), marcador (marcador de ADN de 100 pb Takara, número de produto: D505A), etc.; e

Um reagente e um instrumento para a sequenciação do ADN com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, que pode incluir um dispositivo de corte para o corte de gel de agarose dentro de um certo intervalo.

De preferência, o kit pode incluir um reagente e um instrumento para amplificar o ADN recuperado do corte de gel de agarose e preparar o mesmo numa biblioteca de sequenciação.

Forma de realização 4: Um dispositivo para a detecção do numero de cópias de cromossoma fetal ou cromossomas de células tumorais

Um dispositivo para a detecção do número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais inclui: um módulo de detecção, que está adaptado para a sequenciação de ADN numa amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor, em que a sequenciação inclui uma etapa de preparar todo o ADN na amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor numa biblioteca de sequenciação para sequenciar o ADN na amostra de plasma materno, o módulo de detecção pode inclui o instrumento cBOT da Illumina e Genome Analyzer ou sequenciador HiSeq2000 da Illumina ou sequenciador SOLiD da ABI; um módulo de comparação, que está adaptado para comparar um resultado de sequenciação do ADN com um mapa de sequência genómica para determinar de qual cromossoma cada sequência de ADN é proveniente e o comprimento de sequência de cada segmento de ADN, o módulo de comparação pode ser a base de dados de sequência padrão do genoma humano hgl9; um módulo de cálculo, que está adaptado para calcular a proporção entre o número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados a todos os segmentos de ADN na mesma amostra, corrigir a proporção de acordo com um teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados numa amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação; e um módulo de saida, que está adaptado para emitir o número de cópias dos cromossomas a serem detectados.

Opcionalmente, o módulo de detecção é capaz de detectar todos os segmentos de ADN da amostra, podem também apenas detectar todo o ADN com o comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb tal como 150 pb a 175 pb, o módulo de detecção pode ser um módulo ou um dispositivo para a realização de electroforese em gel de agarose pela inclusão de um reagente e um instrumento para a separação do ADN no plasma materno de acordo com o tamanho do segmento de ADN a montante do dispositivo de detecção.

Obviamente, os especialistas na técnica devem compreender que alguns módulos ou algumas etapas da invenção podem ser implementados por meio de dispositivos de computação gerais. Os módulos ou etapas podem concentrar-se num único dispositivo de computação, ou serem distribuídos na rede composta por vários dispositivos de computação. Opcionalmente, os módulos ou etapas podem ser implementados pelo código de programa executável no dispositivo de computação, desse modo armazenando os mesmos num dispositivo de armazenamento e execução pelo dispositivo de computação, ou implementando os módulos ou etapas tornando-os em cada módulo do circuito integrado respectivamente, ou tornando muitos dos módulos ou etapas num módulo de circuito integrado único. Desse modo, a invenção não fica limitada à combinação de qualquer hardware e software em particular. A descrição acima é apenas uma forma de realização preferida da invenção e não se destina a limitar o âmbito de protecção da invenção. Para os especialistas na técnica, diversas variações e modificações podem ser feitas à invenção.

Referências: 1. Cunningham F, et al. (2002) In Williams Obstretrics (McGraw-Hill Professional, Nova Iorque), p942. 2. Wapner R, et al. (2003) First-trimester screening for trisomies 21 and 18. N Engl J Med, 349:1405-1413. 3. Lo YM, et al. (1997) Presence of fetal DAN in maternal plasma and serum. Lancet, 350: 485-487. 4. Lo YM, et al. (2007) Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med, 13: 218-223. 5. Tong YK, et al. (2006) Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma: Theoretical and empirical considerations. Clin Chem, 52: 2194-2202. 6. Fan HC, Quake SR. (2007) Detection of aneuploidy with digital polymerase chain reaction. Anal Chem, 79: 7576- 7579. 7. Lo YM, et al. (2007) Digital PCR for molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc Natl Acad

Sei EUA, 104: 13116-13121. 8. Bentley DR, et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 456: 53-59. 9. McKernan KJ, et al. (2009) Sequence and structure variation in a human genome uncovered by short-read, massively parallel ligation sequencing using two-base encoding. Genome Research, 119: 1527-1541.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo para detectar o número de cópias de cromossomas fetais ou cromossomas de células tumorais, caracterizado por compreender: um módulo de detecção, que é adaptado para a sequenciação do ADN numa amostra de plasma materno ou de plasma de doente com tumor, em que a sequenciação inclui a preparação de todo o ADN na amostra de plasma materno ou do plasma de doente com tumor numa biblioteca de sequenciação; um módulo de comparação, que é adaptado para comparar um resultado de sequenciação do ADN com um mapa de sequência genómica para determinar de qual cromossoma cada sequência de ADN é proveniente e o comprimento de cada sequência de ADN; um módulo de cálculo, que é adaptado para calcular a proporção do número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em relação ao número total de segmentos de ADN na mesma amostra, corrigir a proporção de acordo com um teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados; e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados numa amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação; em que o módulo de cálculo corrige a proporção de acordo com um teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN de cada cromossoma, respectivamente tem relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN, e a relação linear pode ser representada por Y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção do número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, a e b podem ser valores diferentes para diferentes cromossomas; e um módulo de saída, que é adaptado para emitir o número de cópias dos cromossomas a serem detectados.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o módulo de cálculo corrigir as proporções dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X tem, respectivamente, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma do total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é negativo; e, em que, de preferência, a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 e X e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN é dada a seguir:
3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o módulo de cálculo corrigir as proporções dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 de acordo com a seguinte função: o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22, respectivamente, te, relações lineares com as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma do total de segmentos de ADN, a relação linear pode ser representada por y = ax + b, em que y representa o teor de GC do segmento de ADN do cromossoma a ser detectado, x representa a proporção entre o número de segmentos de ADN do cromossoma a ser detectado em relação ao ADN total, a e b são constantes, e a é positivo; de preferência, em que a relação linear entre o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 e 22 e as proporções dos segmentos de ADN de cada cromossoma em relação ao total de segmentos de ADN é dada a seguir:
4. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o módulo de cálculo ser adaptado para calcular a proporção do número de segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados em todo o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na mesma amostra em relação ao número total de todos os segmentos de ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, corrigir a proporção de acordo com o teor de GC dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados no ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb, e calcular a variação da proporção corrigida dos segmentos de ADN dos cromossomas a serem detectados na amostra a ser detectada, e determinar o número de cópias dos cromossomas a serem detectados de acordo com o grau de variação.
5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb na amostra de plasma materno ou plasma de doente com tumor ser preparado numa biblioteca de sequenciação; de preferência, em que o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb é o ADN de 150 pb a 170 pb; e, mais preferencialmente, em que o ADN com comprimento em qualquer ponto ou em qualquer intervalo dentro da gama de 100 pb a 250 pb é o ADN de 167 pb.