WO2019009431A1 - 腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法 - Google Patents

腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法 Download PDF

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mutations
tumor
dna
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菊也 加藤
洋児 久木田
和宏 片山
和良 大川
良司 高田
Original Assignee
株式会社Ｄｎａチップ研究所
地方独立行政法人 大阪府立病院機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention is a method for highly accurately identifying a mutation generated in a tumor cell and a mutation generated in a normal cell among mutations detected in a subject, and in particular, identifying a mutation in DNA in the subject.
  • the present invention relates to a method for identifying with high precision mutations that have occurred in tumor cells.
  • Circulating tumor DNA is cell-free DNA (cfDNA) in which the genomic DNA of cancer cells destroyed by apoptosis or immunity is leaked into the blood (cfDNA), and combined with the information on tumor specific mutations, the cancer bio It is expected to be used as a marker and a wide range of applications such as early detection and monitoring of drug resistance.
  • ctDNA can be obtained from the blood of a subject, which enables noninvasive diagnosis. Therefore, although diagnostic application of ctDNA to cancer is desired, one milliliter of blood contains cfDNA derived from 1 to several thousand genomes fragmented into 170 base pairs on average. It is extremely difficult to detect and quantify mutations that occur in cancer cells from among the vast amount of DNA.
  • NGS next-generation sequencing
  • the present inventors introduce a molecular barcode sequence into the sequencing sequence (Patent Document 1).
  • This molecular barcode technology labels DNA fragments with random sequences, often 10 to 15 bases, to identify leads from individual molecules and allow grouping of leads from each molecule. That is, creating a lead consensus allows high quality DNA sequencing to be provided and allows sequencing of the sequenced molecules.
  • Double-stranded sequencing technology can distinguish between a mutation (mutation) present in double strand of DNA and a mutation (DNA damage) present in only one strand (Non-patent Document 1). . Therefore, although comprehensive analysis of cfDNA derived from cancer patients using double strand sequencing technology is very useful in elucidating the cause of mutations, double strand sequencing technology provides a huge amount of DNA. As it is required, it is not suitable as a diagnostic application (Non-patent Document 2). Therefore, it is desirable to develop a more accurate method that can be used in diagnostic applications to distinguish between mutations in tumor cells and mutations in normal cells for mutations in the subject's cfDNA. There is.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a method for identifying a mutation generated in a tumor cell with high accuracy by identifying a mutation in DNA in a subject. .
  • COSMIC cancer somatic cell mutation catalog
  • a mutation generated in a tumor cell and a mutation generated in a normal cell are accurately distinguished.
  • a method comprising identifying a mutation in DNA of a subject, and collating the identified mutation with a database in which cancer specific mutations are accumulated, wherein the identified mutation is the tumor.
  • Providing the step of determining the mutation derived from the tumor cell if the database is accumulated as a mutation specific for B or a predetermined threshold number of cases or more in the database.
  • a method for discriminating whether a mutation is caused in a tumor cell or a normal cell only by identifying a mutation in the DNA of a subject can be provided.
  • the presence or absence of a tumor cell in a subject can be confirmed through non-invasively and conveniently identifying the presence of a mutation in the subject, through which the subject can It can serve as a source for selecting a suitable treatment.
  • the DNA in the method of the first main aspect of the present invention described above, can be a cell-free DNA derived from blood.
  • said identified mutations accumulate as two or more somatic mutations in said database as somatic mutations. It can be done.
  • the tumor in the method of the first main aspect of the present invention described above, can be a pancreatic cancer.
  • the mutation is a mutation of the TP53 gene, and 10 or more somatic mutations are accumulated in the database.
  • the normal cells can also contain intraductal papillary mucinous tumor cells.
  • the blood may be a plasma component.
  • a mutation identification system for highly accurately discriminating between a generated mutation and a mutation generated in a normal cell comprising: a means for identifying a mutation in DNA of a subject; Is a means for referring to the accumulated database, wherein the identified mutation is accumulated as a tumor-specific mutation in the database as a predetermined threshold number of cases or more.
  • a system is provided having the means for matching to determine that it is a mutation of origin.
  • FIG. 1 is a reaction scheme showing the binding of barcode tags for a barcode sequence in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a scatter plot showing the distribution of the number of filtered variants in the sample data and the number of variants filtered out in one embodiment of the present invention.
  • the present invention is a method for highly accurately identifying, among mutations detected from a subject, a mutation generated in a tumor cell and a mutation generated in a normal cell, which is sudden in the DNA of the subject. Identifying a mutation, and collating the identified mutation with a database in which cancer specific mutations are accumulated, wherein the identified mutation is identified as a mutation specific to the tumor in the database. And D. determining that the mutation is derived from the tumor cell, if they are accumulated for a predetermined threshold number of cases or more.
  • a mutation caused in a tumor cell refers to a mutation in circulating tumor DNA (ctDNA), which is free DNA derived from a tumor suspended in the blood of a subject.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • liquid biopsy based on ctDNA having a mutation specific to a specific cancer it is possible to detect cancer before diagnosis of cancer by methods such as imaging diagnosis, and also to judge success of treatment. It becomes possible.
  • ctDNA is known to be present in a very small amount compared to normal cell DNA.
  • a mutation that occurs in normal cells refers to a mutation in cell-free DNA (cfDNA) that is released from cells into plasma by the death of normal cells in a subject.
  • cfDNA cell-free DNA
  • the “database in which cancer specific mutations are accumulated” is obtained from a nucleotide sequence derived from cancer tissue in which a unique mutation present in various cancer tissues is captured in base units. It may be a database that comprehensively accumulates information on somatic mutations associated with cancer such as single nucleotide polymorphisms, copy number mutations, structural polymorphisms and the like.
  • a “database in which cancer specific mutations are accumulated” Catalog Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC), The Cancer Genome Atlas (TCGA), International Cancer Genome Consortium (ICGC), etc. can be used. It is not limited to this.
  • the “predetermined threshold number of cases” refers to the above-mentioned database when determining whether the identified mutation is a mutation derived from a tumor cell or a mutation derived from a normal cell. It refers to the number of cases that is the threshold of the judgment. For example, in a cancer or a tumor or gene in which a mutation occurs, such as the threshold number of cases is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more. It can be set as appropriate.
  • the identified mutation can be determined to be a tumor cell-derived mutation if it is accumulated as two or more cancer tissue mutations in the database.
  • the number of cases can be altered by the mutation or the gene from which the mutation occurs.
  • the threshold number of cases can be changed.
  • 10 or more mutations are accumulated in the above-mentioned database as mutations, it can also be determined as a mutation derived from a tumor cell.
  • the “predetermined threshold number of cases” may be appropriately changed according to the type of cancer, the type of mutation identified, the type of gene in which the mutation has occurred, and the like.
  • a predetermined threshold number of cases for determining such a mutation derived from a tumor cell can also be referred to as a CV78 filter.
  • a CV78 filter By processing with this filter, variants with a number of cases exceeding the set threshold can be selected and can be considered as a somatic mutation specific to tumor tissue, while other mutations below that number of cases The body can be excluded.
  • the threshold number of cases is set to 10 in the case of mutation of TP53 gene, and to 2 in the case of mutation of other genes.
  • the threshold number of cases can also be set to
  • intraductal papillary mucinous tumor (IPMN) cells can be included as normal cells. By doing so, it is also possible to distinguish IPMN from pancreatic cancer through whether the identified mutation is a pancreatic cancer cell-derived mutation or an IPMN cell-derived mutation.
  • IPMN intraductal papillary mucinous tumor
  • the "subject's DNA” may be DNA obtained from a subject, and the cell or tissue from which it is derived is not particularly limited.
  • the "subject's DNA” may be cell-free DNA derived from the subject's blood, in which case it is preferred to use the subject's plasma components.
  • the method for identifying mutations as described above is preferable as the number of accumulated samples in the database in which cancer specific mutations are accumulated is larger, and the accuracy of the identification method according to the present invention is also enhanced.
  • data relating to such accumulated samples can be stored in any database. That is, the present invention can also provide a database for storing such data, and an analyzer or system for reading out and executing the data and programs necessary for comparative analysis. According to such an analysis device or system, information on the mutation to be identified is accumulated for each subject of interest, and the accumulated information is taken out if necessary, and cancer specific mutations are accumulated. By collating with the database, among the mutations detected from the subject, mutations generated in tumor cells and mutations generated in normal cells can always be identified with high accuracy.
  • such a system is configured by connecting an external storage device such as a RAM, a ROM, an HDD, a magnetic disk, and an input / output interface (I / F) to a CPU built in a computer system via a system bus.
  • an external storage device such as a RAM, a ROM, an HDD, a magnetic disk, and an input / output interface (I / F)
  • I / F input / output interface
  • I / F input / output interface
  • the external storage device includes a ctDNA amount information DB, an image diagnostic information DB, and a program storage unit, and each is a fixed storage area secured in the storage device.
  • such a system can have a system for measuring and analyzing the amount of DNA and a system for identifying a mutation, and such a system includes nucleic acid collected from a subject by a blood collection tube for molecular diagnosis or the like.
  • a nucleic acid analyzer that performs nucleic acid analysis based on a biological sample can be included, and each can be electronically connected by a communication network such as a dedicated line or a public line.
  • Plasma preparation and DNA extraction were performed by conventional means. Tissue samples were also obtained using endoscope, ultrasound guidance, and fine needle aspiration. Written informed consent has been obtained from all patients, and this study has been approved by the Ethics Committee of the Osaka Prefectural Cancer Medical Center.
  • Adapters and Primers for Amplification of Target Region The target regions of genes associated with pancreatic cancer are shown in Table 1.
  • a 30-base long adapter sequence containing a primer sequence for ion torrent sequencing was linked to 5 bases serving as a solid indicator, 12 bases serving as a molecule indicator, and 20 bases serving as a spacer on the 3 'side.
  • the ligation product was purified twice with 1.2 volumes of AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Purified beads in 20 ⁇ l linear amplification solution containing 1 ⁇ Q5 reaction buffer (NEB), 0.2 mM dNTPs, 6 ⁇ M gene specific primer mix, and 0.4 units of Q5 hot start High Fidelity DNA polymerase (NEB) Mixed. After removing AMPure XP beads, amplification was performed as follows. 30 cycles at 98 ° C for denaturation followed by 15 cycles of 10 seconds at 98 ° C and 2 minutes at 65 ° C.
  • T_PCR_A 100 ⁇ M T_PCR_A was added to the reaction mixture and amplified at 15 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  • the amplification product was purified once with 1.2 volumes of AMPure XP and recovered with 20 ⁇ L of 0.1 ⁇ TE.
  • the FASTQ format reads were classified using a 5-base index for individual assignment.
  • the sequence between the 5 base index and the spacer sequence was used as a molecular barcode tag.
  • BWA-MEM was used to align the reads to the target region if the spacer and the following sequence had a total length greater than 50 bases.
  • the reads at the short mapping end were discarded.
  • Reads with the same barcode sequence were grouped together, and error barcode tag detection and removal was performed as described in US Pat.
  • a consensus sequence of reads with the same barcode was performed using VarScan. If it has the same base at a position where there is 85% or more of the lead, it is made a consensus base.
  • a Poisson distribution model was applied to calculate sequencing errors for detection of variants.
  • Each base position of codons 12 and 13 of the KRAS gene was evaluated at a specific threshold. This analysis did not consider common SNP sites and sites prone to errors.
  • the version of human reference genome is GRCh37 / hg19.
  • pancreatic cancer-related genes of KRAS, TP53, SMAD4, CTNNB1, CDKN2A, GNAS, HRAS, and NRAS were sequenced by the method described above.
  • the total size of the target region was 2.8 kb.
  • the barcode tagged adapter was directly coupled to the undigested end of cfDNA.
  • the target region was amplified using an adapter and a mixture of gene specific primers. The reaction scheme is shown in FIG. This library was sequenced on an ion torrent sequencer. Sequence reads were grouped using molecular barcodes. After removing the error sequences, high quality sequence data was used to construct a consensus sequence for each read group. The average number of molecules sequenced was 900 bases per target area.
  • the first data set was obtained from a cohort of 12 healthy people and 57 pancreatic cancer patients. The results of mutant detection are summarized in the upper half of Table 2. Twelve variants were found in healthy human samples (Table 3).
  • variants present at less than 1% reads do not affect the analysis of conventional applications of next-generation sequencers such as whole genome or exome sequencing, they pose a serious problem in the detection of ctDNA.
  • 5 out of 12 healthy individuals were determined to be mutant positive (Table 2). That is, even in a healthy person, there are five individuals who are judged to be positive for cancer specific mutations, and judging directly from the result of sequencing that they are positive for cancer specific mutations is pancreatic cancer Not suitable for the diagnosis of mutations in Therefore, we set up a mutant filter.
  • COSMIC Cancer Somatic Cell Mutation Catalog
  • CV78 filter Validation of the variants by CV 78 filter excluded all variants present in healthy individuals (Table 2). Filtered variants were defined as CV78 filter selected variants (Table 2). Insertion / deletion errors were rare in the experiments of this example and were therefore excluded from analysis (one defect and one insertion).
  • IPMN tubular papillary mucinous neoplasms
  • pancreatic cancer Identification of variants by initial sequencing followed by verification of the entire process of filtering variants for cancer specificity in a second independent sample set did.
  • This sample set includes plasma samples of 20 IPMN patients and 86 pancreatic cancer patients. Plasma samples from pancreatic cancer patients included in the second data set were obtained later than those of the patients included in the first data set, except for plasma samples paired with tissue samples. Only after the construction of the CV78 filter, a second set of all samples was assayed and analyzed.
  • IPMN is a neoplasm that grows in the pancreatic duct, so it is unlikely to release cfDNA into the bloodstream. KRAS mutations are hardly detected in the plasma of benign neoplasm patients. The distinction between IPMN and pancreatic cancer is believed to have substantial clinical benefit as a significant proportion of IPMN cases progress to pancreatic cancer.

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Abstract

【課題】　被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法を提供すること。 【解決手段】　被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有する、方法。

Description

腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法
　本発明は、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法、特に、被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法に関する。
　循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、アポトーシスや免疫によって破壊された癌細胞のゲノムＤＮＡが血中に漏出されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）であり、腫瘍特異的突然変異の情報と組み合わせることによって癌のバイオマーカーとしての利用や、薬剤耐性の早期検出およびモニタリングなどの幅広い用途が期待されている。また、ｃｔＤＮＡは被験者の血液から取得することができるため、非侵襲的な診断が可能となる。そのため、ｃｔＤＮＡの癌への診断適用が望まれているものの、１ミリリットルの血液中に平均して１７０塩基対に断片化された１から数千のゲノム由来のｃｆＤＮＡが含まれるため、正常細胞由来の膨大な量のＤＮＡの中から癌細胞で生じた突然変異を検出し定量することは極めて困難である。
　このような突然変異を検出するための技術としてデジタルＰＣＲや次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が用いられている。しかし、癌細胞で生じた突然変異はわずかな量しか血中に存在しないため、ＮＧＳによるシーケンシングエラー率は大きな問題となる。そこで本発明者らはこの問題を解決するため、シーケンシング配列に分子バーコード配列を導入している（特許文献１）。この分子バーコード技術によれば、多くの場合１０から１５塩基のランダムな配列でＤＮＡ断片をラベルし、個々の分子由来のリードを見分け、各分子由来のリードのグループ化を可能にする。つまり、リードのコンセンサスを作ることにより、高品質のＤＮＡシーケンシングを提供し、配列決定した分子を計数することができるようになる。
特許第６１２５７３１号
Schmitt MW, Kennedy SR, Salk JJ, Fox EJ, Hiatt JB, Loeb LA. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc Natl Acad Sci USA 2012;109:14508-13. Newman AM, Lovejoy AF, Klass DM, Kurtz DM, Chabon JJ, Scherer F, et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol 2016;34:547-55.
　しかしながら、このような分子バーコード技術によって配列を正確に読み取ることができたとしても、サンプル調製の際のＤＮＡ損傷によるゲノムＤＮＡ中の塩基置換のような、ＰＣＲ前に生じた塩基の相違については検出することができない。また正常組織あるいは血中セルフリーＤＮＡで低頻度に存在する体細胞突然変異についても、正常細胞由来のＤＮＡなのか、ごく少数存在する腫瘍細胞由来のＤＮＡなのかを区別することを困難とさせている。
　二本鎖シーケンシング技術は、ＤＮＡの二本の鎖に存在する変異（突然変異）と、一本の鎖にのみ存在する変異（ＤＮＡ損傷）とを区別することができる（非特許文献１）。そのため、二重鎖シーケンシング技術を用いた癌患者由来ｃｆＤＮＡの包括的な分析は変異の原因を解明する上で非常に有益であるものの、二重鎖シーケンシング技術には膨大な量のＤＮＡを必要とするため、診断用途としては適していない（非特許文献２）。そこで、被験者のｃｆＤＮＡの突然変異について、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを区別するために、診断用途で用いることのできるより高精度な方法の開発が望まれている。　
　本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、このような課題を解決するために、癌体細胞突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ）に集積された突然変異の特徴に着目した結果、健常人被験者で観察された突然変異の多くが、ＣＯＳＭＩＣに登録されていないか、または数エントリーしか登録されていないことがわかった。そこで鋭意研究を重ねた結果、癌組織における体細胞突然変異である可能性の低い変異体を除外できるフィルターを開発し、このフィルターを用いて被験者のＤＮＡにおける突然変異を解析することにより、腫瘍細胞で生じた突然変異なのか正常細胞で生じた突然変異なのかを見分けることができることを見出した。
　具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有する、方法が提供される。
　このような構成によれば、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定するだけで、その突然変異が腫瘍細胞で生じた突然変異なのか、正常細胞で生じた突然変異なのかを見分ける方法を提供することができる。また、このような構成によれば、非侵襲的かつ簡便に被験者における突然変異の存在を同定することを介して、被験者における腫瘍細胞の存在の有無を確認することができ、これを通して、被験者に適した治療法を選択するための材料として資することができる。
　また、本発明の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記ＤＮＡを血液由来のセルフリーＤＮＡとすることができる。
　さらに、本発明の他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記同定した突然変異が、体細胞突然変異として前記データベースに２例またはそれ以上集積されていることができる。
　また、本発明の別の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記腫瘍を膵臓癌とすることができる。この場合、前記突然変異がＴＰ５３遺伝子の変異であり、体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されていることが好ましい。またこの場合、前記正常細胞は膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞を含むこともできる。
　また、本発明のさらに別の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記血液を血漿成分とすることもできる。
　本発明の第二の主要な観点によれば、上述の第一の主要な観点に係る方法を実行するシステムが提供され、具体的には、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する突然変異識別システムであって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する手段と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する手段であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する手段とを有する、システムが提供される。
　なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
図１は、本願発明の一実施形態において、バーコードシーケンスのためのバーコードタグの結合を示す反応スキームである。 図２は、本発明の一実施形態において、サンプルデータにおけるフィルター処理された変異体数とフィルター処理によって除外された変異体数の分布を示すスキャッタープロットである。
　以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。　
　上記のとおり、本願発明は、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有するものである。
　本願明細書において、「腫瘍細胞で生じた突然変異」とは、被験者の血液中に浮遊している腫瘍由来の遊離ＤＮＡである循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異を指す。特定の癌に特有の突然変異を有するｃｔＤＮＡに基づくリキッドバイオプシーを用いることにより、画像診断などの方法で癌と診断されるよりも前に癌を発見することができ、また治療の奏功の判断が可能となる。なお、一般的に、血液中に存在するＤＮＡのうち、ｃｔＤＮＡは、正常細胞ＤＮＡに比べて非常に微量でしか存在しないことが知られている。
　本願明細書において、「正常細胞で生じた突然変異」とは、被験者の正常細胞の死滅によって細胞から血漿中に放出されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）における突然変異を指す。
　本願発明の一実施形態において、「癌特異的突然変異が集積されたデータベース」とは、種々の癌組織に存在する固有の突然変異を塩基単位で捉えた癌組織由来の塩基配列から得られるものであり、１塩基多型、コピー数変異、構造多型などの癌に関連する体細胞変異の情報を網羅的に集積したデータベースであればよい。例えば、「癌特異的突然変異が集積されたデータベース」としては、Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC)、The Cancer Genome Atlas（TCGA）、International Cancer Genome Consortium（ICGC）等を用いることができるが、これに限られるものではない。
　また、本願明細書において、「所定の閾値症例数」とは、同定した突然変異が腫瘍細胞由来の突然変異なのか正常細胞由来の突然変異なのかを上記のデータベースを用いて判定する際に、その判定の閾値となる症例数を指す。例えば、閾値症例数を２例、３例、４例、５例、６例、７例、８例、９例、１０例またはそれ以上などのように、突然変異が生じる癌または腫瘍または遺伝子に応じて適宜設定可能である。
　例えば、腫瘍が膵臓癌の場合、同定した突然変異が、癌組織突然変異としてデータベースに２例またはそれ以上集積されている場合に、腫瘍細胞由来の突然変異であると判定することもでき、この症例数はその突然変異や突然変異が生じる遺伝子によって変更することができる。ＴＰ５３遺伝子の場合は登録変異数が多く正常細胞の変異あるいは塩基配列決定時の誤りが多いため、同定した突然変異がＴＰ５３遺伝子の場合には閾値症例数を変更することもでき、例えば体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されている場合に、腫瘍細胞由来の突然変異であると判定することもできる。このように、本願明細書において、「所定の閾値症例数」とは、癌の種類、同定した突然変異の種類、突然変異が生じた遺伝子の種類等によって適宜変更することも可能である。
　本願発明の一実施形態において、このような腫瘍細胞由来の突然変異であると判定するための所定の閾値症例数をＣＶ７８フィルターと呼ぶこともできる。このフィルターによって処理することにより、設定した閾値を超える症例数を有する変異体が選択され、腫瘍組織に特異的な体細胞突然変異とみなすことができ、一方でその症例数に満たない他の変異体は除外することができる。例えば、ＣＶ７８フィルターにおいて、ＴＰ５３遺伝子の変異の場合には閾値症例数を１０とし、その他の遺伝子の変異の場合には２とするなど、同一のフィルター内において、突然変異が生じた遺伝子の種類毎に閾値症例数を設定することもできる。
　また、本願発明の一実施形態において、腫瘍が膵臓癌の場合、正常細胞として膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）細胞を含むこともできる。このようにすることで、同定した突然変異が膵臓癌細胞由来の突然変異なのかＩＰＭＮ細胞由来の突然変異なのかを通じて、ＩＰＭＮと膵臓癌とを区別することもできる。
　本願明細書において、「被験者のＤＮＡ」とは被験者から得られたＤＮＡであればよく、その由来細胞または由来組織は特に限られない。本願発明の一実施形態において、「被験者のＤＮＡ」を被験者の血液由来のセルフリーＤＮＡとすることができ、この場合には被験者の血漿成分を用いることが好ましい。
　なお、上述のような突然変異の識別方法は、癌特異的突然変異が集積されたデータベースの蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る識別方法の精度も高くなると考えられる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置またはシステムをも提供することができる。このような解析装置またはシステムによれば、対象となる被験者毎に、識別の対象となる突然変異に係る情報を蓄積し、必要に応じてその蓄積した情報を取り出し、癌特異的突然変異が集積されたデータベースと照合することにより、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とをいつでも高精度に識別することができる。
　また、このようなシステムは、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵにシステムバスを介してＲＡＭ、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスクなどの外部記憶装置及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）が接続されて構成されることができる。入出力Ｉ／Ｆには、キーボードやマウスなどの入力装置、ディスプレイなどの出力装置、及びモデムなどの通信デバイスが夫々接続されている。外部記憶装置は、ｃｔＤＮＡ量情報ＤＢ、画像診断情報ＤＢ、及びプログラム格納部とを備え、いずれも記憶装置内に確保された一定の記憶領域である。
　さらに、このようなシステムは、ＤＮＡ量を測定および解析するシステムおよび突然変異を同定するシステムを有することができ、このようなシステムは、被験者から分子診断用採血管等で採取された核酸を含む生体サンプルを元に核酸分析を行う核酸分析装置を含むことができ、それぞれ、専用回線や公衆回線等の通信ネットワークによって電子的に接続されることができる。
　以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実験手法および材料）
　以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。
　被験者およびサンプル
　大阪府立成人病センターにおいて、２０１２年１月から２０１６年２月までの間に、膵癌患者およびＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）患者の血液サンプリングを行った。血漿調製およびＤＮＡ抽出は従来周知の手段によって行った。また組織サンプルについては内視鏡、超音波誘導、及び細針吸引を用いて得た。すべての患者から書面による同意を得ており、この研究は大阪府立癌医療センターの倫理委員会で承認されている。
　標的領域を増幅するためのアダプターおよびプライマー
　膵臓癌に関連する遺伝子の標的領域を表１に示した。イオントレントシーケンシングのためのプライマー配列を含む３０塩基長のアダプター配列を、固体の指標となる５塩基、分子の指標となる１２塩基、および３’側のスペーサーとなる２０塩基に結合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　バーコード鎖を用いたライブラリー構築
　２つの遺伝子特異的プライマーで血漿サンプルあたり２つの別個の反応混合物を調製した。約１ｍｌの全血由来のセルフリーＤＮＡを、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、２．４ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio, Kusatu, Japan）、７．５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB, Ipswich, MA, USA）、及び０．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Toyobo, Osaka, Japan）を含む１５μｌ溶液中で、２５℃で３０分間、次いで７５℃で２０分間インキュベートすることによって末端修復した。１２ヌクレオチドのバーコード配列でタグ付けされたアダプターのライゲーションを、２０μｌの末端修復溶液中で、０．５μＬの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、４０ｐｍｏｌのアダプター、及び２０００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、２５℃で１５分間インキュベートすることによって行った。ライゲーション産物を１．２倍量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）で２回精製した。精製ビーズを、１×Ｑ５反応緩衝液（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、６μＭ遺伝子特異的プライマー混合物、及び０．４ユニットのＱ５ホットスタートＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含む２０μｌの線形増幅溶液に混合した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを除去した後、以下のように増幅を行った。変性のための９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒、及び６５℃で２分を１５サイクル。続いて、１．２μＬの１００μＭ Ｔ＿ＰＣＲ＿Ａを反応混合物に加え、９８℃で１０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を１５サイクルで増幅した。増幅産物を１．２倍量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰで１回精製し、２０μＬの０．１×ＴＥで回収した。３μｌの精製産物を、１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ緩衝液（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５μＭ Ｔ＿ＰＣＲ＿Ａ、０．５μＭネステッドプライマーミックス、及び０．４ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Thermo Fisher Scientific）を含むＰＣＲ増幅溶液（各２０μＬ）の２本のチューブに添加した。熱サイクルは以下のように行った。変性を９５℃で２分、及び９５℃で１５秒、６３℃で１分を２５サイクルまたは３０サイクル。増幅産物を１．２倍容量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。Qubit dsDNA HS Assay KitまたはQuant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて生成物濃度を測定した。
　シーケンシングおよびデータ解析
　プロトコールに従って、Ion Torrent Protonシーケンサー（Thermo Fisher Scientific）を用いて、大規模並列シーケンシングを行った。Torrent Suite（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ローシグナルをベースコールに変換し、シーケンスリードのＦＡＳＴＱファイルを抽出した。
　ＦＡＳＴＱ形式のリードは、個体の割り当てのための５塩基のインデックスを使用して分類した。５塩基インデックスとスペーサー配列との間の配列を分子バーコードタグとして使用した。スペーサーおよびそれに続く配列の全長が５０塩基よりも大きい場合、ＢＷＡ－ＭＥＭを用いてリードを標的領域に並べた。短いマッピング末端（４０塩基未満）のリードは破棄した。同じバーコード配列を持つリードはまとめてグループ化し、エラーバーコードタグの検出および除去を特許文献１に記載したとおりに行なった。同じバーコードを有するリードのコンセンサス配列はＶａｒＳｃａｎを用いて行った。リードの８５％以上があるポジションに同じ塩基を持っている場合、それをコンセンサス塩基とした。変異体の検出のため、シークエンシングエラーを計算するためのポアソン分布モデルを適用した。変異体の存在ごとに各標的領域を評価し、検出閾値としてＰ＝１０－４を設定した。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２および１３の各塩基位置を特定の閾値で評価した。この分析では、一般的なＳＮＰ部位およびエラーが起こりやすい部位は考慮しなかった。ヒトリファレンスゲノムのバージョンはＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９である。
　結果
　膵臓癌のシーケンシング
　ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳの膵臓癌関連遺伝子の標的領域を上述の方法によってシーケンシングした。標的領域の総サイズは２．８ｋｂであった。バーコードタグ付きアダプターは直接ｃｆＤＮＡの未消化末端に結合させた。ライブラリー構築のために、遺伝子特異的プライマーのみを用いた線形増幅工程の後、アダプターと遺伝子特異的プライマーの混合物とを用いて標的領域を増幅した。反応スキームを図１に示した。このライブラリーをイオントレントシーケンサーでシーケンスした。シーケンスリードは、分子バーコードを用いてグループ化した。エラー配列を除去した後、高品質の配列データを用いて各リード群についてコンセンサス配列を構築した。配列決定された分子の平均数は、標的領域あたり９００塩基であった。
　非腫瘍特異的変異体を除去するためのフィルターの構築
　第１のデータセットは、健常人１２名および膵臓癌患者５７名のコホートから得た。変異体検出の結果を表２の上半分にまとめた。健常人サンプルにおいては１２の変異体が見出された（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　１％未満のリードに存在する変異体は全ゲノムまたはエキソームシーケンシングのような次世代シーケンサーの従来の適用での分析では影響しないが、ｃｔＤＮＡの検出においては重大な問題となる。この実施例では、１２人の健常人のうち５人が変異体陽性と判定された（表２）。つまり、健常人であっても癌特異的変異に陽性と判断された個人が５名いることとなり、シーケンシングの結果から直接的に癌特異的変異に陽性であると判断することは、膵臓癌の突然変異の診断として適切ではない。したがって、本発明者らは変異体フィルターを設定した。
　すべての癌特異的突然変異のデータは、癌体細胞突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ）と呼ばれる公開データベースに保存されている。国際癌ゲノムコンソーシアムおよび癌ゲノムアトラスなどの癌ゲノムを特徴付ける最近の大規模な努力により、原発腫瘍に起因するほとんどの変異を同定していると推定される。しかしながら、健常人で同定された１２の変異体のうち１０種はＣＯＳＭＩＣに登録されていなかった。本発明者らはこれに対処するために以下の２つのことを前提とした。（１）ＣＯＳＭＩＣは癌組織に存在するすべての体細胞突然変異をカバーする。（２）ＣＯＳＭＩＣにおける低頻度のエントリーはＤＮＡ損傷やＰＣＲ／シーケンシングエラーなどの人工的な要因から生じる可能性がある。したがって、ＴＰ５３の変異体を除き、ＣＯＳＭＩＣ（バージョン７８）でカタログ化されていない変異体とシングルエントリーの変異体を除外した。ＴＰ５３については、多くの体細胞突然変異がそのコード領域においてカタログ化されているため、より厳格な基準を適用し、１０未満のエントリーの変異体を除外した。このようなバイオインフォマティクスプロセスをＣＶ７８フィルターと命名した。ＣＶ７８フィルターによって変異体を検証すると、健常人に存在するすべての変異体を除外した（表２）。フィルター処理された変異体は、ＣＶ７８フィルターによって選択された変異体として定義した（表２）。本実施例の実験では挿入／欠損のエラーは稀であったため、解析から除外した（１つの欠損と１つの挿入）。
　膵臓癌患者１０例については、血漿および腫瘍の両方のサンプルを入手できた。シーケンシングで同定したその変異体を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　同定された３５の変異体のうち、６つは血漿サンプルでのみ検出された。これらの変異体をＣＶ７８フィルターで検証すると、６つの変異体のすべてが除外された。すなわち、ＣＶ７８フィルターは正常細胞に存在する変異体と腫瘍細胞に存在する変異体とを識別できることがわかる。
　管状乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）と膵臓癌との区別
　最初のシーケンシングによる変異体の同定、その後の癌特異性のための変異体のフィルタリングの全プロセスを、独立した第２のサンプルセットで検証した。このサンプルセットにはＩＰＭＮ患者２０人と膵臓癌患者８６人の血漿サンプルが含まれる。第２のデータセットに含まれる膵臓癌患者由来の血漿サンプルは、組織サンプルとペアになった血漿サンプルを除いて、第１のデータセットに含まれる患者のものよりも後に得られた。ＣＶ７８フィルターの構築後にのみ、第２のセットのすべてのサンプルをアッセイし、分析した。
　ＩＰＭＮは膵管内で増殖する新生物であり、そのため、血流中にｃｆＤＮＡを放出する可能性は低い。ＫＲＡＳ突然変異は、良性新生物患者の血漿中ではほとんど検出されない。ＩＰＭＮ症例のかなりの割合が膵臓癌に進行するため、ＩＰＭＮと膵臓癌との区別は実質的な臨床的利益を有すると考えられる。
　ＩＰＭＮ患者２０人のうち１０人はＣＶ７８フィルター処理前には変異型陽性であったが、ＣＶ７８フィルター処理後には１人の患者のみが変異型陽性となった（表２）。一方、膵臓癌患者８６人のうち３２人は、ＣＶ７８フィルター処理後にも変異体陽性となった。
　バーコードシーケンスによって同定された変異の他の特徴
　バーコードシーケンスによって同定された変異を、特定の遺伝子におけるそれらの存在に従って分類した（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　第１および第２のサンプルセットに共通して、ＣＶ７８フィルターで処理してもＫＲＡＳ突然変異の場合では突然変異とみなされるものが多い。これはコドン１２および１３に存在する突然変異ホットスポットに起因する。第１および第２のサンプルセット間のリカバリー率（変異体として選択された割合）に有意差はなかった。
　第１および第２のサンプルセットの結果に有意差がなかったため、その後の分析は両方のサンプルセット由来のデータを組み合わせて行った。フィルター処理した変異体では、Ｇ>Ｔ／Ｃ>Ａのトランスバージョン変異およびＣ>Ｔ／Ｇ>Ａのトランジション変異がそれぞれ２３．３％および６２．８％の割合で見出された（表６）。ＣＶ７８フィルターによって除外された変異体では、Ｇ>Ｔ／Ｃ>Ａのトランスバージョン変異およびＣ>Ｔ／Ｇ>Ａのトランジション変異が、それぞれ３２．２％および４０．６％の割合で見出された（表６）。これらのトランスバージョン変異およびトランジション変異は両方のデータセットの大部分の突然変異を占めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　すべてのサンプルを、ｘ軸をシーケンスされた分子数、ｙ軸を変異体分子数としてスキャッタープロット上にプロットした（図２）。フィルター処理された変異体（フィルター処理で残された変異体）と除外された変異体の分布は互いに異なっていた。フィルター処理された変異体分子は、シーケンスされた分子の１０％超から１％未満までのそれぞれの割合で広く分布していた。一方で、除外された変異体はシーケンスされた分子の１０％以上を占めることはほぼなく、その割合は１％前後であった。
　その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。

Claims (8)

  1. 　被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、
    　被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、
    　前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程と
    　を有する、方法。
  2. 　前記ＤＮＡが血液由来のセルフリーＤＮＡである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記同定した突然変異が、体細胞突然変異として前記データベースに２例またはそれ以上集積されている、請求項１記載の方法。
  4. 　前記腫瘍が膵臓癌である、請求項１記載の方法。
  5. 　請求項４記載の方法において、前記同定した突然変異がＴＰ５３遺伝子の変異であり、体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されている、方法。
  6. 　請求項４記載の方法において、前記正常細胞は膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞を含む、方法。
  7. 　前記血液が血漿成分である、請求項１記載の方法。
  8. 　被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する突然変異識別システムであって、
    　被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する手段と、
    　前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する手段であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する手段と
    　を有する、システム。
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