ES2605372T3 - Un dispositivo para detectar el número de copias de cromosomas fetales o cromosomas de células tumorales - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo para detectar el número de copias de cromosomas fetales o cromosomas de células tumorales, que comprende: un módulo de detección, que se adapta para secuenciar ADN en una muestra de plasma de mujeres embarazadas o plasma de paciente con tumor; un módulo de comparación, que se adapta para comparar un resultado de secuenciación del ADN con un mapa de secuencia genómica para determinar de qué cromosoma viene cada secuencia de ADN y la longitud de cada secuencia de ADN; un módulo de cálculo, que se adapta para calcular la proporción del número de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto al número total de segmentos de ADN en la misma muestra, y corregir la proporción según un contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar; y calcular la variación de la proporción corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el número de copias de los cromosomas para detectar según un grado de variación, en el que el módulo de cálculo corrige la proporción según un contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar según la siguiente función: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de cada cromosoma tienen respectivamente relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, y la relación lineal puede representarse mediante y>=ax+b, en la que y representa contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporción del número de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, a y b pueden ser valores diferentes para diferentes cromosomas; y un módulo de salida, que se adapta para producir el número de copias de los cromosomas para detectar.
Description
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DESCRIPCION
Un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales Campo de la invencion
La invencion se refiere a un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales.
Antecedentes de la invencion
La anomalfa del numero de copias de cromosomas esta estrechamente relacionada con enfermedades humanas. La anomalfa cromosomica aparece en celulas fetales que portan enfermedad genetica y celulas tumorales. En promedio, 9 de cada 1000 neonatos pueden portar enfermedades provocadas por anomalfa del numero de copias de cromosomas (1). Por lo tanto, es importante detectar el numero de copias de cromosomas antes de que los ninos hayan nacido. Sin embargo, los metodos de diagnostico usados en la actualidad incluyendo amniocentesis y corionica ovina pertenecen a metodos invasivos, que suponen ciertos riesgos para mujeres embarazadas y fetos. Se usan marcadores proteicos sericos y ondas ultrasonicas para detectar si los fetos padecen enfermedades debido a anomalfa del numero de copias de cromosomas, aunque no es invasivo, no se detectan directamente factores patogenos, por lo que la precision y sensibilidad no son buenas (2). Tambien existe el problema de que las enfermedades debido a la anomalfa de numero de copias de cromosomas no pueden encontrarse tan pronto como es posible. Esta situacion impulsa a los investigadores a desarrollar un metodo de deteccion y diagnostico no invasivo preciso y altamente sensible.
Desde que se ha encontrado ADN fetal en sangre materna (3), el diagnostico y deteccion de la anomalfa de cromosomas fetales de forma no invasiva y directa se ha convertido en un asunto de estudio importante. En el 2007, el Profesor LO Yuk Ming Dennis y sus colaboradores demostraron que el porcentaje de sitios de mutacion del gen espedfico de la placenta 4 en ARNm de plasma materno podna usarse para valorar si el feto tiene cromosoma 21 triploide (4). El porcentaje de sitio de mutacion se usa al mismo tiempo para valorar si el cromosoma 18 es un triploide (5). Su limitacion es que el sitio de mutacion no es comun en la poblacion, por lo que estos metodos son solamente adecuados para una parte de la poblacion. Durante el mismo periodo, se usa PCR digital (dPCR) para detectar la triploidfa de cromosomas fetales (6), (7). La PCR digital tiene la ventaja de la independencia de cualquier sitio de mutacion, pero su precision es insuficiente, y requiere muchas muestras de sangre, lo que aumenta la dificultad de la toma de muestras.
En anos recientes, los problemas anteriores se han resuelto mediante tecnicas de secuenciacion de ADN de alto rendimiento rapidamente desarrolladas. Estas tecnicas incluyen Analizador Genomico de Illumina (8), SOLiD de Life Technologies (9) y Heliscope de Helicos (10), por lo que puede detectarse a la vez cientos de millones o incluso miles de millones de secuencias. Cuando se usan estas tecnicas para detectar DAN en plasma materno, el cambio de numero de cromosomas de cantidades traza de ADN fetal en plasma puede detectarse (11), (12), (13). No obstante debido al alto coste de secuenciacion, esas tecnicas no se han usado habitualmente. Al mismo tiempo, existe un problema no resuelto de deteccion del cambio del numero de copias parcial de cromosomas fetales del plasma materno. Es ventajoso detectar el cambio del numero de copias de cromosomas fetales de plasma materno mediante secuenciacion de alto rendimiento, pero esa tecnica es cara y no puede popularizarse. Ademas, el Coeficiente de Variacion (CV) de secuenciacion es alto, y tambien es necesario mejorar la precision y estabilidad de deteccion. El CV de secuenciacion tambien determina que este metodo solamente es adecuado para algunos cromosomas, tales como el cromosoma 21, el cromosoma 18 y es inadecuado para detectar el cambio de numero de copias parcial de cromosomas.
Es muy caro y diffcil de detectar el cambio del numero de cromosomas mediante secuenciacion de alto rendimiento, siendo la principal razon que el contenido de ADN fetal en plasma materno es bajo, solamente 5 % cuando es bajo, en particular durante el desarrollo fetal temprano. La mayor parte del ADN en plasma materno es ADN materno. El fondo de ADN materno abarca facilmente el cambio del numero de cromosomas fetales o numero de copias parciales. Por lo tanto, el metodo para separar el ADN de mujeres embarazadas y ADN fetal se ha convertido en un objeto estudiado durante anos con poco progreso. Un metodo exitoso debe pertenecer al metodo de separacion de histonas inventado por el Colegio Medico de Baylor (14). La cantidad de ADN separada es muy pequena, de modo que el metodo solamente es adecuado para detectar el sitio de mutacion, y es inadecuado para detectar el cambio del numero de copias de cromosomas.
El documento US 2010/216153 A1 (Lapidus Stanley et al) desvela un metodo para detectar acidos nucleicos fetales y metodos para diagnosticar anomalfas fetales.
Sumario de la invencion
A la vista de los problemas anteriores en el metodo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales, el inventor ha disenado un kit, un dispositivo y un metodo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales
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parcial o completo eficazmente a bajo coste.
Los dispositivos de la presente invencion se definen en las reivindicaciones adjuntas 1-5.
La invencion se basa en los siguientes hechos: el inventor ha descubierto que los contenidos de GC de los segmentos de ADN de cada cromosoma respectivamente tienen relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN totales, el fenomeno anterior puede estar relacionado con el metodo de deteccion, la relacion lineal puede representarse por y = ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, a y b pueden ser valores diferentes para diferentes cromosomas, la proporcion puede corregirse segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, y se calcula la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar, y se determina el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion. Corrigiendo el contenido de GC, pueden detectarse eficazmente muchos resultados falsos negativos que no pueden detectarse solamente por metodo de valoracion de la proporcion de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a segmentos de ADN total. Los experimentos espedficos se toman como pruebas en la descripcion detallada de las realizaciones.
Adicionalmente, como se indica en el documento (15), la mayona del ADN fetal en plasma materno son segmentos de 100 pb a 250 pb, particularmente en la gran mayona de 150 pb a 170 pb. Aunque solamente una parte minima del ADN materno se distribuye en el intervalo del segmento, los segmentos de ADN de mas de 250 pb basicamente pertenecen al ADN materno. El inventor ha descubierto que, aunque la razon es desconocida, la proporcion de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total se distribuye de forma uniforme con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb, es decir, cada cromosoma tiene longitud en cualquier punto dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb, tal como 110 pb o 167 pb (la cantidad de ADN en el sitio es maxima), la proporcion con el ADN total representa la proporcion de otros puntos, representando por lo tanto la proporcion de cada cromosoma con todo el aDn dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb. Mediante secuenciacion del ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en el ADN, los resultados de secuenciacion de todo el ADN con cualquier longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en el ADN se comparan con el mapa de secuencias genomicas para determinar de que cromosoma viene cada segmento de ADN de la secuencia de ADN dentro de todo el ADN o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en el ADN y la longitud de cada segmento de ADN; se calcula la proporcion del numero de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en la misma muestra con respecto a todos los segmentos de ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb para obtener la proporcion de cada cromosoma fetal con respecto al ADN total. Esto reduce en gran medida los resultados de deteccion. La proporcion se corrige segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar junto con el metodo de correccion basado en GC anterior, y se calcula la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar para determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion.
Al mismo tiempo, el inventor ha descubierto que, de forma similar durante el desarrollo de tumores, sucede lo mismo en la sangre del paciente que en la sangre materna durante el desarrollo de tumores, es decir, en la sangre del paciente con tumor, puede detectarse ADN de celulas tumorales libres. La relacion lineal entre el contenido de GC de los segmentos de ADN de cada cromosoma medido con el metodo de la invencion con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total es de forma similar adecuada para detectar aneuploidfa de celulas tumorales. Ademas, esta presente ADN de celulas tumorales libres en plasma en forma de nucleosomas, de modo que son principalmente segmentos de 100 pb a 250 pb, la proporcion de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total se distribuye uniformemente con la longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb, es decir, cada cromosoma tiene longitud en cualquier punto dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb, representando de este modo la proporcion de cada cromosoma con respecto a todo el ADN dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb. Por lo tanto, el dispositivo de la invencion tambien es adecuado para detectar el numero de copias de cromosomas de celulas tumorales o cromosomas parciales.
Basandose en los hallazgos anteriores, el inventor proporciona un kit, un dispositivo y un metodo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales o cromosomas parciales de forma no invasiva y economica.
Un kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales proporcionado por la divulgacion incluye: un instrumento para recoger sangre de una mujer embarazada o un paciente con tumor; un instrumento para separar celulas sangumeas de plasma en sangre; un reactivo y un instrumento para extraer acidos desoxirribonucleicos (ADN) en plasma; un reactivo y un instrumento para separar el ADN con un metodo ffsico segun el tamano de los segmentos de ADN; y un reactivo y un instrumento para secuenciar ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb.
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Preferentemente, los cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales son los cromosomas completos o cromosomas parciales.
Preferentemente, el kit incluye ademas: un reactivo y un instrumento para preparar todo el ADN en una biblioteca de secuenciacion.
Preferentemente, el kit incluye ademas: un reactivo y un instrumento para realizar amplificacion por PCR del ADN extrafdo de plasma o la biblioteca de secuenciacion.
Preferentemente, el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb es el ADN de 150 pb-170 pb, mas preferentemente, es el ADN de 167 pb.
Otro kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales proporcionado por la divulgacion incluye: un instrumento para recoger sangre de una mujer embarazada o un paciente con tumor; un instrumento para separar celulas sangumeas de plasma en sangre; un reactivo y un instrumento para extraer ADN del plasma; un reactivo y un instrumento para preparar el ADN en una biblioteca de secuenciacion; y un reactivo y un instrumento para secuenciar el aDn, en el que los cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales son los cromosomas completos o cromosomas parciales.
Preferentemente, el kit incluye ademas: un reactivo y un instrumento para realizar amplificacion por PCR en el ADN extrafdo del plasma.
Un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales proporcionado por la invencion incluye: un modulo de deteccion, que se adapta para secuenciar ADN en una muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor, en el que la secuenciacion incluye preparar todo el ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor en una biblioteca de secuenciacion; un modulo de comparacion, que se adapta para comparar un resultado de secuenciacion del ADN con un mapa de secuencia genomica para determinar de que cromosoma viene cada secuencia de ADN y la longitud de cada secuencia de ADN; un modulo de calculo, que se adapta para calcular la proporcion del numero de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto al numero total de segmentos de ADN en la misma muestra, corregir la proporcion segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion; y un modulo de salida, que se adapta para producir el numero de copias de los cromosomas para detectar.
Preferentemente, el modulo de calculo en el dispositivo de la invencion corrige las proporciones de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X tienen respectivamente relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse por y = ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes y a es negativo.
Preferentemente, la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN totales es como se muestra en la Tabla 1.
Preferentemente, el modulo de calculo en el dispositivo de la invencion corrige las proporciones de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 segun la siguiente funcion: los contenidos de Gc de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 respectivamente tienen relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN totales, la relacion lineal puede representarse por y = ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, y a es positivo.
Preferentemente, la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total es como se muestra en la Tabla 2.
Preferentemente, la secuenciacion incluye el proceso de preparar todo el ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor en una biblioteca de secuenciacion.
Preferentemente, la secuenciacion del ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor se realiza mediante secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales.
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Preferentemente, los cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales son los cromosomas completos o cromosomas parciales.
Preferentemente, la amplificacion por PCR del ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor se realiza antes de secuenciar el ADN.
Preferentemente, en el dispositivo de la invencion, el modulo de calculo se adapta para calcular la proporcion del numero de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en la misma muestra con respecto al numero total de todos los segmentos de ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb, corrigiendo la proporcion segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb, y calculando la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar, y determinando el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion.
Preferentemente, todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor se prepara en la biblioteca de secuenciacion.
Preferentemente, la amplificacion por PCR del ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor se realiza antes o despues de preparar el ADN en la biblioteca de secuenciacion.
Preferentemente, el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb es el ADN de 150 pb-170 pb, mas preferentemente el ADN de 167 pb.
Un metodo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales proporcionadas por la divulgacion incluye las siguientes etapas: recoger plasma materno o plasma de paciente con tumor; separar el plasma de celulas sangumeas en sangre; preparar ADN en el plasma en una biblioteca de secuenciacion; secuenciar la biblioteca de secuenciacion de ADN; comparar un resultado de secuenciacion con un mapa de secuencia genomica para determinar de que cromosoma viene cada secuencia de ADN y la longitud de cada segmento de ADN; y calcular la proporcion de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto al numero total de los segmentos de ADN por secuenciacion y resultados de comparacion de ADN, corregir la proporcion segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion.
Preferentemente, el metodo de la divulgacion incluye ademas corregir las proporciones de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X respectivamente tienen relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse por y = ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, ay b son constantes, y a es negativo.
Preferentemente, la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total es como se muestra en la Tabla 1.
Preferentemente, el metodo de divulgacion incluye ademas corregir la proporciones de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 tienen respectivamente relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse por y = ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, y a es positivo.
Preferentemente, la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total es como se muestra en la Tabla 2.
Preferentemente, el metodo incluye calcular la proporcion del numero de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb en la misma muestra con respecto al numero total de todos los segmentos de ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb solamente por secuenciacion y resultados de comparacion de todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a
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Preferentemente, se realiza secuenciacion de la biblioteca de secuenciacion de ADN mediante secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales.
Preferentemente, el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del tramo de 100 pb a 250 pb es el ADN de 150 pb-170 pb, mas preferentemente el ADN de 167 pb.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es una imagen obtenida por electroforesis en gel de agarosa 1 % despues de preparar el ADN en plasma materno en una biblioteca para secuenciacion de extremos emparejados. El canal izquierdo es una imagen de un marcador de 100 pb de ADN, el canal derecho es una imagen de una biblioteca para secuenciacion de extremos emparejados, y la tira mas evidente se localiza a aproximadamente 280 pb, que contiene cebadores de conexion de 120 pb.
La Fig. 2 es un grafico de distribucion del tamano de segmentos de ADN de la muestra G356.
La Fig. 3 es un grafico de distribucion de segmento de ADN de cromosoma X en una muestra G356 comparada realizado segun el tamano del segmento.
La Fig. 4 es un grafico de distribucion de segmentos de ADN calculados y realmente medidos del cromosoma X de G356 segun el tamano del segmento, en el que la lmea con un asterisco representa un grafico obtenido multiplicando el numero total de secuencias de ADN de la muestra G356 por el porcentaje de cromosoma X, el cfrculo representa el numero de secuencia de cromosomas X realmente medidos. Como se muestra en la figura, la distribucion del segmento de ADN del cromosoma X de G356 calculada es la misma que la distribucion medida realmente esencialmente, estas dos lmeas son basicamente uniformes entre sf.
Las Figs. 5A-5H son curvas patron dibujadas segun los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en G356, G397 (repetido 8 veces), G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 y G825 y las proporciones de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto a los segmentos de ADN total, en los que las muestras G346, G397, G426, G735, g756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 y G825 se identifican como muestras de feto femenino normal [46, XX] mediante amniocentesis por cariotipo de cromosomas en el Colegio Medico Xiangya de la Universidad Central del Sur. El eje X presenta la proporcion del numero de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto a los segmentos de ADN total, el eje Y representa el contenido de GC de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar. Cada una de 5A-5F muestra curvas patron de tres cromosomas, que muestran ordenadamente curvas patron de los cromosomas 1 a 18, la Fig. 5G muestra una curva patron de los cromosomas 19 al 22, la Fig. 5H muestra una curva patron del cromosoma X. Las funciones de las curvas patron de cada cromosoma son como se muestra en la Tabla 1 y la Tabla 2.
La FIG. 6 es un diagrama esquematico de una muestra de trisoirna del 13 detectada por el metodo de la invencion, en el que el eje X representa la proporcion del numero de segmentos de ADN del cromosoma 13 con respecto a los segmentos de ADN total, el eje Y representa el contenido de GC de los segmentos de ADN del cromosoma 13. El rombo en el eje X muestra la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma 13 con respecto a los segmentos de ADN total en cada muestra, el rectangulo indicado por flecha representa una muestra de trisomfa del 13 detectada despues de corregir el contenido de GC de segmentos de ADN del cromosoma 13. Si no se realiza la correccion del contenido de GC de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar de la presente invencion, no se pueden encontrar tres muestras anomalas indicadas por la flecha solamente por la proporcion de los segmentos de ADN del cromosoma 13 con respecto a los segmentos de ADN total, y habna un resultado de falso negativo.
La Fig. 7 es un diagrama esquematico de una muestra de trisomfa del 18 detectada por el metodo de la invencion, en el que el eje X representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma 18 con respecto a los segmentos de ADN total, el eje Y representa el contenido de GC de los segmentos de ADN del cromosoma 18. El rombo en el eje X muestra la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma 18 con respecto a los segmentos de ADN total en cada muestra, el rectangulo indicado por la flecha representa una muestra de trisomfa del 18 detectada despues de corregir el contenido de GC de segmentos de ADN del cromosoma 18. Si la correccion del contenido de GC de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar de la presente invencion no se realiza, puede encontrarse solamente que 5 muestras en las que la proporcion del segmento de ADN del cromosoma 18 con respecto a los segmentos de ADN total es mayor que o igual a 0,031 es la trisomfa del 18, y no
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puede encontrarse que dos muestras con una proporcion de aproximadamente 0,03 son anomalas, solamente por la proporcion de los segmentos de ADN del cromosoma 18 con respecto a los segmentos de ADN total, con respecto a las dos muestras, habna un resultado de falso negativo.
La Fig. 8 es un diagrama esquematico de una muestra de monosoirna o trisoirna del X detectada por el metodo de la divulgacion en el que el eje X representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma X con respecto a los segmentos de ADN total, el eje Y representa el contenido de GC de los segmentos de ADN del cromosoma X. El rombo en el eje X muestra la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma X con respecto a los segmentos de ADN total en cada muestra, el rectangulo indicado por la flecha a la izquierda de la curva patron representa una muestra de monosoirna del X detectada despues de corregir el contenido de GC de segmentos de ADN del cromosoma X, el rectangulo indicado por la flecha a la derecha de la curva patron representa una muestra de trisoirna del X detectada despues de corregir el contenido de GC de segmentos de ADN del cromosoma X. Si no se realiza la correccion del contenido de GC de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar de la presente invencion, solamente puede encontrarse una muestra de trisoirna del X y la muestra de monosoirna del X no puede encontrarse facilmente solamente por la proporcion de los segmentos de ADN del cromosoma X con respecto a los segmentos de ADN total, y habna un resultado de falso negativo.
Las Figs. 9A-9B son diagramas esquematicos de una muestra de trisoirna del 21 detectada por el metodo de la divulgacion en el que el eje X representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma 21 con respecto a los segmentos de ADN total, el eje Y representa el contenido de GC de los segmentos de ADN del cromosoma 21. El rombo en el eje X muestra la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma 21 con respecto a los segmentos del ADN total en cada muestra, el rectangulo indicado por flecha representa una muestra de trisoirna del 21 detectada despues de corregir el contenido de GC de segmentos de ADN del cromosoma 18. Si puede encontrarse que solamente 4 muestras en las que la proporcion de segmento de ADN del cromosoma 21 en la Fig. 9 con respecto a los segmentos de ADN total es el maximo es la trisoirna del 21, y no puede encontrarse que las muestras con una proporcion de aproximadamente 0,0138 sean anomalas, solamente por la proporcion de los segmentos de ADN del cromosoma 18 con respecto a los segmentos de ADN total en lugar de corrigiendo el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, con respecto a las muestras, hay un resultado de falso negativo.
Descripcion detallada de las realizaciones
Debena observarse que, sin contradiccion, las realizaciones de la solicitud y las caractensticas en las realizaciones pueden combinarse. La invencion se describe posteriormente con referencia a dibujos junto con realizaciones. Los dibujos de la invencion y las realizaciones se usan solamente para explicar la invencion, y no se pretende que limiten la invencion.
Definicion de expresiones
Secuencia corta de extremos emparejados se refiere a una secuencia de menos de 50 pb junto a cebador conector 5' terminal y una secuencia de menos de 50 pb junto a cebador conector 3' terminal. Preferentemente, la secuencia corta de extremos emparejados se refiere a una secuencia de no mas de 36 pb junto a cebador conector 5' terminal y una secuencia de no mas de 36 pb junto a cebador conector 3' terminal.
Secuencia corta de extremo individual se refiere a una secuencia de menos de 50 pb junto a cebador conector 5' terminal o una secuencia de menos de 50 pb junto a cebador conector 3' terminal. Preferentemente, la secuencia corta de extremo individual se refiere a una secuencia de no mas de 36 pb junto a cebador conector 5' terminal o una secuencia de no mas de 36 pb junto a cebador conector 3' terminal.
Secuencia larga de extremo individual se refiere a una secuencia de mas de 99 pb junto a cebador conector 5' terminal o una secuencia de mas de 99 pb junto a cebador conector 3' terminal.
Secuenciacion de extremos emparejados se refiere a ensayar la secuencia de ambos extremos de la secuencia.
Secuenciacion de extremo individual se refiere a ensayar la secuencia en un extremo de la secuencia.
Grupo de ADN se refiere a multiples moleculas de ADN formadas amplificando una molecula de ADN y localizadas en un area de superficie fija. En las realizaciones de la solicitud, el grupo de ADN se refiere a aproximadamente 1000 moleculas de ADN formadas amplificando una molecula de ADN y localizada dentro de un 1 micrometro cuadrado.
La Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) de emulsion se refiere a realizar reaccion de PCR colocando reactivos de PCR incluyendo ADN molde de PCR, cebador de PCR, polimerasa de PCR y bases libres dentro de una gota de aceite. Habitualmente, dentro de una gota de aceite, el molde de PCR de emulsion tiene solamente una molecula de ADN.
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El contenido de GC se refiere a la proporcion del numero de guanina y citosina con respecto al numero total de todas las bases en acidos nucleicos o acidos desoxirribonucleicos.
Realizacion 1: Un metodo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales
Etapa 1: Recoger sangre materna para preparar plasma.
En la realizacion, se extraen 14 muestras de sangre materna, codigos de muestra: G356, G397, G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778, G779, G780, G781, G824 y G825, todos identificados como muestras de feto femenino normales [46, XX] por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico Xiangya de la Universidad Central del Sur mediante amniocentesis por cariotipo de cromosomas. Los datos detectados de las muestras anteriores se usan para dibujar una curva patron, y las muestras anteriores tambien se usan como muestras patron. Se obtienen muestras de plasma de las que se retiran celulas sangumeas despues de centrifugar las muestras de sangre a alta velocidad, y cada muestra tiene un volumen de plasma de aproximadamente 1 ml.
Etapa 2: Extraer ADN de plasma.
Se extrae ADN en el plasma usando el kit de extraccion de ADN producido por Qiagen (numero de producto: 57704). Etapa 3: Preparar el ADN de plasma en una biblioteca de secuenciacion.
El ADN de plasma puede prepararse en una biblioteca para secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales. El proceso para preparar la biblioteca para secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados es el siguiente.
Los extremos del ADN extrafdo se hacen romos y se somete el ADN a fosforilacion 5' terminal: 30 |il de ADN, 45 |il de agua pura, 10 |il de tampon de ADN ligasa T4 con ATP 10 mM, 4 |il de mezcla de dNTP 10 mM, 5 |il de ADN polimerasa T4, 1 |il de enzima Klenow y 5 |il de PNK T4 se tratan en un bano caliente durante 30 min a 20 ° C despues de mezclar (los reactivos se proporcionan por el kit de preparacion de muestras Illumina PE-102-1001). El ADN se purifica mediante el kit de purificacion de PCR QIAquick de QIAGEN (parte n.° 28104) despues del tratamiento con bano caliente.
Suspension de A en el extremo: el producto resultante de la etapa anterior se disuelve en 32 |il de tampon, 5 |il de tampon Klenow, 10 |il de dATP 1 mM y 3 |il de Exo Klenow se anaden a la mezcla y se mantienen durante 30 min a 37 °C (los reactivos se proporcionan por el kit de preparacion de muestras Illumina PE-102-1001), el producto resultante se purifica mediante el kit de purificacion de pCr MinElute de QIAGEN (parte n.° 28004).
Conexion: el ADN se disuelve en 10 |il de tampon, 2 x 25 |il de tampon de ADN ligasa, 10 |il de Mezcla de Oligos Adaptadores PE y 5 |il de ADN ligasa se anaden a la mezcla, y se mantienen durante 15 min a 20 °C (los reactivos se proporcionan por el kit de preparacion de muestras de Illumina PE-102-1001). El ADN se purifica mediante el kit de purificacion de PCR QIAquick de QIAGEN (parte n.° 28104) despues del tratamiento con bano caliente.
La Fig. 1 es una imagen de electroforesis en gel, en la que el ADN en una muestra se prepara en una biblioteca para secuenciacion de extremos emparejados, el ADN de la biblioteca se somete a electroforesis por 1 % de gel de agarosa, localizandose la tira mas evidente a 280 pb, debido a que contiene cebadores enlazadores de 120 pb, los segmentos de ADN principales en el plasma materno principalmente se centran en aproximadamente 160 pb.
Preferentemente, tambien puede realizarse amplificacion por PCR en la biblioteca para secuenciacion de extremos emparejados: 1 |il de ADN, 22 |il de agua pura, 1 |il de cebador de PCR PE PE 2.0, 1 |il de cebador de PCR PE PE 1.0 y ADN polimerasa Phusion 2x (Finnzymes Oy) (los reactivos se proporcionan por el kit de preparacion de muestras Illumina PE-102-1001). El ADN se amplifica mediante instrumento de PCR, el procedimiento es 98 °C, 30 s, 98 °C, 40 s, 65 °C, 30 s, 72 °C, 30 s, 12 ciclos en total, 72 °C, 5 min.
Etapa 4: Secuenciacion de la biblioteca de secuenciacion de ADN.
Segun diferentes bibliotecas preparadas en la Etapa 3, puede realizarse secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales respectivamente. El proceso para realizar secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados es el siguiente.
Se prepara una molecula de ADN individual en biblioteca de secuenciacion de extremos emparejados de ADN en grupo de ADN mediante instrumento cBot de Illumina, esta etapa tambien puede ser una etapa de cambio de molecula de ADN individual en polimolecula en una gota mediante PCR de emulsion. El grupo de ADN generado o la gota de ADN obtenida mediante PCR de emulsion se someten a secuenciacion de extremos emparejados en
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Analizador de Genoma o secuenciador HiSeq2000 de Illumina. El proceso se finaliza automaticamente por el propio instrumento.
Como alternativa, el grupo de ADN generado o la gota de ADN obtenida mediante PCR de emulsion se somete a secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales en Analizador de Genoma o HiSeq2000 de Illumina, o secuenciador SOLiD de Life Technologies. Las etapas de secuenciacion y las condiciones de reaccion en el Analizador de Genoma o HiSeq2000 de Illumina, o secuenciador SOLiD de Life Technologies son las mismas que se han descrito anteriormente.
Etapa 5: Determinar de que cromosoma viene el segmento de ADN en el plasma y determinar si el numero de copias de los cromosomas para detectar es normal.
Despues de realizar secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados de la biblioteca de ADN (como alternativa, medir secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales), cuando se conoce cada secuencia de base de 36 pb en cada extremo de un segmento de ADN, las secuencias en ambos extremos pueden compararse con la secuencia patron de genoma humano 37.1 (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/data/?build=37), que tambien se denomina hg19 para determinar la posicion respectiva de las secuencias en ambos extremos del cromosoma. La distancia entre las secuencias en ambos extremos es la longitud del segmento de ADN, al mismo tiempo, la posicion cromosomica de las secuencias en ambos extremos determina de que cromosoma viene el segmento de ADN.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/data/?build=37), que tambien se denomina hg19 para determinar la posicion respectiva de las secuencias en ambos extremos del cromosoma. La distancia entre las secuencias en ambos extremos es la longitud del segmento de ADN, al mismo tiempo, la posicion cromosomica de las secuencias en ambos extremos determina de que cromosoma viene el segmento de ADN.
La Fig. 2 es un grafico de distribucion del tamano de segmento de ADN de la muestra G356 determinado segun el metodo anterior, del que el ADN corto en el plasma materno se centra principalmente entre 100 pb y 220 pb.
La Fig. 3 es un grafico de distribucion de segmento de ADN del cromosoma X en una muestra comparada G356 preparada segun el tamano del segmento. El grafico obtenido es sustancialmente igual que en la Fig. 2.
Etapa 6: Calcular la proporcion del numero de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto a todos los segmentos de ADN en el ADN en la misma muestra, corregir la proporcion de acuerdo con el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion.
Preferentemente, el metodo incluye calcular la proporcion del numero de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb en la misma muestra con respecto al numero total de todos los segmentos de ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb mediante secuenciacion y resultados de comparacion de todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb de longitud de secuencia de ADN, corrigiendo la proporcion segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion.
En experimentos, se ha descubierto que la precision del resultado experimental puede mejorarse mediante secuenciacion y resultados de comparacion de todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb de longitud de secuencia de ADN.
El algoritmo espedfico es el siguiente: Usando muestras convencionales, calcular la proporcion de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la misma muestra con respecto a todos los segmentos de ADN, obtener el contenido de GC del segmento de ADN de los cromosomas para detectar segun los resultados de secuenciacion; dibujar una curva patron de contenido de GC (eje Y) y el porcentaje (eje X) de cada cromosoma o cromosoma parcial con respecto a todos los cromosomas de acuerdo con la proporcion anterior y contenido de GC; corregir la proporcion medida del cromosoma de muestra para detectar en un valor de GC fijo (habitualmente media aritmetica de valor de GC) segun su propia funcion del cromosoma; y calcular el valor de variacion Z de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el valor Z.
Las Figs. 5A-5H son curvas patron dibujadas segun los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en muestras medidas y las proporciones de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto a los segmentos de aDn total. Puede verse a partir de las figuras que los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 18 y X estan respectivamente en proporcion inversa a las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse mediante y=ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes y a es negativa.
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Debera observarse que, con respecto a diferentes muestras de referencia, pueden producirse pequenos cambios en parametros espedficos de la formula, pero la tendencia general no cambia. Las funciones de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 18 y X se muestran en la Tabla 1:
Tabla 1
- Cromosoma n.°
- Funcion
- 2
- Y = -1274,5X + 154,48
- 3
- Y = -682,68X + 88,11
- 4
- Y = -391,42X + 62,075
- 5
- Y = -772,25X + 88,517
- 6
- Y = -729,61X + 84,354
- 7
- Y = -2874,7X + 197,28
- 8
- Y = -1599,4X + 122,84
- 12
- Y = -1936,7X + 129,32
- 13
- Y = -827,29X + 67,049
- 14
- Y = -933,9X + 74,22
- 18
- Y = -1946,4X + 97,323
- X
- Y = -749,77X + 71,33
Los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas, 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 estan respectivamente en proporcion con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse mediante y=ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes y a es positivo.
Tabla 2
- Cromosoma n.°
- Funcion
- 1
- Y = 909,17X -29,372
- 9
- Y = 2211,3X -45,632
- 10
- Y = 1886,8X -51,026
- 11
- Y = 1255X - 15,714
- 15
- Y = 1775,8X - 10,124
- 16
- Y = 797,17x + 23,883
- 17
- Y = 560,83X + 31,227
- 19
- Y = 513,79X + 43,088
- 20
- Y = 1006,7X + 22,818
- 21
- Y = 7298X -51,083
- 22
- Y = 596,24X + 43,346
Despues, la proporcion medida de cromosoma de muestra para detectar se corrige en un valor de GC fijo (habitualmente media aritmetica del valor de GC) segun su propia funcion del cromosoma.
Por ejemplo, puede verse a partir de la funcion y=ax+b representada por los contenidos de GC de los segmentos de ADN de cada cromosoma y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, que la proporcion x de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total en cada muestra pueden corregirse mediante la funcion de acuerdo con el valor de GC. La
- (y - y)
formula de correccion puede ser x = e--------------, en la que x es la proporcion corregida de los segmentos de
a
ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total; e es la proporcion del segmento de cromosoma espedfico con respecto a los segmentos de ADN total en la muestra detectada; y es el contenido de GC del segmento de cromosoma espedfico en la muestra para detectar; y es la media aritmetica del valor de GC del segmento de cromosoma en la muestra patron detectada (muestra normal conocida, tal como 14 muestras patrones normales conocidas detectadas en la Realizacion 1). a es la pendiente de esta curva. Para la funcion de cada cromosoma, vease Tabla 1 y Tabla 2; para muestras diferentes, e e y son valores medidos de este ensayo, que vanan junto con diferentes muestras para detectar.
Mediante el calculo de los valores promedios de estos valores X corregidos y errores convencionales, se obtiene el valor Z: Z=(proporcion corregida x de la muestra para detectar - valor promedio corregido de proporcion de cada muestra patron)/Error tfpico. Se calcula la variacion de la proporcion x corregida en cada muestra para detectar, y se determina el numero de copias de los cromosomas para detectar o cromosomas parciales para detectar segun el valor Z de variacion. En general, el valor absoluto de Z que es menor de 3 se considera error de deteccion normal, y el valor absoluto Z que es mayor de 3 se considera anomalo.
Las siguientes Tablas 3, 4, y 5 muestras resultados de deteccion y correccion de los cromosomas 13, 18 y 21 calculados detectando muestras G356, G397 (repetida 8 veces), G426, G735, G756, G760, G763, G770, G778,
G779, G780, G781, G824 y G825 con el metodo de la Realizacion 1.
Tabla 3: Tabla de correccion del cromosoma 13
- Muestra
- X Y X corregido
- G356
- 0,032128056 40,40838593 0,0312599
- G397L1
- 0,031796287 40,74129367 0,031330538
- G397L2
- 0,031829498 40,74485255 0,031368051
- G397L3
- 0,031300856 41,02955526 0,031183548
- G397L4
- 0,031461675 40,97527314 0,031278753
- G397L5
- 0,030861045 41,52415988 0,031341599
- G397L6
- 0,031076999 41,18977275 0,031153357
- G397L7
- 0,030740791 41,5445585 0,031246002
- G397L8
- 0,031068253 41,29163215 0,031267736
- G426
- 0,032116722 40,65542488 0,031547179
- G735
- 0,030833804 41,76349467 0,031603657
- G756
- 0,032145341 40,54153095 0,031438126
- G760
- 0,032505467 40,22754276 0,031418714
- G763
- 0,03135526 41,028428 0,03123659
- G770
- 0,029324725 42,84226241 0,031398557
- G778
- 0,030580783 41,74167735 0,031324265
- G779
- 0,030604185 41,75611131 0,031365114
- G780
- 0,03115125 41,49762797 0,031599733
- G781
- 0,030039316 42,09062396 0,031204592
- G824
- 0,032731055 39,92248585 0,031275559
- G825
- 0,032354852 40,14196058 0,03116465
- Valor promedio 0,03133363 41,1266026 0,03133363
- Error tipico 0,000853052 0,714097704 0,000131819
- Pendiente -827,2898903
Tabla 4: Tabla de correccion del cromosoma 18
- Muestra
- X Y X corregido
- G356
- 0,028355 42,32462 0,028009403
- G397L1
- 0,028042 42,66689 0,027871871
- G397L2
- 0,028211 42,5936 0,028003058
- G397L3
- 0,027866 42,92468 0,027828101
- G397L4
- 0,028163 42,8853 0,028105316
- G397L5
- 0,027723 43,42382 0,027941782
- G397L6
- 0,027887 43,01112 0,027893673
- G397L7
- 0,027615 43,52203 0,027884151
- G397L8
- 0,027718 43,18862 0,027815666
- G426
- 0,028085 42,34471 0,027749591
- G735
- 0,027524 43,74306 0,027906323
- G756
- 0,028028 42,56583 0,027805722
- G760
- 0,028321 42,13679 0,02787838
- G763
- 0,027859 42,81759 0,027766269
- G770
- 0,027028 44,70943 0,027907267
- G778
- 0,02775 43,55682 0,028036728
- G779
- 0,02766 43,52168 0,027929435
- G780
- 0,027819 43,34723 0,027998124
- G781
- 0,027553 43,88948 0,028010923
- G824
- 0,02851 41,7596 0,027874031
5
10
15
20
25
- Muestra
- X Y X corregido
- G825
- 0,028393 42,02757 0,027894578
- Valor promedio 0,02791 42,99812 0,027910019
- Error tfpico 0,000353 0,710198 0,0000921681
- Pendiente -1946,44
Tabla 5: Tabla de correccion del cromosoma 21
- Muestra
- X Y X corregido
- G356
- 0,01313 44,40818 0,013271072
- G397L1
- 0,013154 44,93124 0,013223969
- G397L2
- 0,013215 44,89741 0,013289069
- G397L3
- 0,013191 45,45013 0,013189714
- G397L4
- 0,013192 45,39349 0,013197949
- G397L5
- 0,013315 46,10443 0,013224459
- G397L6
- 0,013301 45,56648 0,013283986
- G397L7
- 0,013347 46,32729 0,013225833
- G397L8
- 0,01339 45,78404 0,013342788
- G426
- 0,013157 44,51204 0,013283828
- G735
- 0,013269 46,54507 0,013117886
- G756
- 0,013212 44,89562 0,013286433
- G760
- 0,013046 44,22742 0,01321199
- G763
- 0,013181 45,2873 0,013202366
- G770
- 0,01351 47,67432 0,013203677
- G778
- 0,013235 45,93867 0,0131666
- G779
- 0,013146 46,1604 0,013047278
- G780
- 0,013177 45,80678 0,013126693
- G781
- 0,013333 46,55558 0,013180262
- G824
- 0,013081 43,62277 0,0133298
- G825
- 0,013164 44,15792 0,013339786
- Valor promedio 0,013226 45,44031 0,013225973
- Error tfpico 0,000109 0,973152 0,0000762249
- Pendiente 7298,004
Observese que el metodo de deteccion y calculo anterior no solamente es adecuado para detectar la anomalfa del numero de copias del cromosoma completo, sino que tambien es adecuado para detectar la anomalfa de numero de copias del cromosoma parcial.
A continuacion hay una realizacion en la que se detecta el numero de copias del cromosoma fetal 13 en una muestra para detectar
Como se ha descrito anteriormente, se extraen un total de 15 muestras de sangre materna, se obtienen muestras de plasma de las que se retiran celulas sangumeas despues de centrifugar las muestras de sangre a alta velocidad, y cada muestra tiene un volumen de plasma de aproximadamente 1 ml. El codigo de muestra es G352, G362, G372, G383, G397 (repetida 8 veces), G402, G409, G415, G424, G445, G503, G488, G735 y G783. Las muestras anteriores se recogen por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur.
Se detecta la trisoirna del 13 que esta posiblemente presente. El resultado de deteccion se verifica mediante la curva patron del cromosoma 13 obtenida anteriormente. Como se muestra en la Fig. 6, en ausencia de correccion de GC (marcado con un rombo en el eje X de la figura), es imposible distinguir las muestras de trisomfa del 13 G445, G352 y G402 (muestras marcadas con 3 drculos en el eje x) de muestras normales (muestras sin marcas en el eje x). Sin embargo, en presencia de correccion de GC (representada por un rectangulo en la figura), es posible distinguir claramente muestras de trisomfa del 13 G445, G352 y G402 (muestras marcadas con 3 flechas en la figura) de muestras normales (otras muestras representadas por un rectangulo en la figura). El resultado de correccion de GC es el mismo que el resultado identificado por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur mediante amniocentesis por cariotipo de cromosoma. Como resultado, la correccion del contenido de GC puede usarse para detectar la trisomfa del 13 para reducir la aparicion de resultados falsos
5
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35
negativos.
La siguiente Tabla 6 ilustra solamente la deteccion y el resultado del calculo de parte de las muestras para detectar, y no ilustra el resultado de otras muestras.
Tabla 6: Tabla de calculo de valor Z del cromosoma 13 corregido
- Muestra
- Resultado de Cariotipo X corregido Valor Z corregido
- G445
- 47,XX,+13 0,033854 19,12307
- G352
- 47,XY,+13 0,033835 18,97637
- G402
- 47,XY,+13 0,034761 25,99744
- G383
- 46,XY 0,031641 2,331371
- G415
- 47,XX,+18 0,031497 1,23855
- G503
- 46,XY 0,031504 1,29343
- G424
- 47,XY,+18 0,031567 1,771192
- Cromosoma 13
- X corregido
- Valor promedio
- 0,031334
- Error tfpico
- 0,000132
Puede verse a partir de la tabla anterior que el valor Z de las muestras G445, G352, G402 es mayor de 3, lo que puede valorarse como trisoirna del 13. El valor Z de otras muestras esta entre -3 y +3.
A continuacion hay una realizacion en la que se detecta el numero de copias del cromosoma fetal 18 en una muestra para detectar
Como se ha descrito anteriormente, se extraen un total de 16 muestras de sangre materna, se obtienen muestras de plasma de las que se retiran celulas sangumeas despues de centrifugar las muestras de sangre a alta velocidad, y cada muestra tiene un volumen de plasma de aproximadamente 1 ml. El codigo de muestra es G362, G372, G383, G397 (repetida 8 veces), G407, G409, G415, G424, G432, G445, G440, G595, G588, G735 y G783. Las muestras anteriores se recogen por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur.
Se detecta la trisoirna del 18 que esta posiblemente presente. Como se muestra en la Fig. 7, el resultado de deteccion se verifica mediante curva patron del cromosoma 18 obtenido anteriormente. En ausencia de correccion de GC (marcado con un rombo en el eje X en la figura), es imposible distinguir algunas muestras de trisoirna del 18 (muestras marcadas con 1 cfrculo negro en el eje x) de muestras normales (muestras sin marcas en el eje x representadas por un rombo), lo que da como resultado muestras de falso negativo. Otras muestras de trisoirna del 18 (muestras marcadas con una flecha hacia abajo en el eje x) pueden detectarse sin correccion de GC. Sin embargo, en presencia de correccion de GC (representada por un rectangulo en la figura), es posible distinguir claramente todas las muestras de trisoirna del 18 (muestras marcadas con flechas horizontales en la figura) de muestras normales (otras muestras representadas por el rectangulo en la figura). El resultado de correccion de GC es el mismo que el resultado identificado por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur mediante amniocentesis por cariotipo de cromosoma. Como resultado, la correccion del contenido de GC puede usarse para detectar trisoirna del 18 para reducir la aparicion de resultados falsos negativos.
La siguiente Tabla 7 ilustra solamente la deteccion y el resultado de calculo de parte de las muestras para detectar, y no ilustra el resultado de otras muestras.
Tabla 7: Tabla de calculo de valor Z de cromosoma 18 corregido
- Muestra
- Resultado de Cariotipo X corregido Valor Z corregido
- G424
- 47,XY,+18 0,031846 42,7029466
- G442
- 47,XY,+18 0,03259 50,7813669
- G432
- 47,XY,+18 0,031475 38,6805289
- G415
- 47,XX,+18 0,029786 20,35574454
- G595
- 47,XY,+18 0,031124 34,87420168
- G407
- 47,XY,+18 0,030189 24,72396854
- G372
- 46,XY 0,027704 -2,234074343
- G383
- 46,XY 0,027657 -2,740277188
- G362
- 46,XY 0,02795 0,428428385
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- Muestra
- Resultado de Cariotipo X corregido Valor Z corregido
- Cromosoma 18
- X corregido
- Valor promedio
- 0,027910019
- Error tfpico
- 0,0000921681
Puede verse a partir de la tabla anterior que el valor Z de las muestras G424, G442, G432, G415, G595, G407 es mayor de 3, lo que puede valorarse como trisoirna del 18. El valor Z de otras muestras esta entre -3 y +3.
A continuacion hay una realizacion en la que se detecta el numero de copias del cromosoma fetal 21 en una muestra para detectar
Como se ha descrito anteriormente, se extraen un total de 14 muestras de sangre materna, se obtienen muestras de plasma de las que se retiran celulas sangumeas despues de centrifugar las muestras de sangre a alta velocidad, y cada muestra tiene un volumen de plasma de aproximadamente 1 ml. El codigo de muestra es G267, G387, G393, G376, G397 (repetida 8 veces), G405, G408, G409, G440, G491, G588, G641, G735 y G783. Las muestras anteriores se recogen por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur.
Se detecta la trisoirna del 21 (es decir, muestra de smdrome de Down) que esta posiblemente presente. Como se muestra en la Fig. 9A, el resultado de deteccion se verifica mientras curva patron del cromosoma 21 obtenido anteriormente. En ausencia de correccion de GC (marcada con rombo en el eje X en la figura), la muestra con trisoirna del 21 (una muestra marcada con drculos negros y 3 flechas verticales en el eje x) puede detectarse solamente mediante el porcentaje de la trisoirna del 21 en todos los cromosomas. La diferencia entre una muestra (una muestra marcada con un cfrculo negro en el eje x) y muestra normal (otras muestras marcadas con rombos) no es evidente, lo que puede dar como resultado muestras de falso negativo. Sin embargo, en presencia de correccion de GC (representada por un rectangulo en la figura), es posible distinguir claramente todas las muestras de trisoirna del 21 (muestras marcadas con 4 flechas horizontales en la figura) de muestras normales (otras muestras representadas por un rectangulo en la figura). El resultado de correccion de GC es el mismo que el resultado identificado por el Profesor Wu Lingqian del Colegio Medico de Xiangya de la Universidad Central del Sur mediante amniocentesis por cariotipo de cromosoma. La mejora de la precision de la trisoirna del 21 mediante correccion del contenido de GC puede medirse por distancia minima entre la muestra con trisoirna del 21 y la normal. Como se muestra en la Fig. 9B, la distancia minima corregida d1 es mayor que la distancia minima d2 que no se ha corregido. Como resultado, la correccion del contenido de GC puede usarse para detectar trisoirna del 21 para reducir la aparicion de resultados de falso negativo.
La siguiente Tabla 8 ilustra solamente la deteccion y el resultado de calculo de parte de las muestras para detectar, y no ilustra el resultado de otras muestras.
Tabla 8: Tabla de calculo de valor Z ^ de cromosoma 21 corregida
- Muestra
- Resultado de Cariotipo X corregido Valor Z corregido
- G405
- 47,XX,+21 0,014702324 19,36834952
- G387
- 47,XX,+21 0,014591238 17,91101164
- G376
- 47,XX,+21 0,014355433 14,81746245
- G393
- 47,XX,+21 0,014044123 10,73336561
- G491
- 46,XY 0,013049564 -2,314322329
- G641
- 46,XY 0,013287067 0,801496645
- G488
- 46,XY 0,013284892 0,772960653
- G408
- 46,XX 0,013038312 -2,461945144
- Cromosoma 18
- X corregido
- Valor promedio
- 0,013225973
- Error tfpico
- 0,0000762249
Puede verse a partir de la tabla anterior que el valor Z de las muestras G405, G387, G376, G393 es mayor de 3, lo que puede valorarse como trisoirna del 21. El valor Z de otras muestras esta entre -3 y +3.
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Realizacion 2: Un kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales
Con respecto al metodo de deteccion de la Realizacion 1, el inventor de la solicitud desarrolla un kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales, que incluye:
un instrumento para recoger sangre de una mujer embarazada o un paciente con tumor, que puede ser cualquier aguja de recogida de sangre para recoger sangre, jeringa o similares;
un instrumento para separar celulas sangumeas de plasma en sangre, que puede ser un micro-tubo adecuado para contener sangre en una centnfuga o cualquier otro recipiente o instrumento para separacion;
reactivos e instrumentos para extraer ADN del plasma, que pueden incluir proteasa, fenol saturado, cloroformo: isoamilol (24:1), acetato sodico, alcohol anhfdrido, etanol 70 %, solucion de Te, etc., el ADN en el plasma puede extraerse usando kit de extraccion de ADN producido por Qiagen (numero de producto: 57704) y cualquier otro reactivo o recipiente para extraer el ADN;
un reactivo y un instrumento para preparar el ADN en una biblioteca de secuenciacion, la biblioteca de secuenciacion puede ser una biblioteca para la secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, una biblioteca para secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o una biblioteca para la secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales, el reactivo y un instrumento para preparar el ADN en la biblioteca para secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados incluye: tampon de ADN ligasa T4 con ATP 10 mM, Mezcla de dNTP 10 nM, ADN polimerasa T4, enzima de Klenow y PNK T4 (los reactivos anteriores se proporcionan por el kit de preparacion de muestras de Illumina PE-102-1001), asf como resina de intercambio ionico con afinidad por el ADN en ciertas circunstancias para realizar la separacion de ADN, ademas, pueden seleccionarse el kit de separacion de producto de PCR QIAquick QIAGEN (numero de producto: n.° 28104) o kit de separacion de producto de PCR MinElute QIAGEN (numero de producto: n° 28004);
un reactivo y un instrumento para secuenciar el ADN, que pueden usarse para realizar la secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados, la secuenciacion de secuencias largas de extremos individuales o secuenciacion de secuencias cortas de extremos individuales en el ADN. El reactivo y un instrumento para realizar secuenciacion de secuencias cortas de extremos emparejados pueden incluir cebador de PCR PE PE 2.0, cebador de PCR PE PE 1.0, ADN polimerasa Phusion (Finnzymes Oy) (los reactivos se proporcionan por el kit de preparacion de muestras de Illumina PE-102-1001).
Realizacion 3: Otro kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales
El inventor de la solicitud desarrolla otro kit para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas de tumorales, que incluye:
un instrumento para recoger sangre de una mujer embarazada o un paciente con tumor, que puede ser cualquier aguja de recogida de sangre para recoger sangre, jeringa o similares;
un instrumento para separar celulas sangumeas de plasma en sangre, que puede ser un micro-tubo adecuado para contener sangre en una centnfuga o cualquier otro recipiente o instrumento para separacion;
un reactivo y un instrumento para extraer ADN del plasma, que pueden incluir proteasa, fenol saturado, cloroformo: isoamilol (24:1), acetato sodico, alcohol anhfdrido, etanol al 70 %, solucion de TE, etc., el ADN en el plasma puede extraerse usando el kit de extraccion de ADN producido por Qiagen (numero de producto: 57704) y cualquier otro reactivo o recipiente para extraer el ADN;
un reactivo y un instrumento para separar el ADN con un metodo ffsico segun el tamano de los segmentos de ADN, que puede incluir: polvo de agarosa (Biowest 11860), marcador (marcador de ADN de 100 pb Takara, numero de producto: D5050A), etc.; y
un reactivo y un instrumento para secuenciar ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb, que puede incluir una cuchilla para cortar gel de agarosa en un cierto intervalo.
Preferentemente, el kit puede incluir un reactivo y un instrumento para amplificar el ADN recuperado de gel de agarosa cortado y prepararlo en una biblioteca de secuenciacion.
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Realizacion 4: Un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosoma fetal o cromosomas de celulas tumorales
Un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales incluye:
un modulo de deteccion, que se adapta para secuenciar ADN en una muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor, en el que la secuenciacion incluye una etapa de preparar todo el ADN en la muestra de plasma materno o plasma de paciente con tumor en una biblioteca de secuenciacion para secuenciar el ADN en la muestra de plasma materno, el modulo de deteccion puede incluir instrumento cBot de Illumina y Analizador de Genoma o secuenciador HiSeq2000 de Illumina o secuenciador SOLiD de ABI;
un modulo de comparacion, que se adapta para comparar un resultado de secuenciacion del ADN con un mapa de secuencia genomica para determinar de que cromosoma viene cada secuencia de ADN y la longitud de secuencia de cada segmento de ADN, el modulo de comparacion puede ser la base de datos de secuencias convencionales de genoma humano hg19;
un modulo de calculo, que se adapta para calcular la proporcion del numero de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto a todos los segmentos de ADN en la misma muestra, corregir la proporcion de acuerdo con un contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar, y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de variacion; y
un modulo de resultado, que se adapta para producir el numero de copias de los cromosomas para detectar.
Opcionalmente, el modulo de deteccion puede detectar todos los segmentos de ADN en la muestra, tambien pueden detectar solamente todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb tal como 150 pb a 175 pb, el modulo de deteccion puede ser un modulo o un dispositivo para realizar electroforesis en gel de agarosa incluyendo un reactivo y un instrumento para separar el ADN en el plasma materno segun el tamano de segmento de ADN cadena arriba del dispositivo de deteccion.
Evidentemente, los expertos en la materia debenan entender que algunos modulos o algunas etapas de la invencion pueden implementarse mediante dispositivos informaticos generales. Los modulos o las etapas pueden centrarse en un unico dispositivo informatico, o distribuirse en la red compuesta por multiples dispositivos informaticos. Opcionalmente, los modulos o las etapas pueden implementarse mediante codigo de programa ejecutable por dispositivo informatico, almacenandolos por lo tanto en un dispositivo de almacenamiento y ejecutandolos mediante dispositivo informatico, o implementando los modulos o las etapas introduciendolos en cada modulo de circuito integrado respectivamente, o introduciendo muchos de los modulos o de las etapas en un unico modulo de circuito integrado. De esta manera, la invencion no esta limitada a la combinacion de cualquier hardware y software particular.
Lo anterior es solamente la realizacion preferida de la invencion y no se pretende que limite el alcance de proteccion de la invencion. Para los expertos en la materia, pueden realizarse diversas variaciones y cambios a la invencion.
Referencias:
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15. Fan HC, et al. (2010) Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by double-end sequencing. Clin Chem, 56: 1279-1286.
20
Claims (5)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un dispositivo para detectar el numero de copias de cromosomas fetales o cromosomas de celulas tumorales, que comprende:un modulo de deteccion, que se adapta para secuenciar ADN en una muestra de plasma de mujeres embarazadas o plasma de paciente con tumor;un modulo de comparacion, que se adapta para comparar un resultado de secuenciacion del ADN con un mapa de secuencia genomica para determinar de que cromosoma viene cada secuencia de ADN y la longitud de cada secuencia de ADN;un modulo de calculo, que se adapta para calcular la proporcion del numero de segmentos de ADN de los cromosomas para detectar con respecto al numero total de segmentos de ADN en la misma muestra, y corregir la proporcion segun un contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar; y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en una muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun un grado de variacion, en el que el modulo de calculo corrige la proporcion segun un contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de cada cromosoma tienen respectivamente relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, y la relacion lineal puede representarse mediante y=ax+b, en la que y representa contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al aDn total, a y b son constantes, a y b pueden ser valores diferentes para diferentes cromosomas; y un modulo de salida, que se adapta para producir el numero de copias de los cromosomas para detectar.
- 2. El dispositivo segun la reivindicacion 1, en el que el modulo de calculo corrige las proporciones de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X respectivamente tienen relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse mediante y=ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, y a es negativo; y preferentemente en el que la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 18 y X y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total se proporciona a continuacion:n.° de cromosoma Funcion2 Y = -1274,5X + 154,483 Y = -682,68X + 88,114 Y = -391,42X + 62,0755 Y = -772,25X + 88,5176 Y = -729,61 X + 84,3547 Y = -2874,7X + 197,288 Y = -1599,4X + 122,8412 Y = -1936,7X + 129,3213 Y = -827,29X + 67,04918 Y = -1946,4X + 97,323X Y = -749,77X + 71,33
- 3. El dispositivo segun la reivindicacion 1, en el que el modulo de calculo corrige la proporcion de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 segun la siguiente funcion: los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 respectivamente tienen relaciones lineales con las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total, la relacion lineal puede representarse mediante y=ax+b, en la que y representa el contenido de GC del segmento de ADN del cromosoma para detectar, x representa la proporcion del numero de los segmentos de ADN del cromosoma para detectar con respecto al ADN total, a y b son constantes, y a es positivo; preferentemente en el que la relacion lineal entre los contenidos de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas 1, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 19, 20, 21 y 22 y las proporciones de los segmentos de ADN de cada cromosoma con respecto a los segmentos de ADN total se proporciona a continuacion:n.° de cromosoma 1910 111516FuncionY = 909,17X -29,372Y = 2211,3X -45,632Y = 1886,8X - 51,026 Y = 1255X - 15,714 Y= 1775,8X - 10,124Y = 797,17X + 23,883n.° de cromosoma 171920 21 22FuncionY = 560,83X + 31,227Y = 513,79X + 43,088Y = 1006,7X + 22,818 Y = 7298X -51,083Y = 596,24X + 43,346
- 4. El dispositivo segun la reivindicacion 1, en el que el modulo de calculo se adapta para calcular la proporcion del numero de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en todo el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb en la misma muestra con respecto al numero total de 5 todos los segmentos de ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb, corregir la proporcion segun el contenido de GC de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb, y calcular la variacion de la proporcion corregida de los segmentos de ADN de los cromosomas para detectar en la muestra para detectar, y determinar el numero de copias de los cromosomas para detectar segun el grado de 10 variacion.
- 5. El dispositivo segun la reivindicacion 4, en el que el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb en la muestra de plasma materno o plasma del paciente con tumor se prepara en una biblioteca de secuenciacion; preferentemente en el que el ADN con longitud en cualquier punto o en 15 cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb es el ADN de 150 pb-170 pb; y mas preferentemente en el que el ADN con longitud en cualquier punto o en cualquier intervalo dentro del intervalo de 100 pb a 250 pb es el ADN de 167 pb.
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