JP5926795B2 - 胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出するシステム及び装置 - Google Patents
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Description
本発明は、胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジ、装置及び方法に関する。
染色体コピー数の異常は人類の病気と密接な関係を有する。遺伝性病気を携帯した胎芽細胞及び腫瘍細胞中にいずれも染色体の異常が存在する。平均１０００人の新生児に９人が染色体コピー数異常による病気を携帯する（１）。従って、胎児が生まれる前に染色体コピー数を検出できることは重要である。しかし、現在、用いられている診断方法は、羊水穿刺と羊膜絨毛膜サンプリングを含み、いずれも傷をつける方法で、妊婦と胎児が一定のリスクを抱えることになる。血清蛋白マーカーと超音波で胎児に染色体コピー数が異常である病気があるか否かを検出すると傷付けることはないが、病気要因を直接検出することではないので、正確性及び感度が理想的ではなく（２）、染色体コピー数が異常である病気をできるだけ早く発現できない問題が存在する。従って、研究者による精度及び感度の高い非侵襲的な診断及び検出方法の研究が望まれている。
母体血液中の胎芽ＤＮＡが発現された後（３）、非侵襲的に直接に胎芽染色体の異常性を診断及び検出することは重大な課題となった。２００７年、盧▲ユウ▼明教授及びその同僚たちは、母体血漿ｍＲＮＡ中の胎盤特異的な遺伝子４の突然変異点比例を用いて胎芽が２１番染色体３倍体があるか否かを断定できることを証明した（４）。突然変異点比例は、１８番染色体が３倍体であるか否かを判定する時にも用いられる（５）。その限界性は、突然変異点が人に普遍するものではないので、上記方法は一部の人のみに適することである。同一の時期において、デジタルＰＣＲ（ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、又はｄＰＣＲ）は胎芽の染色体３倍体の検出に用いられる（６）、（７）。デジタルＰＣＲは、いかなる突然変異点にも依頼しないメリットを有するが、その精度はあんまり高くなく、大量の血液サンプルが必要であって、サンプリングが難しくなってしまう。
最近、高速に発展しているハイ・スループット・シークエンシング技術によると、上記の問題を解決できる。これらの技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ会社のＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（８）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社のＳＯＬｉＤ（９）、Ｈｅｌｉｃｏｓ会社のＨｅｌｉｓｃｏｐｅ（１０）を含み、一回で数億ないし数十億個の配列を検出できる。これらの技術で母体血漿ＤＮＡを検出する場合、血漿中の微量の胎芽ＤＮＡの染色体数量の変化を検出できる（１１）、（１２）、（１３）。しかし、シークエンシングのコストが高いので、これらの技術は汎用されていない。同時に、母体血液で胎芽染色体の一部のコピー数の変化を検出することはいまだに課題として残されている。ハイ・スループット・シークエンシングで母体血漿中の胎芽染色体のコピー数の変化を検出する場合、いくつかのメリットを有するが、価格が高いので、普及されていない。また、シークエンシングの偏差（ＣＶ）が高く、検出の精度及び安定性も改善しなければならない。シークエンシングの偏差により、当該方法は少数の幾つかの染色体、例えば２１番染色体、１８番染色体にしか応用できず、また、染色体の一部のコピー数変化の検出に応用できない。
ハイ・スループット・シークエンシングで染色体数量の変化を検出する場合の高コスト及び難度は、特に胎芽発育の早期において母体血漿中の胎芽ＤＮＡの含有量が低い（低い時は５％である）からである。母体血漿中の大部分ＤＮＡは母体ＤＮＡである。胎芽の染色体数量又は一部のコピー数の変化は母体ＤＮＡの背景に覆われやすい。従って、母体と胎芽のＤＮＡを分離する方法も数年間にわたって課題となっているが、顕著な効果をもたらすことはできなかった。比較的に成功した方法は、Ｂａｙｌｏｒ医学院で発明したヒストン・タンパク質に対する分離方法である（１４）。しかし、分離されるＤＮＡの量が少なく、突然変異点の検出のみに適し、染色体コピー数の変化の検出に応用することができない。
上記の胎芽染色体コピー数を検出する方法におけるさまざまな問題に対し、発明者はコストを有効に低減できる胎芽染色体の全部又は一部のコピー数を検出できる試薬カートリッジ、装置及び方法をデザインした。
本発明は以下の事実に基づくものである：発明者は、本発明による方法で検出して得た各染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係を持ち、上記現象は検出の方法と関係のあるものであって、該線形関係をｙ＝ａｘ+ｂで表することができ、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数であって、異なる染色体の場合ａとｂが異なる値であって、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合に補正を行うことができ、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算して、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定することができることを発現した。ＧＣ含有量を補正することによって、元は各染色体のＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合のみに基づいて判定する方法では検出できなかった複数の仮陰性結果を検出できる。具体的な実施形態において具体的な実験で証明している。
一方、例えば、文献に開示されたように（１５）、母体血漿中の胎芽ＤＮＡの大部分は１００ｂｐ〜２５０ｂｐの断片であって、且つ１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡが特に多い。母体のＤＮＡの極少ない部分が当該断片領域に分布されているが、断片が２５０ｂｐを超えるＤＮＡは基本的に母体のＤＮＡに所属される。本発明者は以下のことを発現した：理由不明であるが、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合は、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡにおいて均一に分布され、即ち、各染色体が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点、例えば１１０ｂｐ又は１６７ｂｐ（当該点のＤＮＡ量が最も多い）において、総ＤＮＡを占める割合が他の点の割合を示し、従って、各染色体が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間の全てのＤＮＡを占める割合を示す。前記ＤＮＡ中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡに対してシークエンシングを行って、前記ＤＮＡ中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較することによって、前記ＤＮＡ中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び各ＤＮＡ断片の配列長さを確定し；また、同一のサンプル中の前記ＤＮＡ中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ断片を占める割合を計算すると、各胎芽染色体と総ＤＮＡとの割合を得ることができる。これによって、検出の結果を大幅に低減させることができる。上記のＧＣ補正の方法を結合すると、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する。
同時に、発明者は、腫瘍発生中において、同様に、患者の血液に胎芽発育中に母体血液に起こった現象に類似する現象が起こっていて、即ち、腫瘍患者の血液において、遊離する腫瘍細胞のＤＮＡを検出できることを発現した。本発明の方法で検出して得た各染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係を有するが、腫瘍細胞のＤＮＡの染色体の多倍体の検出にも適する。また、血漿で遊離する腫瘍細胞のＤＮＡはヌクレオソームの形式で存在するので、大部分が１００ｂｐ〜２５０ｂｐの断片であって、また、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡは均一に分布され、即ち、各染色体が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれか一点において、総ＤＮＡを占める割合は他の点の割合を示し、従って、各染色体が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間の全てのＤＮＡを占める割合を示す。従って、本発明の試薬カートリッジ、装置及び方法は腫瘍細胞染色体又は一部の染色体のコピー数の検出にも適する。
上記発現事項に基づいて、本発明者は比較的に非侵襲的であって且つ経済的で便利であって一層正確に胎芽又は腫瘍染色体又は一部の染色体のコピー数を検出できる試薬カートリッジ、装置及び方法を開発した。
本発明に係わる胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジは、母体又は腫瘍患者体内から血液を採取する器具と、前記血液中の血細胞と血漿を分離させるに適する器具と、前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、物理方法で、前記ＤＮＡの断片をそのサイズに応じて分離する試薬及び器具と、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡを選択してシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含む。
前記胎芽又は腫瘍染色体が全本の染色体又は一部の染色体であることが好ましい。
本発明の試薬カートリッジが、前記ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具をさらに含むことが好ましい。
本発明の試薬カートリッジが、前記血漿から採取したＤＮＡ又は前記シークエンシング用のライブラリに対してＰＣＲ増幅を行う試薬及び器具をさらに含むことが好ましい。
前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡであることが好ましく、１６７ｂｐのＤＮＡであることがさらに好ましい。
本発明に係わる他の胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジは、母体又は腫瘍患者体内から血液を採取する器具と、前記血液中の血細胞と血漿を分離させるに適する器具と、前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、前記ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成の試薬及び器具と、前記ＤＮＡに対してシークエンシングを行う試薬及び器具とを、含む。ここで、前記胎芽又は腫瘍染色体は全本の染色体又は一部の染色体である。
本発明の試薬カートリッジが、血漿から採取した前記ＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行う試薬及び器具をさらに含むことが好ましい。
本発明に係わる胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置は、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行い、ここで、前記シークエンシングが、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプルの全てのＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する工程を含む検出モジュールと、前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して、前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量がＤＮＡ断片総数を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含む。
本発明による装置中の計算モジュールが、以下の関数に従って第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体の割合を補正することが好ましい。つまり、第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ちｙ＝ａｘ+ｂを有し、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数であって、且つａは負数である。
前記第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係は表１に示すとおりであることが好ましい。
本発明による装置中の計算モジュールが以下の関数に従って第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体の割合を補正することが好ましい。つまり、第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量はそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ち、ｙ＝ａｘ+ｂを有し、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数であって、且つａは正数である。
前記第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係が表２に示す通りであることが好ましい。
前記シークエンシングが、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中の全てのＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する工程を含むことが好ましい。
前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行うことが、双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングであることが好ましい。
前記胎芽又は腫瘍染色体が全本の染色体又は一部の染色体であることが好ましい。
前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行う前にＰＣＲ増幅を行うことが好ましい。
本発明の装置において、計算モジュールが、同一のサンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡの中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する。
前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成することが好ましい。
前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡを、シークエンシング用のライブラリに作成する前又はその後にＰＣＲ増幅を行うことが好ましい。
前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡであることが好ましく、１６７ｂｐのＤＮＡであることがさらに好ましい。
本発明に係わる胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する方法は、母体血漿又は腫瘍患者血漿を採取することと、前記血液中の血漿と血細胞を分離することと、前記血漿中のＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成することと、前記ＤＮＡライブラリに対してシークエンシングを行うことと、前記シークエンシングの結果と染色体組配列図譜とを比較して各断片の前記ＤＮＡ配列が何番の染色体からのものであるか、及び各断片の前記ＤＮＡ配列の長さを確定することと、前記ＤＮＡのシークエンシング及び比較結果に基づいて、同一のサンプル中で検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量がＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定することを含む。
本発明の方法が以下の関数に従って、第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体の割合を補正することが好ましい。つまり、第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ち，即ちｙ＝ａｘ+ｂを有し、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数であって、且つａは負数である。
前記第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係が表１に示す通りであることが好ましい。
本発明の方法が以下の関数に従って、第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体の割合を補正を行うことが好ましい。つまり、第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ち、即ちｙ＝ａｘ+ｂを有し、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数であって、且つａは正数である。
前記第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係が表２に示す通りであることが好ましい。
ＤＮＡの配列長さが１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡのシークエンシングと比較結果のみを選択し、同一のサンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定することが好ましい。
前記ＤＮＡライブラリに対するシークエンシングが、双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングであることが好ましい。
前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡであることが好ましく、１６７ｂｐのＤＮＡであることがさらに好ましい。
ここで、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例に記載の特徴を組み合わせることができる。以下、図面を参照しつつ実施例を結合して本発明を説明する。本発明における図及び実施例は本発明を解釈するためのもので、本発明を限定するのではない。
用語解釈
双端短配列は、５’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列と、３’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列を指す。双端短配列が、５’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列と、３’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列を指すことが好ましい。
双端短配列は、５’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列と、３’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列を指す。双端短配列が、５’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列と、３’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列を指すことが好ましい。
単端短配列は、５’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列又は３’末端接続プライマー直後の５０ｂｐ未満の配列を指す。単端短配列が、５’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列又は３’末端接続プライマー直後の３６ｂｐ以下の配列を指すことが好ましい。
単端長配列は、５’末端接続プライマー直後の９９ｂｐを超える配列又は３’末端接続プライマー直後の９９ｂｐを超える配列を指す。
双端シークエンシングは、配列両端に位置する配列をそれぞれテストすることを指す。
単端シークエンシングは、配列の一端に位置する配列をテストすることを指す。
ＤＮＡ群は、単一のＤＮＡ分子を増幅してなる一定の固体面積に位置する複数のＤＮＡ分子のことを言う。本願の実施例において、ＤＮＡ群は、単一のＤＮＡ分子を増幅してなる１平方ミクロン内に位置する約１０００個のＤＮＡ分子を指す。
乳化ＰＣＲのは、ＰＣＲ鋳型ＤＮＡ、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲポリメラーゼ、自由塩基を含むＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）の反応物を一つのオイル・ドロップ内でＰＣＲ反応を行うことを指す。通常、一つのオイル・ドロップ内で、ＰＣＲの乳状化を行う鋳型は一つのＤＮＡ分子だけである。
ＧＣ含有量は、核酸又はデオキシリボ核酸において、グアニンとシトシンの数量が塩基総量で占める比例を指す。
実施例１：胎芽染色体コピー数の検出方法
工程１：母体血液を採取して血漿を調製する。
本実施例において、合計で１４個の母体血液サンプルを取得し、サンプルの番号は、Ｇ３５６、Ｇ３９７、Ｇ４２６、Ｇ７３５、Ｇ７５６、Ｇ７６０、Ｇ７６３、Ｇ７７０、Ｇ７７８、Ｇ７７９、Ｇ７８０、Ｇ７８１、Ｇ８２４、Ｇ８２５であって、いずれも中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が羊水穿刺によって染色体核型鑑定を経て正常の女性の胎芽サンプル[４６，ＸＸ]であると鑑定されたものである。上記サンプルを検出したデータは標準曲線の作成に用いられ、また、上記サンプルは標準サンプルになる。血液サンプルを高速遠心処理して血細胞が除去された血漿サンプルを取得し、各サンプルの血漿量は約１ｍｌである。
工程１：母体血液を採取して血漿を調製する。
本実施例において、合計で１４個の母体血液サンプルを取得し、サンプルの番号は、Ｇ３５６、Ｇ３９７、Ｇ４２６、Ｇ７３５、Ｇ７５６、Ｇ７６０、Ｇ７６３、Ｇ７７０、Ｇ７７８、Ｇ７７９、Ｇ７８０、Ｇ７８１、Ｇ８２４、Ｇ８２５であって、いずれも中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が羊水穿刺によって染色体核型鑑定を経て正常の女性の胎芽サンプル[４６，ＸＸ]であると鑑定されたものである。上記サンプルを検出したデータは標準曲線の作成に用いられ、また、上記サンプルは標準サンプルになる。血液サンプルを高速遠心処理して血細胞が除去された血漿サンプルを取得し、各サンプルの血漿量は約１ｍｌである。
工程２：血漿ＤＮＡを抽出する。
Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができる。
Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができる。
工程３：血漿ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する。
血漿ＤＮＡを双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシング用のライブラリに作成することができ、以下は双端短配列シークエンシング用のライブラリに作成する工程である。
血漿ＤＮＡを双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシング用のライブラリに作成することができ、以下は双端短配列シークエンシング用のライブラリに作成する工程である。
抽出したＤＮＡ末端を充満して５’端のリン酸化を行って、ＤＮＡ３０μl、純水４５μl、１０ｍＭ ＡＴＰを有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μl、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ ４μl、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ５μl、Ｋｌｅｎｏｗ酵素１μl、Ｔ４ ＰＮＫ５μl混合した後、２０℃で、３０分の温浴を行う（試薬は、Ｉｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ〜１０２〜１００１が提供）。温浴後にＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ浄化試薬カートリッジ（ｐａｒｔ ＃ ２８１０４）を用いてＤＮＡを浄化した。
末端懸Ａ：前工程で得られた製品を３２μlの緩衝液に溶解し、Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液５μl、１ｍＭ ｄＡＴＰ １０μl、Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘo〜３μlを添加し、在３７℃で３０分保持し（試薬は、Ｉｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ〜１０２〜１００１が提供）、製品はＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ浄化試薬カートリッジ（ｐａｒｔ ＃ ２８００４）
接続：ＤＮＡを１０μlの緩衝液に溶解し、ＤＮＡ リガーゼ緩衝液２Ｘ２５μl、ＰＥ Ａｄａｐｔｅｒ Ｏｌｉｇｅ Ｍｉｘ １０μl，ＤＮＡリガーゼ５μlを添加し、２０℃で１５分保持する（試薬は、Ｉｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ〜１０２〜１００１が提供）。温浴後にＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ浄化試薬カートリッジ（ｐａｒｔ ＃ ２８１０４）を用いてＤＮＡを浄化する。
接続：ＤＮＡを１０μlの緩衝液に溶解し、ＤＮＡ リガーゼ緩衝液２Ｘ２５μl、ＰＥ Ａｄａｐｔｅｒ Ｏｌｉｇｅ Ｍｉｘ １０μl，ＤＮＡリガーゼ５μlを添加し、２０℃で１５分保持する（試薬は、Ｉｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ〜１０２〜１００１が提供）。温浴後にＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ浄化試薬カートリッジ（ｐａｒｔ ＃ ２８１０４）を用いてＤＮＡを浄化する。
図１は、サンプルのＤＮＡが両端シークエンシング用のライブラリに作成されたもので、当該ライブラリ中のＤＮＡは１％のアガロース・ゲルで電気泳動を行い、図１はアガロース・ゲル電気泳動の画像で、最も明確なストリップは２８０ｂｐ前後にある。１２０ｂｐの接続プライマーを含むので、母体血漿ＤＮＡの主な断片は１６０ｂｐ前後に集中されている。
両端シークエンシング用のライブラリに対してＰＣＲ増幅を行うことが好ましい。つまり、１μlのＤＮＡ、２２μlの純水、１μlのＰＥ ＰＣＲ プライマーＰＥ２.０、１μlのＰＥ ＰＣＲプライマーＰＥ１.０、２ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ）（試薬はＩｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ〜１０２〜１００１が提供）。ＰＣＲ機器でＤＮＡ増幅を行って、その工程は、９８℃で３０秒、９８℃で４０秒、６５℃で３０秒、７２℃で３０秒で、合計１２個の循環を行って、７２℃で５分行った。
工程４：前記ＤＮＡシークエンシング用のライブラリに対しシークエンシングを行う。
工程３で製造されたライブラリの違いに基づいて、それぞれ双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングを行うことができる。以下は、双端短配列シークエンシングを行う工程である。
工程３で製造されたライブラリの違いに基づいて、それぞれ双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングを行うことができる。以下は、双端短配列シークエンシングを行う工程である。
ＩｌｌｕｍｉｎａのｃＢｏｔ機器を用いてＤＮＡ双端シークエンシング・ライブラリ中の単一のＤＮＡ分子でＤＮＡ群を構成し、当該工程を、乳化ＰＣＲによって単一のＤＮＡ分子をビーズ上の多分子に変更させることで完成することもできる。上述のように得られたＤＮＡ群又は乳化ＰＣＲによって得られたＤＮＡ玉をＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＨｉＳｅｑ２０００シークエンシング器で双端シークエンシングを行う。当該工程は機器自体で完成する。
また、上述のＤＮＡ群又は乳化ＰＣＲによって得られたＤＮＡ玉をＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＨｉＳｅｑ２０００又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社のＳＯＬｉＤシークエンシング器で単端長配列のシークエンシングを行うこともできる。ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＨｉＳｅｑ２０００とＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社のＳＯＬｉＤシークエンシング器でのシークエンシング工程及び反応条件は、上述のと同じである。
工程５：血漿中のＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるかを確定し、また、検出対象染色体のコピー数が正常であるか否かを確定する。
ＤＮＡライブラリの双端短配列シークエンシングを行って後（また、単端長配列又は単端短配列のシークエンシングを行うこともできる）、一つのＤＮＡ断片両端の各３６ｂｐの塩基配列を把握した後、当該両端の配列と人類ゲノム標準配列３７.１（Ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ/ｐｒｏｊｅｃｔｓ/ｇｅｎｏｍｅ/ａｓｓｅｍｂｌｙ/ｇｒｃ/ｈｕｍａｎ/ｄａｔａ/？ｂｕｉｌｄ＝３７）（当該データベースはＨＧ１９とも呼ばれる）と比較し、当該両端の配列各々の染色体上の位置を確定した。当該両端配列間の距離が当該ＤＮＡ断片の長さであって、同時に、当該両端配列が位置する染色体の位置によって当該ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるかを確定できる。
ＤＮＡライブラリの双端短配列シークエンシングを行って後（また、単端長配列又は単端短配列のシークエンシングを行うこともできる）、一つのＤＮＡ断片両端の各３６ｂｐの塩基配列を把握した後、当該両端の配列と人類ゲノム標準配列３７.１（Ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ/ｐｒｏｊｅｃｔｓ/ｇｅｎｏｍｅ/ａｓｓｅｍｂｌｙ/ｇｒｃ/ｈｕｍａｎ/ｄａｔａ/？ｂｕｉｌｄ＝３７）（当該データベースはＨＧ１９とも呼ばれる）と比較し、当該両端の配列各々の染色体上の位置を確定した。当該両端配列間の距離が当該ＤＮＡ断片の長さであって、同時に、当該両端配列が位置する染色体の位置によって当該ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるかを確定できる。
図２は、上記の方法で確定して得たサンプルＧ３５６のＤＮＡ断片サイズの分布図で、図２に示すように、母体血漿の短ＤＮＡは主に１００ｂｐ〜２２０ｂｐの間に集中されている。
図３は、比較後のサンプルＧ３５６中のＸ染色体からのものであると確定されたＤＮＡ断片を断片サイズに基づいて行った分布図である。得られた図形は図２と大体一致する。
工程６：同一のサンプル中の前記ＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片数量がＤＮＡ断片を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて、前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する。
ＤＮＡの配列の長さが１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間であるいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡのシークエンシングと比較結果を選択し、同一のサンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ断片を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて、前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定することが好ましい。
実験において、ＤＮＡの配列の長さが１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間にあるいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡのシークエンシングと比較結果を選択する、実験結果の正確度を向上できることが分かった。
具体的な計算方法は以下の通りである：標準サンプルを用いて、同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片が全てのＤＮＡ断片を占める割合を計算し、シークエンシングの結果に基づいて、検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を把握できる。また、上記割合とＧＣ含有量に基づいて、ＧＣ含有量（Ｙ軸）と各染色体又は一部の染色体が全染色体で占める百分比（Ｘ軸）の標準曲線を作成することができる。検出対象サンプルを検出して得た染色体の割合を当該染色体特有の関数に従ってある固定のＧＣ値に補正し、通常、ＧＣ値の算術平均を用いる。また、検出対象サンプル中の前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片を補正した後の割合の変異Ｚ値を計算し、Ｚ値に基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する。
図５Ａ〜Ｈは、検出したサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と検出対象染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合に基づいて作成した標準曲線である。図に示すように、第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１４、１８、Ｘ番染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量はそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と反比例し、前記線形関係をｙ＝ａｘ+ｂで表することができ、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数で、且つａは負数である。ここで、異なる参照サンプルの場合、式中の具体的なパラメーターが若干の変化があるが、総傾向は変化しない。表１に第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１４、１８、Ｘ番染色体の関数を示した。
第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量はそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合に正比例し、前記線形関係はｙ＝ａｘ+ｂで表することができ、ここで、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数で、且つａは正数である。
そして、検出対象サンプルを検出して得た染色体の割合を、当該染色体特有の関数に従って、ある固定のＧＣ値に補正し、通常、ＧＣ値の算術平均を用いる。
例えば、各染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合を示すｙ＝ａｘ+ｂの関数から分かるように、各サンプル中の各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合ｘを、当該関数によってＧＣ値で補正することができる。補正式は、
である。ここで、
は検出したサンプルが当該所定の染色体断片が総ＤＮＡ断片を占める割合を示し、ｙは検出対象サンプルの所定の染色体断片上のＧＣ含有量を示し、
は検出した標準サンプル（既に正常のサンプルであることを把握、例えば、実施例１において検出した既に正常であることを把握した１４個の標準サンプル）の当該断片の染色体における算術平均ＧＣ値を示し、ａは当該曲線の傾斜度を示す。各染色体の関数は表１と表２に示す通りで、異なるサンプルのy、ｙの値は今回試験の検出値であって、当該２つのパラメーターは検出対象サンプルが異なると相違する。
は検出したサンプルが当該所定の染色体断片が総ＤＮＡ断片を占める割合を示し、ｙは検出対象サンプルの所定の染色体断片上のＧＣ含有量を示し、
は検出した標準サンプル（既に正常のサンプルであることを把握、例えば、実施例１において検出した既に正常であることを把握した１４個の標準サンプル）の当該断片の染色体における算術平均ＧＣ値を示し、ａは当該曲線の傾斜度を示す。各染色体の関数は表１と表２に示す通りで、異なるサンプルのy、ｙの値は今回試験の検出値であって、当該２つのパラメーターは検出対象サンプルが異なると相違する。
このような補正済みのｘ値の平均値と標準誤差を計算することによって、数値Ｚが得られ、Ｚ＝（検出対象サンプルの補正済みの割合ｘ-補正済みの各標準サンプル割合の平均値）/標準誤差である。各検出対象サンプルの前記補正済みの割合ｘの変異を計算し、前記変異の数値Ｚに基づいて、検出対象染色体又は検出対象一部の染色体のコピー数を確定する。通常、Ｚの絶対値が３未満であると正常の検出誤差とし、Ｚの絶対値が３を超えると異常と判定する。
以下の表３、４、５は、実施例１の方法で、サンプルＧ３５６、Ｇ３９７（重複して８回検出した）、Ｇ４２６、Ｇ７３５、Ｇ７５６、Ｇ７６０、Ｇ７６３、Ｇ７７０、Ｇ７７８、Ｇ７７９、Ｇ７８０、Ｇ７８１、Ｇ８２４、Ｇ８２５を検出して計算した第１３、１８、２１番の染色体の検出及び補正結果である。
ここで、上記検出と計算の方法は染色体全体のコピー数の異常の検出に適すると共に、一部の染色体のコピー数の異常の検出にも適する。
以下は、検出対象サンプル中の胎芽１３番の染色体のコピー数を検出する実施例である。
上述のように、合計で１５個の母体血液サンプルを採取し、血液サンプルは高速遠心処理を経て血細胞が除去された血漿サンプルであって、各サンプルの血漿量は約１ｍｌで、サンプルの番号はＧ３５２、Ｇ３６２、Ｇ３７２、Ｇ３８３、Ｇ３９７（重複して８回検出した）、Ｇ４０２、Ｇ４０９、Ｇ４１５、Ｇ４２４、Ｇ４４５、Ｇ４４０、Ｇ５０３、Ｇ５８８、Ｇ７３５、Ｇ７８３である。上記サンプルはいずれも中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授によって収集したものである。
存在する可能性のある１３番染色体３倍体を検出する。上述のように得られた１３番の染色体の標準曲線を用いて、上述の検出の結果を検証する。図６に示すように、ＧＣ補正を行っていない場合（図においてＸ軸上の菱形で標記）、１３番染色体３倍体のサンプルＧ４４５、Ｇ３５２、Ｇ４０２（Ｘ軸上三つの円形で標記したサンプル）と正常のサンプル（Ｘ軸上で標記していないサンプル）とを区別することができない。しかし、ＧＣ補正を行った場合（図において矩形で示す）、１３番染色体３倍体のサンプルＧ４４５、Ｇ３５２、Ｇ４０２（図において三つの矢印で標記したサンプル）と正常のサンプル（図において他の矩形で示すサンプル）とを明確に区別することができ、また、ＧＣ補正を行った結果は中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が羊水穿刺して染色体核型鑑定した結果と一致する。従って、ＧＣ含有量の補正は、１３番の染色体３倍体の検出に用いられ、仮陰性結果の出現を低減できる。
以下の表６に一部の検出対象サンプルの検出と計算結果のみを示す、他のサンプルの結果は示していない。
表に示すように、Ｇ４４５、Ｇ３５２、Ｇ４０２サンプルのＺ値が３を超えると、１３番の染色体３倍体と確定することができる。他の各サンプルのＺ値はいずれも−３〜＋３の間である。
以下は、検出対象サンプル中の胎芽１８番染色体のコピー数を検出する実施例である。
上述のように、合計１６個の母体血液サンプルを採取し、血液サンプルは高速遠心処理を経て血細胞が除去された血漿サンプルで、各サンプルの血漿量は約１ｍｌで、サンプルの番号はＧ３６２、Ｇ３７２、Ｇ３８３、Ｇ３９７（重複して８回検出した）、Ｇ４０７、Ｇ４０９、Ｇ４１５、Ｇ４２４、Ｇ４４２、Ｇ４３２、Ｇ４４５、Ｇ４４０、Ｇ５９５、Ｇ５８８、Ｇ７３５、Ｇ７８３である。上記サンプルはいずれも中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が収集したものである。
存在する可能性のある１８番の染色体３倍体を検出する。図７に示すように、上述のように得られた１８番の染色体の標準曲線を用いて、前記検出の結果を検証する。ＧＣ補正を行っていない場合（図においてＸ軸上の菱形で示す）、一部の１８番染色体３倍体のサンプル（Ｘ軸上の黒の円形で標記したサンプル）と正常のサンプル（Ｘ軸上で菱形で示すが標記していないサンプル）とを区別することができないので、当該サンプルの仮陰性をもたらした。他の１８番染色体３倍体のサンプル（図において下向き矢印で標記したＸ軸上のサンプル）はＧＣ含有量の補正を行わずに検出することができる。しかし、ＧＣ補正を行った場合（図において矩形で標記）、全ての１８番染色体３倍体のサンプル（図において横向き矢印で標記したサンプル）と正常のサンプル（図において他の矩形で示すサンプル）とを明確に区別することができ、また、ＧＣ補正を行った結果は中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が羊水穿刺して染色体核型鑑定した結果と一致する。従って、ＧＣ含有量の補正は、１８番染色体３倍体の検出に用いられ、仮陰性結果の出現を低減できる。
以下の表７に一部の検出対象サンプルの検出と計算結果のみを示し、他のサンプルの結果は示していない。
表に示すように、Ｇ４２４、Ｇ４４２、Ｇ４３２、Ｇ４１５、Ｇ５９５、Ｇ４０７サンプルのＺ値が３を超えると、１８番染色体３倍体であると確定することができる。他の各サンプルのＺ値はいずれも−３〜＋３間である。
以下は、検出対象サンプル中の胎芽２１番染色体のコピー数を検出する実施例である。
上述のように、合計で１４個の母体血液サンプルを採取し、血液サンプルは高速遠心処理を経て血細胞が除去された血漿サンプルであって、各サンプルの血漿量は約１ｍｌで、サンプルの番号はＧ２６７、Ｇ３８７、Ｇ３９３、Ｇ３７６、Ｇ３９７（重複して８回検出した）、Ｇ４０５、Ｇ４０８、Ｇ４０９、Ｇ４４０、Ｇ４９１、Ｇ５８８、Ｇ６４１、Ｇ７３５、Ｇ７８３である。上記サンプルはいずれも中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が収集したものである。
２１番染色体３倍体が存在する可能性のあるダウン症候群のサンプルを検出する。図９Ａに示すように、上述のように得られた２１番染色体の標準曲線を用いて、前記検出の結果を検証する。ＧＣ補正を行っていない場合（図においてＸ軸上の菱形で示す）、２１番染色体３倍体のサンプルを、総染色体を占める百分比のみに基づいて検出することができる（Ｘ軸上の黒の円形と三つの縦方向矢印で標記するサンプル）。その中の一つのサンプル（Ｘ軸上の黒の円形で標記したサンプル）と正常のサンプル（他の菱形で標記したサンプル）との区別が明確でなく、当該サンプルの仮陰性が検出される恐れがある。しかし、ＧＣ補正を行った場合（図において矩形で標記）、全ての２１番染色体３倍体のサンプル（図において四つの横方向の矢印で標記したサンプル）と正常のサンプル（図において他の矩形で標記するサンプル）とを明確に区別でき、また、ＧＣ補正を行った結果は中南大学湘雅医学院の▲ウ▼玲仟教授が羊水穿刺して染色体核型鑑定した結果に一致する。ＧＣ含有量の補正の、２１番染色体３倍体の検出精度の向上に対する影響を、２１番染色体３倍体のサンプルと正常のサンプルとの最小距離に基づいて判断することができる。図９Ｂに示すように、補正後の最小距離ｄ１は補正前の最小距離ｄ２より大きい。従って、ＧＣ含有量の補正によると、２１番染色体３倍体をさらに正確に検出し、仮陰性結果の出現を低減することができる。
以下の表８には一部の検出対象サンプルの検出と計算結果のみを示し、他のサンプルの結果は示していない。
表に示すように、Ｇ４０５、Ｇ３８７、Ｇ３７６、Ｇ３９３サンプルのＺ値が３を超えると、２１番染色体３倍体であると確定できる。他の各サンプルのＺ値はいずれも：−３〜＋３の間である。
実施例２：胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジ
実施例１の検出方法に対応し、本願の発明者は胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出できる試薬カートリッジを開発した。当該試薬カートリッジは、血液の採取に用いることのできる全ての採血針、注射器等であることができる、母体又は腫瘍患者から採血する器具と、遠心分離機に適して血液を収容するための微小管又は他の分離に適する全ての容器又は器具であることができる、前記血液中の血細胞と血漿との分離に適する器具と、プロテアーゼ、飽和フェノール、クロロホルム：イソペンチルアルコール（２４：１）、酢酸ナトリウム、無水アルコール、７０％アルコール、ＴＥ溶液等を含むことができる前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、ここで、Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができ、また他のＤＮＡの抽出に適する試薬又は容器を選択することができ、前記ＤＮＡを、双端短配列シークエンシングのライブラリ、単端長配列シークエンシングのライブラリ又は単端短配列シークエンシングのライブラリであることのできるシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具と、ここで、前記ＤＮＡを双端短配列シークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具は、１０ｍＭ ＡＴＰを有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘと、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと、Ｋｌｅｎｏｗ酵素と、Ｔ４ＰＮＫ（以上の試薬はＩｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ―１０２―１００１が提供）と、特定の環境でＤＮＡと親和性を有するイオン交換樹脂と、を含み、ＤＮＡを分離させる。また、ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ製品である分離試薬カートリッジ（製品番号#２８１０４）又はＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ製品である分離試薬カートリッジ（製品番号#２８００４）を選択することもでき、前記ＤＮＡに対して、双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングであることのできるシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含み、ここで、双端短配列シークエンシングを行う試薬及び器具は、ＰＥＰＣＲプライマーＰＥ２.０と、ＰＥ ＰＣＲプライマーＰＥ１.０と、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（FinnzymesOy）と、を含む（試薬はＩｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ―１０２―１００１が提供）。
実施例１の検出方法に対応し、本願の発明者は胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出できる試薬カートリッジを開発した。当該試薬カートリッジは、血液の採取に用いることのできる全ての採血針、注射器等であることができる、母体又は腫瘍患者から採血する器具と、遠心分離機に適して血液を収容するための微小管又は他の分離に適する全ての容器又は器具であることができる、前記血液中の血細胞と血漿との分離に適する器具と、プロテアーゼ、飽和フェノール、クロロホルム：イソペンチルアルコール（２４：１）、酢酸ナトリウム、無水アルコール、７０％アルコール、ＴＥ溶液等を含むことができる前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、ここで、Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができ、また他のＤＮＡの抽出に適する試薬又は容器を選択することができ、前記ＤＮＡを、双端短配列シークエンシングのライブラリ、単端長配列シークエンシングのライブラリ又は単端短配列シークエンシングのライブラリであることのできるシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具と、ここで、前記ＤＮＡを双端短配列シークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具は、１０ｍＭ ＡＴＰを有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液と、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘと、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼと、Ｋｌｅｎｏｗ酵素と、Ｔ４ＰＮＫ（以上の試薬はＩｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ―１０２―１００１が提供）と、特定の環境でＤＮＡと親和性を有するイオン交換樹脂と、を含み、ＤＮＡを分離させる。また、ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ製品である分離試薬カートリッジ（製品番号#２８１０４）又はＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ製品である分離試薬カートリッジ（製品番号#２８００４）を選択することもでき、前記ＤＮＡに対して、双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングであることのできるシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含み、ここで、双端短配列シークエンシングを行う試薬及び器具は、ＰＥＰＣＲプライマーＰＥ２.０と、ＰＥ ＰＣＲプライマーＰＥ１.０と、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（FinnzymesOy）と、を含む（試薬はＩｌｌｕｍｉｎａサンプル準備試薬カートリッジＰＥ―１０２―１００１が提供）。
実施例３：他の胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジ
本願の発明者は、他の胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出できる試薬カートリッジを開発し、それは、血液の採取に用いることのできる全ての採血針、注射器等であることができる、母体又は腫瘍患者から採血する器具と、遠心分離機に適して血液を収容するための微小管又は他の分離に適する全ての容器又は器具であることができる、前記血液中の血細胞と血漿との分離に適する器具と、プロテアーゼ、飽和フェノール、クロロホルム：イソペンチルアルコール（２４：１）、酢酸ナトリウム、無水アルコール、７０％アルコール、ＴＥ溶液等を含むことができる前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、ここで、Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができ、また他のＤＮＡの抽出に適する試薬又は容器を選択することができ、アガロース粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ １１８６０）、ｍａｒｋｅｒmarker（Ｔａｋａｒａ １００ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、製品番号Ｄ５０５Ａ）等を含むことができる、物理方法で前記ＤＮＡの断片をそのサイズに応じて分離する試薬及び器具と、例えば、一定の区間のアガロース・ゲルを取るカッターを含むことができる、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡを選択してシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含む。
本願の発明者は、他の胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出できる試薬カートリッジを開発し、それは、血液の採取に用いることのできる全ての採血針、注射器等であることができる、母体又は腫瘍患者から採血する器具と、遠心分離機に適して血液を収容するための微小管又は他の分離に適する全ての容器又は器具であることができる、前記血液中の血細胞と血漿との分離に適する器具と、プロテアーゼ、飽和フェノール、クロロホルム：イソペンチルアルコール（２４：１）、酢酸ナトリウム、無水アルコール、７０％アルコール、ＴＥ溶液等を含むことができる前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、ここで、Ｑｉａｇｅｎ会社が生産したＤＮＡ抽出試薬カートリッジを用いて血漿中のＤＮＡ（製品番号５７７０４）を抽出することができ、また他のＤＮＡの抽出に適する試薬又は容器を選択することができ、アガロース粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ １１８６０）、ｍａｒｋｅｒmarker（Ｔａｋａｒａ １００ｂｐ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、製品番号Ｄ５０５Ａ）等を含むことができる、物理方法で前記ＤＮＡの断片をそのサイズに応じて分離する試薬及び器具と、例えば、一定の区間のアガロース・ゲルを取るカッターを含むことができる、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡを選択してシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含む。
切り取ったアガロース・ゲルからＤＮＡを回収して増幅を行ってシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具を含むことが好ましい。
実施例４：胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置
胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置は、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行う検出モジュールと、ここで、前記シークエンシングは母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する工程であり；母体血漿のサンプル中のＤＮＡに対するシークエンシングに、ＩｌｌｕｍｉｎａのｃＢｏｔ機器とＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＨｉＳｅｑ２０００シークエンシング器又はＡＢＩ会社のＳＯＬｉＤシリーズのシークエンシング器を用いることができ、前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、ここで、人類ゲノム標準配列データベースｈｇ１９を利用することができ、同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が全てのＤＮＡ断片を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含む。
胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置は、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行う検出モジュールと、ここで、前記シークエンシングは母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する工程であり；母体血漿のサンプル中のＤＮＡに対するシークエンシングに、ＩｌｌｕｍｉｎａのｃＢｏｔ機器とＩｌｌｕｍｉｎａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＨｉＳｅｑ２０００シークエンシング器又はＡＢＩ会社のＳＯＬｉＤシリーズのシークエンシング器を用いることができ、前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、ここで、人類ゲノム標準配列データベースｈｇ１９を利用することができ、同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が全てのＤＮＡ断片を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含む。
また、検出モジュールは、サンプル中の全てのＤＮＡ断片を検出することができれば、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間、例えば１５０ｂｐ〜１７５ｂｐの全てのＤＮＡのみを検出することもでき、検出装置の上流に、前記ＤＮＡの断片のサイズに応じて母体血漿中のＤＮＡを分離する試薬及び器具、例えばアガロース・ゲル電気泳動のモジュール又は装置を設けることによって実現することができる。
当業者にとって、上述の本発明の各ブロック又は各ステップは共通の計算装置によって実現することができ、単独の計算装置に集中させることができれば、複数の計算装置から構成されるネットワークに分布させることもでき、さらに計算装置が実行可能なプログラムのコードによって実現することもできるので、それらを記憶装置に記憶させて計算装置によって実行することができ、又は夫々集積回路ブロックに製作し、又はそれらにおける複数のブロック又はステップを単独の集積回路ブロックに製作して実現することができることは明らかなことである。このように、本発明は如何なる特定のハードウェアとソフトウェアの結合にも限定されない。
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者であれば本発明に様々な修正や変形が可能である。本発明の精神や原則内での如何なる修正、置換、改良などは本発明の保護範囲内に含まれる。
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Claims (24)
- 胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジと胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置とからなる胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出するシステムであって、
前記胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジは、
母体又は腫瘍患者体内から血液を採取する器具と、
前記血液中の血細胞と血漿を分離させるに適する器具と、
前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、
物理方法で、前記ＤＮＡの断片のサイズに応じてそれを分離する試薬及び器具と、
１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡを選択してシークエンシングを行う試薬及び器具と、を含み、
前記腫瘍染色体のコピー数を検出する装置は、
前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して、前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、
同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量がＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、下記の式に従って、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、
前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含み、
補正後の割合の変異＝検出対象サンプルの補正済みの割合−補正済みの各標準サンプル割合の平均値）/標準誤差
検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ちｙ＝ａｘ+ｂの線形関係を有し、前記計算モジュールが、当該関数に従って前記割合を補正し、但し、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数である胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出するシステム。 - 前記胎芽又は腫瘍染色体が全本の染色体又は一部の染色体である請求項１に記載のシステム。
- 前記ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具をさらに含む請求項１に記載のシステム。
- 前記ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する試薬及び器具をさらに含む請求項２に記載のシステム。
- 前記シークエンシング用のライブラリに対してＰＣＲ増幅を行う試薬及び器具をさらに含む請求項４に記載のシステム。
- 前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡである請求項１又は５に記載のシステム。
- 前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１６７ｂｐのＤＮＡである請求項６に記載のシステム。
- 胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジと胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置とからなる胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出するシステムであって、
前記胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する試薬カートリッジは、
母体又は腫瘍患者体内から血液を採取する器具と、
前記血液中の血細胞と血漿を分離させるに適する器具と、
前記血漿中のＤＮＡを抽出する試薬及び器具と、
前記ＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成するための試薬及び器具と、
前記ＤＮＡに対してシークエンシングを行う試薬及び器具とを、含み
前記腫瘍染色体のコピー数を検出する装置は、
前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して、前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、
同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量がＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、また、下記の式に従って、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、
前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含み、
補正後の割合の変異＝検出対象サンプルの補正済みの割合−補正済みの各標準サンプル割合の平均値）/標準誤差
検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ちｙ＝ａｘ+ｂの線形関係を有し、前記計算モジュールが、当該関数に従って前記割合を補正し、但し、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数である胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出するシステム。 - 前記胎芽又は腫瘍染色体が全本の染色体又は一部の染色体である請求項８に記載のシステム。
- 血漿から抽出した前記ＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行う試薬及び器具をさらに含む請求項８に記載のシステム。
- 母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対してシークエンシングを行う検出モジュールと、
前記ＤＮＡのシークエンシング結果と染色体組配列図譜とを比較して、前記ＤＮＡ中の各ＤＮＡ断片が何番の染色体からのものであるか、及び前記各ＤＮＡ断片の配列長さを確定する比較モジュールと、
同一のサンプル中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量がＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、そして、下記の式に従って検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する計算モジュールと、
前記検出対象染色体のコピー数を出力する出力モジュールと、を含み、
補正後の割合の変異＝検出対象サンプルの補正済みの割合−補正済みの各標準サンプル割合の平均値）/標準誤差
検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量がそれぞれ、各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合と一定の線形関係、即ちｙ＝ａｘ+ｂの線形関係を有し、前記計算モジュールが、当該関数に従って前記割合を補正し、但し、ｙは検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量を示し、ｘは検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が総ＤＮＡを占める割合を示し、ａとｂは常数である胎芽又は腫瘍染色体のコピー数を検出する装置。 - 前記計算モジュールが、第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体の割合を補正し、且つａは負数である請求項１１に記載の装置。
- 前記第２、３、４、５、６、７、８、１２、１３、１８、Ｘ番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係が以下のとおりである請求項１２に記載の装置。
- 前記計算モジュールが第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体の割合を補正し、且つａは正数である請求項１１に記載の装置。
- 前記第１、９、１０、１１、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２番の染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量と各染色体からのＤＮＡ断片が総ＤＮＡ断片を占める割合との間の線形関係が以下の通りである請求項１４に記載の装置。
- 前記検出モジュールが、母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中の全てのＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する請求項１１乃至１５の中のいずれかに記載の装置。
- 前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対するシークエンシングが、双端短配列シークエンシング、単端長配列シークエンシング又は単端短配列シークエンシングである請求項１１に記載の装置。
- 前記胎芽又は腫瘍染色体が全本の染色体又は一部の染色体である請求項１１に記載の装置。
- 前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡに対して、シークエンシングを行う前にＰＣＲ増幅を行う請求項１７に記載の装置。
- 計算モジュールが、同一のサンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡの中の、検出対象染色体からのＤＮＡ断片の数量が１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ断片の総数を占める割合を計算し、１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡ中の検出対象染色体からのＤＮＡ断片のＧＣ含有量に基づいて前記割合を補正し、そして、検出対象サンプルにおける前記検出対象染色体からのＤＮＡ断片の補正後の割合の変異を計算し、前記変異レベルに基づいて検出対象染色体のコピー数を確定する請求項１９に記載の装置。
- 前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中の１００ｂｐ〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間の全てのＤＮＡをシークエンシング用のライブラリに作成する請求項２０に記載の装置。
- 前記母体の血漿サンプル又は腫瘍患者の血漿サンプル中のＤＮＡを、シークエンシング用のライブラリに作成される前又はその後にＰＣＲ増幅を行う請求項２１に記載の装置。
- 前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１５０ｂｐ〜１７０ｂｐのＤＮＡである請求項２０に記載の装置。
- 前記１００〜２５０ｂｐ間のいずれかの一点又はいずれかの一つの区間のＤＮＡが１６７ｂｐのＤＮＡである請求項２３に記載の装置。
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