CN111286320A - 可用于九色荧光str分型的荧光染料、特异性扩增引物对和分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开可用于九色荧光STR分型的荧光染料、特异性扩增引物对和分型方法，包括9种荧光染料，分别为FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635、ET650和ET680；8个荧光染料FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635和ET650对41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel的扩增引物进行荧光标记；ET680用于标记内标。本发明的分型方法灵敏度高、结果稳定、图谱完整清晰，重复检测结果无明显差异；stutter峰面积比不超过10％，峰高比不超过15％，具有良好的系统重复性，42个基因座复合扩增体系检测均能得到准确分型结果。
Description
技术领域
本发明涉及荧光STR分型技术领域。具体地说是可用于九色荧光STR分型的荧光染料、特异性扩增引物对和分型方法。
背景技术
目前，市售DNA检验试剂盒最多为六色荧光，如申请人的在先研究如中国专利文献CN107254516，对24个常染色基因座和1个性别决定基因座在内的共计25个基因座进行荧光STR分型。
最先进的DNA检验试剂，常染色体最多能同时扩增检测27个基因座，Y染色体可达到38个，受限于可用荧光染料种类和引物设计等因素，限制了试剂盒基因座的检测数量。对于微量降解检材、复杂亲缘关系鉴定还需要加做试剂盒检验。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可用于九色荧光STR分型的荧光染料、特异性扩增引物对和荧光STR分型方法，打破现有检测系统荧光数量和基因座数目的限制，通过一次扩增可以获得41个常染色体基因座的分型信息，可有效的提高系统检测效能。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
可用于九色荧光STR分型的荧光染料，包括9种荧光染料，分别为FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635、ET650和ET680；其中，8个荧光染料FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635和ET650对41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel的扩增引物进行荧光标记；ET680用于标记内标。
可用于九色荧光STR分型的特异性扩增引物对，包括42个基因座对应的特异性扩增引物对，其序列分别为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.84的核苷酸序列。
九色荧光STR分型方法，包括如下步骤：
(1)荧光体系的构建：采用8种不同的荧光染料标记42个基因座的扩增引物，并采用ET680用于标记内标；
(2)复合扩增体系的构建：使用与42个基因座对应的特异性扩增荧光引物序列对42个基因座进行扩增，获得扩增产物；
(3)对PCR扩增产物进行STR基因座分型。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
首次提出了九色荧光复合扩增技术，目前尚无相关文献及专利。本发明可一次同时扩增检测42个基因座，为同类产品中包含常染色体基因座数量最多的试剂盒。
本发明系统的灵敏度高，能对低至0.125ng的DNA进行检测。复合扩增体系检测猴、鼠、鸡、猪等动物血液样本，在分型区均未产生特异性峰型，表明本发明的方法和系统具有良好的种属特异性。本发明方法和系统结果稳定、图谱完整清晰；重复检测结果无明显差异；stutter峰面积比不超过10％，峰高比不超过15％。使用本发明体系分型与使用DNATyper19TM、DNATyper25 TM和Amp 
Plus PCR AmplificationKit试剂盒分型在共有基因座上分型结果完全相同，说明本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。将本发明PCR体系中PCR引物+反应混合物和Typer500内标反复冻融5、10、15、20次获得的检测结果之间没有明显变化，各基因座间扩增平衡性好，可以看出本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。本发明的方法和系统的分型准确，42个基因座复合扩增体系检测均能得到准确分型 结果，峰型尖锐，扩增平衡性良好，且与DNATyper 19TM、DNATyper25 TM和Amp 
Plus PCR Amplification Kit试剂盒在共有基因座上的分型结果完全相同。
附图说明
图1本发明的9色荧光Matrix结果图；
图2-1灵敏度测试结果图(0.125ng、0.25ng和0.5ng)；
图2-2灵敏度测试结果图(1ng、1.25ng和1.5ng)；
图2-3灵敏度测试结果图(2ng)；
图3-1种属特异性测试结果图(食蟹猴、恒河猴和鸡)；
图3-2种属特异性测试结果图(火鸡、大鼠和小鼠)；
图3-3种属特异性测试结果图(豚鼠和猪)；
图4-1 9947分型图第一部分；
图4-2 9947分型图第二部分；
图4-3 9947分型图第三部分；
图5-1 Ladder图第一部分；
图5-2 Ladder图第二部分；
图5-3 Ladder图第三部分。
具体实施方式
实施例1
可用于九色荧光STR分型的荧光染料，9种荧光染料分别为FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635、ET650和ET680。其中，8个荧光染料FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635和ET650对41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel的扩增引物进行荧光标记；ET680用于标记内标。
9种荧光染料的结构如表1所示：
表1
42个基因座的信息如表2所示：
表2
实施例2
可用于九色荧光STR分型的特异性扩增引物对，42个基因座所对应的特异性扩增引物，如表2所示，其中PCRU代表上游引物，PCRL代理下游引物。
表3
实施例3
采用本实施例的九色荧光STR分型方法对待检测样品进行STR分型。
1、荧光体系的构建：采用8种不同的荧光染料标记42个基因座，并采用ET680用于标记内标；
所述8种不同的荧光染料分别为：FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635、ET650和ET680；
所述42个基因座包括41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel；41个常染色体STR基因座分别为：D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677、PentaD、TPOX、TH01、D22S1045、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、PentaE、D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408、D9S2157、D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482、D14S1434、D20S1082、D17S1301、D12ATA63和SE33；
所述42个基因座所对应的特异性扩增引物对为序列表中的SEQ ID No.1至SEQ IDNo.84的核苷酸序列，如表3所示。
42个基因座对应的扩增引物的荧光标记为：Amel、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO和D2S1338的扩增引物的荧光标记为FAM；D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677和PentaD的扩增引物的荧光标记为TET；TPOX、TH01、D22S1045、D18S51和FGA的扩增引物的荧光标记为HEX；D6S1043、D13S317、D12S391和PentaE的扩增引物的荧光标记为NED；D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248和D11S4463的扩增引物的荧光标记为ET598；D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408和D9S2157的扩增引物的荧光标记为ET618；D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482和D14S1434的扩增引物的荧光标记为ET635；D20S1082、D17S1301、D12ATA63和SE33的扩增引物的荧光标记为ET650。
2、复合扩增体系的构建：使用与42个基因座对应的特异性扩增荧光引物序列对42个基因座进行扩增，获得扩增产物；
2.1、配制PCR反应混合物，如表3所示：
表3
2.2、扩增程序
将PCR反应物置于PCR仪上，调整循环程序如表4所示进行扩增，得到扩增产物。
表4
3、对PCR扩增产物进行STR基因座分型。
待分型样品的准备：
3.1、电泳上样混合物的准备，按下面比例准备由内标和去离子甲酰胺组成上样混合物：10μL的Typer500内标+1000μL的去离子甲酰胺，混合均匀。
3.2、每管加入10μL电泳上样混合物和1μL扩增产物，混匀。
3.3、95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后电泳。
利用GA118-24B型遗传分析仪上进行检测。应用GeneTyper1.0软件对电泳结果进行分析，获得所述42个基因座的基因型。
在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述42个基因座的基因型的步骤。
在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是GA118-24B型遗传分析仪，通过GeneTyper软件分析该PCR扩增产物中所述42个基因座的基因型。
4结果与讨论
4.1、灵敏度检测
当9947标准DNA模板量≥0.125ng，42个基因座的全部等位基因均可正确分型，见图2。模板量<0.125ng，出现等位基因丢失现象。
即本发明的系统能对低至0.125ng的DNA进行检测。
4.2、种属特异性检测
复合扩增体系检测动物(猪、鸡、猴和鼠)血液样本，在分型区均未产生特异性峰型，见图3。可以看出本发明的方法和系统具有良好的种属特异性。
4.3、系统重复性检测
采用2个批次的试剂对150份样本(FTA卡，来自公安部物证鉴定中心)进行检测，结果稳定、图谱完整清晰；重复检测结果无明显差异；stutter峰面积比不超过10％，峰高比不超过15％。
使用本发明所述体系分型与使用DNATyper19TM、DNATyper25TM和Amp
Plus PCR Amplification Kit试剂盒分型在共有基因座上分型结果完全相同，说明本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。
进一步的，将本发明PCR体系中PCR引物+反应混合物和Typer500内标反复冻融5、10、15、20次获得的检测结果之间没有明显变化，各基因座间扩增平衡性好，可以看出本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。
4.4、分型准确性
9947阳性对照标准物经本发明系统的42个基因座复合扩增体系检测均能得到准确分型结果(见图4)，峰型尖锐，扩增平衡性良好，且与DNATyper19TM、DNATyper25TM和Amp
Plus PCR Amplification Kit试剂盒在共有基因座上的分型结果完全相同。
4.5、ladder分型：见图5。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 可用于九色荧光STR分型的荧光染料、特异性扩增引物对和分型方法
<141> 2020-01-21
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gttcttctct ggtgtgagat 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
catcttaact gcattcatgg 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtttgccact ccataataaa tc 22
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
attgttggtc atctcctcct t 21
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agccatgctc cagtgtcc 18
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcaaagtagc caaacatcag t 21
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gaagtgtgtg gtgttatgat 20
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gttgctcaag ggtcaact 18
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cctgaacaga ataagattc 19
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcttggcaga gcagatg 17
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gtttcttcgc caaataaaaa gaa 23
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
catgaggttt gcaaatacta tcttaac 27
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gttttaattt tctccaaatc tcca 24
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caaaaggctg taacaagggc ta 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gttcactctc cttcccaaat gtt 23
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cccaaaatta cttgagccaa t 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gagacaaaat gaagaagaca g 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agctgacatc ttaccacgtt c 21
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gtgcttggca tatattaaac tgta 24
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agatgggaac gatgcagaca 20
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcataaatgg atggggat 18
<210> 61
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gatcacgcca cggta 15
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gttctccatt tcaaagatca t 21
<210> 63
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ggaacacttg agcca 15
<210> 64
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gtggactggg gtaag 15
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gatcacgcca cggta 15
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gttctccatt tcaaagatca t 21
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acattaagca catgctcttt gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gatgaactca ttggcaaaag ga 22
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ggttttccaa gagatagacc tta 23
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtcctctcat aaatccctac ttatc 25
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ggctctgatt tccacctg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaactcttg gaagccagtc 20
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<212> DNA
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ctccattctc tcacaccca 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccctttgaag tgccagagca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cagtaaaaag acctgagca 19
<210> 82
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtcccaag gagtgtt 17
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gtttcttaga atgtagcaaa tatcagaat 29
Claims (10)
1.可用于九色荧光STR分型的荧光染料，其特征在于，包括9种荧光染料，分别为FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635、ET650和ET680；其中，8个荧光染料FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635和ET650对41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel的扩增引物进行荧光标记；ET680用于标记内标。
2.根据权利要求1所述的可用于九色荧光STR分型的荧光染料，其特征在于，所述FAM如下式所示：
FAM可以对基因座分别为Amel、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO和D2S1338的扩增引物进行荧光标记；
所述TET如下式所示：
TET可以对基因座分别为D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677和PentaD的扩增引物进行荧光标记；
所述HEX如下式所示：
HEX可以对基因座分别为TPOX、TH01、D22S1045、D18S51和FGA的扩增引物进行荧光标记；
所述NED下式所示：
NED可以对基因座分别为D6S1043、D13S317、D12S391和PentaE的扩增引物进行荧光标记；
所述ET598下式所示：
ET598可以对基因座分别为D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248和D11S4463的扩增引物进行荧光标记；
所述ET618如下式所示：
ET618可以对基因座分别为D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408和D9S2157的扩增引物进行荧光标记；
所述ET635如下式所示：
ET635可以对基因座分别为D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482和D14S1434的扩增引物进行荧光标记；
所述ET650如下式所示：
ET650可以对基因座分别为D20S1082、D17S1301、D12ATA63和SE33的扩增引物进行荧光标记；
所述ET680如下式所示：
3.可用于九色荧光STR分型的特异性扩增引物对，其特征在于，包括42个基因座对应的特异性扩增引物对，其序列分别为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.84的核苷酸序列。
4.九色荧光STR分型方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)荧光体系的构建：采用8种不同的荧光染料标记42个基因座的扩增引物，并采用ET680用于标记内标；
(2)复合扩增体系的构建：使用与42个基因座对应的特异性扩增荧光引物序列对42个基因座进行扩增，获得扩增产物；
(3)对PCR扩增产物进行STR基因座分型。
5.根据权利要求4所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述42个基因座包括41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel；所述8种荧光染料FAM、TET、HEX、NED、ET598、ET618、ET635和ET650对41个常染色体STR基因座和1个性别决定基因座Amel的扩增引物进行荧光标记；
41个常染色体STR基因座分别为：
D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338,
D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677、PentaD，
TPOX、TH01、D22S1045、D18S51、FGA，
D6S1043、D13S317、D12S391、PentaE，
D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248、D11S4463，
D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408、D9S2157，
D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482、D14S1434，
D20S1082、D17S1301、D12ATA63、SE33。
6.根据权利要求5所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述42个基因座所对应的特异性扩增引物对为序列表中的SEQ ID No.1至SEQ ID No.84的核苷酸序列。
7.根据权利要求5所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(2)中，42个基因座对应的扩增引物的荧光标记染料：
所述FAM如下式所示：
FAM可以对基因座分别为Amel、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO和D2S1338的扩增引物进行荧光标记；
所述TET如下式所示：
TET可以对基因座分别为D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677和PentaD的扩增引物进行荧光标记；
所述HEX如下式所示：
HEX可以对基因座分别为TPOX、TH01、D22S1045、D18S51和FGA的扩增引物进行荧光标记；
所述NED下式所示：
NED可以对基因座分别为D6S1043、D13S317、D12S391和PentaE的扩增引物进行荧光标记；
所述ET598下式所示：
ET598可以对基因座分别为D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248和D11S4463的扩增引物进行荧光标记；
所述ET618如下式所示：
ET618可以对基因座分别为D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408和D9S2157的扩增引物进行荧光标记；
所述ET635如下式所示：
ET635可以对基因座分别为D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482和D14S1434的扩增引物进行荧光标记；
所述ET650如下式所示：
ET650可以对基因座分别为D20S1082、D17S1301、D12ATA63和SE33的扩增引物进行荧光标记；
所述ET680如下式所示：
8.根据权利要求5所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(2)中，复合扩增体系包括：反应混合物、特异性扩增荧光引物混合物、ddH2O和待检测DNA模板，所述反应混合物的体积为5μL，特异性扩增荧光引物混合物的体积为5μL，待检测DNA模板为1μL提取DNA或者直径1.0mm的血卡1片；反应混合物的组成为含2.5×PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和热启动Taq酶，MgCl2的浓度为1.2-3.0mM，dNTPs的浓度为200μM。
9.根据权利要求5所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(2)中，扩增的程序为：初始变性：95℃11min，循环1次；扩增热循环：94℃10s，59℃90s，28个循环；终延伸：60℃10min，循环1次；保温：4℃保温维持。
10.根据权利要求5所述的九色荧光STR分型方法，其特征在于，在步骤(3)中，42个基因座对应的扩增引物的荧光标记为：
Amel、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO和D2S1338的扩增引物的荧光标记为FAM；
D3S1358、vWA、D8S1179、D16S539、D1S1677和PentaD的扩增引物的荧光标记为TET；
TPOX、TH01、D22S1045、D18S51和FGA的扩增引物的荧光标记为HEX；
D6S1043、D13S317、D12S391和PentaE的扩增引物的荧光标记为NED；
D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248和D11S4463的扩增引物的荧光标记为ET598；
D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408和D9S2157的扩增引物的荧光标记为ET618；
D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482和D14S1434的扩增引物的荧光标记为ET635；
D20S1082、D17S1301、D12ATA63和SE33的扩增引物的荧光标记为ET650。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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