CN104726604A - 一种腐败检材降解dna的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腐败检材降解DNA的检测方法，包括以下步骤：a）获取人体血液组织位于核小体核心区域DNA；b）对所述核小体核心区域DNA进行测序；c）将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得了核小体核心区域SNVs、Indels或STRs遗传标记；d）根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e）提取腐败检材的DNA；f）用所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g）对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分型分析。本发明利用核小体核心区域的遗传标记对腐败检材降解DNA进行检测，其基因座的检出率更高、获得的检测信息更为全面，使得其在法医鉴定和考古分析中得出更为准确、可靠的结论。

Description

一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及法医学DNA的检测领域，具体地说是一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用。

背景技术

在死、伤案件的侦破中，经常遇到腐败生物检材，由于检材中的DNA严重降解，若采用常规的试剂盒检测，会出现所得结果不完整或重复性差，其图谱可见ladder带和stutter带，等位基因扩增不平衡、位点丢失，扩增的基因座信号很弱、根本无法判型等现象，导致该类案件侦破率较低。目前，常用检测降解DNA的MiniSTR和SNP扩增体系虽能解决部分难题，但仍然存在等位基因丢失、基因座的检出率低下，获得的检出信息全面性和准确度较差，而这些问题也正是现阶段国际法医DNA检验中存在的却无法解决的技术瓶颈。因此，能够研发一种高检出率、可以广泛应用于腐败生物检材降解DNA分型的全体系基因位点的检测技术，是当前法医行业和考古领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用，以提供一种用于腐败检材降解DNA的检测新技术，以解决现有检测方法对于检测腐败检材降解DNA存在等位基因丢失、基因座检测率较低的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种腐败检材降解DNA的检测方法，包括以下步骤：a）获取人体血液组织位于核小体核心区域DNA；b）对所述核小体核心区域DNA进行测序；c）将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得SNVs、Indels或STRs遗传标记；d）根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e）提取腐败检材的DNA；f）用设计的所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g）对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分型分析。

本发明将所述测序获得的序列与样本已知基因组库序列信息进行比对时，每条测序获得的序列与人类基因组序列比对不多于3个碱基错配的为有效序列，可用于进一步筛选。

本发明所述SNVs遗传标记和Indels遗传标记均采用samtools和varscan软件进行筛选，发现和过滤基因组变异的遗传标记，分别获得了2462个SNVs遗传标记和128个Indels遗传标记。

本发明所述STRs遗传标记通过自行编写计算机程序进行筛选，运行程序的编程条件为：①允许有0个碱基错配；②STR重复单位的基序长度为3 bp、4 bp或者5bp；③STR重复单位的重复次数大于5；④对于重复单元相同的所有潜在STR，取出其两翼序列，两翼序列有任意一端长度小于10 bp的过滤掉；⑤对两翼序列分别两两比较，潜在STR往左右分别取10bp，完全相同的认定为同一个STR；⑥一个STR有3个及以上的序列支持，认定该STR遗传标记为真实存在的有效序列；全部满足以上6个条件的序列为有效STRs遗传标记。由该方法筛选到了10167个STRs遗传标记，其部分序列见序列表。

本发明中从所筛选到的核小体核心区域STRs遗传标记中选用了部分标记进行对腐败检材降解DNA进行检测，并以非核小体核心区域STRs遗传标记作为对比例，检测结果表明，对于在一定降解程度的腐败检材，采用核小体核心区域的遗传标记检测腐败检材降解DNA，其基因座的检出率较非核小体核心区域遗传标记的检出率平均高出38%，同时，根据核小体核心区域的遗传标记与非核小体核心区域的遗传标记抗降解性能的实验证明，核小体核心区域的遗传标记的抗降解性能更高，由此证明，利用核小体核心区域遗传标记能够在腐败检材降解DNA法医检测中得到很好地应用，可以作为新一代腐败生物检材降解DNA分型全体系基因位点扩增技术的遗传标记，并在检测中可以获得基因座的更高检出率和更为全面可信的检测信息，由此解决了法医鉴定和考古分析中由于检材中的DNA严重降解使得检测结果不完整或重复性差，导致一部分案件无法侦破的难题。

本发明所述核小体核心区域遗传标记为核小体核心区域的SNVs遗传标记、Indels遗传标记或STRs遗传标记中的任意一个遗传位点。

所述STRs遗传标记为D10S1248、D18S51、TH01、TPOX或DYS391中的任意一个。

所述D10S1248遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，扩增所述D10S1248遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:11、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:12；

所述D18S51遗传标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，扩增所述D18S51遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:13、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:14；

所述TH01遗传标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，扩增所述TH01遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:15、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:16；

所述TPOX遗传标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，扩增所述TPOX遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:17、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:18；

所述DYS391遗传标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，扩增所述DYS391遗传标记的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:19、下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:20。

本发明使用二代高通量测序技术对人类白细胞核小体核心区域三种多态性遗传标记进行筛选，筛选结果准确，能满足法医学检案之急需；同时，本发明所获核小体核心区遗传标记具有较高法医学应用价值，可以进一步开发为针对降解检材分析的商品化试剂盒，应用于法医学检案或考古学领域的家族溯源。

本发明的创造性贡献在于首次提出了利用核小体核心区域的遗传标记来检测腐败检材降解DNA，而且通过实验证明，该方法检测一定降解程度的腐败检材，其基因座的平均检出率高达64%，这在案件侦查过程中，可以获得更为全面的检测信息，使得其在法医鉴定和考古分析中得到更为准确、可靠的结论，更有利于一些疑难案件的分析和侦破。

附图说明

图1为样本在DNase I消化各时间点的相对DNA含量。

图2为人工降解检材中核小体组STRs与非核小体组STRs的基因座检出率。虚线表示两组的平均基因座检出率。

图3为20例人工降解检材中单个基因座检出率分析。

图4为采用核小体组STRs遗传标记和非核小体组STRs遗传标记检测福尔马林固定样本基因座的检出率。虚线表示两组的平均基因座检出率。

图5为采用核小体组STRs遗传标记和非核小体组STRs遗传标记检测不同福尔马林固定时长的基因座检出率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1 获取位于核小体核心区域的DNA遗传标记

其DNA遗传标记包括SNVs（单核苷酸变异位点），Indels（插入缺失多态性位点），STRs（短串联重复序列多态性位点）。

实验方法：

（1）从健康人外周血收集白细胞，使用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease，MNase）对血液裂解后的白细胞进行消化；加入终浓度为1mM的CaCl₂溶液和终浓度为3U/ul的微球菌核酸酶，于37℃下孵育3h以释放核小体核心部分，使用酚氯仿法提取消化后白细胞中DNA，即得到人体血液组织中的核小体核心区DNA；

（2）使用Illumina Hiseq 2000 Genome Analyser分析平台对获得的核小体核心区DNA进行测序；

（3）使用bwa (0.6.2-r126)将测序获得的reads与人类基因组序列信息(human genome，hg19) 进行比对，每条read 运行不多于3个碱基错配；使用samtools和varscan软件来发现和过滤基因组变异；使用SeattleSeq和annovar对发现的SNVs和Indels遗传标记进行注释；

（4）通过编写程序进行筛选短串联重复序列位点STRs，其编程条件为：①允许有0个碱基错配；②STR重复单位的基序长度为3，4，或者5bp；③ STR重复单位的重复次数大于5；④对于重复单元相同的所有潜在STR，取出其两翼序列，两翼序列有任意一端长度小于10bp的过滤掉；⑤对两翼序列分别两两比较，潜在STR往左右分别取10bp，完全相同的认定为同一个STR；⑥一个STR有3个及以上reads支持，认定该STR为真实存在。全部满足以上6个条件所筛选到的序列为有效STRs遗传标记。

实验结果：

（1）经过上述筛选方案，共获得共筛选到至少有10条reads支持的单核苷酸变异（single nucleotide variations ，SNVs)共2462个。在检测到的2462个SNVs中有2220个SNVs在dbSNP_138数据库中存在记录，242个SNVs为本实验首次发现，不存在于dbSNP_138数据库中。其部分序列见表1。

表1 筛选的SNVs遗传标记的部分序列

（2）至少有10条reads支持获取的插入缺失位点（Insertion-deletion polymorphisms，）128个。在检测到的128个indels中有89个indels在dbSNP_138数据库中存在记录，39个indels为本实验首次发现，不存在于dbSNP_138数据库中。其部分序列见表2。

表2 筛选的Indels遗传标记的部分序列

（3）对于短串联重复序列的筛选，当满足筛选方法全部条件时共筛选到10167个短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）。其部分序列见序列表。

实施例2 以所获得的核小体核心区域的部分标记为例设计引物

将实施例1所获的STRs标记数据与44个法医学常用遗传标记进行比较。有5个STR基因座成功匹配，选定这5个STR基因座作为核小体组STRs，即D10S1248、D18S51、TH01、TPOX和DYS391，见表3中标记两个星号的标记。从未比对上的剩余39个基因座中随机选择了5个STR基因座作为非核小体组STRs，即CSF1PO、D5S818、D8S1179、D16S539和DYS392，见表3中标记一个星号的标记。选定的位于核小体不同区域内的法医学常用遗传标记的详细信息见表3。通过重新设计引物使上述10个选定的STRs扩增片段长度均小于核小体核心片段长度147bp，所述引物的信息见表4。对设计的引物进行扩增效率验证，设计的引物得到了成功的扩增，并且扩增效率达到了96.818%～110.185%。相关系数R²为0.970～0.992。为了消除扩增片段长度影响，我们使用Mann-Whitney U Test分析了核小体组与非核小体组扩增子片段长度的差异，结果见表5。结果显示5个样本中两组片段长度均无差异。（P_A = 0.188＞0.5，P_B = 0.258＞0.5，P_C =0.449＞0.5，P_D = 0.060＞0.5，P_E =0.059＞0.5）。

表3 44个法医学常用遗传标记信息

表4 10个选定的STRs信息

表5 核小体组与非核小体组扩增子长度差异分析

实施例3 人工制备降解检材并提取降解DNA

抽取5个不同个体（A、B、C、D和E）的血液为样本，分别提取血液中的DNA（采用QIAamp DNA Blood Midi kit，德国Qiagen公司），取10µg的DNA，使用浓度为0.01U/µl的消化酶DNase I进行消化，待消化至0、2.5 min、5 min、10 min、20 min和 30min每个时间点，进行取样，即得30例人工降解检材样本。

实施例4 核小体核心区域DNA具有较强抗降解能力的鉴定

采用上述5个核小体组的STRs遗传标记的引物和5个非核小体组STRs遗传标记的引物对所述30例人工降解的DNA样本进行PCR扩增，使用日本Takara SYBR^® Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒进行的实时荧光定量分析。按下列组成配制实时荧光定量PCR反应体系，共20μl：

实时荧光定量PCR反应以ROX作为校正染料进行定量分析。按以下条件进行PCR反应：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，共40个循环。每次实验均以9948男性DNA作为阳性对照进行扩增并进行熔炼曲线的分析，每次实验做3次平行重复。我们对5个个体共30例样本两组（核小体组STRs和非核小体组STRs）的每个基因座含量进行了分析。

结果显示，伴随着DNaseⅠ消化时间的增加，在5个个体降解检材中各基因座的含量均呈现明显的下降趋势，见图1。使用重复测量方差分析和多元方差分析对各时间点核小体组STRs和非核小体组STRs基因座含量进行了分析。球形检验显示P＜0.05（P_A=0.000＜0.05，P_B= 0.000＜0.05，P_C=0.000＜0.05， P_D= 0.000＜0.05，P_E=0.000＜0.05），说明6次重复测量的数据间存在高度的相关性，宜用多元方差分析进行检验。比较了两组基因座在不同降解时间下(0min、2.5min、5min、10min、20min、30min)的差异，其结果见表6和图1。

表6 5例人工降解检材实时荧光定量分析结果

图1中星号表示经过多元方差分析在该时间点核小体缠绕区DNA含量较非缠绕区有明显差异(P < 0.05)。代表样本A在DNaseⅠ消化的2.5、5、10、20和 30 min时核小体缠绕区较非缠绕区具有明显差异，各时间点两组差异的P值分别为0.005，0.028，0.001，0.004和0.025。

从表6和图1的结果显示在5min、10min、20min时，被分析的5个样本的核小体组STRs与非核小体组STRs均存在差异。在样本B、D、E中在降解时间点为2.5min和30min时，两组基因座含量并不存在差异。同时，这一结果可以表明：当样本被降解至某一程度之内，即10μg完整DNA被0.01U/µl的DNase I消化5、10、和20min时，其核小体核心区域的DNA较非核小体核心区域的DNA的抗降解能力更强。

实施例5 采用设计的引物对人工降解DNA的检测

选择20个个体为样本，分别提取血液中的DNA，取10µg的DNA，使用浓度为0.01U/µl的消化酶DNase I进行消化，选择消化时间为0和20 min两个点进行取样。

采用表4所列10个STRs遗传标记的上游引物5’端标记6-FAM荧光，利用新合成的荧光标记引物对20例人工降解检材进行扩增，将扩增产物用毛细管凝胶电泳分型分析。扩增时，取人工降解检材的DNA 10ng为模板，对每个基因座进行单独扩增，每例样本均重复扩增3次。具体反应体系和热循环参数如下：

20µl扩增体系：上游引物和下游引物各加入量4 pM，Taq DNA聚合酶1 Units，dNTPs加入量每种 200μM，缓冲液为1×Buffer，MgCl₂浓度1.5mM，在PTC-200热循环仪中进行扩增；

扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火75s，72℃延伸15s，共28个循环，最后72℃延伸30min，4℃保存备检。

实施例6 对扩增产物用毛细管凝胶电泳进行分析

取扩增产物1μl，去离子甲酰胺12μl和GeneScan™ 500 LIZ Size Standard内标0.3μl充分混匀；95℃ 5min变性后，4℃骤冷，应用 ABI 3130遗传分析仪进行电泳检测。应用Data Collection 3.0软件收集数据，GenemapperV 3.2软件进行结果分析。以基因座检出率（Loci detection rates）对所获分型结果进行评价。基因座检出率（Loci detection rates）＝1－基因座缺失率（Loci dropout rates）。使用SPSS 16.0软件对20例人工降解DNA进行了两组基因座（核小体STRs组与非核小体STRs组）检出率的计算。采用Mann-Whitney U Test对两组检出率的差异性进行了比较，以P<0.05为有统计学差异。

通过比较降解0 min和20 min的检材样本的分型结果，结果见图2和图3。从图2所示的结果可以看出在20例血液样本中核小体组基因座平均检出率明显高于非核小体组基因座平均检出率，其核小体组的检出率为：64.75﹪，非核小体组的检出率为：26.75﹪，P=0.001＜0.05。从图3所示的结果表明，在被分析的10个STRs遗传标记中，位于核小体组的D10S1248基因座更容易被毛细管凝胶电泳检测到，在20例人工降解检材中样本中的检出率达到了100﹪，其D18S51基因座是核小体组内检出率最低的一个基因座，其检出率低于60%，该遗传标记检出率相对较低主要是由于扩增片段相对较长的原因。而非核小体组内基因座检出率普遍较低，其检出率在10%至45%之间。从上述结果的比较可知，本发明所述的核小体核心区域的遗传标记较非核心区域遗传标记更易于在降解检材中得到较高的检出率，获得较好的分型。

发明人认为，由于核小体作为真核染色质最基本的重复结构单元由DNA和蛋白质两个部分构成。缠绕核小体DNA长200bp，分为核心DNA和连接DNA两个部分。核心DNA包绕在组蛋白八聚体上，长度为147bp左右。即使在凋亡细胞中，由于内源性核酸酶消化仍可获得200bp左右的DNA条带。由此，从以上部分遗传标记的抗降解实验结果可以确定核小体核心区域的DNA具有较强的抗降解能力，那么本发明从核小体核心区域筛选获得其他SNVs、Indels或STRs遗传标记，均可成为理想的腐败生物检材降解DNA分型的全体系基因标记扩增的候选基因标记。

实施例7 核小体核心区域遗传标记在实际降解检材案件分析中的应用

样本选择：选择法医病理学实际案件样本共3个个体，每个个体选择4种组织（心、肝、肾和肺），3个个体的组织样本在医用浓度10%的福尔马林固定液中分别浸泡的时长为2、4、6年，即每个降解时间获得同一个体来源的4例降解检材，对降解检材提取DNA（TIANamp FFPE DNA Kit，北京天根生化科技有限公司）。

采用表4所列10个STRs遗传标记的上游引物5’端标记6-FAM荧光，利用新合成的荧光标记引物对对待检样本的所述DNA进行PCR扩增，其扩增模板为10ng；每个基因座进行单独扩增，每个样本均扩增3次。具体反应体系和扩增程序如下：

20µl扩增体系：上游引物和下游引物各加入量4 pM，Taq DNA聚合酶1 Units，dNTPs加入量每种 200μM，缓冲液为1×Buffer，MgCl₂浓度1.5mM，在PTC-200热循环仪中进行扩增；

扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火75s，72℃延伸15s，共28个循环，最后72℃延伸30min，4℃保存备检。

扩增产物1μl，去离子甲酰胺12μl和GeneScan™ 500 LIZ Size Standard内标0.3μl充分混匀；95℃ 5min变性后，4℃骤冷，应用ABI 3130遗传分析仪进行电泳检测。应用Data Collection 3.0软件收集数据，GenemapperV 3.2软件进行结果分析。其结果见图4和图5。以基因座检出率（Loci detection rates）对所获分型结果进行评价。

基因座检出率（Loci detection rates）＝1－基因座缺失率（Loci dropout rates）

使用SPSS 16.0软件对不同降解时间的12例福尔马林固定样本进行了两组基因座（核小体STRs组与非核小体STRs组）检出率的计算。采用Mann-Whitney U Test对两组检出率的差异性进行了比较，以P<0.05为有统计学差异。

图4的结果显示在12例样本中，核小体组基因座平均检出率为50﹪；非核小体组的平均检出率为27﹪，核小体组检出率明显高于非核小体组 (P = 0.008< 0.05)。且从图4中的2年取样组织为肾的样本可以看出非核小体组检出率为0；而核小体组的遗传标记的检出率为60%。

图5的结果显示，在不同福尔马林固定时间的检出率其差异较大，在核小体组中随着固定时间的延长检出率有明显下降的趋势，非核小体组随着固定时间的延长检出率基本无变化，但不论固定时间长短，核小体组检出率均明显非核小体组。

由此可以充分证明利用核小体核心区域的遗传标记在检测腐败检材降解DNA的应用中，其基因座的检出率更高、获得的检测信息更为全面，使得其在法医鉴定和考古分析中得到更为准确、可靠的结论。

同理，本发明筛选的SNVs遗传标记和Indels遗传标记中的每个标记与以上实施例4-6中STRs遗传标记中为例的遗传标记的实验效果基本类似，其对降解检材基因座的检出率均显著高于非核小体遗传标记以及现有技术中常用的遗传标记，因此，核小体核心区的遗传标记均可很好地在腐败检材降解DNA的法医检测和考古中广泛应用。

福尔马林固定组织是病理学、法医病理学进行疾病诊断和科学研究的常用检材，并被长期保存，也是涉嫌保险欺诈，医疗纠纷，财产继承等刑事、民事案件的法医物证检材。目前，10% 的福尔马林仍然是医院和研究机构固定人类组织常用固定剂，普通福尔马林溶液固定人体组织中DNA降解相对比较严重，提取高质量的DNA并进行PCR-STR分型较为困难。我们选择这一常见降解检材对所获核小体核心区遗传标记的抗降解性进行了实际应用的验证，结果显示本发明使用大规模测序技术获得的核小体核心区域遗传标记具有良好的抗降解作用，具有进一步开发为针对降解检材分析的商品化试剂盒的潜力。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北医科大学

<120> 一种腐败检材降解DNA的检测方法及其应用

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 153

<212> DNA

<213> STR遗传标记D10S1248

<400> 1

ttaatgaatt gaacaaatga gtgaggcaac tctggttgta ttgtcttcat ttaatgaatt 60

gaacaaatga gtgagtggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa 120

ggaaggaaat gaagacaata caaccagagt tgt 153

<210> 2

<211> 204

<212> DNA

<213> STR遗传标记D18S51

<400> 2

tgagtgacaa attgagacct tgtcttacaa taacagttgc tactatttga gtgacaaatt 60

gagaccttgt ctcagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga 120

aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaaaaga gagaggaaag aaagagaaaa agaaaagaaa 180

tagtagcaac tgttattgta agac 204

<210> 3

<211> 127

<212> DNA

<213> STR遗传标记TH01

<400> 3

cctgttcctc ccttatttcc cgtttcttgg gaacacagac tccatggtgc ctgttcctcc 60

cttatttccc tcattcattc attcattcat tcattcattc accatggagt ctgtgttccc 120

tgtgacc 127

<210> 4

<211> 112

<212> DNA

<213> STR遗传标记TPOX

<400> 4

aggcacttag ggaaccctgt cagcgtttat ttgcccaggc acttagggaa ccctcactga 60

atgaatgaat gaatgaatga atgaatgaat gtttgggcaa ataaacgctg ac 112

<210> 5

<211> 155

<212> DNA

<213> STR遗传标记DYS391

<400> 5

ttcaatcata cacccatatc tgtcgataga gggataggta ggcaggcttc aatcatacac 60

ccatatctgt ctgtctgtct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct 120

atctgcctat ctgcctgcct acctatccct ctatg 155

<210> 6

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 6

agaaagctcc actgatcatc ctccccataa agacaccaac aactatctac atagaaaaaa 60

caaacaaaca aacaaacaaa caaacaaaaa acaccttcac a 101

<210> 7

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 7

tgagtgctcc agatttatgg atatctgcct ggccatgaag caaagaggac ccctgtgctc 60

caacacacac acacacacac acacacacac acacactccc c 101

<210> 8

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

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tccttcttct tcttcttctg acagagtctt gctctgtcac ccaggctgga gtgcagcggc 60

acaatctcag ctcactacaa cctcctcctc ctggattcaa g 101

<210> 9

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

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acagggcctg ggcggcacac agcacacttg gaaggcacac acacgcacac acacacacac 60

acacacacac acacacacac gagagagaga gagagagcga a 101

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<212> DNA

<213> STR遗传标记

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agggaaacgt gaaaatatta tttcaatttt attttacgtc actttatttt attttatttt 60

attttatttg tttatttctg agacagtgcc tcgctctgtc c 101

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<213> D10S1248上游引物

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ttaatgaatt gaacaaatga gtgag 25

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<213> D10S1248下游引物

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gcaactctgg ttgtattgtc ttcat 25

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<211> 21

<212> DNA

<213> D18S51上游引物

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tgagtgacaa attgagacct t 21

<210> 14

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<212> DNA

<213> D18S51下游引物

<400> 14

gtcttacaat aacagttgct actatt 26

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> TH01上游引物

<400> 15

cctgttcctc ccttatttcc c 21

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> TH01下游引物

<400> 16

gtttcttggg aacacagact ccatggtg 28

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> TPOX上游引物

<400> 17

aggcacttag ggaaccct 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> TPOX下游引物

<400> 18

gtcagcgttt atttgccc 18

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> DYS391上游引物

<400> 19

ttcaatcata cacccatatc tgtc 24

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> DYS391下游引物

<400> 20

gatagaggga taggtaggca ggc 23

<210> 21

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 21

tcaccaccac caccatcacc accatcatca ccaccaccac catcaccatc atcactgcca 60

ccaccaccac catcaccatc accaccacca ttaccaccat c 101

<210> 22

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 22

ttctttcttt ctctctctct ctctctctct ctctctctgt ctctctcccc tccctccctc 60

cttggtgcct tctcggctcg ctgctgctgc tgcctctgcc t 101

<210> 23

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 23

aaaattgttg ttgttgttgt tgttgttgtt tgagacagag tctcaccctg tcacccaggt 60

tggagtgcag tggcccgacc tcggctcact gcagcctctg c 101

<210> 24

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 24

tcaccactgc accagtacac acaccatcac caccacatca ccactgcact agcacacaca 60

ccaccaccac cacatcacca ctgcactagt acacacacca c 101

<210> 25

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 25

agaccaccct gggcaacatg gcgagacccc ggtttctaca aaaaaacaaa acaacaacaa 60

caacaaaaac actagctggg catagtggca cgtgcctgta g 101

<210> 26

<211> 101

<212> DNA

<213> STR遗传标记

<400> 26

tggaacggaa tggaatggga tggaatggaa tggtacggaa tagaatggaa tggaatgaaa 60

tggaatggaa tggaatggaa tggaatggaa tggaatgaac c 101

Claims (7)

1.一种腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)获取人体血液组织中位于核小体核心区域DNA；b)对所述核小体核心区域DNA进行测序；c)将测序得到的序列与人类基因组序列信息进行比对，筛选，获得了核小体核心区域SNVs、Indels或STRs遗传标记；d)根据所述SNVs、Indels或STRs遗传标记的序列设计上、下游引物；e)提取腐败检材的DNA；f)用设计的所述上、下游引物对所述腐败检材的DNA进行PCR扩增，得扩增产物；g)对所述扩增产物电泳，根据扩增获得的每个基因座进行分析。

2.根据权利要求1所述的腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，将所述测序获得的序列与人类基因组序列信息进行比对时，每条测序获得的序列与人类基因组序列比对不多于3个碱基错配的为有效序列，可用于进一步筛选。

3.根据权利要求1所述的腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，所述SNVs遗传标记采用samtools和varscan软件进行筛选。

4.根据权利要求1所述的腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，所述Indels遗传标记采用samtools和varscan软件进行筛选。

5.根据权利要求1所述的腐败检材降解DNA的检测方法，其特征在于，所述STRs遗传标记通过编程筛选，其编程条件为：①允许有0个碱基错配；②STR重复单位的基序长度为3、4或者5bp；③STR重复单位的重复次数大于5；④对于重复单元相同的所有潜在STR，取出其两翼序列，两翼序列有任意一端长度小于10bp的过滤掉；⑤对两翼序列分别两两比较，潜在STR向左、右分别取10bp，完全相同的认定为同一个STR；⑥一个STR有3个及以上的序列支持，认定该STR遗传标记为真实存在；全部满足以上6个条件的序列为有效STRs遗传标记。

6.一种核小体核心区域遗传标记在腐败检材降解DNA法医检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的核小体核心区域遗传标记在腐败检材降解DNA法医检测中的应用，其特征在于，所述核小体核心区域遗传标记为核小体核心区域的SNVs遗传标记、Indels遗传标记或STRs遗传标记中的任意一条。