CN113564237B - 获得稳定核小体定位信息的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种获得稳定核小体定位信息的方法，其包括以下步骤：（a）对待检测样本进行预处理，获得包含DNA的样品；（b）将样品分组，分别用高、中、低剂量水平的微球菌核酸酶对相应样品进行消化；（c）使用试剂盒提取消化后样品中的DNA，获得核小体核心区DNA；（d）对获得的核小体核心区DNA进行测序，将相同微球菌核酸酶消化水平的两个样本数据使用生物信息学工具DANPOS进行比较，进而筛选出稳定核小体定位信息。本发明提供了一种获得稳定核小体定位信息的方法，本发明的稳定核小体指在不同样本间定位一致的核小体，其对于法医鉴定来说可靠性更高。
Description
技术领域
本发明涉及法医鉴定技术领域，具体地说是一种获得稳定核小体定位信息的方法。
背景技术
法医检案过程中经常会遇到各种各样的降解生物检材。在细胞死亡后，生物检材同时受到高温、潮湿、土壤微生物、暴晒、强酸、强碱和紫外辐射等因素的作用，使DNA发生降解。在这种情况下，后续实验过程中常常会有PCR扩增缺失或错误扩增，STR分型出现Ladder-like条带、Sutter峰、等位基因不平等扩增及丢失等现象，使DNA分型成功率大大降低，案件侦破变得极为困难。为解决降解生物检材分析这一难题，国内外学者进行了大量深入研究，但仍然无法解决全部问题，使案件无法顺利侦破。
核小体是真核生物染色质最基本的结构单位，由DNA和组蛋白构成。每个核小体DNA长约200bp，其中缠绕在组蛋白八聚体上的核心DNA (core DNA)约146bp，两个组蛋白八聚体间的DNA (linker DNA) 约20-50bp。Bjo ̈ rn Rydberg等在放射性辐射中观察到活细胞中DNA链的核小体保护作用。另有研究发现在细胞凋亡或程序性细胞死亡过程中，核小体DNA序列能够逃脱酶促反应的切割。核小体对核心DNA序列的这种保护作用能否应用于法医降解生物检材的检测，目前已有法医工作者进行了探索，但存在一定争议。例如A. Freire-Aradas 等使用生物信息学软件RECON筛选出核小体核心区18个SNPs，并构建复合扩增体系；该体系对降解检材的分型成功率较SNP for ID 高6%，并且明显高于miniSTR体系。Phuvadol Thanakiatkrai 等使用生物信息软件NXSensor 和nuScore对60个STR位点的核小体定位情况进行评分，结果显示这些STR基因座已经在一定程度上受到了保护核小体降解。建议在选择遗传标记时尽量选择可以受到保护的基因座。但该团队后续进行的实验验证结果显示不同评分STR位点间检出率并无差异。
基于上述情况，我们认为出现不同结果的原因可能是核小体定位方法的差异。目前仍然缺乏获得精确核小体定位的方法，核小体定位方法分为两类，软件预测和实验方法。国外团队均是基于预测软件对核小体核心区域进行定位。这种整体上属于分类预测的方法并不是解决核小体定位问题的根本途径。核小体形成时会受到多种因素影响，如二核苷酸周期性和堆积力，GC含量和染色质重塑。有研究也表明细胞所处环境常较DNA序列信号更具影响力，从而导致核小体占据或离开某一位点。核小体预测软件是基于DNA与组蛋白结合的形成能或序列信号特性开发而来，可能忽略了其它核小体形成因素。微球菌核酸酶消化结合高通量测序（MNase-seq）是最常用的核小体定位实验方法，但是对数据库中的各种物种的MNase-seq数据进行分析发现，即使是在相同的细胞系中，不同的数据之间单个核小体的位置也存在差异。造成差异的原因，一部分是核小体本身的动态性即核小体定位受染色质重塑等过程的调控而变化，另一部分是由实验方法和数据分析方法引起的噪音。这些情况为核小体的精确定位带来了困扰。Daniel J. Gaffney等通过计算基因组200bp区域内片段中点的集中程度来评估多个样本在基因组上某个位置的核小体定位一致性。但是该方法并没有考虑到测序产生的重复reads和不同样本的测序深度差异，这些因素会影响稳定核小体定位的精确度。因此，研究一种可获得高精确度核小体定位的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是提供一种获得稳定核小体定位信息的方法，以解决现有技术中核小体定位方法精确度低的问题。
本发明的目的是这样实现的：一种获得稳定核小体定位信息的方法，包括以下步骤：
（a）对待检测样本进行预处理，获得包含DNA的样品；
（b）将样品分组，分别用高、中、低剂量水平的微球菌核酸酶对相应样品进行消化，消化条件为37℃孵育2-4小时；其中，高剂量水平为微球菌核酸酶∶裸DNA量=110-130U∶17µg，中剂量水平为微球菌核酸酶∶裸DNA量=25-40U∶17µg，低剂量水平为微球菌核酸酶∶裸DNA量=10-20U∶17µg；
（c）使用试剂盒提取消化后样品中的DNA，获得核小体核心区DNA；
（d）对获得的核小体核心区DNA进行测序，将测序数据导入bwa软件，并与人类参考基因组GRCh38进行比对；将相同微球菌核酸酶消化水平的两个样本数据使用生物信息学工具DANPOS进行比较，基于泊松分布以单核苷酸分辨率计算核小体差异信号，从而获得基因组相同位置上的每个核小体的位移、模糊度和占据水平的变化值；
（e）根据设定的筛选条件获得平移定位稳定的核小体信息。
步骤（a）中，所述样本为不同人的外周血，所述包含DNA的样品为将外周血裂解后获得的白细胞。
步骤（b）中，消化液中加入CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为80-120mM，CaCl2溶液的加入量与裸DNA量的比为230-270µL∶17µg。
步骤（b）中，每个样本以裸DNA消化作为对照，其步骤为先将样本提取DNA，然后加入微球菌核酸酶进行消化，消化条件为37℃孵育2-4小时，微球菌核酸酶∶裸DNA量=0.45U∶1µg。
步骤（d）中，将裸DNA消化对照组获得的信息作为背景，利用DANPOS，对中、高剂量消化水平的数据分别进行校正。
步骤（d）中，使用bwa软件将测序获得的reads与人类参考基因组GRCh38进行比对，对raw reads进行精细过滤，得到clean reads，所有样品产生的BED文件均通过DANPOS算法运行并比较。
步骤（d）中，每个样本的测序方法和数据分析方法保持一致。
步骤（e）中，稳定核小体的筛选条件如下：
核小体中心位移treat2control_dis=0；
模糊度满足：fuzziness_diff_log10pval ≥ -10，并且 |fuzziness_log2FC|≤1；
占据水平满足：control_smt_val>0，并且treat_smt_val>0。
本发明提供了一种获得稳定核小体定位信息的方法，本发明的稳定核小体指在不同样本间定位一致的核小体，其对于法医鉴定来说可靠性更高。
本发明在检测和数据分析过程中尽量避免噪音的干扰，主要措施有（1）精确实验条件，例如MNase的消化水平、切割特点，（2）保证测序方法一致性，例如测序平台，单端还是双端测序，测序深度等，（3）数据分析方法一致性，例如检测核小体峰的算法。最终，我们通过筛选稳定核小体并且去除噪音，开发出了一种可获得高精确度核小体定位的方法。
附图说明
图1为样品在裸DNA校正前后的模糊分数分布。
图2为样品在裸DNA校正前与校正后GC含量与占据水平的相关性。A为校正前样品数据，B为校正后样品数据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法或制造商建议的条件进行。
实施例1
本实施例方法包括以下步骤：
（一）设置三个不同MNase消化程度，获得全面、精确的核小体定位图谱
从2个健康人外周血收集白细胞，使用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease ，MNase）对血液裂解后白细胞进行消化。在显微镜下对白细胞进行计数，5×106个细胞分为1管。每个样本制备3组白细胞样品。每个样本的每组白细胞中分别加入MNase（thermoscientific）15、30、120U，同时加入CaCl2溶液（浓度为100mM用量为250µl），均于37℃孵育3小时，最后加150微升500mM EDTA终止反应。使用E.Z.N.A.TM Blood DNA Midi Kit（OMEGA）提取纯化DNA。使用Labchip®GX Touch24 对MNase消化后DNA进行分析，获得各片段的浓度，计算消化程度。切取琼脂糖凝胶电泳的单核小体片段（150bp左右），使用Wizard SVGel and PCR clean-up System（promega）回收并纯化DNA。每个个体样本制备一份裸DNA对照样品，方法与前述的6组样品相同，不同的地方是首先从血液白细胞中提取出DNA，再加入0.45U MNase，琼脂糖凝胶电泳切胶回收150bp条带。对核小体DNA使用配对末端（2×150bp）方法在Novaseq 6000平台上测序。
共8组样品的测序数据使用bwa将测序获得的reads与人类参考基因组GRCh38进行比对，对raw reads进行精细过滤，得到clean reads。所有样品产生的BED文件均通过DANPOS算法运行，在该算法中，将重复reads去除以排除任何潜在的PCR扩增偏差，调整reads长度以提高信号与噪音的比例。DANPOS使用默认参数运行。获得每个样本全基因组上的每个核小体的位置，模糊度评分和占据评分。
（二）以裸DNA对照样品，对部分MNase消化的核小体定位数据进行校正，排除不完全消化带来的噪音。
由于MNase在部分消化时有序列偏好性，为了消除这种偏差同时去除背景噪音，提高核小体定位的精确度，我们将裸DNA信号作为背景，利用生物信息学工具DANPOS，对中、高两个消化程度MNase-seq数据分别进行校正。获得每个样本在校正后的全基因组上的每个核小体位置，模糊度评分和占据评分。对比同一样本校正前后的变化，结果显示，4组样品校正后核小体模糊度均降低，表明核小体定位的精确度提高（图1）。此外4组样品校正后GC含量与核小体占据水平相关性系数R减小（图2），表明GC偏好性降低。
（三）对MNase消化水平相同的核小体定位数据进行比较，排除消化水平带来的噪音，筛选稳定核小体。每个样本的测序方法和数据分析保持一致，尽可能去除噪音。在本实验中，稳定核小体的筛选条件是：1.核小体中心位移为0（treat2control_dis=0），2.模糊度无差异（fuzziness_diff_log10pval ≥ -10，并且 |fuzziness_log2FC|≤ 1），3.占据水平均大于检测阈值（control_smt_val>0 并且 treat_smt_val>0）。本实施例获得了来源于2个不同样本，在三种MNase消化水平下的稳定核小体平均为925897、843359、862330个。分别占总核小体数量的10.13%，10.47%，14.01%。远远多于单一MNase条件下的数量。
本发明设置三种不同的消化程度使我们确定了MNase对核小体定位的影响，获得了更加全面的核小体定位图谱。
1.MNase消化程度对核小体图谱的影响是多个方面的，包括单核小体片段的大小、核小体定位、占据水平、模糊分数。因此，在进行两样本比较前，确定MNase消化程度是否一致是至关重要的，若不一致则会严重影响结果的准确性。
2.由于不同MNase消化程度下，核小体定位和占据水平不同，甚至部分核小体仅在某一消化程度下存在，在其他消化程度下完全不存在。那么单个MNase条件不能获得全面的核小体定位信息。因此我们制备了低、中、高三种MNase消化程度，相较于传统的单一的高消化程度，获得了更加全面的核小体定位信息。
3.增加裸DNA对照，对部分MNase消化的核小体定位数据进行校正。排除了不完全消化带来的噪音，提高了核小体定位的精确度。
4.对MNase消化水平相同的核小体定位数据进行比较，排除消化水平带来的噪音，筛选稳定核小体。每个样本的测序方法和数据分析保持一致，尽可能避免噪音。
本发明基于生物信息软件DANPOS对两样本进行高精确度的比较。DANPOS软件在比较两样本前可去除重复reads，调整reads长度，对测序深度不同的样本进行校正使其具有可比性。基于泊松分布以单核苷酸分辨率计算核小体差异信号，获得基因组相同位置上的每个核小体的位移、模糊度和占据水平的变化值。通过对三种变化值分别设置阈值，筛选出稳定核小体，并且可以获得每个核小体发生差异的类型和具体数值，能够做到定性并且定量。
Claims (1)
1.一种获得稳定核小体定位信息的方法，其特征是，包括以下步骤：
（a）对两个待检测样本进行预处理，获得包含DNA的样品；其中，所述样本为不同人的外周血，所述包含DNA的样品为将外周血裂解后获得的白细胞；
（b）将样品分组，分别用高、中、低剂量水平的微球菌核酸酶对相应样品进行消化，同时在消化液中加入CaCl2溶液，消化条件为37℃孵育2-4小时；其中，高剂量水平为120U的微球菌核酸酶，中剂量水平为30U的微球菌核酸酶，低剂量水平为15U的微球菌核酸酶；
每个样本以裸DNA消化作为对照，其步骤为先将样本提取DNA，然后加入微球菌核酸酶进行消化，同时在消化液中加入CaCl2溶液，消化条件为37℃孵育2-4小时，微球菌核酸酶∶裸DNA量=0.45U∶1µg；
所述CaCl2溶液的浓度为100mM，加入量为250µL；
（c）使用试剂盒提取消化后样品中的DNA，获得核小体核心区DNA；
（d）对获得的核小体核心区DNA进行测序，将测序数据导入bwa软件，并与人类参考基因组GRCh38进行比对；以裸DNA消化对照组获得的信息作为背景，利用DANPOS，对中、高两个消化程度的数据分别进行校正；将相同微球菌核酸酶消化水平的两个样本数据使用生物信息学工具DANPOS进行比较，基于泊松分布以单核苷酸分辨率计算核小体差异信号，从而获得基因组相同位置上的每个核小体的位移、模糊度和占据水平的变化值；其中，使用bwa软件将测序获得的reads与人类参考基因组GRCh38进行比对，对raw reads进行精细过滤，得到clean reads，所有样品产生的BED文件均通过DANPOS算法运行并比较；每个样本的测序方法和数据分析方法保持一致；
（e）根据如下筛选条件获得平移定位稳定的核小体信息：
核小体中心位移treat2control_dis=0；
模糊度满足：fuzziness_diff_log10pval ≥ -10，并且 |fuzziness_log2FC|≤ 1；
占据水平满足：control_smt_val>0，并且treat_smt_val>0。
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| MNase-seq与核小体定占位研究;邓玮杭等;《遗传》;第42卷(第12期);第1143-1155页 * |
| Subtracting the sequence bias from partially digested MNase‑seq data reveals a general contribution of TFIIS to nucleosome positioning;Gabriel Gutiérrez等;《Epigenetics & Chromatin》;第10卷;第3 页、 第4 页右 栏和第5 页右栏 * |
| 多样本核小体动态定位识别技术研究;刘凌洁;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;A006-34 * |
| 核小体在DNA降解过程中的作用及其法医学应用研究;董春楠;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;E076-3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113564237A (zh) | 2021-10-29 |
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