DE102005060925B4

DE102005060925B4 - Verfahren zur Detektion von DNA-Basensequenzveränderungen

Info

Publication number: DE102005060925B4
Application number: DE200510060925
Authority: DE
Inventors: Klaus Prof. Dr. Eschrich
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2005-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2010-04-01
Anticipated expiration: 2025-12-15
Also published as: DE102005060925A1

Abstract

Verfahren zur Detektion von DNA-Basensequenzveränderungen in einer Proben-DNA mit den Schritten
a. Amplifikation der Proben-DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR),
b. Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease,
c. massenspektrometrische Analyse der Fragmente,
d. Rückschluss auf das Vorliegen einer DNA-Basensequenzveränderung durch Vergleich der massenspektrometrisch ermittelten Fragmentmassen mit für das Vorliegen solcher DNA-Basensequenzveränderungen berechneten Fragmentmassen,
dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a.
– mindestens einer der eingesetzten Primer an mindestens einer Position anstelle einer Base, vorzugsweise anstelle eines Thymins, ein Uracil enthält, wobei die Position des Uracils so gewählt ist, dass nach Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease die Fragmente, die die nachzuweisende DNA-Veränderung enthalten, eine Masse zwischen 2000 und 6000 Da aufweisen,
– die zur PCR eingesetzten Primer an die zu detektierende DNA-Basensequenzveränderung flankierende Bereiche der Proben-DNA binden,
– die PCR in Gegenwart von dUTP, dATP, dGTP und dCTP...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von DNA-Sequenzveränderungen mittels MALDI-TOF-MS zur Anwendung auf allen Gebieten, bei denen eine schnelle Identifizierung von kleinen DNA-Sequenzveränderungen (Mutationen), wie z. B. Punktmutationen (Basenaustausche, Einzelbasenpolymorphismen (SNPs), Verlust oder Insertion einer Base) oder kleinen Deletionen oder Insertionen (Verlust oder Insertion weniger Basen), bedeutsam ist, z. B. Human- und Tiermedizin (Genetik, Diagnostik von Erbkrankheiten, SNP-Diagnostik, Forensik (DNA-Vergleiche)), Mikrobiologie (Vergleiche ähnlicher Mikroorganismen (z. B. Stämme einer Spezies)), Pflanzengenetik und Züchtungsforschung.
Es ist bereits bekannt, DNA-Basensequenzveränderungen mit einer Vielzahl verschiedener Methoden nachzuweisen. Unter diesen Methoden sind auf Massenspektrometrie basierende Mutationsdetektionsverfahren von besonderem Interesse, da bei allen anderen Methoden die Ergebnisse aus qualitativen oder halbquantitativen Daten (z. B. dem Auftreten von Elektrophoresebanden nur ungefähr bestimmbarer Massen nach Restriktionsverdau oder dem Auftreten von Gelektrophoresebanden oder Elutionspeaks bei DNA-Sequenzierung, oder dem Auftreten von Fluoreszenzsignalen bei Hybridisierungstechniken) gewonnen werden, während die Massenspektrometrie, insbesondere die Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS), hochpräzise absolute Produktmassen liefert. Aus diesem Grunde sind massenspektrometriebasierte Mutationsdetektionsverfahren zuverlässiger als andere Methoden (Pusch et al, 2002, Tost und Gut, 2002).
Die bekannten auf Massenspektrometrie basierenden Verfahren zur Mutationsdetektion beruhen auf einer Kombination aus Polymerasekettenreaktion (PCR), nachfolgender Primer-Extensionsreaktion (PE) und massenspektrometrischer Analyse meist mittels Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS).
Die PCR dient zur Vervielfältigung eines Abschnitts der die Mutation enthaltenden Ausgangs-DNA. Dies ist notwendig, da bisher keine Methoden existieren, die wenigen mutierten DNA-Moleküle in komplexen biologischen Proben, wie z. B. genomischer DNA, unmittelbar nachzuweisen.
Im Anschluss an die PCR wird das PCR-Produkt gereinigt. In der PCR nicht verbrauchte Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) werden entfernt bzw. hydrolysiert, da sie die nachfolgende Primer-Extensionsreaktion (PE) stören würden.
Die direkte massenspektrometrische Analyse des PCR-Produkts ist mit bekannten Methoden nicht möglich, da sogar kleinstmögliche PCR-Produkte, die nur etwa 35–40 Basenpaare (Bp) groß sind, zu groß sind, um mittels MALDI-TOF MS mit handelsüblichen Geräten (Stickstofflaser) hinreichend empfindlich nachgewiesen werden zu können.
Bei der nachfolgenden Primerextensionsreaktion (PE) wird daher ein kurzer Primer, der auf der 5'-Seite der zu detektierenden Mutation an das PCR-Produkt bindet, durch Zugabe von Didesoxyribonukleosidtriphosphaten (ddNTPs) um eine Base verlängert. Die PE-Produkte müssen aufgereinigt werden, um die für die nachfolgende massenspektrometrische Analyse (meist MALDI-TOF MS) erforderliche Qualität zu erlangen.
Der Mutationsnachweis erfolgt durch Vergleich der experimentell ermittelten Massen der PE-Produkte mit den für Wildtyp und die zu erwartenden Mutanten berechneten PE-Produktmassen. Dabei sind hohe gerätetechnische Anforderungen zu erfüllen, da beim Nachweis von Einzelbasenveränderungen (z. B. Einzelbasenpolymorphismen (SNPs)) 9 Da als kleinste Massendifferenz aufgelöst werden müssen. Dies entspricht der Massendifferenz zwischen Adenin und Thymin.
Weiterhin ist eine methodische Variante dieses Verfahrens („Genosnip”-Methode, Wenzel et al. (2003)) bekannt. Dabei wird als PE-Primer ein 5'-biotinyliertes Oligonukleotid verwendet, das einen photospaltbaren Linker enthält. Nach der PE erfolgt die Aufreinigung des Produktes durch Bindung an Streptavidin-beschichtete Plastikgefäße. Das 3'-Fragment des PE-Produktes, das die Information über die Mutation trägt, wird von der festen Phase mittels UV-Licht abgespalten. Bei dieser Methode sind die Massen der zu analysierenden Fragmente kleiner und unabhängig von der Gesamtmasse des PE-Primers.
Die Nachteile der bekannten auf Massenspektrometrie basierenden Mutationsnachweismethoden bestehen darin, dass jede Probe nacheinander zwei unterschiedlichen Amplifikationsmethoden (PCR und PE) unterzogen werden muss, die zudem für jeden Mutationsnachweis unabhängig voneinander optimiert werden müssen. Dies erfordert hohen Arbeits-, Zeit- und Materialaufwand.
Außerdem ist insbesondere die Primerextensionsreaktion sehr empfindlich gegenüber Template-unabhängiger Primer-Selbstverlängerung. Ursache für Primerselbstverlängerung ist die sequenzabhängige Ausbildung von Sekundärstrukturen oder von Primerduplexen, in denen einzelsträngige 5'-Anteile eines oder beider Primer vorkommen, die als Template für Primerextensionen dienen können. Durch Primerselbstverlängerung entsteht wie bei der PE ein um eine Base verlängerter Primer, was zu falschen Ergebnissen bei der massenspektrometrischen Analyse führt.
Primerselbstverlängerung kann nur durch zeitaufwändige Vorversuche in Abwesenheit des Templates ausgeschlossen werden. Da Primerselbstverlängerung jedoch nicht immer hinreichend reproduzierbar und kontrollierbar ist, kann die bloße Anwesenheit von Fremd-DNA zur Primerselbstverlängerung führen. Durch zeit- und arbeitsaufwändiges Einführen von Basensequenzveränderungen in den Primern lässt sich zwar die Primerselbstverlängerung vermindern, dies führt aber unvermeidbar zu Mismatchen und damit Spezifitäts- und Sensitivitätsverlusten.
Es sind weiterhin Verfahren zur Bestimmung der Größe von Oligonukleotiden mit Hilfe von Massenspektrometrie bekannt, die auf einer PCR mit einem modifizierten Primer beruhen, welcher eine spaltbare Stelle, z. B. Uracil, enthält. Zur massenspektometrischen Bestimmung werden Primer und das daran in der PCR angeheftete Verlängerungsprodukt an der spaltbaren Stelle im Primer gespalten und anschließend die Größe des gesamten Verlängerungsproduktes bestimmt. Dabei entspricht die kleinste für den Nachweis einer Einzelbasenmutation aufzulösende Massendifferenz der Massendifferenz zwischen Adenin und Thymin, welche 9 Da beträgt ( DE 696 05 669 T2 ).
Weiterhin sind Verfahren zur schnelleren Identifikation von Bakterien bekannt, bei denen eine Amplifikation eines bestimmten Abschnittes der bakteriellen 16 S rRNA mittels PCR stattfindet, welche in Gegenwart von dUTP anstelle von dTTP durchgeführt wird. Das erhaltene Produkt von ca. 350 bp wird enthält dann anstelle von Thymin Uracil und wird an dieser Stelle durch eine Uracil-DNA-Glycosylase in Fragmente gespalten und dann mittels MALDI-TOF analysiert. Die Massen aller Fragmente der PCR-Reaktion werden dabei erfasst, so dass die gesamte Peakliste zur Charakterisierung des jeweiligen Bakteriums herangezogen werden kann (Wintzingerode et al, 2002).
Zur Detektion einer Mutation bzw. eines Unterschieds in einem oder mehreren Nukleotiden zwischen einem Nukleinsäuremolekül und einem Referenznukleinsäuremolekül ist ein Verfahren bekannt, in dem das Nukleinsäuremolekül basenspezifisch gespalten wird. Die resultierenden Oligonukleotide werden mittels MALDI-TOF analysiert und mit dem Fragmentierungsmuster des Referenz-Nukleinsäuremoleküls verglichen, wobei ein gegenüber dem Referenzspektrum veränderter Massenpeak eine Mutation bzw. einen Unterschied in einem oder mehreren Nukleotiden zwischen dem Nukleinsäuremolekül und dem Referenz-Nukleinsäuremolekül indiziert. Dafür wird die Nukleinsäureprobe in Gegenwart von dUTP anstelle von dTTP mittels PCR amplifiziert und die entstehenden 69 bp bzw. 70 bp langen, Uracil enthaltenden, PCR-Produkte mittels einer Uracil-N-Glycosylase fragmentiert und anschließend mittels-MALDI-TOF analysiert ( WO 98/54571 ).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das eine einfache, schnelle und kostengünstige Detektion von DNA-Basensequenzveränderungen erlaubt und zudem geringere gerätetechnische Anforderungen an die erforderliche Massenauflösung stellt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von DNA-Basensequenzveränderungen in einer Proben-DNA mit den Schritten:

a. Amplifikation der Proben-DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR),
b. Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease,
c. massenspektrometrische Analyse der Fragmente,
d. Rückschluss auf das Vorliegen einer DNA-Basensequenzveränderung durch Vergleich der massenspektrometrisch ermittelten Fragmentmassen mit für das Vorliegen solcher DNA-Basensequenzveränderungen berechneten Fragmentmassen. dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a.
– mindestens einer der eingesetzten Primer an mindestens einer Position anstelle einer Base, vorzugsweise anstelle eines Thymins, ein Uracil enthält, wobei die Position des Uracils so gewählt ist, dass nach Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease die Fragmente, die die nachzuweisende DNA-Veränderung enthalten, eine Masse zwischen 2000 und 6000 Da aufweisen,
– die zur PCR eingesetzten Primer an die zu detektierende DNA-Basensequenzveränderung flankierende Bereiche der Proben-DNA binden,
– die PCR in Gegenwart von dUTP, dATP, dGTP und dCTP durchgeführt wird und
– ein PCR-Produkt mit einer Länge von 33 bis 60 Basenpaaren gebildet wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren entfällt der Primerextensions-Schritt. Dadurch ist das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren wesentlich schneller, kostengünstiger und deutlich weniger störanfällig, denn durch den Wegfall des PE-Schrittes entfallen die für die PE erforderlichen zeitaufwändigen und kostenintensiven Schritte der Reinigung des PCR-Produkts, der Optimierung von PE-Bedingungen und der Primerselbstverlängerungstests. Durch den Wegfall des PE-Schrittes ist das Verfahren weniger störanfällg gegenüber Primerselbstverlängerung.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden kleine, massenspektrometrisch analysierbare Fragmente der PCR-Produkte erzeugt, indem die beiden PCR-Primer so gewählt werden, dass sie die zu detektierende DNA-Basensequenzveränderung unmittelbar flankieren (d. h. mit ihren 3'-Enden unmittelbar vor bzw. hinter der Mutation liegen oder mit ihren 3'-Enden nur wenige Basen von der Mutation entfernt sind), einer der PCR-Primer so modifiziert ist, dass er an einer Position ein Uracil enthält, bei der PCR dUTP statt TTP eingesetzt wird und auf diese Weise ein Uracil-haltiges PCR-Produkt erzeugt wird, das nach der PCR enzymatisch in kleine Fragmente zerlegt werden kann.
Die kleinste für den Nachweis einer Einzelbasenmutation aufzulösende Massendifferenz beträgt bei herkömmlichen Verfahren nach dem Stand der Technik 9 Da und entspricht der Massendifferenz zwischen Adenin und Thymin. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird anstelle von dTTP dUTP in der PCR eingesetzt. Dies hat den Vorteil, dass die kleinste aufzulösende Massendifferenz beim erfindungsgemäßen Verfahren 16 Da beträgt, was der Massendifferenz zwischen Adenin und Guanin entspricht. Die für den Nachweis einer Einzelbasenmutation, bei der Thymin (bzw. Uracil nach der PCR) beteiligt ist, aufzulösende Massendifferenz ist sogar größer als 300 Da, da durch das mit der PCR eingeführte Uracil eine Spaltstelle für den enzymatischen Verdau entsteht, während das analoge Fragment, das A, C oder G anstelle des U an dieser Position enthält, nicht gespalten wird. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher geringere Anforderungen an die Leistungsfähigkeit des eingesetzten Massenspektometer.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zum Nachweis von Punktmutationen (Basenaustausche, Einzelbasenpolymorphismen (SNPs), Verlust oder Insertion einer Base) oder kleinen Deletionen oder Insertionen (Verlust oder Insertion weniger Basen) z. B. in der Pflanzen-, Tier- und Humangenetik, in der Gendiagnostik an Mensch und Tier, in der Züchtungsforschung von Pflanzen und Tieren, in der genetischen Analyse von Mikroorganismen (Umweltanalytik, Nachweis von Antibiotikaresistenzen, Selektion von Hochleistungsstämmen für Produktions- und Umweltsanierungsprozesse).
Die zu untersuchende Proben-DNA wird beispielsweise aus einer biologischen Probe (isolierte Zellen von Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen, Tieren oder Menschen, kultivierte Zellen von Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen, Tieren oder Menschen, Gewebe von Zellen von Pilzen, Pflanzen, Tieren oder Menschen, Zell- oder Gewebehaltige Proben aus Umwelt oder technischen Prozessen) durch DNA-Isolierung mittels bekannter Verfahren gewonnen und ggf. beispielsweise mittels einer Polymerasekettenreaktion vorangereichert. Für diese Voranreicherungs-PCR sind typischerweise etwa 50 ng isolierte DNA nötig, die als Template für eine Amplifikation dienen, bei der die Primer so gewählt werden, daß ein zwischen 150 und 800 Basenpaare großes Amplifikat entsteht, das den Polymorphismus enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die PCR unmittelbar an der Proben-DNA durchgeführt. Dazu sind typischerweise etwa 50 ng isolierte DNA nötig. Die eingesetzten Primer einer Länge zwischen 16 und 22 Basen flankieren den nachzuweisenden Polymorphismus unmittelbar oder enden nur wenige Basen von diesem entfernt. Die zur PCR eingesetzten Primer werden so gewählt, dass ein ungewöhnlich kleines PCR-Produkt mit einer Länge von 33 bis 60 Basenpaaren gebildet wird. In einem der Primer wird eine Base (bevorzugt, aber nicht notwendig) ein Thymin durch ein Uracil ersetzt. Die Position des Uracils wird so gewählt, daß die Amplifikatfragmente, die die nachzuweisende DNA-Veränderung enthalten, eine gut messbare Masse, vorzugsweise zwischen 2000 und 6000 Da aufweisen, und weitere Spaltprodukte des Amplifikates keine ähnlichen Massen aufweisen.
Die PCR wird in Gegenwart von dUTP anstelle von TTP durchgeführt. Für die Amplifikation können alle üblichen thermostabilen DNA-Polymerasen verwendet werden. Die für jede PCR erforderliche Optimierung der Reaktionsbedingungen geht von Standardbedingungen aus. Wegen der geringen Länge des Amplifikates können typischerweise Synthesephasen (72°C) von weniger als 30 Sekunden zur Anwendung kommen.
Als Uracil-spezifische Nuklease wird eine Kombination aus Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glycosylase-lyase Endonuklease VIII, z. B. „USER Enzyme” der Firma New England Biolabs, eingesetzt. Uracil-DNA-Glykosylasen katalysieren die Spaltung der N-glykosidischen Bindung zwischen Zucker und Uracil-Base, DNA-Glycosylase-lyasen spalten die Phosphodiesterbindung.
In alternativen Ausgestaltungsformen des Verfahrens werden vor der massenspektrometrische Analyse Substanzen, die die massenspektrometrische Analyse stören, entfernt. Dabei wird die DNA von die massenspektrometrische Analyse störenden Substanzen wie z. B. Kationen, Detergenzien befreit. Dies kann z. B. durch Verwendung des „Genopure Oligo”-Kits der Firma Bruker Daltonik GmbH erfolgen.
Vorzugsweise erfolgt die massenspektrometrische Analyse der Fragmente mittels MALDI-TOF MS. Dabei werden durch den Laser die beiden DNA-Stränge des Doppelstranges getrennt und die einfach positiv geladenen Molekülionen aller Fragmente nach ihrer Masse aufgetrennt. Typischerweise wird ein Massenfenster analysiert, das die Massen der die zu untersuchende Basensequenzveränderung reflektierenden Fragmente enthält sowie mindestens ein von dieser DNA-Veränderung unabhängiges Primer- oder Produktfragment, das eine einfache interne Kalibrierung erlaubt.
Aus dem Vergleich der experimentell ermittelten Fragmentmassen mit den für die möglichen Sequenzveränderungen (Mutationen) berechneten Fragmentmassen wird auf die in der Proben DNA tatsächlich vorliegende Sequenz(en) bzw. Mutation(en) rückgeschlossen.
Zur massenspektrometrischen Analyse werden die Fragmente mit einer für MALDI-TOF MS geeigneten Matrix, vorzugsweise Dihydroxypikolinsäure, versetzt.
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Dabei zeigen
1: MALDI-TOF MS Spektrum des Leerwertes (PCR ohne Templat)
2: MALDI-TOF MS Spektrum von Probe 1
3: MALDI-TOF MS Spektrum von Probe 2
4: MALDI-TOF MS Spektrum von Probe 3
Die Abkürzungen „mM” steht im Folgenden für die Einheit mmol/l. Die Abkürzung „Da” entspricht der Einheit g/mol.
Ausführungsbeispiel 1
Nachweis eines Einzelbasenpolymorphismus (SNP) am Beispiel des –174 G/C-Polymorphismus im Promotor des humanen Interleukin-6-Gens
Gezeigt ist ein Ausschnitt aus der DNA-Sequenz des Promotors des humanen Interleukin-6-Gens (Genbank, AF005485) mit einem G/C-Polymorphismus (unterstrichen) an der Position -174.
Die Sequenz des Uracil-haltigen Vorwärtsprimers für die PCR „IL6-SNPfoU1” ist fett dargestellt, die des Rückwärtsprimers für die PCR „IL6-SNPre” ist fett und kursiv dargestellt.
Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6-SNPfoU1:

5'-CCC CTA GTT GUG TCT TGC-3'
MW: 5420 Da

Rückwärtsprimer IL6-SNPre:

5'-TGT GAC GTC CTT TAG CAT-3'
MW: 5482 Da

Da chromosomale DNA diploider Körperzellen als Ausgangsmaterial zur Analyse benutzt wird, können hinsichtlich des –174 G/C-Polymorphismus drei Genotypen vorliegen:
GG (homozygot Wildtyp),
GC (heterozygot, nicht unterscheidbar von CG) oder
CC (homozygot Mutante).
1. DNA-Reinigung aus Blut
Die Reinigung von DNA aus Blut erfolgt mittels QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden). Die DNA-Konzentration beträgt zwischen 50 und 100 ng/μL.
2. PCR

Mit der in der Tabelle aufgeführten Zusammensetzung wird eine PCR nach folgendem Schema durchgeführt:

Temperaturprofil:	initial 96°C 5 min;
	30 Zyklen:
		96°C 30 sec
		50°C 30 sec
		72°C 30 sec
	terminal: 72°C 5 min; hold at 4°C

Bestandteil	Volumen [μl]
Wasser	19.3
PCR Puffer (10 × B)	2.5
MgCl₂ (25 mM)	1.5
dNTPs (50 mM dUTP, 25 mM dATP, 25 mM dCTP, 25mM dGTP)	0.1
IL6-SNPfoU1 (100 pmol/μl)	0.2
IL6-SNPre (100 pmol/μl)	0.2
FirePol DNA-Polymerase (5 U/μl)	0.2
Template-DNA	1

Ansatzvolumen: 25 μl

In Gegenwart des Uracil-haltigen dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dUTP) wird in der PCR folgendes Produkt erhalten:
(A) beschreibt die Möglichkeit, dass die Taq-Polymerase Template-unabhängig ein Adenin an das Produkt anfügt. Ob und in welchem Ausmaß dies geschieht, kann nicht vorhergesagt, sondern nur experimentell beobachtet werden. Dies hat jedoch keinerlei Einfluss auf die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens.
3. Spaltung des PCR-Produktes
Nach der PCR werden zu 25 μl PCR-Ansatz 5 Units „User enzym”, New England Biolabs, ein Gemisch aus Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glycosylase-lyase Endonuklease VIII, gegeben und der Ansatz wird für 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
4. Aufreinigung des behandelten PCR-Produktes für die MALDI-TOF MS
10 μl des Ansatzes werden mittels „Genopure Oligo”-Kit der Firma Bruker Daltonik GmbH nach Herstellervorschrift aufgereinigt. Von den Magnetkügelchen wird mit 10 μl Wasser eluiert.
5. MALDI-TOF MS
1 μl Matrixlösung (100 mg 3-Hydroxypicolinsäure plus 20 mg Dihydrogenammoniumcitrat in 10 ml Reinstwasser) wird auf jeden zu einer MALDI-TOF Untersuchung vorzubereitenden Spot berührungsfrei auf das Anker-Target (Anker-Target S/N 00605 mit 384 Anker-Spots mit 400 μm Durchmesser) aufgetragen. Die Spots werden unter einer Reinstraumbox (Laminar Air Flow) getrocknet. 1 μl des nach der „Genopure Oligo”-Reinigung erhaltenen Eluates (Schritt 4) werden auf die matrixbelegten Spots auftragen. Dabei werden alle Proben grundsätzlich zweifach aufgetragen. Die Spots werden unter einer Reinstraumbox (Laminar Air Flow) getrocknet. Das Anker-Target wird in das MALDI-TOF-Massenspektrometer (Biflex III, Bruker Daltonik GmbH, Bremen) eingeschleust. Die Kalibrierung des Massenspektrometers erfolgt nach Herstellervorschrift. Die Analyse der Proben erfolgt durch mehrfaches Beschießen der Probenspots mit geeigneter Laserleistung. Mindestens drei Spektren werden jeweils akkumuliert.
Messbedingungen:
Parameter:

Ion source 1: 19 kV, Ion source 2: 17 kV, Lens: 9,5 kV, Reflector: 0 kV
Mass range: 2000–11000 Da (für Standard) und 2000–6000 Da für Proben
Linear Detection Gain: 4,6 x
Calibration: Quadratic fit

6. Berechnung der im MALDI-TOF-MS-Spektrum zu erwartenden Fragmentmassen:
Durch Verdau des PCR-Produktes
mittels der Uracil-spezifischen Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glycosylase-lyase Endonuklease VIII können folgende Fragmente erhalten werden:

*: hinsichtlich des G/C-Polymorphismus informatives Fragment
P: Phosphat
r: Desoxyribose
**: zu große Masse für MALDI-TOF-MS, theoretisch hinsichtlich des G/C-Polymorphismus informatives Fragment

7. Auswertung der MALDI-TOF MS-Spektren
7.1 Leerwert (PCR ohne Templatezusatz)
Die PCR wurde wie unter Punkt 2 durchgeführt, jedoch wurde kein Templat zugesetzt.
Das erhaltene MALDI-TOF MS Spektrum für den „Leerwert” ist in 1 dargestellt.
Der Peak mit m/z 3062.2 stammt vom Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6SNPfoU1 oder Vorwärtsprimer enthaltenden Produktsträngen (Fragment: CCCCTAGTTG-P, berechnete Masse 3059 Da). Die Massenabweichung des gemessenen von dem berechneten Wert ist eichungsbedingt, gering und für die Methode unerheblich.
Erwartungsgemäß sind keinerlei Produktpeaks (berechnete Fragmentmassen m/z 2889, 2849, 2964, 3005) zu sehen.
7.2. Probe 1
Das erhaltene MALDI-TOF MS Spektrum für „Probe 1” ist in 2 dargestellt.
Der Peak mit m/z 3059.1 stammt vom Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6SNPfoU1 oder Vorwärtsprimer enthaltenden Produktsträngen (Fragment: CCCCTAGTTG-P, berechnete Masse 3059 Da (P = Phosphat)), der Peak mit m/z 2849.6 stammt vom Fragment P-GTCTTGCCA-P (informatives Produktfragment: C-Polymorphismus, berechnete Masse 2849 Da). Der Peak mit m/z 2965.1 stammt vom Fragment rPGTCTTGCCA-P oder P-GTCTTGCCA-Pr (informatives Produktfragment: C-Polymorphismus, berechnete Masse 2964 Da (r = Desoxyribose)). Diese Fragmente entstehen durch unvollständigen Endonuklease VIII-Verdau und werden häufig, aber nicht immer beobachtet. Sie stützen das aus dem Fragment mit 2849 Da ermittelte Ergebnis, sind aber nicht erforderlich. Alle Massenabweichungen der gemessenen von den berechneten Werten sind eichungsbedingt, gering und für die Methode unerheblich.

Ergebnis: Probe 1 enthält den -174 G/C-Polymorphismus im Promotor des humanen Interleukin-6-Gens als „homozygote Mutante (CC)”.

7.3. Probe 2
Das erhaltene MALDI-TOF MS Spektrum für „Probe 2” ist in 3 dargestellt.
Der Peak mit m/z 3058.8 stammt vom Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6SNPfoU1 oder Vorwärtsprimer enthaltenden Produktsträngen (Fragment: CCCCTAGTTG-P, berechnete Masse 3059 Da), der Peak mit m/z 2889.0 stammt vom Fragment P-GTCTTGCGA-P (informatives Produktfragment: G-Polymorphismus, berechnete Masse 2889 Da). Der Peak mit m/z 3004.7 stammt vom Fragment rPGTCTTGCGA-P oder P-GTCTTGCGA-Pr (informatives Produktfragment: G-Polymorphismus, berechnete Masse 3005 Da). Diese Fragmente entstehen durch unvollständigen Endonuklease VIII-Verdau und werden häufig, aber nicht immer beobachtet. Sie stützen das aus dem Fragment mit 2889 Da ermittelte Ergebnis, sind aber nicht erforderlich. Alle Massenabweichungen der gemessenen von den berechneten Werten sind eichungsbedingt, gering und für die Methode unerheblich.

Ergebnis: Probe 2 enthält den -174 G/C-Polymorphismus im Promotor des humanen Interleukin-6-Gens als „homozygoten Wildtyp (GG)”.

7.4. Probe 3
Das erhaltene MALDI-TOF MS Spektrum für „Probe 3” ist in 4 dargestellt.
Der Peak mit m/z 3059.1 stammt vom Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6*, -SNPfoU1 oder Vorwärtsprimer enthaltenden Produktsträngen (Fragment: CCCCTAGTTG-P, berechnete Masse 3059 Da), der Peak mit m/z 2849.2 stammt vom Fragment P-GTCTTGCCA-P (informatives Produktfragment: C-Polymorphismus, berechnete Masse 2849 Da). Der Peak mit m/z 2965.2 stammt vom Fragment rPGTCTTGCCA-P oder P- GTCTTGCCA-Pr (informatives Produktfragment: C-Polymorphismus, berechnete Masse 2964 Da).
Der Peak mit m/z 2889.1 stammt vom Fragment P-GTCTTGCGA-P (informatives Produktfragment: G-Polymorphismus, berechnete Masse 2889 Da). Der Peak mit m/z 3005.0 stammt vom Fragment rP-GTCTTGCGA-P oder P-GTCTTGCGAPr (informatives Produktfragment: G-Polymorphismus, berechnete Masse 3005 Da).

Ergebnis: Probe 3 enthält den –174 G/C-Polymorphismus im Promotor des humanen Interleukin-6-Gens als „heterozygot (GC bzw. CG)”.

Die an den Proben 1, 2 und 3 erhaltenen Ergebnisse wurden mit Hilfe einer unabhängigen Methode (Genosnip-Methode, Bruker Daltonik GmbH) überprüft und bestätigt.
Literatur

Pusch, W., Wurmbach, J. -H., Thiele, H. und Kostrzewa, M. „MALDI-TOF mass spectrometry-based SNP genotyping”. Pharmacogenomics 3(4), 537–548 (2002).
Tost, J. und Gut, I. G. „Genotyping single nucleotide polymorphisms by mass spectrometry”. Mass Spectrom Rev. 21(6), 388–418 (2002).
Wenzel, T., Elssner, T., Fahr, K., Bimmler, J., Richter, S., Thomas, I. und Kostrzewa, M. „Genosnip: SNP genotyping by MALDI-TOF MS using photocleavable oligonucleotides”. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 22(5–8), 1579–1581 (2003)
v. Wintzingerode, F., Bäcker, Schlötelburg, C., Chiu, N. H., Storm, N., Jurinke C., Cantor C. R., Göbel, U. B. und van den Boom, D. ”Base-specific fragmentation of amplified 16S rRNA genes analyzed by mass spectrometry: A tool for rapid bacterial identification”. PNAS 99 (10), 7039–7044 (2002)

Sequenzprotokoll

SEQ ID NO 1:	Ausschnitt aus der DNA-Sequenz des Promotors des humanen Interleukin-6-Gens (Genbank, AF005485) mit einem G/C-Polymorphismus an Position –174 Beschreibung Seite 7 und 8
SEQ ID NO 2:	Vorwärtsprimer (Uracilhaltiger Primer) IL6-SNPfoU1 Beschreibung Seite 8
SEQ ID NO 3:	Rückwärtsprimer IL6-SNPre Beschreibung Seite 8
SEQ ID NO 4:	PCR-Produkt (Vorwärtsstrang) Beschreibung Seite 9
SEQ ID NO 5:	PCR-Produkt (Rückwärtsstrang) Beschreibung Seite 9

SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Detektion von DNA-Basensequenzveränderungen in einer Proben-DNA mit den Schritten a. Amplifikation der Proben-DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), b. Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease, c. massenspektrometrische Analyse der Fragmente, d. Rückschluss auf das Vorliegen einer DNA-Basensequenzveränderung durch Vergleich der massenspektrometrisch ermittelten Fragmentmassen mit für das Vorliegen solcher DNA-Basensequenzveränderungen berechneten Fragmentmassen, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a. – mindestens einer der eingesetzten Primer an mindestens einer Position anstelle einer Base, vorzugsweise anstelle eines Thymins, ein Uracil enthält, wobei die Position des Uracils so gewählt ist, dass nach Spaltung des PCR-Produkts in Fragmente durch eine Uracil-spezifische Nuklease die Fragmente, die die nachzuweisende DNA-Veränderung enthalten, eine Masse zwischen 2000 und 6000 Da aufweisen, – die zur PCR eingesetzten Primer an die zu detektierende DNA-Basensequenzveränderung flankierende Bereiche der Proben-DNA binden, – die PCR in Gegenwart von dUTP, dATP, dGTP und dCTP durchgeführt wird und – ein PCR-Produkt mit einer Länge von 33 bis 60 Basenpaaren gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zur PCR eingesetzten Primer zwischen 16 und 22 Basen lang sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Uracil-spezifische Nuklease Uracil-DNA-Glykosylase und DNA-Glycosylase-lyase Endonuklease VIII eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der massenspektroskopischen Analyse Substanzen, die die massenspektroskopische Analyse stören, entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrische Analyse der Fragmente mittels MALDI-TOF MS erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmente zur massenspektrometrischen Analyse mit einer für MALDI-TOF MS geeigneten Matrix versetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Dihydroxypikolinsäure als Matrix eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Massenfenster analysiert wird, das die Massen der Fragmente enthält, die die zu analysierende Basensequenzveränderung widerspiegeln.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Massenfenster analysiert wird, das mindestens ein von der zu analysierenden DNA-Sequenzänderung unabhängiges Fragment zur internen Kalibrierung enthält.