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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ausführung einer Haplotypisierung
einer Mehrzahl von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), welches
allelspezifische PCR und eine Massenspektrometrie-Analyse einsetzt.
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Die
vollständige
Sequenz des menschlichen Genoms wird in den nächsten Monaten erhalten und
vollständig
veröffentlicht
werden. Dieses Projekt wird die vollständige Sequenz der 3 Milliarden
Basen und die relativen Positionen von allen geschätzten (von
30.000 bis über
100.000) Genen in diesem Genom enthüllen. Das Verfügen über diese
Sequenz eröffnet
zahlreiche Möglichkeiten
für die
Ermittlung von Genfunktionen und Wechselwirkungen von verschiedenen
Genen.
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Sie
ermöglicht
auch die Implementierung von Pharmakogenetik und Pharmakogenomik.
Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielen auf eine zielgerichtete
Verwendung einer Medikation abhängig
von dem Genotyp eines Individuums und so auf die dramatische Verbesserung
der Wirksamkeit von Arzneimitteln ab. Ein notwendiger Zwischenschritt
dazu besteht in der Bestimmung der Variabilität von verschiedenen Individuen
auf einer Genom-Basis. Dies wird bewerkstelligt, indem verschiedene
Marker bestimmt und diese dann für eine
Genotypisierung (Charakterisierung des Vorhandenseins eines Markers
in einem Individuum) und eine Haplotypisierung (Verknüpfung zwischen
verschiedenen Markern, die sich in großer Nähe zueinander befinden) verwendet
werden.
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Gegenwärtig werden
zwei Arten von Markern für
die Genotypisierung verwendet: Mikrosatelliten und Einzelnukleotidpolymorphismen
(SNPs).
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Mikrosatelliten
sind hochgradig polymorphe Marker, wobei unterschiedliche Allele
aus unterschiedlichen Anzahlen von repetitiven oder wiederholten
Sequenzelementen zwischen konservierten flankierenden Regionen gebildet
werden. Ein Mikrosatellit wird im Durchschnitt alle 100.000 Basen
gefunden. Eine vollständige
Karte von Mikrosatelliten-Markern, welche das menschliche Genom überspannen,
wurde von der CEPH (Dib et al., Nature 1996, 14. März; 380
(6570): 152–4)
präsentiert.
Mikrosatelliten werden üblicherweise
genotypisiert, indem die Größe von PCR-Produkten,
die im Bereich der repetitiven Region erzeugt worden sind, auf Gelen
bestimmt wird. Die am weitesten verbreitet verwendeten Systeme basieren
auf der Verwendung von fluoreszierend markierter DNA und deren Detektion
in Fluoreszenz-Sequenziergeräten.
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Im
patentfreien Bereich gibt es gegenwärtig weniger SNPs. Eine SNP-Karte
mit 300000 SNPs wird gegenwärtig
durch das SNP-Konsortium erstellt (Science, 1999, 284, 406–407).
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Für die Genotypisierung
von SNPs gibt es ein paar Verfahren, die dem Fachmann auf diesem
Gebiet zur Verfügung
stehen, alle von diesen mit Vorteilen und Nachteilen.
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Einige
von diesen Verfahren beruhen auf einer auf Gelen basierenden Detektion,
wie der Oligonukleotid-Ligase-Assay (OLA), und ermöglichen
aus diesem Grund nur Anwendungen mit mittlerem Durchsatz.
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Andere
beruhen auf einer reinen Hybridisierung, die nicht so unterscheidungskräftig ist
und schwierig abzustimmen ist, um die erforderliche hohe Stringenz
zu erhalten (Oligonukleotid-Anordnungen (Arrays), DNA-Chips). Obwohl
DNA-Chips für
eine gleichzeitige Genotypisierung einer großen Anzahl von Genotypen in
einer sehr stark begrenzten Region des Genoms und bei einer übersehbaren
Anzahl von Individuen gut geeignet sind, ist das Hauptproblem, das
bei der Verwendung dieser Gegenstände festgestellt wird, die
Schwierigkeit, die Hybridisierungsbedingungen (insbesondere hinsichtlich
der Stringenz) zu optimieren.
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Es
sind Ansätze
unter Verwendung von Primer-Extension (Primer-Verlängerung)
und Detektion durch Fluoreszenz gezeigt worden. Ihr Vorteil ist
eine leichte Emissionsdetektion in einem Lesegerät vom ELISA-Typ. Die Einschränkung dieser
Verfahren ist die zur Verfügung
stehende begrenzte Anzahl von fluoreszierenden Farbstoffen, welche
wiederum die Anzahl von Proben, die gleichzeitig analysiert werden
können,
begrenzt.
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Mehrere
Verfahren einer SNP-Genotypisierung verwenden Massenspektrometrie-Detektion, da eine Massenspektrometrie
einen sehr hohen Durchsatz ermöglicht
und zugleich zusätzliche
Informationen über
die Base, die vorhanden ist, durch die Masse des erhaltenen Produkts
liefert. Bei Anwendungen, wo ein allelspezifisches Produkt gemessen
wird, stellt dies eine direkte Information dar und ist dementsprechend
sehr überzeugend.
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Für die SNP-Genotypisierung
sind mehrere Verfahren unter Verwendung von Massenspektrometrie vorgeschlagen
worden (WO 98/23774,
US 5,843,669 ).
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Matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
(„Matrixassisted
laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry", MALDI) ermöglicht die
massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen (Karas und Hillenkamp,
Anal. Chem. 60, 2299–3301
(1988)). Tatsächlich
ist MALDI auf die Analyse von DNA in Variationen, die von der Analyse
von PCR-Produkten bis zu Ansätzen
unter Verwendung einer allelspezifischen Termination bis zu Einzelnukleotid-Primer-Extension-Reaktionen,
Sequenzierung und Hybridisierung angewendet worden (
US 5,885,775 , WO 96/29431,
US 5,691,141 , WO 97/37041,
WO 94/16101, WO 96/27681,
GB
2339279 .
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Hauptnachteile
dieser Ansätze
liegen darin, dass sie stark auf stringenten Reinigungsprozeduren
vor der MALDI-Analyse beruhen, die sich ihrerseits nicht für eine leichte
Automatisierung anbieten und einen Hauptteil der Kosten ausmachen.
Es werden häufig
Spin-Säulen-Reinigung und/oder
magnetische Kügelchen-Technologie
und Umkehrphase-Reinigung angewendet.
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Tatsächlich ist
die Analyse von Nukleinsäuren
durch MALDI stark von dem Ladungszustand abhängig und es kann eine 100-fache
Erhöhung
der Analysenempfindlichkeit erzielt wer den, wenn die DNA so konditioniert
wird, dass sie eine positive Ladung trägt. Solche modifizierten DNA-Produkte
neigen auch signifikant weniger zu einer Addukt-Bildung und erfordern
so keine Reinigungsprozeduren (WO 96/27681,
GB 2339279 , Gut und Beck (1995) Nucleic
Acids Research, 23, 1367–1373,
Gut et al. (1997) Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43–50.
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Ein
ausgehend davon entwickelter Assay für die Erzeugung von allelspezifischen
Produkten für
SNPs ist als der „GOOD-Assay" für die SNP-Analyse
bezeichnet worden (Sauer et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28,
E13).
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Nichtsdestotrotz
ermöglicht
die Genotypisierungsinformation allein keine vollständige Beurteilung
der Translation einer DNA-Sequenz in ein Protein oder der Regulation
der Transkription. Insbesondere wenn die zwei Allele eines gegebenen
Gens unterschiedliche SNPs tragen, ist es sehr wichtig, über Informationen über die
Kombination von verschiedenen SNPs in Bezug zu einander (Haplotypisierung)
und darüber,
welche der Allele sich auf dem gleichen DNA-Strang befinden, zu
verfügen.
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Es
gibt einige wenige Verfahren zur Haplotypisierung. Sie beruhen auf
der Erzeugung von allelspezifischen Produkten durch allelspezifische
PCR unter Verwendung eines Primers, dessen Base am 3'-Ende spezifisch
zu einem Allel, das amplifiziert werden soll, passt. Dennoch sind
sie in ihrem Leistungsvermögen,
eine Mehrzahl von Positionen gleichzeitig abzuklären, beschränkt. Das Vorhandensein oder
das Fehlen eines PCR-Produkts wird für die Identifizierung eines
Haplotyps verwendet.
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Ruano
et al. (1989), Nucleic Acids Research, 20, 8392, offenbaren die
Haplotypisierung von Chromosomensegmenten aus einer Mehrzahl von
Heterozygoten über
allelspezifische PCR-Amplifizierung und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Detektion.
Sauer et al. (2000), Nucleic Acids Research, 28, 2000, und WO 97
47766 beschreiben die Verwendung von Massenspektrometrie für die Genotypisierung.
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Um
die Spezifität
einer allelspezifischen PCR zu erhöhen, werden zwei hauptsächliche
Strategien verfolgt. Eine ist die Hinzufügung von GC-reichen Schwänzen an
das 5'-Ende der
Primer für
die PCR und das Ausführen
der PCR mit einer hohen Hybridisierungs- (Annealing-)-Temperatur (Liu et
al. (1997), Genome Res 7(4): 389–98). Für anfängliche Zyklen der PCR wird
so hohe Stringenz erhalten. In späteren Zyklen gewährleistet
der GC-Schwanz eine Präferenz
für die
Amplifizierungsmatrizen. Dies ergibt jedoch nicht in allen Fällen ausreichende
Stringenz.
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Ein
anderer Weg, um die Stringenz der allelspezifischen PCR zu erhöhen, ist
die Einführung
von weiteren Fehlpaarungen (Newton et al. (1989), Nucleic Acids
Res. 17(7): 2503–16).
Dieses Verfahren allein kann ebenfalls begrenzte Stringenz ergeben.
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Es
könnte
sich daher als interessant erweisen, diese beiden Verfahren zur
Erhöhung
der Spezifität
und Stringenz bei der allelspezifischen PCR-Reaktion zu kombinieren.
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Nichtsdestotrotz
hat die allelspezifische PCR (mit oder ohne Verbesserungen) den
Nachteil, dass sie nur zwei Polymorphismen in Bezug zu einander
abklären
kann.
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Clark
et al. (1998, Am. J. Hum. Genet., 69, 595–612) beschreiben ein Verfahren
für die
Analyse von Nukleotid-Sequenzvariationen in der humanen Lipoprotein-Lipase,
das eine Sequenzierung der Gene und der allelspezifischen PCR-Produkte
als das Analysenverfahren für
die Genotypisierung verwendet. Die Autoren legen die Schwächen dieses
Haplotypisierungsverfahrens dar, insbesondere da eine Menge Aufwand
erforderlich ist.
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Es
ist das Ziel der Erfindung, ein einfaches und Hochdurchsatz-Verfahren
zur Haplotypisierung bereitzustellen, das eine Bestimmung der Verknüpfung einer
Mehrzahl von SNPs in einer schnellen, kosteneffizienten und verlässlichen
Weise ermöglicht.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht
die gleichzeitige Analyse einer Mehrzahl von polymorphen Stellen,
nachdem nur eine allelspezifische PCR-Reaktion ausgeführt wurde.
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Tatsächlich ist
es oftmals erforderlich, die Allele von mehr als zwei Einzelnukleotidpolymorphismen durch
Genotypisierung zu bestimmen. Wenn es sich herausstellt, dass der
individuelle Genotyp hinsichtlich mehr als eines der SNPs heterozygot
ist, ist es interessant, zu bestimmen, welche der Allele sich auf
demselben DNA-Strang befinden.
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Die
Erfindung verwendet allelspezifische PCR für die Amplifizierung von nur
einem Allel aus der genomischen DNA. Der allelspezifische Primer
ist so gestaltet, dass er zu einem Allel eines heterozygoten SNPs passt.
Das Amplifizierungsprodukt wird dann genotypisiert, was offenbart
erlaubt, abzuleiten, welches die anderen Allele auf diesem Produkt
sind, und die Bestimmung des Haplotyps erlaubt, da die zuvor heterozygoten SNPs
nun homozygot erscheinen.
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Die
Assoziation des der allelspezifischen PCR zugrunde liegenden Polymorphismus
mit den bestimmten Allelen der Allele der anderen Polymorphismen
ergibt den Haplotyp.
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Die
Erfindung ist dementsprechend auf ein Verfahren zur Bestimmung des
Haplotyps eines Individuums gerichtet, welches die Schritte umfasst:
- a) Genotypisieren von mehr als zwei Einzelnukleotidpolymorphismen
(SNPs; „single
nucleotide polymorphisms")
durch Massenspektrometrie;
- b) allelspezifische PCR, wobei ein Primer für ein Allel eines heterozygoten
Polymorphismus spezifisch ist, wenn mehr als ein Polymorphismus
heterozygot ist;
- c) Genotypisieren an dem allelspezifischen PCR-Produkt durch
Massenspektrometrie;
- d) Assoziierung des der allelspezifischen PCR zugrunde liegenden
Polymorphismus mit den bestimmten Allelen der anderen getesteten
Polymorphismen.
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Das
Verfahren der Erfindung könnte
auch verwendet werden, um nahezu identische Sequenzen zu identifizieren,
um herauszufinden, ob eine Sequenz verdoppelt oder heterozygot ist.
Die Variationen können verwendet
werden, um „allelspezifische" Produkte zu erzeugen;
wenn andere Polymorphismen, die bei der anfänglichen Genotypisierung heterozygot
waren, heterozygot bleiben, ist es klar, dass eine Sequenz verdoppelt ist.
Wenn die zweite Genotypisierungsrunde dieses Systems zu allesamt
homozygoten SNPs führt,
ist es wahrscheinlich, dass die Sequenz, die untersucht wird, nicht
verdoppelt ist.
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Die
Verwendung von Massenspektrometrie erlaubt, die Analyse einer großen Anzahl
von Proben auszuführen
und die entsprechenden Daten in einer Multiplex-Reaktion zu erhalten.
Dementsprechend kann das Verfahren der Erfindung, das durch eine
Kombination zwischen allelspezifischer PCR und der Verwendung von Massenspektrometrie
für die
Genotypisierung und Datenanalyse gekennzeichnet ist, bei hohem Durchsatz verwendet
werden. Es kann auch automatisiert werden und wird eine leichte
und schnelle Bestimmung des SNP-Profils der Patienten ermöglichen.
Es wird dementsprechend die vollständige Implementierung von Pharmakogenetik
und Pharmakogenomik und eine verbesserte Nutzung der Daten, die
aus dem Genomsequenzierungsprojekt erhalten werden, ermöglichen.
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Die
Genotypisierung der SNPs in den Schritten a) und c) wird durch Massenspektrometrie
nach Erzeugung von allelspezifischen Produkten, die herkömmlicherweise
durch Primer-Extension,
Oligonukleotidligation, Spaltungsreaktionen erhalten werden können, ausgeführt.
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Einer
der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Möglichkeit,
die Analyse einer Mehrzahl von SNPs in einer DNA-Probe zu gleicher
Zeit in einer Multiplex-Reaktion, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet
bekannt ist, auszuführen,
indem die geeigneten Bedingungen gewählt werden.
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Um
die allelspezifische PCR-Reaktion von Schritt b) auszuführen, würde man
einen Primer verwenden, der zu einem Allel eines heterozygoten SNPs
passt, und vorzugsweise einen Primer, der spezifisch mit dem heterozygoten
SNP, der sich an der am weitesten 5' oder am weitesten 3' gelegenen Stelle von allen getesteten
SNPs befindet, hybridisiert. Der andere Primer würde mit beiden Allelen hybridisieren
und so gelegen sein, dass die Amplifizierung der Region, die alle
heterozygoten SNPs enthält,
erhalten wird.
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Bei
einer bevorzugten Implementierung der Erfindung wird eine Allelspezifität für die PCR-Amplifizierung
durch die Base am 3'-Ende
des Primers erzielt. Diese Base wird so gewählt, dass sie zu einem Allel
und nicht zu dem anderen passt. Weitere Spezifität kann erzielt werden, indem
ein Primer verwendet wird, bei dem zwischen 10 und 25 Basen komplementär zu der
Sequenz der genomischen DNA sind, am meisten bevorzugt zwischen
15 und 20 oder 22, wobei die Spezifität, wie beschrieben, durch die
Base am 3'-Ende
erhalten wird.
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Man
könnte
auch einen unspezifischen CG-reichen Schwanz an dem 5'-Ende des Primers
und/oder weitere Fehlpaarungen vor der allelspezifischen Base am
3'-Ende, wie beschrieben,
vorsehen. Mehr bevorzugt weist der Primer eine Fehlpaarung mehr
als 3 Basen entfernt von dem 3'-Ende
auf.
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Die
Hybridisierungs-(Annealing-)-Temperatur wird als kritisch (höher als
die berechnete Schmelztemperatur) gewählt. In den ersten Runden der
PCR kann nur die vollständig
komplementäre
Sequenz anhybridisieren. Sind einmal einige PCR-Runden erhalten
worden, stellt die höhere
Hybridisierungstemperatur aufgrund des GC-reichen Schwanzes eine
hauptsächliche
Amplifizierung eines einzelnen Allels sicher.
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Für diese
Prozedur wird Massenspektrometrie verwendet, da sie für die Analyse
von bis zu mehreren zehn Polymorphismen gut geeignet ist und im
Betrieb sehr leicht ist. Daher ist eine vollständige Automatisierung der Probenvorbereitung
durch dieses Verfahren möglich.
Abhängig
von der Probenvorbereitungsprozedur, die für die massenspektrometrische
Genotypisierung verwendet wird, ist diese Technologie sehr effektiv.
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Bei
einer bevorzugten Implementierung dieser Erfindung verwendet das
für einen
oder beide der Genotypisierungsschritte (a) und (c) ausgeführte Verfahren
Primer, die von chimärer
Natur sind, und die verfolgte Vorgehensweise ist ein für MALDI
entwickelter Assay, der als der GOOD-Assay, beschrieben von Sauer
et al., bezeichnet wird.
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Bei
einer bevorzugten Implementierung der Erfindung, in welcher matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
(MALDI) für
die Analyse der Genotypen verwendet wird. In einer anderen Ausführungsform
wird für
die Detektion Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
verwendet.
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Bei
einer bevorzugten Implementierung der Erfindung sind die Reagenzien
für die
anfängliche
Genotypisierung die gleichen wie diejenigen, die für die Genotypisierung
nach der allelspezifischen PCR verwendet werden.
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Diese
Erfindung stellt ein leichtes Verfahren zur Bestimmung von Haplotypen
bereit, welches kosteneffizient ist, hochgradig verlässlich ist
und leicht automatisiert werden kann und sich so für einen
hohen Durchsatz anbietet.
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Dieses
verbesserte Verfahren nutzt das Potential einer hochgradig parallel
verlaufenden Vorbereitung von Produkten für die Genotypisierung, deren
Konditionierung, so dass sie keine Reinigung erfordern, und das Potential
von Massenspektrometern, große
Anzahlen von Produkten gleichzeitig in einem Spektrum unterscheiden
zu können,
und welche in der Lage sind, ein einzelnes Spektrum in wenigen Sekunden
aufzuzeichnen, aus. Diese Erfindung umreißt Möglichkeiten, um die Probleme
beim Haplotypisieren einer großen
Anzahl von SNPs, auf welche man gegenwärtig in diesem Fachgebiet trifft,
in dramatischer Weise zu lösen,
und macht eine verbesserte und effiziente SNP-Genotypisierung möglich.
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Die
Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von Primern für eine PCR,
die allelspezifische Produkte erzeugen, für die Implementierung einer
Haplotypisierung durch das Verfahren der Erfindung. Die oben erwähnte Verwendung
in einem Kit kann auch die Reagenzien, um die Schritte a) und c)
des Verfahrens (Erzeugung von Proben, die durch Massenspektrometrie
für eine
Genotypisierung analysiert werden sollen) und die Instruktionen,
wie das Verfahren der Erfindung auszuführen ist, umfassen.
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BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 beschreibt das Prinzip des Verfahrens
der Erfindung, angewendet auf 4 SNPs, von denen zwei heterozygot
sind. Der erste Genotypisierungsschritt (1.A)
führt zu
der Erzeugung von 6 Produkten, wie durch Massenspektrometrie bestimmt.
Eine allelspezifische PCR (1.B)
führt zu
der Amplifizierung des väterlichen
Strangs. Eine Genotypisierung dieses Produkts (1.C) ermöglicht
die Identifizierung der SNPs, die auf diesem Allel vorhanden sind.
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2 zeigt typische Massenspektrometerdaten,
die nach einer Genotypisierung und Haplotypisierung für die SNPs
298 und 390 (2.A) und 325 und 423 (2.B) des Gens des β2-adrenergen Rezeptors erhalten
worden sind. Die oberen Spektren zeigen das Genotypisierungsergebnis,
während
die mittleren und unteren Spektren die Ergebnisse, die jeweils für Haplotyp
1 bzw. 2 nach allelspezifischer PCR erhalten worden sind, zeigen.
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BEISPIEL
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Das
Beispiel veranschaulicht das Verfahren der Erfindung und kann leicht
durch den Fachmann auf diesem Gebiet für andere Gene verallgemeinert
werden.
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Das
hier gezeigte Beispiel ist die Haplotypisierung von 4 veröffentlichten
SNPs in dem Gen des β2-adrenergen
Rezeptors. Die SNPs sind T/C bei 298, C/T bei 325, G/A bei 390 und
G/C bei 423. Für
jeden SNP wurde die Genotypisierung durch den GOOD-Assay an einem
(mittels der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2) amplifizierten
Fragment der genomischen DNA erstellt. Die Genotypisierung wurde
ausgeführt,
indem dem Verfahren von Sauer et al. (Nucleic Acids Research, 2000,
28, E13) gefolgt wurde, mit den Primern SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID
Nr. 8 für
die Primer-Extension. Die Analyse erfolgt im positiven Ionen-Modus
an einem MALDI-Massenspektrometer.
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In
einem ersten Experiment wird der Genotyp für alle vier SNPs bestimmt.
Der Genotyp für
SNP 298 und SNP 390 ist auf dem Bild von 2.A gezeigt,
während
der Genotyp für
SNP 325 und SNP 423 auf dem Bild von 2.B gezeigt
ist. Das m/z, das für
die Produkte beobachtet wird, liegt im Bereich von 1400 bis 1500 Da
(2, obere Spektren).
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Die
Daten zeigen, dass das Individuum, dessen DNA getestet wird, hinsichtlich
der vier SNPs heterozygot ist.
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Um
den Haplotyp zu bestimmen, werden allelspezifische PCR-Reaktionen
ausgeführt
unter Verwendung der allelspezifischen Primer SEQ ID Nr. 3 oder
SEQ ID Nr. 4 in Kombination mit dem Primer SEQ ID Nr. 2.
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Die
Primer SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 sind für ein Allel von SNP 298 (welcher
der am weitesten 5' gelegene
der heterozygoten SNPs ist) spezifisch und tragen des Weiteren einen
GC-reichen Schwanz und eine Fehlpaarung, die 5 Basen von dem 3'-Ende des Primers
entfernt gelegen ist.
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Die
allelspezifische PCR hätte
auch mit dem Primer SEQ ID Nr. 1 und Primern, die für SNP 423
(den am weitesten 3' gelegenen
der heterozygoten SNPs) allelspezifisch sind, ausgeführt werden
können.
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Die
Genotypisierung wird an den allelspezifischen Produkten (2, mittlere Spektren für Haplotyp 1, untere Spektren
für Haplotyp
2) durch Verwendung des gleichen Verfahrens wie zuvor ausgeführt.
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Es
ist klar, dass die zwei erhaltenen Haplotypen sich zu dem Genotyp
des Individuums aufsummieren und die Daten ermöglichen die Bestimmung des
vollständigen
Haplotyps des getesteten Individuums.
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Die
PCR-Reaktion wird mittels klassischer Bedingungen ausgeführt mit
0,5 μl genomischer
DNA (50 ng/μl),
0,5 μl von
jedem der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 (7,5 pmol/μl) und den
Zyklus-Bedingungen:
- 1. 95°C 2 min
- 2. 95°C
20 s
- 3. 68°C
30 s
- 4. 72°C
30 s,
Wiederholen der Schritte 2 bis 4 für 35 Mal.
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Primer-Extension-Reaktionen
werden klassischerweise ausgeführt
unter Verwendung von 1 μl
des Kopier-Primers („copy
primer") (SEQ ID
Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8) (25 pmol/μl)
mit den Zyklus-Bedingungen:
- 1. 95°C 3 min
- 2. 95°C
10 s
- 3. 58°C
30 s
- 4. 72°C
15 s,
Wiederholen der Schritte 2 bis 4 für 35 Mal.
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Ein
Phosphodiesterase-Verdau wird ausgeführt, indem 1 μl Essigsäure (0,5
M) und 3 μl
PDE zugegeben werden, und durch Inkubation bei 37°C für 80 min.
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Eine
Alkylierung wird ausgeführt
durch Zugabe von 45 μl
Acetonitril, 15 μl
Triethylamin/CO2-Puffer (2 M, pH 8,0) und 14 μl Mel und Inkubation bei 40°C für 25 min.
Eine 20 μl-Probe
wird entnommen und mit 45 μl 40%
Acetonitril gemischt.
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Die
MALDI-Analyse wird ausgeführt
mit α-Cyanozimtsäuremethylester
in Aceton, aufgetüpfelt
auf das Ziel, und 0,5 μl
der Probe, die auf die Matrix aufgetüpfelt wird.
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Eine
Analyse erfolgt im positiven Ionen-Modus an einem MALDI-Massenspektrometer.
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Eine
allelspezifische PCR wird unter Verwendung entweder des Primers
SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 2 ausgeführt, indem
den gleichen klassischen Bedingungen, wie zuvor beschrieben, gefolgt
wurde.
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