ES2271066T3 - Metodo de haplotipado por espectrometria de masas. - Google Patents
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Abstract
Método de determinación del haplotipo de un individuo, que comprende las etapas siguientes: a) genotipar más de dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) por espectrometría de masas; b) PCR específica para el alelo con un cebador que es específico para un alelo de un polimorfismo heterocigótico, si más de un polimorfismo es heterocigótico; c) genotipar en el producto de la PCR específica para el alelo por espectrometría de masas; d) asociar el polimorfismo que sirve de base a la PCR específica para el alelo con los alelos determinados de los alelos de los otros polimorfismos analizados.
Description
Método de haplotipado por espectrometría de
masas.
La invención se refiere a un método para
realizar el hapotiplado de polimorfismos múltiples de un solo
nucleótido (SNP) que utiliza PCR específica para el alelo y análisis
de espectrometría de masas.
La secuencia completa del genoma humano se
conseguirá y será publicada completamente en los próximos meses.
Este proyecto dará a conocer la secuencia completa de las 3 billones
de bases y las posiciones relativas de todos los genes estimados
(entre 30.000 y más de 100.000) en este genoma. Al disponer de esta
secuencia se abren numerosas posibilidades para el esclarecimiento
de la función génica e interacción de diferentes genes.
Esto permite además la aplicación de
farmacogenéticos y farmacogenómicos. Los farmacogenéticos y los
farmacogenómicos tienen como objetivo una utilización dirigida de la
medicación dependiente del genotipo de un individuo y de esta manera
la mejora drástica de la eficacia de los fármacos. Una etapa
intermedia necesaria para esto es la determinación de la
variabilidad de diferentes individuos sobre una base genómica. Esto
se realiza determinando diferentes marcadores y a continuación
utilizando éstos para el genotipado (caracterización de la presencia
de un marcador en un individuo) y haplotipado (enlace entre
diferentes marcadores en estrecha proximidad).
Actualmente se utilizan dos tipos de marcadores
para el genotipado: microsatélites y polimorfismos de un solo
nucleótido (SNP).
Los microsatélites son marcadores muy
polimórficos en los que diferentes alelos están compuestos por
diferentes números de elementos de secuencia repetitiva entre las
zonas flanqueantes conservadas. Por término medio se encuentra un
microsatélite cada 100.000 bases. Una cartografía completa de
marcadores microsatélite que comprende el genoma humano fue
presentada por la CEPH (Dib et al., Nature 14 de marzo de
1996; 380(6570):152-4). Los microsatélites
están normalmente genotipados por productos de PCR por tamaño
generados sobre la zona repetida en los geles. Los sistemas más
ampliamente utilizados se basan en la utilización de ADN marcado con
fluorescencia y su detección en secuenciadores de fluorescencia.
Pocos SNP son actualmente de dominio público.
Una cartografía de SNP con 300.000 SNP está siendo creada por el
consorcio SNP (Science, 1999, 284,
406-407).
Para genotipar SNP, existen unos pocos métodos
disponibles para el experto en la materia, todos los cuales
presentan ventajas y desventajas.
Algunos de estos métodos se basan en la
detección a base de gel, como el ensayo con oligonucleótido ligasa
(OLA) y por esta razón solamente permite aplicaciones de rendimiento
medio.
Otras se basan en la hibridación pura que no es
discriminante y es difícil de ajustar para obtener la alta severidad
requerida (conjunto de oligonucleótidos, chips de ADN). Aunque los
chips de ADN son muy apropiados para el genotipado simultáneo de un
gran número de genotipos en una zona muy limitada del genoma y en un
número controlable de individuos, el problema principal observado en
la utilización de estos objetos es la dificultad de optimizar las
condiciones de hibridación (en particular para la severidad).
Se han presentado métodos que utilizan la
extensión y detección del cebador por fluorescencia. Su ventaja es
la fácil detección de la emisión en un lector de tipo ELISA. La
limitación de estos métodos es el número limitado de colorantes
fluorescentes disponibles, que en cambio limita el número de
muestras que pueden analizarse simultáneamente.
Varios métodos de genotipado de SNP utilizan la
detección por espectrometría de masas, ya que la espectrometría de
masas permite rendimientos muy altos y al mismo tiempo proporciona
información añadida basándose en que está presente en toda la masa
del producto obtenido. En las aplicaciones en las que se mide un
producto específico del alelo, esta es la información directa y por
lo tanto muy sólida.
Se han propuesto varios métodos que utilizan
espectrometría de masas para el genotipado de SNP (documentos WO
98/23774 y US nº 5.843.669).
La espectrometría de masas con tiempo de vuelo
por desorción/ionización con láser asistido por la matriz (MALDI)
permite el análisis espectrométrico de masas de las biomoléculas
(Karas e Hillenkamp Anal. Chem. 60, 2299-2301
(1988)). De hecho, se ha aplicado MALDI al análisis del ADN en
variaciones comprendidas entre el análisis de los productos por PCR
y los métodos que utilizan la terminación específica para el alelo a
las reacciones de extensión del cebador de un solo nucleótido, el
secuenciado y la hibridación (patentes US nº 5.885.775, WO 96/29431,
US nº 5.691.141, WO 97/37041, WO 94/16101, WO 96/27681 y GB
2339279).
Los principales inconvenientes de estos métodos
son que se basan en gran medida en los procedimientos de
purificación severa antes del análisis MALDI que no se prestan a la
fácil automatización y constituyen una parte principal del coste. La
purificación en columna de rotación y/o la tecnología del lecho
magnético y la purificación en base inversa se aplican
frecuentemente.
De hecho, el análisis de los ácidos nucleicos
por MALDI es muy dependiente del estado de carga y puede conseguirse
un aumento de 100 veces en la sensibilidad del análisis cuando el
ADN se acondiciona para llevar una carga positiva. Dichos productos
de ADN modificados son asimismo significativamente menos sensibles a
la formación del aducto y de este modo no requieren procedimientos
de purificación (WO 96/27681, GB 2339279, Gut y Beck (1995)
Nucleic Acids Research, 23, 1367-1373, Gut
et al. (1997) Rapid Commun. Mass Spectrom., 11,
43-50).
Un análisis desarrollado a partir de esto para
la generación de productos específicos para el alelo para las SNP se
ha denominado "análisis GOOD" para el análisis de SNP (Sauer
et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28, E 13).
No obstante, la información del genotipado no
permite por sí misma la evaluación de la traducción de una secuencia
de ADN en una proteína o la regulación de la transcripción. En
particular, cuando los dos alelos de unos genes dados llevan
diferentes SNP, es muy importante tener información acerca de la
combinación de diferentes SNP en relación entre sí (haplotipado) y
acerca de cuál de los alelos está en la misma cadena de ADN.
Existen pocos métodos de haplotipado. Se basan
en la generación de productos específicos para el alelo por PCR
específica para el alelo, utilizando un cebador cuya base del
extremo 3' se empareja específicamente un alelo que debe ampliarse.
No obstante, están limitados en su capacidad para examinar
simultáneamente múltiples posiciones. Para la identificación de un
haplotipo se utiliza la presencia o ausencia de un producto de
PCR.
Ruano et al. (1989) Nucleic Acids
Research, 20, 8392 da a conocer el haplotipado de los segmentos
cromosómicos de heterocigotos múltiples por ampliación de PCR
específica para el alelo y la detección del polimorfismo de la
longitud de fragmentos de restricción. Sauer et al. (2000)
Nucleic Acids Research, 23, 2000 y WO nº 97/47766 describe la
utilización de la espectrometría de masas para el genotipado.
Para aumentar la especificidad de la PCR
específica para el alelo, se consideran dos métodos principales. Uno
consiste en la adición de colas ricas en GC en el extremo 5' de los
cebadores para la PCR y realizando la PCR con una elevada
temperatura de hibridación (Liu et al. (1997), Genome
Res. 7(4): 389-98). Durante los ciclos
iniciales de la PCR, de esta manera se obtiene alta severidad. En
los últimos ciclos, la cola GC proporciona una preferencia para las
plantillas de ampliación. Sin embargo, esto no proporciona
suficiente severidad en todos los casos.
Otra manera de aumentar la severidad de la PCR
específica para el alelo es la introducción de más emparejamientos
erróneos (Newton et al. (1989), Nucleic Acids Res.
17(7): 2503-16). Este método por sí mismo
puede asimismo proporcionar severidad limitada.
Puede por lo tanto justificarse interesante
combinar estos dos métodos para aumentar la especificidad y
severidad en la reacción de PCR específica para el alelo.
No obstante, la PCR específica para el alelo
(con o sin mejoras) adolece del inconveniente de que únicamente
puede examinar dos polimorfismos en relación entre sí.
Clark et al. (1998, Am. J. Hum.
Genet., 63, 595-612) describe un método para el
análisis de la variación de la secuencia de nucleótidos en la
lipoproteína lipasa humana que utiliza el secuenciado de los genes y
de los productos de la PCR específica para el alelo como método de
análisis para genotipado. Los autores muestran la debilidad de este
método de haplotipado, en particular en la medida en que se requiere
un gran esfuerzo.
Un objetivo de la invención consiste en
proporcionar un método sencillo y de gran rendimiento para el
haplotipado, que permite la determinación del enlace de SNP
múltiples de una manera rápida, económica y fiable. El método de la
invención permite el análisis simultáneo de puntos polimorfos
múltiples, después de realizar solamente una reacción PCR específica
para el alelo.
De hecho, se requiere con frecuencia determinar
los alelos de más de dos polimorfismos de nucleótidos individuales
por genotipado. Si resulta que el genotipo individual es
heterocigótico para más de uno de los SNP, es interesante
determinar cuál de los alelos están en la misma cadena de ADN.
La invención utiliza la PCR específica para el
alelo para la ampliación de únicamente un alelo del ADN genómico. Se
designa el cebador específico del alelo para emparejarse con una
alelo de un SNP heterocigótico. Se genotipa a continuación el
producto de la ampliación cuyas manifestaciones permiten deducir que
otros alelos están en este producto y permite la determinación del
haplotipo, a medida que los SNP previamente heterocigóticos aparecen
ahora homocigóticos.
La asociación del polimorfismo que sirve de base
a la PCR específica del alelo con los alelos determinados de los
alelos de los demás polimorfismos proporcionan el haplotipo.
La invención por consiguiente se refiere a un
método de determinación del haplotipo de un individuo, que comprende
las etapas siguientes:
- a)
- genotipar más de dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) por espectrometría de masas;
- b)
- PCR específica para el alelo con un cebador que es específico para un alelo de un polimorfismo heterocigótico, si más de un polimorfismo es heterocigótico;
- c)
- genotipar en el producto de la PCR específica para el alelo por espectrometría de masas;
- d)
- asociar el polimorfismo que sirve de base a la PCR específica del alelo con los alelos determinados de los demás polimorfismos analizados.
El método de la invención podría asimismo
utilizarse para identificar secuencias casi idénticas a fin de
descubrir si una secuencia está duplicada o es heterocigótica.
Pueden utilizarse variaciones para generar productos "específicos
para el alelo" si otros polimorfismos que eran heterocigóticos en
el genotipado inicial permanecen heterocigóticos es evidente que una
secuencia está duplicada. Si la segunda ronda de genotipado de este
sistema produce todos los SNP homocigóticos es posible que la
secuencia que está siendo estudiada no esté duplicada.
La utilización de espectrometría de masas
permite realizar el análisis de un gran número de muestras y obtener
los datos correspondientes en una reacción múltiple. Por
consiguiente, puede utilizarse con gran rendimiento el método de la
invención que se caracteriza por una combinación entre la PCR
específica para el alelo y la utilización de espectrometría de
masas para el genotipado y el análisis de datos. Puede asimismo
automatizarse y ello permitirá una determinación fácil y rápida del
perfil del SNP de los pacientes. Por consiguiente permitirá la
aplicación completa de la farmacogenética y farmacogenómica y
mejorará la utilización de los datos obtenidos a partir del proyecto
de secuenciado del genoma.
El genotipado de los SNP en las etapas a) y c)
se realiza por espectrometría de masas después de la generación de
productos específicos para el alelo, que pueden obtenerse
convencionalmente por ampliación del cebador, ligadura de
oligonucleótidos y reacción de escisión.
Una de las ventajas del método según la
invención consiste en la posibilidad de realizar el análisis de
múltiples SNP en una muestra de ADN al mismo tiempo en una reacción
multiplexada, conocida por los expertos en la materia, seleccionando
las condiciones apropiadas.
A fin de realizar la reacción de PCR específica
para el alelo de la etapa b), se utilizaría un cebador que empareja
un alelo de un SNP heterocigótico, y preferentemente un cebador que
se hibrida específicamente con el SNP heterocigótico que está
situado en la mayoría de las posiciones 5' o en la mayoría de las
posiciones 3' de todos los SNP analizados. El otro cebador
hibridaría ambos alelos y estaría situado de modo que se obtenga la
ampliación de la zona que contiene todos los SNP
heterocigóticos.
En una puesta en práctica preferida de la
invención, la especificidad del alelo para la ampliación por PCR se
consigue mediante la base en el extremo 3' del cebador. Esta base se
selecciona para emparejar un alelo y no el otro. Se puede conseguir
más especificidad utilizando un cebador que tenga entre 10 y 25
bases complementarias con la secuencia del ADN genómico, más
preferentemente entre 15 y 20 ó 22, obteniéndose la especificidad
mediante la base en el extremo 3', como se describe.
Se podría asimismo incluir una cola no
específica rica en CG en el extremo 5' del cebador y/o más
emparejamientos erróneos antes de la base específica para el alelo
en el extremo 3', como se ha descrito. Más preferentemente, el
cebador presenta un emparejamiento erróneo más de 3 bases apartada
del extremo 3'.
La temperatura de hibridación se selecciona
crítica (mayor que la temperatura de fusión calculada). En las
primeras rondas de la PCR solamente puede hibridarse la secuencia
totalmente complementaria. Una vez se han alcanzado algunas rondas
de PCR, la temperatura mayor de hibridación debida a la cola rica en
CG asegura la mayoría de la ampliación de un único alelo.
Se utiliza espectrometría de masas para este
procedimiento ya que es muy adecuada para el análisis de hasta
varias decenas de polimorfismos y es muy fácil en la operación. La
automatización completa de la preparación de la muestra es posible
por lo tanto por este método. Dependiendo del procedimiento de
preparación de la muestra utilizado para el genotipado por
espectrometría de masas, esta tecnología es muy eficaz.
En una puesta en práctica preferida de la
presente invención, el método realizado para una o ambas etapas (a)
y (c) de genotipado utiliza cebadores que son híbridos naturales y
el procedimiento seguido es un análisis desarrollado para MALDI
denominado análisis GOOD, descrito por Sauer et al.
En una puesta en práctica preferida de la
invención se utiliza espectrometría de masas con tiempo de vuelo de
desorción/ionización por láser asistida por la matriz (MALDI) para
el análisis de los genotipos. En otra forma de realización, para la
detección se utiliza espectrometría de masas de ionización por
electroatomización.
En una puesta en práctica preferida de la
invención los reactivos para el genotipado inicial son los mismos
que los utilizados para el genotipado después de la PCR específica
para el alelo.
\newpage
La presente invención proporciona un
procedimiento fácil para la determinación de haplotipos que es
económico, muy fiable y puede automatizarse fácilmente y ofrece así
un alto rendimiento.
El procedimiento perfilado utiliza el potencial
de una preparación muy paralela de productos para el genotipado, su
acondicionamiento de modo que no requieren ninguna purificación y el
potencial de espectrómetros de masa para distinguir grandes
cantidades de productos simultáneamente en un espectro y ser capaces
de registrar un espectro único en unos pocos segundos. La presente
invención esboza las posibilidades de resolver drásticamente los
problemas de haplotipado de un gran número de SNP descubiertos
actualmente en la técnica y hace posible el genotipado perfilado y
eficaz del SNP.
La invención se refiere además a la utilización
de cebadores para la PCR que generan productos específicos para el
alelo para la aplicación de haplotipado por el método de la
invención. La utilización mencionada anteriormente en un kit puede
incluir además los reactivos para realizar las etapas a) y c) del
procedimiento (generación de muestras que deben analizarse por
espectrometría de masas para el genotipado) y las instrucciones de
cómo realizar el método de la invención.
La Figura 1 describe el principio del método de
la invención, aplicado a 4 SNP, siendo dos de ellos heterocigóticos.
La primera etapa de genotipado (1.A) conduce a la generación de 6
productos determinados por espectrometría de masas. La PCR
específica para el alelo (1.B) conduce a la ampliación de la cadena
paterna. El genotipado de este producto (1.C) permite la
identificación de los SNP que están presentes en este alelo.
La Figura 2 presenta los espectros típicos del
espectrómetro de masas obtenidos después del genotipado y
haplotipado para los SNP 298 y 390 (figura 2.A) y 325 y 423 (figura
2.B) del gen receptor beta-2 adrenérgico. El
espectro superior presenta el resultado del genotipado, mientras que
los espectros medio e inferior presentan los resultados obtenidos
respectivamente para los haplotipados 1 y 2, después de la PCR
específica para el alelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
El ejemplo ilustra el método de la invención y
un experto en la materia puede generalizarlo fácilmente para otros
genes.
El ejemplo presentado aquí es el haplotipado de
4 SNP publicados en el gen receptor
\beta2-adrenérgico. Los SNP son T/C en 298, C/T en
325, G/A en 390 y G/C en 423. Para cada SNP, se creó el genotipado
mediante el análisis GOOD en un fragmento ampliado (con la SEC. ID
nº: 1 y la SEC. ID nº: 2 de los cebadores) del ADN genómico. Se
realizó el genotipado siguiendo el método de Sauer et al.,
(Nucleic Acids Research, 2000, 28, E 13), con la SEC.
ID nº: 5 a la SEC. ID nº: 8 de los cebadores, para la ampliación del
cebador. El análisis se realiza en modo de ión positivo en un
espectrómetro de masas MALDI.
En un primer experimento se determina el
genotipo para los 4 SNP. El genotipo para SNP 298 y SNP 390 se
presenta en el panel de la figura 2.A, mientras que el genotipo para
SNP 325 y SNP 423 se presenta en el panel de la figura 2.B. La m/z
observada para los productos están en el intervalo comprendido entre
1.400 y 1.500 Da (figura 2, espectro superior).
Los datos demuestran que el individuo, cuyos ADN
se analizan, es heterocigótico para los cuatro SNP.
A fin de determinar el haplotipo, se realizan
las reacciones de PCR específicas para el alelo, utilizando la SEC.
ID nº: 3 o la SEC. ID nº: 4 de los cebadores específicos para el
alelo, en combinación con la SEC. ID nº: 2 del ceba-
dor.
dor.
La SEC. ID nº: 3 y la SEC. ID nº: 4 de los
cebadores son específicas de un alelo de SNP 298 (que es la mayoría
de 5' de los SNP heterocigóticos) y lleva además una cola rica en GC
y un emparejamiento erróneo situado 5 bases a partir del extremo 3'
de los cebadores.
La PCR específica para el alelo podría
realizarse además con la SEC. ID nº: 1 del cebador y los cebadores
que son específicos para el alelo para SNP 423 (la mayoría de 3' de
los SNP heterocigóticos).
El genotipado se realiza en los productos
específicos para el alelo (figura 2, espectro medio para el
haplotipo 1, espectro inferior para el haplotipo 2) utilizando el
mismo método que anteriormente.
Es evidente que los dos haplotipos obtenidos se
añaden al genotipo del individuo y los datos permiten la
identificación del haplotipo completo del individuo analizado.
\newpage
| SNP 298, -47 | SNP 325, -20 | SNP 390, 46 | SNP 423, 79 | |
| (C/T) | (C/T) | (A/G) | (C/G) | |
| Muestra de ADN | MALDI | MALDI | MALDI | MALDI |
| Genotipos | TC | TC | GA | GC |
| Haplotipo 1 | C | C | G | G |
| Haplotipo 2 | T | T | A | C |
La reacción de PCR se realiza en condiciones
clásicas, con 0,5 \mul de ADN genómico (50 ng/\mul), 0,5 \mul
de cada una de las SEC. ID nº: 1 y SEC. ID nº: 2 de los cebadores
(7,5 pmoles/\mul) y las condiciones de ciclación siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
1. \+ 95ºC 2 min\cr 2. \+ 95ºC 20 s\cr 3. \+ 68ºC 30 s\cr 4. \+
72ºC 30
s\cr}
se repiten 35 veces las etapas 2 a
4.
Las reacciones de ampliación del cebador se
realizan de forma clásica utilizando 1 \mul de la copia del
cebador (SEC. ID nº: 5 a SEC. ID nº: 8) (25 pmoles/\mul) en las
condiciones de ciclación siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
1. \+ 95ºC 3 min\cr 2. \+ 95ºC 10 s\cr 3. \+ 58ºC 30 s\cr 4. \+
72ºC 15
s\cr}
se repiten 35 veces las etapas 2 a
4.
La digesta de fosfodiesterasa se realiza
añadiendo 1 \mul de ácido acético (0,5 M) y 3 \mul de PDE se
añaden y se realiza la incubación a 37ºC durante 80 min.
La alquilación se realiza mediante la adición de
45 \mul de acetonitrilo, 15 \mul de trietilamina/tampón de CO2
(2 M, pH 8,0) y 14 \mul de MeI e incubación a 40ºC durante 25 min.
Se toma una muestra de 20 \mul y se mezcla con 45 \mul de
acetonitrilo al 40%.
Se realiza el análisis MALDI con el éster
metílico del ácido \alpha-ciano cinnámico en
acetona salpicada en la diana y 0,5 \mul de la muestra salpicada
en la matriz.
El análisis se realiza en modo ión positivo en
un espectrómetro de masas MALDI.
La PCR específica para el alelo se realiza
utilizando la SEC. ID nº: 3 o la SEC. ID nº: 4 y la SEC. ID nº: 2
del cebador, siguiendo las mismas condiciones clásicas descritas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> CENTRE NATIONAL DE GENOTYPAGE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO DE HAPLOTIPADO POR
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D19042
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 00 402 112
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-07-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador b2_para_2 para la ampliación
de la zona del gen receptor beta-2 adrenérgico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgcgggcc cgcagagcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador b2_rev_11 para la ampliación
de la zona del gen receptor beta-2 adrenérgico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttggtgacc gtctgcagac gctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador específico para el alelo b2_298_C_tMIS para SNP
298 del gen receptor adrenérgico beta-2.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggcgggg cgccgtgggt cagccc
\hfill26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador específico para el alelo b2_298_T_tMIS para SNP
298 del gen receptor adrenérgico beta-2.
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggcgggg cgccgtgggt cagcct
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador b2_2981 para la
determinación del SNP 298 del gen receptor adrenérgico
beta-2.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgccgtggg tccgcc
\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador b2_3901 para la
determinación del SNP 390 del gen receptor adrenérgico
beta-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttgctggc acccaat
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador b2_325r para la
determinación del SNP 325 del gen receptor adrenérgico
beta-2.
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgcagtct ggcaggt
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador b2_4231 para la
determinación del SNP 4231 del gen receptor adrenérgico
beta-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccacgacg tcacgcag
\hfill18
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Claims (15)
1. Método de determinación del haplotipo de un
individuo, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- genotipar más de dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) por espectrometría de masas;
- b)
- PCR específica para el alelo con un cebador que es específico para un alelo de un polimorfismo heterocigótico, si más de un polimorfismo es heterocigótico;
- c)
- genotipar en el producto de la PCR específica para el alelo por espectrometría de masas;
- d)
- asociar el polimorfismo que sirve de base a la PCR específica para el alelo con los alelos determinados de los alelos de los otros polimorfismos analizados.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el genotipado de los SNP en las etapas a) y c) o en ambas etapas se
realiza después de la generación de productos específicos para el
alelo, siendo dicha generación de productos específicos para el
alelo realizados por ampliación del cebador, ligadura de
oligonucleótidos y reacción de escisión.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el genotipado para los SNP múltiples en la etapa a), etapa c) o
en ambas etapas se realiza en una reacción en un procedimiento
multiplexado.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la reacción PCR específica para el
alelo en la etapa b) se consigue seleccionando un cebador que se
empareja a un alelo de un SNP heterocigótico.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
dicho cebador se selecciona para hibridarse específicamente con el
SNP heterocigótico situado en la mayoría de las posiciones 5' o la
mayoría de las 3' de todos los SNP analizados.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que por lo menos un cebador utilizado
para la PCR específica para el alelo es completamente complementario
a la secuencia de un alelo.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la base del extremo 3' del cebador
específico del alelo se empareja específicamente con un alelo del
SNP heterocigótico.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 7, en el que dicho cebador específico del alelo
tiene 10 a 25 bases que son complementarias de la secuencia de dicho
un alelo del ADN genómico.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5, 7 y 8, en el que dicho cebador específico del
alelo presenta una cola 5' que es rica en G y C.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4, 5, 7 a 9, en el que dicho cebador específico del
alelo presenta un emparejamiento erróneo en la secuencia
complementaria alejada más de 3 bases del extremo 3'.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que se utiliza espectrometría de
masas con tiempo de vuelo por desorción/ionización con láser
asistido por la matriz para una o ambas etapas a) y c) definidas en
la reivindicación 1.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el cebador utilizado para la
generación de los productos detectados en el genotipado en las
etapas a) y/o c) son híbridos en la naturaleza.
13. Método de la reivindicación 12, en el que un
análisis con detección espectrométrica de masas MALDI se aplica a
una o ambas etapas a) y c) de genotipado.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la espectrometría de masas de
ionización por electropulverización se utiliza para una o ambas
etapas a) y c) de la reivindicación 1.
15. Utilización de cebadores para PCR que
generan productos específicos para el alelo destinados a la
aplicación del haplotipado por el método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14.
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