DE10237691B4

DE10237691B4 - Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens

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Publication number: DE10237691B4
Application number: DE2002137691
Authority: DE
Inventors: Ralf Dr. Neunaber; Pavel Dr. Strohner; Joachim Dr. Schreiber; Gesine Voigt; Wolf-Hagen Dr. Schunck
Original assignee: Biotez Berlin Buch Bioche GmbH; Biotez Berlin-Buch Biochemisch-Technologisches Zentrum GmbH
Current assignee: Biotez Berlin Buch Bioche GmbH; Biotez Berlin-Buch Biochemisch-Technologisches Zentrum GmbH
Priority date: 2002-08-15
Filing date: 2002-08-15
Publication date: 2010-01-28
Anticipated expiration: 2022-08-16
Also published as: WO2004018707A2; DE10237691A1; AU2003269675A1; WO2004018707A3

Abstract

Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen in Cytochrom P450 Genen, dadurch gekennzeichnet, dass
a) Genabschnitte humaner CYP2-Gene aus einer Probe mit den Amplifikationsprimern SEQ-ID No. 1–16 in einem multiplen Assay isoformspezifisch mittels diskriminierender oder asymmetrischer Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden
und
b1) nachfolgend eine Immobilisierung der biotinylierten Amplifikate erfolgt,
c1) anschließend mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 17–36 hybridisiert wird,
oder
b2) nachfolgend mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotid-Primern SEQ-ID No. 56–57 hybridisiert wird und eine allelspezifische Verlängerung des markierten Primers erfolgt
und
c2) anschließend die Produkte aus Schritt b2) mit immobilisierten, biotinylierten Oligonukleotiden der SEQ ID No. 58 hybridisiert werden
und in beiden Fällen
d) nachfolgend stringent gewaschen wird und
e) schließlich die amplifizierten Allele detektiert werden.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Satz von Substanzen und Vorschriften – insgesamt wird ein solcher Satz auch als „Kit” bezeichnet – der es gestattet, bestimmte, für den Arzneimittelmetabolismus wichtige Polymorphismen in den Cytochrom P450 Genen (CYP) eines Menschen mit einfachen Mitteln zuverlässig nachzuweisen.
Anwendungsgebiete sind die Molekularbiologie und die Medizin, insbesondere die medizinische Diagnostik.
Die in der Beschreibung für Konzentrationen angegebene Abkürzung M steht für die Einheit mol/l.
Polymorphismen in Genen des Arzneimittelmetabolismus stehen mit dem Fortschritt bei der Erforschung der Beziehungen zwischen genetischer Diversität und Arzneimittelunverträglichkeiten im Mittelpunkt des Interesses. Das gilt im besonderen für bestimmte Einzelnukleotidpolymorphismen („single nucleotide polymorphisms”-SNP's) an Genen des sogenannten Biotransformationssystems. Ein großer Teil der heute verwendeten Medikamente, vor allem solche mit lipophilem Charakter, werden von den Enzymen der Phase I des Biotransformationssystems, den Cytochrom P450 Enzymen, metabolisiert [Gonzales, F. J., Pharmacological Reviews 40, (1989) 243–288; Guengerich et al., Journal of Biological Chemistry 266 (1991) 10019–10022]. Als Folge dieser enzymatischen Reaktionen werden je nach chemischer Struktur des Medikaments, nach Art und Genotyp des Cytochrom P450 Isoenzyms oder infolge nachgeschalteter sogenannter Phase II Enzyme (NAT I u. II, GSTM u. a.) [Brockmüller et al. Toxicology Letters 102–103 (1998) 173–183] die Medikamente entweder physiologisch aktiviert, oder sie werden inaktiviert und zur Ausscheidung vorbereitet. Polymorphismen an diesen Genen sind in der Bevölkerung relativ weit verbreitet und führen zu erheblichen individuellen Unterschieden in den Umsatzraten der betroffenen Arzneimittel. In der Konsequenz können je nach Medikament und Allel individuelle Über- oder Unterdosierungen die Folge sein. Es können sich unerwünschte Nebenwirkungen einstellen, oder aber eine Wirkung kann ganz ausbleiben [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59–124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102–103 (1998) 155–160]. Die genaue Kenntnis der genetischen Prädisposition eines Patienten zu solcherart verändertem Arzneimittelstoffwechsel ist dementsprechend für seine individuelle Arzneimitteltherapie von entscheidender Bedeutung. Als Folge konsequenter Genotypisierung von Patienten mit erhöhtem Risiko (z. B. von chronisch kranken Patienten, oder von solchen mit einer entsprechenden Familienanamnese) sind erheblich verminderte Nebenwirkungsrisiken, Kosteneinsparungen, aber auch völlig neuartige Medikationsstrategien denkbar. Praktische Voraussetzung für eine konsequente Genotypisierung vieler einzelner Patienten ist jedoch ein kostengünstiges und zuverlässiges Genotypisierungsverfahren.
Die Cytochrom P450 Enzyme werden artübergreifend anhand ihrer Aminosäuresequenzhomologie in Familien (Homologie > 40% – bezeichnet mit einer arabischen Ziffer) und Subfamilien (Homologie > 55% – bezeichnet mit einem Großbuchstaben) unterteilt. Zum Beispiel ist CYP2C9 ein Cytochrom der Familie 2, Subfamilie C, Isoform Nr. 9 [Nelson et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 1–42]. Die zum Teil extrem hohe Sequenzhomologie bei Genen einer Subfamilie muß bei der Entwicklung von Genotypisierungsverfahren, die auf einer Amplifikation von Genteilsequenzen beruhen, denn auch vorrangig berücksichtigt werden. So sind die Pseudogene CYP2D7 und CYP2D8 zu > 90% identisch mit CYP2D6. Ein sicherer Nachweis einzelner Allele setzt somit eine sichere Differenzierung der homologen Gene (Isoformen) voraus. Technisch ist dies durch diskriminierende PCR Amplifikationsverfahren möglich.

Zu den am besten charakterisierten und für den Arzneimittelmetabolismus bedeutendsten Cytochromen gehören CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4 mit ihren diversen Allelvarianten. [Zu Übersicht und neuestem Stand der bekannten Polymorphismen menschlicher Cytochrom P450 Enzyme siehe [http://www.imm.ki.se/CYPalleles/]. Diese vier Isoenzyme zusammen setzen nach Schätzungen von Experten mehr als zwei Drittel aller wirksamen Bestandteile der heute gängigen Medikamente um. [Eine übersichtliche Zusammenstellung der umgesetzten Pharmazeutika findet sich unter [http://medicine.iupui.edu/flockhart/]. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, sind in der kaukasischen Bevölkerung die Allele CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*5, CYP2D6*6 sowie weitere, weniger gut untersuchte Allele von CYP2D6 von größter Bedeutung [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59–124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102–103 (1998) 155–160; Marez et al. Pharmacogenetics 7 (1997) 193–202; De Morais et al. Mol. Pharmacol. 46 (1994) 594–598; Sachse et al. Am. J. Hum. Genet. 60 (1997) 284–295; Wrighton SA and Stevens JC. Crit. Rev. Toxicol. 22 (1992) 1–21; Cholerton et al. Trends Pharmacol. Sci. 13 (1992) 434–439; Saxena et al. Hum. Mol. Genet. 3 (1994) 923–926; Steen et al. Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 2251–2257]. Tabelle 1 Wichtige allele Varianten humaner Cytochrom P450 Isoenzyme, ihre Enzymaktivität und ihre Häufigkeit (%) in der kaukasischen Bevölkerung

Allel	Enzymaktivität	Häufigkeit	Referenz
CYP2C9*2	Vermindert	16	Ingelman-Sundberg (1998)
CYP2C9*3	Vermindert	6	Ingelman-Sundberg (1998)
CYP2C19*2	Keine	10	Ingelman-Sundberg (1998)
CYP2D6*3	Keine	2	Sachse et al. (1997)
CYP2D6*4	Keine	23	Marez et al. (1997)
CYP2D6*5	Keine	2–5	Steen et al. (1995), Sachse et al. (1997)
CYP2D6*6	Keine	1–2	Saxena et al. (1994), Sachse et al. (1997)

Die klinische Relevanz der allelen Varianten von CYP3A4 ist zur Zeit Gegenstand intensiver Forschung [Eiselt et al. Pharmacogenetics 11 (2001) 447–458; Kuehl et al. Nature Genetics 27 (2001) 383–391; Westlind et al. Biochem. Biophys. Res. Comun. 259 (1999) 201–205].
Der Nachweis alleler Varianten der am Arzneimittelmetabolismus beteiligten Cytochrom P450 Isoenzyme erfolgte anfänglich mit Hilfe des Sequenzvergleichs entsprechender isolierter cDNA's, oder durch direkte Sequenzierung von aus genomischer DNA gewonnenen PCR Fragmenten [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341–349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37–42; Inoue et al. Jpn. J. Hum. Genet. 39 (1994) 337–343]. Durch heterologe Expression vorsequenzierter oder modifizierter cDNA's in geeigneten Systemen und anschließende in vitro Charakterisierung konnte dann oft ein Zusammenhang zum Arzneimittelmetabolismus belegt werden [Haining et al. Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996) 447–458]. Ein weiteres Verfahren zur Identifikation neuer SNP's – das SSCP („single strand conformational polymorphisms”) Verfahren – nutzt die sequenzabhängig unterschiedliche Mobilität von einzelsträngigen PCR Produkten in Harnstoff-Polyacrylamidgelen zum Nachweis von Mutationen [Stubbins et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 429–439; Daly et al. Methods Enzymol. 272 (1996) 199–210]. Auch in WO 02/18641 A2 ist ein Nachweisverfahren für einzelne SNP's durch Sequenzierung auf der Basis spezieller Primer beschrieben.
Das zur Zeit neben der Sequenzierung am häufigsten genutzte Verfahren zum Nachweis von SNP's ist die „Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus” (RFLP) Analyse [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341–349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37–42]. Durch Einführung der MADGE (microplate array diagonal gel electrophoresis) Technologie [Day and Humphries Anal. Biochem. 222 (1994) 389–395] wurde es möglich, RFLP oder ARMS (amplification refractory mutation system) [Newton et al. Nucleic Acid Res. 17 (1989) 2503–2516) im 96 Kammer (96 well) Format durchzuführen. Ein in der Vergangenheit oft eingesetztes Verfahren für den Nachweis von SNP's ist der sogenannte „Southern blot”. Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips sind die zur Zeit noch in der Entwicklung befindlichen „Microarray” Gen Chip Verfahren. Beide Verfahren beruhen auf einer allelspezifischen Hybridisierungsreaktion an immobilisierten PCR Fragmenten, oder Detektionssonden. Im Falle des „Microarray” Verfahrens sind die Areale der Hybridisierung durch spezielle Belegungsverfahren zum Teil nur wenige nm im Durchmesser.
Ein anderes, zunehmend eingesetztes, Verfahren zum Nachweis von SNP's macht von der „matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry” (MALDI/TOF-MS) Gebrauch. Dieses Verfahren setzt jedoch ebenfalls eine isoformspezifische PCR, eine anschließende Aufreinigung und den Allelnachweis mittels z. B. hybridisierter, synthetischer Oligonukleotide und den nachfolgenden, allelspezifischen Einbau zusätzlicher Nukleotide durch eine DNA Polymerase voraus.
Ebenfalls bekannt ist ein Verfahren zum Nachweis von SNP's in CYP2 Genen mit einer Multiplex-PCR-Reaktion und anschließender Hybridisierung aus Labuda et al. Anal. Biochem. (1999) 275 (1) 84–92. In diesem Verfahren wird eine diskriminierende PCR mit anschließender Hybridisierung im Dot Blot Verfahren unter Verwendung von isoformspezifischen Primern beschrieben. Weitere isoformspezifische Primer sind im Stand der Technik aus Daly A. K. Pharmcogenetics (1991) 1, 33–44 bekannt. In beiden Fällen sind die Ergebnisse jedoch zu ungenau. Aufgrund mangelnder Diskriminierung ist es mit ihnen nicht möglich, homozygote Allelträger eindeutig zu identifizieren.
Das Sequenzierverfahren ist vergleichsweise sehr aufwendig und insbesondere für die Identifizierung neuer SNP's geeignet. Es erfaßt aber weder Duplikationen noch Deletionen kompletter Gene. Das SSCP Verfahren kann zwar beides erfassen und ist daher für die frühe Identifikation von SNP's das Verfahren der Wahl, erfordert jedoch ebenfalls einen hohen Arbeitsaufwand, bzw. einen hohen Automatisierungsgrad und verursacht somit hohe Kosten. Das RFLP Verfahren macht oft mangels geeigneter Restriktionsorte den Austausch zusätzlicher Nukleotide in der Umgebung der alleldeterminierenden Position mittels PCR nötig. Auch ist der Verdau in einigen Fällen nur unvollständig und erfordert eine zusätzliche Validierung mittels Positivkontrolle bzw. Kreuzvergleich mit anderen Allelen. Die auf der allelspezifischen Hybridisierung aufbauenden Verfahren (TaqMan^TM; Dash^TM; GeneChip^®; Code Link^TM) stellen eine echte Alternative für den Nachweis bekannter SNP's dar. Im Falle der „Microarray” (GeneChip^®; Code Link^TM ⁾ Technologie entsteht jedoch ein besonderes Problem aus dem Anspruch dieser Technologieplattform, große Mengen an Sequenzdaten von nur einem Chip zu erhalten. Mit der Menge steigt die Schwierigkeit, ein gemeinsames Regime für alle auf dem Chip nachzuweisenden Allele zu etablieren. Es werden umfangreiche Kontrollen sowie aufwendige und komplizierte Auswertesysteme erforderlich und somit steigen die Kosten. Für die klinische Diagnostik, sowie für klinische Studien mit vordefinierten, eingegrenzten, objektspezifischen Allelen bietet sich somit eher ein sogenannter „low density Chip” in Form eines Glasobjekträgers mit 32 bis maximal 384 möglichen spezifischen Arealen (spots) an.
Zur Zeit werden Komplettlösungen für den Nachweis von SNP's in Arzneimittel metabolisierenden Genen nur von wenigen Firmen angeboten:

• TaqMan Technologie (Applied Biosystems)-Prinzip: Fluoreszenzdetektion mittels mittelständiger Hybridisierungssonde. Der Nachweis des Allels geschieht über die 5'-3' Exonucleaseaktivität einer DNA Polymerase, welche an perfekt passenden Primern gequenchte 5'endständige Fluorophore (FAM und VIC^TM) freisetzt. Fehlgepaarte Primer werden von der DNA Polymerase unter den gewählten Bedingungen vollständig intakt (also gequencht) freigesetzt, während richtig gepaarte Primer im ungequenchten, fluoreszierenden Zustand freigesetzt werden. Für CYP2C9*2 und *3; CYP2C19*2 und *3; CYP2D6 *3, *4, *6, *7 und *8 wird je ein kompletter Kit angeboten. Voraussetzung für den Einsatz dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung eines TaqMan Gerätes, sowie der dazugehörigen Zusatzausrüstung.
• Der GeneChip CYP450 Assay (Affimetrix) beruht auf einer Hybridisierungsreaktion von allelspezifischen, endständig auf einem „Microarray Chip” immobilisierten Sonden mit Fluorophor markierten Amplikons. Das markierte Amplikon leitet sich aus einer vorgeschalteten Multiplex PCR ab, die über intronlokalisierte Primer eine isoformspezifische Amplifikation gewährleisten soll. Angeboten werden CYP2C9 *2 und *3, sowie 10 Allele des Gens CYP2D6 (von Exon 1–9) als Komplettansätze. Voraussetzung für den Einsatz dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung des sehr kostenintensiven GeneChip Instrument Systems, sowie der dazugehörigen GeneChips, Reagenzien – und Primer Kits.
• Das Code Link^TM P450 Verfahren (Motorola) basiert auf demselben Nachweisprinzip wie der Affimetrix Chip, setzt jedoch den Nachweis von 75 CYP450 SNPs (CYP2D6, -2C19, -1A1,1-A2, -2E1, -3A4 und -1B1) auf einem Glasobjektträger um. Es erfordert ebenfalls die zusätzliche Anschaffung der sehr kostenintensiven Instrumentierung sowie natürlich der dazugehörigen Reagenzien und Primer Kits.
• Der Pharm-O-Kin Chip von GenScan Diagnostics ist ein Genchip auf der Basis eines Glasobjektträgers und weist 36 SNP's verschiedene P450 Isoenzyme sowie andere für den Arzneimitteltransport relevante Gene nach (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, sowie NAT2 und MDR1).
Andere Systeme sind prinzipiell ebenfalls geeignet, Polymorphismen an Arzneimittel metabolisierenden Genen nachzuweisen. Die Oligonukleotidprimer für die PCR und/oder die Alleldetektion mit den dazugehörigen Reportersystemen müssen jedoch vom Anwender gesondert entwickelt werden. Solche Systeme sind:
• das DASH^TM System von Hybaid, beruhend auf der Immobilisierung einzelsträngiger Amplikons auf Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP) und anschließender kinetischer Analyse der Schmelzpunkterniedrigung allelspezifischer Hybridisierungssonden. Als Reportersystem wird dabei der interkalierende Fluorophor SYBR Green^TM verwendet. Voraussetzung ist die Anschaffung eines relativ kostenintensiven DASH^TM Gerätes,
• das Pyrosequencing System von Pyrosequencing. Bei diesem Verfahren werden in einzelsträngig vorgelegte PCR Produkte, beginnend an einem spezifischen Primer, Einzelnukleotide sequentiell eingebaut. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotides wird dabei über eine Sulfurylase-Luciferase vermittelte Lichtemissionsreaktion detektiert. Überschüssiges Nukleotid wird vor der Zugabe eines weiteren Nukleotids durch Apyraseaktivität abgebaut. Durch sequentiellen Durchlauf aller Nukleotide wird somit ein kurzes bis mittel langes Sequenzieren in 96 well Platten realisiert. Die Technologie setzt die Anschaffung eines eigens für diesen Zweck entwickelten Gerätes, sowie der benötigten Reagenziencocktails voraus und ist daher vergleichsweise kostenintensiv und nur beschränkt einsetzbar,
• das SNP-IT System von Orchid stellt ein Gerätesystem dar, daß explizit für den Mittel- bis Hochdurchsatz von SNP-Nachweisen an PCR Amplikons entwickelt wurde. Es besteht im wesentlichen aus einem Roboter, welcher automatisch die Aufarbeitung der Proben, den Nachweis der Allele (dafür sind unterschiedlichste Technologien wie Gene Chip Hybridisierungsassay, Sequenzierung etc. integrierbar) und die Datenanalyse (nebst Statistik) leisten soll. Für diese aufwendigen Geräte sind die Anschaffungskosten entsprechend hoch.
• das SureScore^TM System von Invitrogen ist ein auf 96 well Platten basierendes SNP Nachweissystem. Basistechnologie ist der spezifische Einbau markierter (Biotin bzw. FITC) Didesoxynukleotide an einer einzelstängigen, komplementären PCR Produktmatrix durch eine DNA Polymerase an der SNP Position. Der anschließende Nachweis geschieht durch einen markerspezifischen Antikörper, der über eine gekoppeltes Enzym eine Farbreaktion katalysiert.

Die Entwicklung von zuverlässigen Genotypisierungsverfahren, die durch geringen Zeit- und Geräteaufwand und relativ niedrige Kosten gekennzeichnet sind, ist dringend geboten, um eine intensivere klinische Erforschung der Zusammenhänge zwischen Arzneimittelstoffwechsel und Genotyp der beteiligter Enzyme und die Entwicklung hochgradig zuverlässiger und zugleich kostengünstiger, diagnostischer Verfahren zu ermöglichen.
Der Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, ein solches Verfahren zu entwickeln und gleichzeitig ein Testkit zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung zu stellen
Die Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und ein Testkit gemäß Anspruch 7 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Sie betrifft ein vereinfachtes Verfahren zum Nachweis von SNP in CYP-Genen des Menschen und einen Testkit mit folgenden Komponenten:

1. Neu entwickelte synthetische Oligonukleotide der Anlage 1, die geeignet sind, Genabschnitte in Genen des Arzneimittelmetabolismus mit Hilfe der „DNA Polymerase chain reaction” Technologie (PCR) isoformspezifisch (IS-PCR) aus genomischer Leukozyten-DNA zu amplifizieren,
2. Komponenten, die es ermöglichen, einzelsträngig biotinylierte IS-PCR Produkte auf Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (SA-MTP) selektiv, thermostabil und einzelsträngig zu immobilisieren,
3. testoptimierte, allelspezifische, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierte, synthetische Oligonukleotide der Anlage 1, die entweder durch Hybridisierung, oder alternativ dazu durch diskriminierende Verlängerung einzelsträngiger PCR Produkte mittels Taq-Polymeraseaktivität, nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons gewährleisten, oder
4. alternativ zu Streptavidin-Mikrotiterplatten SA-MTP's – aus Streptavidin beschichteten Glasobjektträgern (SA-Chip) auf denen biotinylierte, isoformspezifische, synthetische Oligonukleotide immobilisiert sind, welche mit partiell einzelsträngigen PCR Produkten hybridisiert werden, die durch diskriminierende Verlängerung eines allelspezifischen, endständig Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten Oligonukleotides mittels Taq DNA Polymerase erzeugt wurden und durch nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons gewährleisten.

Durch zusätzliche positive Nachweise der Deletion des CYP2D6 Gens (Allel: CYP2D6*5) und der zum Teil mehrfachen Duplikation desselben Gens (Allel: CYP2D6*2XN) mittels „long distance” PCR mit biotinylierten Sense- und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten Antisense Primern und anschließendem Nachweis, des auf eine Streptavidin-Mikrotiterplatte gebundenen Duplexes, wird somit eine Abschätzung des phänotypisch relevanten Genotyps bezüglich der wichtigsten Arzneimittel metabolisierenden Cytochrom P450 Enzyme ermöglicht.
Im Unterschied zu den bekannten „high-throughput”-Verfahren ermöglicht es die hier beschriebene Erfindung, auch an wenigen Einzelpatienten bei niedrigen Personal- und Sachkosten die therapeutisch wichtigen Befunde zur individuellen Ausstattung mit den verschiedenen CYP Allelen zu erheben.
Die Erfindung nutzt hochgradig genspezifische Oligonukleotidprimer der Anlage 1, für flankierende Regionen der allelbestimmenden Genabschnitte, um diese aus einem Hintergrund von sehr stark homologen Cytochromen der gleichen Subfamilie mittels diskriminierender PCR zu amplifizieren. Der folgende Allelnachweis kann mit zwei zum Teil unterschiedlichen Verfahren erfolgen:

1. durch Markierung eines Primers pro alleltragendem Genfragment mit Biotin; Amplifikation allelbestimmender Genabschnitte mit Oligonukleotidprimern gemäß Anlage 1 mittels diskiminierender PCR; anschließende Kopplung der markierten Amplikons an eine thermostabile Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP), vorzugsweise eine SA-MTP der Firma BioTeZ ( DE10020885 A1 ). Die verunreinigende genomische DNA sowie die Komplementärstränge werden anschließend durch stringentes Waschen entfernt; die dann einzelsträngig vorliegenden Amplikons mit allelspezifischen, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten Oligonukleotiden hybridisiert und danach erneut einer stringenten Waschung unterzogen.
2. durch asymmetrische PCR zur Erzeugung überschüssiger ssDNA Amplikons, anschließende Hybridisierung mit einem 5'-FITC markiertem Primer, dessen 3'-Ende mit der Position der Mutation korrespondiert, und nachfolgende, allelspezifische Verlängerung des markierten Primers durch diskriminierende Taq-Polymeraseaktivität mit dNTP's zu partiell einzelsträngigen Duplexen. Biotinylierte genspezifische Oligonukleotide werden auf definierten Spots eines mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträgers immobilisiert. Die partiell einzelsträngigen Duplexe werden nachfolgend mit den immobilisierten, genspezifischen Oligonukleotiden hybridisiert und durch stringente Waschung von nicht verlängerten, 5'-FITC markierten Oligonukleotidprimer befreit.

Der Nachweis der allelrepräsentierenden 5'-FITC markierten Oligonukleotide geschieht in beiden Fällen durch anschließenden Anti-FITC-Ak-HRP Elisa. Dieses hochempfindliche Verfahren erlaubt den sicheren Nachweis der in den Ausführungsbeispielen aufgeführten Allele unter Einsatz von Laborstandardgeräten und/oder handelsüblichen Durchlichtscannern.
Die erfindungsgemäße Vereinfachung in dem hier beschriebenen Verfahren besteht darin, daß

1. die erfindungsgemäß eingesetzten Primer und Sonden einen hochselektiven Allel-Nachweis an genomischer DNA innerhalb weniger Stunden ermöglichen, und
2. der Test als multipler Assay durchgeführt wird, in dem eine Mehrzahl von einzelnen Allelen in einem speziell angepaßten Protokolldurchlauf auf einer MTP, bzw. mehreren Glasobjekträgern, gleichzeitig erfaßt werden, und
3. für den Fall des Nachweises auf einer MTP nur solche Geräte zum Einsatz kommen, die zur Standardausrüstung eines mit PCR bzw. Elisa Methoden befaßten Labors gehören, und
4. im Falle des Nachweises auf Glasobjekträgern, durch Vorschaltung einer automatisierten Übertragung der IS-PCR Produkte, eine wesentliche Verringerung des personellen und zeitlichen Aufwands, des einzusetzenden Probenmaterials, sowie die Minimierung möglicher Belegungsfehler erzielt werden.

Als interne Kontrollen können Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA (pDNA), vorzugsweise der Plasmid DNA-Sequenzen der Anlage 1, (SEQ ID NO. 37–55), welche allelspezifische Fragmente von CYP-Genabschnitten enthalten, mitgeführt werden.
Vergleichsexperimente mit Primern des Standes der Technik haben gezeigt, dass diese viel weniger zur selektiven Amplifizierung von Genabschnitten des CYP2D6 und zur Anwendung im hier beschriebenen Verfahren geeignet sind, als die erfindungsgemäßen Primer. So verfügen die Primer aus Daly et al. nicht über einen 3' mismatch und diskriminieren daher weniger gut. Die Primer von Meyer und La Roche ( US 5,648,482 A ) liegen weit außerhalb des benötigten Alignments und produzieren ein Amplifikat von 1123 bp Größe, welches eine für eine Multiplex PCR völlig ungeeignete Länge darstellt
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Beispiel 1
Isoformspezifische Amplifikation eines Genabschnitts von CYP2C9 aus genomischer Leukozyten DNA mittels PCR
a) Isolation der genomischen DNA (gDNA)
Genomische DNA kann nach bereits beschriebenen Standardverfahren aus Leukozyten des menschlichen Blutes isoliert werden (Vogelstein B. and Gillespie D. PNAS, (1979) 76: 615–9). Hierbei sollte eine gDNA Konzentration von 5–50 ng/μl angestrebt werden, um bei Einsatz von 0,5–1 μl gDNA/PCR Ansatz eine ausreichende Kopienzahl vorzulegen. Der Qualität der gDNA kann bei der Effektivität des gesamten Assay eine entscheidende Bedeutung zukommen und es sollte daher eine möglichst gleichbleibende Qualität und Konzentration angestrebt werden.
b) Ansatz und Durchführung der PCR mit Probanden gDNA
Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR Ansatz werden 2,5 μl eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z. B. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM KCl, 15 mM MgCl); 0,08 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils 0,5 μl der 50 μM Primer SP2C9201 (SEQ ID NO 1) und dem 5' biotinyliertem Primer RP2C9201 (SEQ ID NO 2); 0,5 μl Taq-DNA Polymerase (5 U/μl), 1 μl gDNA; sowie 16,34 μl für die PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden die Gefäße in ein handelsübliches PCR Gerät überführt und nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:

Zyklen Temp. Dauer

1 × 95°C 3 Min.

35 × 95°C 30 Sek.

57°C 30 Sek.

72°C 45 Sek.

1 × 72°C 5 Min.

4°C Ende
Gleichzeitig wurden Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA (pDNA), welche allelspezifische Fragmente des Genabschnitts CYP2C9*2 (SEQ ID NO 38) und den entsprechenden Abschnitt des Wildtypgens CYP2C9*1 (SEQ ID NO 37) enthalten, als interne Kontrollen ebenfalls im Doppelansatz mitgeführt.
Die entstandenen Amplifikationsprodukte können mittels Agarosegelelektrophorese in 3,5% Agarosegelen bei 5–10 V/cm Gelbreite 1–1½ Stunden aufgetrennt und mittels DNA Marker und Ethidiumbromid Färbung unter UV Licht visualisiert und dokumentiert werden.
Beispiel 2
Hybridisierung und allelspezifischer Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 1 an einer Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP) durch stringente Waschung Fluoresceinisothiocyanat markierter Oligonukleotidsonden

Lösungen

TE-NaCl:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl
HP:	6 × SSC; 0,1% SDS; 2 × Denhardtsche Lösung (DHL)
SDS-WP:	0,1 × SSC; 0,1% SDS
TE-Lysin:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% Lysin (w/v)
TE-RSA:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,05%
	Rinderserum Albumin (w/v)
TE-Tween:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,1% Tween
	(w/v)
TMB:	stabilisierte 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H₂O₂ Lösung der Firma
	DRG Diagnostics (TMBlue)

Durchführung
Jeweils 2 × 5 μl der in Beispiel 1 entstandenen Amplifikationsprodukte werden im Doppelansatz in eine mit 45 μl TE-NaCl vorbeschickte Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP) pipettiert, 20 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert und dann abgesaugt. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA werden je 50 μl 0,2 N NaOH zugegeben, 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geschüttelt und danach abgesaugt. Dann werden je 50 μl TE-NaCl zugesetzt, über 1 Min. bei RT geschüttelt und nachfolgend abgesaugt. Anschließend werden 50 μl nachfolgend bezeichneter, in HP (Hybridisierungspuffer) vorverdünnter Hybridisierungssonden (Endkonzentration – 0,5 – bzw. 1 nM) zu jeweils einem der Doppelansätze zugegeben, 20 Minuten bei 37°C hybridisiert und anschließend abgesaugt. Hybridisierungssonden

Durch dreifach wiederholte Zugabe von 50 μl SDS-WP je Well, Inkubation bei 45°C für 11 Minuten und anschließendes Absaugen werden nicht 100% passende Hybridisierungssonden abgewaschen. Nach dem Blocken überschüssiger, unspezifischer Bindungsstellen für Anti-FITC-IgG-POD Konjugate durch 5 Minuten Inkubation in TE-Lysin bei RT werden 50 μl des Anti-FITC-IgG-POD Konjugates in einer Konzentration von 50 ng/ml in TE-RSA zugesetzt, 20 Minuten abgedunkelt bei RT geschüttelt und anschließend abgesaugt. Nach 2 facher Waschung der Wells mit je 50 μl TE-Tween werden 50 μl/well TMB Lösung zugegeben, 12 Minuten bei RT, abgedunkelt geschüttelt, unmittelbar anschließend mit 50 μl 5 M H₂SO₄ versetzt und sofort danach in einem handelsüblichen MTP Reader bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 bzw. 630 nm vermessen. Tabelle 2 Gemessene Optische Dichte bei 450 nm (OD_450nm) ausgewählter CYP2C9 Allele aus pDNA bzw. gDNA (vortypisiert durch RFLP) nach Hybridisierung mit (Fluoresceinisothiocyanat) FITC-Sonden und Behandlung entsprechend Beispiel 2

Allel (Quelle)	FITC-Sonde	OD_450nm	Match/Mismatch
CYP2C9*1 (pDNA)	WT	2,7	17,5
CYP2C9*2 (pDNA)	MUT	1,9	10,3
CYP2C91/1 (gDNA)	WT	2,7	16,8
CYP2C92/2 (gDNA)	MUT	1,8	11,1
CYP2C91/2 (gDNA)	WT	2,3	1,2
CYP2C91/2 (gDNA)	MUT	1,8	0,8

Legende: CYP2C9*1 (pDNA) ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C9 WT (SEQ ID NO 37) und entsprechend für CYP2C9*2 (SEQ ID NO 38); CYP2C9*2/*2 bzw. -*1/*1 oder – *1/*2 gDNA sind mittels RFLP genotypisierte, genomische DNA Proben der Allele *1 (WT), *2 (MUT) bzw. *1/*2 (heterozygot); WT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel und MUT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend CYP2C9*2; OD_450nm = Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm gegen 620 nm; Match/Mismatch = der Quotient der OD_450nm aus 100% komplementärem zu nicht komplementärem Allel-Sonden Hybriden.

Beispiel 3
IS-PCR von CYP2C19*3 aus pDNA mittels asymmetrischer PCR gefolgt von allelspezifischer Verlängerung Fluoresceinisothiocyanat markierter Oligonukleotide durch Taq DNA Polymerase
Ansatz und Durchführung der PCR mit gentechnisch hergestellter pDNA:
Die pDNA enthält allespezifische Fragmente des Genabschnitts CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44) bzw. des entsprechenden Abschnitt des Wildtypgens CYP2C19*1 (SEQ ID NO 43). Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR Ansatz werden 2,5 μl eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z. B. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM KCl, 15 mM MgCl); 0,2 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils 0,5 μl des 5 μM Primers SP2C1932 (SEQ ID NO 7) und des 50 μM Primers RP2C9201 (SEQ ID NO 8); 0,25 μl Taq-DNA Polymerase (5 U/μl), 1 μl pDNA (50 pg); sowie 20,05 μl für die PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden die Gefäße in ein handelsübliches PCR Gerät überführt und nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:

Zyklen Temp. Dauer

1 × 95°C 2 Min.

35 × 95°C 30 Sek.

55°C 30 Sek.

72°C 45 Sek.

1 × 72°C 5 Min.

Pause

und nach Zusatz von 0,5 μl/PCR Gefäß eines der 50 μM, 5' FITC markierten, allelspezifischen Primer 2C1931AS (SEQ ID NO 56) bzw. 2C1933AS (SEQ ID NO 57) erneut

1 × 95°C 2 Min.

59°C 45 Sek.

72°C 3 Min.

einer allelspezifischen Primerverlängerung unterworfen, anschließend kurzfristig bei 4°C aufbewahrt und nachfolgend weiterverarbeitet.
Beispiel 4
Hybridisierung und allelspezifischer Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 3 an Streptavidin beschichtete Glasobjekträgern (SA-Chips) durch stringente Waschung FITC markierter Primerverlängerungsprodukte

Lösungen

TE-NaCl:	10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl
6 × SSC:	0,09 M Na-Citrat-HCl (pH 7.0); 0,9 M NaCl
SDS-WP:	0,1 × SSC; 0,1% SDS
TE-Lysin:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% Lysin (w/v)
TE-RSA:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,05%
	Rinderserum Albumin (w/v)
TE-Tween:	10 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0,1% Tween
	(w/v)
TMB(p):	präzipitierende, stabilisierte 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H₂O₂
	Lösung der Firma Seramun

Durchführung

Ein mit 32–64 Reaktionsarealen (Spots) ausgestatteter Glasobjektträger wird mit jeweils 3 μl/Spot eines 5' biotinylierten, in TE-NaCl gelösten 500 pM Oligos mit der Bezeichnung B2C193_F (SEQ ID NO 58) versehen, 15 Min. bei RT in einer Humiditätskammer inkubiert, anschließend abgesaugt mit 1 mal mit 6 × SSC bei RT gewaschen. Jeweils 0,25 μl der in Beispiel 3 entstandenen Amplifikationsprodukte werden mit 1,5 μl 12 × SSC versetzt, mit ddH₂O auf 3 μl Gesamtvolumen aufgefüllt, nach Absaugen des 6 × SSC Puffers im Dreifachansatz auf einzelne Spots pipettiert, 30 Minuten bei RT bei gesättigter Humidität hybridisiert und anschließend abgesaugt. Durch 3 fache, stringente Waschung des Glasobjektträgers (SA-Chips) mit 20 ml SDS-WP für jeweils 5 Min. bei 46°C werden nicht verlängerte, Fluoresceinisothiocyanat markierte Mismatch Extensionprimer abgewaschen, während korrekt gepaarte, in der Extensionreaktion verlängerte Match 5' FITC-Primer/Template Kombinationen auf dem Glasobjektträger (SA-Chip) verbleiben. Nach dem Blocken überschüssiger, unspezifischer Bindungsstellen für Anti-FITC-IgG-POD Konjugate durch 5 Min. Inkubation in TE-Lysin bei RT werden 2 μl eines Anti-FITC-IgG-POD Konjugates in TE-RSA (1 μg/ml) zugesetzt und abgedunkelt 20 Minuten in gesättigter Humidität bei RT inkubiert. Nach 2 facher Waschung des Glasobjektträgers (SA-Chips) mit 5 ml TE-Tween werden 2 μl/Spot der TMB (p) Fertiglösung zugegeben und abgedunkelt in gesättigter Humidität über 15 Minuten bei RT inkubiert. Die sofort anschließende Vermessung der auftretenden Violettfärbung erfolgt in einem handelsüblichen Durchlichtscanner (Agfa Scanwise) bei einer Auflösung von 250 dpi. Die Auswertung der gescannten Bilder erfolgt mit Hilfe einer neuentwickelten, speziell auf das Glasobjektträger (SA-Chip) Design und das verwendete farbgebende Reagenz abgestimmten Analysesoftware und wird als auf 100% normierte Wertetabelle im Excel Format als Score Werte ausgegeben. Tabelle 3 Ergebnisse der Messung der CYP2C19*1 bzw. -*3 pDNA Allele entsprechend Beispiel 4

Allel	FITC-Sonde	Score (Mw ± Stdw, n = 3)
		1 × PE	2 × PE
CYP 2C19*1	MUT	1 ± 1	2 ± 3
CYP 2C19*1	WT	82 ± 13	85 ± 1
CYP 2C19*3	MUT	70 ± 16	81 ± 4
CYP 2C19*3	WT	6 ± 2	26 ± 9
		Match/Mismatch (Mw)
		1 × PE	2 × PE
CYP 2C19*1	WT	82	43
CYP 2C19*3	MUT	12	3

Legende: CYP2C19*1 ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C19 WT (SEQ ID NO 43) und entsprechend für CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44); FITC-Sonde = 5' Fluoroescein markiertes Oligonukleotid; WT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel und MUT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend CYP2C19*3; Score_{(Mw±Stdw,n=3)} = Mittelwerte von auf 100% normierten Scorewerten ± Standardabweichung bei Dreifachansatz; Match/Mismatch_(Mw) = Quotient der mittleren Scorewerte aus 100% komplementärem und nicht komplementärem Allel-Sonden Hybrid; n × PE = Zahl (n) der durchgeführten FITC-Primer extension Zyklen. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-Polymorphismen in Cytochrom P450 Genen, dadurch gekennzeichnet, dass a) Genabschnitte humaner CYP2-Gene aus einer Probe mit den Amplifikationsprimern SEQ-ID No. 1–16 in einem multiplen Assay isoformspezifisch mittels diskriminierender oder asymmetrischer Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden und b1) nachfolgend eine Immobilisierung der biotinylierten Amplifikate erfolgt, c1) anschließend mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 17–36 hybridisiert wird, oder b2) nachfolgend mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotid-Primern SEQ-ID No. 56–57 hybridisiert wird und eine allelspezifische Verlängerung des markierten Primers erfolgt und c2) anschließend die Produkte aus Schritt b2) mit immobilisierten, biotinylierten Oligonukleotiden der SEQ ID No. 58 hybridisiert werden und in beiden Fällen d) nachfolgend stringent gewaschen wird und e) schließlich die amplifizierten Allele detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils einer der Amplifikationsprimer in Schritt a) biotinyliert ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung der Amplifikate in Schritt b1) und/oder der Oligonukleotide SEQ ID No. 58 in Schritt c2) auf Streptavidin beschichtete Platten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Platten in Schritt b1) Mikrotiterplatten und in Schritt c2) Glasobjektträger sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 17–36 oder SEQ ID No. 56–57 mittels Fluorometrie oder Photometrie durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, dass a) Genabschnitte humaner CYP2-Gene aus einer Probe mit den Oligonukleotiden SEQ-ID No. 1–16 (Amplifikationsprimer) in einem multiplen Assay isoformspezifisch amplifiziert werden b2) eine zusätzliche allelspezifische Amplifizierung mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Oligonukleotiden SEQ-ID No. 56–57 erfolgt, wobei die allelspezifische Verlängerung des 5'-FITC markierten Primers durch diskriminierende Taq-Polymeraseaktivität mit dNTP's zu partiell einzelsträngigen Duplexen durchgeführt wird; c2) anschließend die partiell einzelsträngigen Amplifikate aus Schritt b2) mit den passenden genspezifischen biotinylierten Oligonukleotiden der SEQ ID No. 58, welche auf definierten Spots des Streptavidin beschichteten Glasobjektträgers immobilisiert worden sind, hybridisiert werden d) nachfolgend stringent Waschung gewaschen und e) schließlich die amplifizierten Allele unter Verwendung eines Meerretich-Peroxidase markierten anti-FITC-Ak-HRP ELISAs detektiert werden.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangegangenen Ansprüche enthaltend a) Amplifikationsprimer SEQ ID No. 1–16, b1) Fluoresceinisothiocyanat markierte Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 17–36, wobei jeweils einer der Amplifikationsprimer SEQ ID No. 1–16 biotinyliert ist und/oder b2) Fluoresceinisothiocyanat markierte Oligonukleotide SEQ ID No. 56–57 und biotinyliertes Oligonukleotid SEQ ID No. 58 und c) Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten und/oder Streptavidin beschichtete Glasobjektträger d) weitere übliche Puffer und Waschlösungen.