DE10020885A1 - Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix für Polymerase Chain Reaction (PCR) und DNA-Hybridisierungsassay

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix unter Verwendung eines inerten thermostabilen Trägermaterials, auf das ein biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem Molekulargewicht L 500 KD, vorzugsweise vernetztes Immunglobulin-Gamma oder Rindergammaglobulin, als Klettsubstanz in stark basischen Puffern bei einem pH-Wert L 11,0 oder in stark saurem Milieu bei einem pH 6 3,0 in Kontakt gebracht wird. Nach Adsorption an den Träger wird über die Biotinbrücke vernetztes Streptavidin und/oder Avidin als hochmolekulares Vernetzungsprodukt V2 aufgebracht. Die so hergestellte Matrix ist chemo- und thermostabil und somit zur kombinierten Verwendung von PCR und Hybridisierungsassay einsetzbar.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines chemo- und thermostabilen, mit vernetztem Streptavidin und/oder Avidin beschichteten Trägers, wobei die aus vernetztem Streptavidin und/oder Avidin bestehende Schicht (V­ 2) über eine vernetzte und biotinylierte Klettsubstanz (V1) für die vorzugsweise Immunglobulin-Gamma (IgG) oder Rindergammaglobulin verwendet wird, in stark basischen Puffern mit pH-Werten ≧ 11,0 oder in stark saurem Milieu bie pH-Werten ≦ 3,0, an die Oberfläche des festen Trägermaterials gebunden wird. Weiterhin betrifft die Erfindung die beschichteten Träger selbst sowie ihren Einsatz bei Festphasen- Hybridisierungstechniken und Festphasen-PCR.
In DE 197 24 787 A1 (BioTeZ GmbH) sowie in EP 0 331 127 A1 (Boehringer-Mannheim GmbH) sind mit Streptavidin oder Avidin beschichtete Oberflächen bereits beschrieben. Als Trägermaterialien für solche Beschichtungen dienen geladene Plastikoberflächen aus Polystyrol, Nylon, Nitrocellulose u. ä. Nachteilig für diese Träger ist jedoch, dass sie nur eine geringe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie für eine Reihe von Anwendungen (z. B. für die Durchführung von PCR) nicht geeignet sind.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Träger mit solchen Beschichtungen zu entwickeln, die die Anwendung auch bei höheren Temperaturen (≧ 60°C bis 100°C) gestatten und die auch bei diesen Temperaturen sowohl Thermostabilität als auch Chemostabilität besitzen.
Überraschend stellte sich heraus, dass es möglich ist, eine chemo- und thermostabile Beschichtung auf einer inerten, thermostabilen Festphasenmatrix zu erreichen, wenn man ein biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem Molekuklargewicht ≧ 500 KD als Klettsubstanz-Unterschicht entweder in basischem Puffer bei pH ≧ 11,0 oder im stark sauren Milieu bei pH ≦ 3,0, an die Oberfläche des Trägermaterials bindet, und anschließend mit vernetztem Streptavidin (auch rekombinantem Streptavidin), vernetztem Avidin oder auch Streptavidin-Avidin-Vernetzungsprodukten umsetzt. Es wurde eine stabile Streptavidin/Avidin- Beschichtung mit wesentlich erhöhter Bindungskapazität (bei Temperaturen von 60°C lag die Bindungskapazität noch bei 93%, im Vergleich zu handelsüblichen Trägern, deren Bindungskapazität bei 60°C nur noch ca. 40% aufwies) und gesteigerter Thermo- und Chemostabilität auf den i. d. R. ungeladenen Trägeroberflächen erzielt.
Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, Streptavidin und/oder Avidin enthaltenden Festphasenmatrix, bei der die Vernetzungsprodukte aus Streptavidin, Avidin oder auch Gemischen von diesen über das biotinylierte Klettprotein V1 an die Oberfläche des festen Trägermaterials gebunden sind.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsprodukt V1, vorzugsweise ein Protein, insbesondere IgG oder Rindergammaglobulin nach seiner Vernetzung unter Verwendung an sich bekannter Reagenzien biotinyliert wird und danach mit einem thermostabilen, vorzugsweise ungeladenen Trägermaterial in stark basischem Milieu bei einem pH-Wert ≧ 11 oder im stark sauren Milieu bei einem pH-Wert ≦ 3,0 in Kontakt gebracht wird. Als stark basische Pufferlösungen werden vorzugsweise Carnonatpufferlösungen und als stark saures Milieu vorzugweise Citratpufferlösungen angewandt.
Im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wonach Beschichtungen generell im basischen Milieu bei pH-Werten nicht über 9,6 ablaufen, führt überraschend die Erhöhung auf einen pH-Wert von ≧ 11 im basischen Milieu bzw. auch eine Erniedrigung unter einen pH-Wert ≦ 3 im sauren Milieu zu einer thermo- und chemostabilen Beschichtung mit hoher Bindungskapazität, wenn ein vernetztes und biotinyliertes Klettprotein V1 und ein vernetztes Protein aus Streptavidin, Avidin oder auch Gemischen von beiden V2 verwendet wird. wobei die Beschichtung auf thermostabilen ungeladenen Trägeroberflächen aus Kunststoff, wie Polycarbonat und Polypropylen erfolgt.
Überraschend ist dabei insbesondere die Tatsache, dass eine chemo- und thermostabile Beschichtung sowohl bei Umsetzung im stark basischen als auch bei Umsetzung im sauren Milieu zu verzeichnen ist.
Nach Fixierung an die Trägeroberfläche wird auf diese Unterschicht eine Oberschicht aus vernetztem Streptavidin, Avidin bzw. einem Gemisch von diesen aufgebracht.
Erfindungsgemäß besteht die vorzugsweise ungeladene Trägeroberfläche aus Kunststoff, vorzugsweise aus Polycarbonat oder Polypropylen. Der Träger stellt eine beschichtete Festphase an einer thermostabilen Plastikoberfläche, bevorzugt aus Polycarbonat, Polypropylen, silikatischen, oxydischen oder auch metallischen und Halbleiteroberflächen sowie auch aus Kombinationen der genannten Trägermaterialien dar.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung die so hergestellten, stabilen, mit Streptavidin und/oder Avidin beschichteten festen Träger an sich, die aus einem thermostabilen, i. d. R. ungeladenen Trägermaterial, einem vernetzten und biotinylierten Protein, vorzugsweise IgG oder Rindergammaglobulin, als Unterschicht und vernetztem Streptavidin und/oder Avidin als Oberschicht bestehen.
Der erfindungsgemäß hergestellte neue Träger stellt eine beschichtete Festphase an einer thermostabilen Plastikoberfläche, bevorzugt aus Polycarbonat, Polypropylen, silikatischen, oxydischen oder auch metallischen und Halbleiteroberflächen sowie auch aus Kombinationen aus den genannten Trägermaterialien dar und weist folgende vorteilhafte Eigenschaften auf:
  • - hohe Bindungskapazität an der Oberfläche (bei 60°C noch 93%),
  • - ausreichende chemische Stabilität, auch gegenüber Detergenzien,
  • - universelle Verwendbarkeit sowie
  • - notwendige Empfindlichkeit der Bestimmungsverfahren,
  • - hohe Thermostabilität bis zu 96°C, (bei 80°C noch mind. 50% Bindungskapazität).
Der beschriebene feste Träger ist demnach vorteilhaft für die Durchführung von molekularbiologischen Festphasenreaktionen und von Festphasen-Hybridisierungstechniken geeignet, insbesondere für die Hybridisierung bei Temperaturen ≧ 60°C, was mit den bisher bekannten Streptavidin-Beschichtungen nicht möglich war, und ermöglicht erstmalig, alle möglichen Varianten von Festphasenreaktionen, bei denen höhere Temperaturen erforderlich sind, wie beispielsweise DNA- Displacement-Assay, Hot-Start-PCR, allelspezifische PCR mit markierten Primern oder Primer-Extension-Assays mit markierten Didesoxy-Nukleotiden u. ä.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert auf die sie jedoch nicht beschränkt werden soll.
Beispiel 1 Präparation des Klettproteins V1
120 mg γ-Globulin (Rind) werden in 13 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst. Unter Rühren werden 7,5 mg Disuccinimidylsuberat (DSS, Fa. PIERCE), gelöst in 620 µl Dioxan, tropfenweise im Verlaufe von 25 min zur γ- Globulinlösung gegeben.
Nach einer Reaktionszeit von 4 Std. unter Rühren bei Raumtemperatur werden 6,0 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin (F. PIERCE) in fester Form in die Reaktionslösung eingebracht, wobei sich das Biotinylierungsreagenz sofort auflöst. Eine vorherige Trennung durch Gelfiltration kann ausgeführt werden, ist aber nicht erforderlich, sondern die Reaktion wird unmittelbar weitergeführt. Dieser zweite Syntheseschritt erfolgt ebenfalls unter Rühren bei Raumtemperatur. Die Reaktionszeit beträgt zunächst 2,5 Std., über Nacht wird das Reaktionsgemisch im Kühlschrank gelagert.
Die Aufarbeitung erfolgt durch Dialyse, zunächst viermal gegen Wasser, anschließend gegen 0,05 M PBS(pH 7,4)/0,05% Natriumazid. Das weitgehend klare Retentat wird vor der spektralfotometrischen Messung zweckmäßigerweise durch ein 0,6­ µm-Sartorius-Filter gedrückt.
Beispiel 2 Thermostabile Beschichtung eines festen Trägers (Mikrotiterplatten)
Zur Grundbeschichtung der Kavitäten (Wells) einer Mikrotiterplatte (MTP) aus thermostabilem Polycarbonat werden in jedes Well 50-250 µl hochvernetztes biotinyliertes γ- Globulin (Rind) gemäß Beipiel 1 in einer Konzentration von 10-­ 20 µg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer (pH ≧ 11) pipettiert und 12 Stunden bei 25°C stehen gelassen.
Zum Aufbau der Oberschicht werden die Wells nach dem Waschen mit destilliertem Wasser mit dem Zusatz von 0,9% NaCl 12 Stunden bei 25°C mit einer Lösung des hochvernetzten Streptavidins (V2) in 0,05/0,15 M PBS-Puffer (pH 7,2) behandelt. Nach erneutem Waschen mit destilliertem Wasser mit dem Zusatz von 0,9% NaCl und Blocken mit destilliertem Wasser mit Zusatz von 0,1% Casein und 0,9% NaCl wird die Schicht mit Denhardt'scher Lösung in 0,1 M Mc Ilvaine-Puffer (pH 6,0) konserviert. Nach Trocknung können die beschichteten MTP (mit Trockenmittel) in Folienbeuteln verschweißt und im Kühlschrank gelagert werden.
Beispiel 3 Bestimmung der Biotin-Bindungskapazität
Das Beispiel beschreibt die Bestimmung der Biotin- Bindungskapazität thermostabil beschichteter MTP nach differenten Temperaturbelastungen. Die unterschiedlichen Molekülgrößen von Biotin, biotinylierten Oligonukleotiden oder anderen biotinylierten Verbindungen, aber auch chemische Einflüsse führen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Als Bestimmungsverfahren für die Biotin-Bindungskapazität der Streptavidinbeschichtung wird ein kompetitiver Enzymimmunoassay mit Hilfe von Biotin (biotinylierte Verbindungen) und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase (Biotin-POD) eingesetzt. Die Bindungsausbeute wird durch Differenzmessung in der flüssigen freien Phase ermittelt. Aus der Differenz zwischen dem Totalwert (Enzymaktivität der eingesetzten Biotin-POD) und der ungebundenen Enzymaktivität in der überstehenden freien Phase des Assays kann die Biotin- Bindungskapazität der Trägerschicht berechnet werden.
Zur Charakterisierung der Thermostabilität der beschichteten Platten werden die Wells mit einem PCR-Puffergemisch (0,01 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl, 0,002 M MgCl2; pH 7,9) gefüllt und über einen fixierten Zeitraum festgelegten Temperaturen ausgesetzt:
25°C, 60°C, 80°C, 90°C und 96°C.
Zum Vergleich werden an sich bekannte MTP aus Polystyrol mit Standard-Beschichtung (biotinyliertes Rinderserumalbumin in 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6) und Streptavidin oder Avidin) dem gleichen Temperaturregime ausgesetzt.
Die chemothermische Stabilität wird durch Belastung bei 25°C mit 0,15 M NaOH, bei 65°C mit 0,1 M NH4OH und bei 85°C mit PCR-Puffer ermittelt. Die chemothermische Belastung der Streptavidin-Schichten wird durch Waschen der Wells mit destilliertem Wasser mit Zusatz von 0,9% NaCl und 0,1% Tween 20 bei Raumtemperatur beendet und die noch vorhandene Bindungskapazität für Biotin oder biotinylierte Verbindungen mit Hilfe eines kompetitiven Biotin-EIA bestimmt.
In diesem kompetitiven Biotin-EIA kommen Reaktionsmischungen aus verschiedenen konzentrierten Lösungen von d(+)-Biotin oder biotinylierter Verbindung (Biot-Oligonukleotid, Biot-IgG) und einer Lösung einer konstanten Konzentration an Biotin-POD in 0,005 M PBS-Puffer (pH 7,4/0,1% BSA) zur Anwendung. Diese Reaktionsmischungen (50-200 µl) sollte mindestens 2 Stunden bei 25°C mit den beschichteten Wells der chemothermisch belasteten MTP reagieren. Der Biotin-POD-Gehalt wird über eine Enzymimmunoassay-Standardkurve der Extinktionen der Substratreaktion mit o-Phenylendiamin(OPD) fotometrisch in der flüssigen Phase bestimmt. Dabei wird die Extinktion des an der festen Phase Gebundenen (B) als Differenz des Totalwertes der Extinktion (T) und der in der freien Phase des Reaktionsüberstandes (F) gemessenen Extinktion bestimmt (B = T - F). Statt der Extinktionswerte werden für die weitere Auswertung die Bindungsraten B/T durch Division der Extinktion der gebundenen Phase durch die Extinktion des Totalwertes verwendet. Nach Ausführung des o. g. Experiments können Enzymimmunoassay-Standardkurven aufgestellt werden, in der wie in anliegender Abbildung die sich ergebenen B/T-Werte in Abhängigkeit zu den eingesetzten Biotin-Konzentrationen dargestellt sind. Mit Hilfe eines Kurven-Fits unter Verwendung des Hill-Modells kann die Biotin-Bindungskapazität der Oberflächenschicht ermittelt werden. Die Unterschiede der Biotin-Bindungskapazität zwischen den erfindungsgemäß mit vernetztem thermostabilen Streptavidin und den mit Streptavidin/Avidin nach Standard beschichteten Oberflächen werden in den folgenden Tabellen aufgezeigt:

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung einer chemo- und thermostabilen Festphasenmatrix zur Kombination von PCR und Hybridisierungsassay, dadurch gekennzeichnet, dass ein biotinyliertes Vernetzungsprodukt V1 mit einem Molekulargewicht ≧ 500 KD als Klettsubstanz mit einem inerten, thermostabilen Trägermaterial in stark basischem Puffer bei einem pH-Wert ≧ 11,0 oder in stark saurem Milieu bei einem pH-Wert ≦ 3,0 in Kontakt gebracht wird und nach Fixierung an der Trägeroberfläche über die Biotinbrücke vernetztes Avidin, vernetztes Streptavidin oder vernetztes rekombinantes Streptavidin oder auch Gemische dieser als hochmolekularen Vernetzungsprodukte V­ 2 aufgebracht werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsprodukt V1 ein Protein ist, vorzugsweise Rindergammaglobulin oder Immunglobulin-Gamma einer anderen Spezies.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Trägermaterials aus bis 100°C thermostabilem Kunststoff, vorzugsweise aus Polycarbonat oder Polypropylen, besteht oder dass als Träger auch silikatische, oxydische oder metallische und Halbleiteroberflächen sowie auch Kombinationen aus den genannten Trägermaterialien eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Vernetzung des Klettsubstanz V1 und der Vernetzungs­ produkte V2 nach an sich bekannten Verfahren unter Verwendung an sich bekannter bifunktioneller Linker, vorzugsweise Disuccinimidylsuberat (DSS), ausgeführt wird.
5. Chemo- und thermostabile Festphasenmatrix zur Durchführung von PCR und Hybridisierungsassays, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus einem inerten, thermostabilen Trägermaterial besteht und einer thermostabilen Schicht, die sich aus einem biotinyliertem Vernetzungsprodukt V1 mit einem Molekulargewicht ≧ 500 KD in Kombination mit einem hochmolekularem Vernetzungsprodukt V2 zusammensetzt.
6. Festphasenmatrix nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsprodukt V1 ein Protein, vorzugsweise Rindergammaglobulin oder Immunglobulin-gamma einer anderen Spezies ist.
7. Festphasenmatrix nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsprodukt V2 vernetztes Avidin, vernetztes Streptavidin oder rekombinantes Streptavidin oder auch Gemische der genannten Substanzen sind.
8. Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das inerte, thermostabile Trägermaterial eine Kunststoffoberfläche, vorzugsweise aus Polycarbonat oder Polypropylen, aufweist.
9. Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger silikatische, oxydische, metallische oder Halbleitermaterialien sowie auch Kombinationen aus den genannten Trägermaterialien sind.
10. Verwendung einer Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur PCR und Hybridisierungsassays, wobei diese auch als Kombination an derselben Festphasenmatrix durchgeführt werden.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass an ihrer Oberfläche biotinylierte Oligonukleotide, biotinylierte DNS- oder RNS-Fragmente sowohl chemo- als auch thermostabil fixiert werden.
12. Verwendung der Festphasenmatrix nach einem der Ansprüche 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass alle Varianten von Festphasen-Hybridisierungstechniken an ihr durchgeführt werden.
13. Verwendung der Festphasenmatrix nach Anspruch 5 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass dass Hybridisierungs-, Denaturierungs- Kettenverlän­ gerungs- oder sonstige Reaktionsschritte ebenfalls bei Temperaturen ≧ 60°C erfolgen.
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