CH626092A5 - - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an flüssigen oder festen Trägermaterialien.

Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen und Hapten-Antikörperreak-tionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat in den vergangenen Jahren grosse Bedeutung erlangt. Es wurden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem zeigt es sich, dass ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen, die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, dass bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der erwartete breite Durchbruch noch nicht realisierte.

Hinzu kommt weiter, dass die meisten Immobilisierungsmethoden nur für bestimmte Trägermaterialien brauchbar sind oder die Herstellung des Trägers durch Polymerisation aus wässriger Lösung in Gegenwart des biologisch aktiven Proteins erfordern (Protein-Copolymerisation), was ebenfalls die brauchbaren Trägermaterialien stark beschränkt.

Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine wären Substanzen, welche sekundäre Amidgruppen enthalten. Hierzu gehören einerseits verschiedene Polymerisate, die sich durch besonders günstige mechanische und chemische Eigenschaften auszeichnen, wie z. B. die Polyamide, Polyurethane und andererseits polypep-tidartige Strukturen, wie Polyaminosäuren und dergleichen. Derartige Substanzen mit sekundären Amidgruppen weisen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit den Proteinstrukturen auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so dass hier negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme nicht zu erwarten sind oder gering bleiben, soweit keine sonstigen Gruppen darin vorhanden sind, welche besonders nachteilig auf die Aktivität von Proteinen einwirken.

Es ist bereits bekannt, dass Imidoester, die sich leicht aus sekundären Aminen erhalten lassen, spezifisch mit den Aminogruppen von Proteinen unter Bildung von Amidino-strukturen reagieren (vergi, z. B. Colowick-Kaplan «Methods in Enzymology», Band 25, Seite 646-648). Es ist auch bekannt, dass man Polyamide mit starken Alkylierungsmitteln in die Polyiminoester überführen kann (US-PS 3340210). Ein wesentlicher Nachteil derartiger Iminoester für die Proteinfixierung besteht jedoch darin, dass sie in den Lösungsmitteln löslich oder zumindest quellbar sind. Dies führt zu starker Klebrigkeit, die insbesondere das Arbeiten mit Granulat, Folien, Schläuchen und ähnlichen Formkörpern wegen der auftretenden Verklebung stark erschwert oder gar unmöglich macht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zu schaffen, welches die Fixierung von biologisch aktiven Proteinen unter Aktivitätserhalt an Substanzen, die mindestens zwei sekundäre Amidgruppen enthalten, ermöglicht und welches die oben erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine,

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welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Amidgruppen bei Temperaturen zwischen —80 und 50° C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Amidgruppen in Iminchloridgruppen der Formel I

R - C = N - R

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worin R und Ri aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Reste darstellen, und das so erhaltene Produkt a) in wässrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe ent- 15 haltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der Formel II

R - C = N - R

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NH - R2-X

worin R2 eine Alkylengruppe, eine a,w-Dioxialkylengruppe 25 oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung geeignete Funktion bedeutet, entweder direkt mit dem Protein oder zuerst mit wenigstens einem bifunktionellen oder polyfunktionellen Proteinreagens und danach mit dem 30 Protein oder mit dem Reaktionsprodukt des Proteins mit dem Proteinreagens zur Reaktion gebracht wird.

Die erfindungsgemässe Iminchlorierungsreaktion wird vorzugsweise an flüssigen oder festen Polymeren vorgenommen, welche die sekundären Amidgruppen enthalten. Besonders 35 bevorzugt werden hierunter wiederum die Polyamide wie Nylon und Perlon und ähnliche. Ein anderes Beispiel für sekundäre Amidgruppen enthaltendes Polymer ist Polyurethan.

Bei festen sekundäre Amidgruppen enthaltenden Poly- 40 meren kann es zweckmässig sein, die Polymeren in gelöstem Zustand der erfindungsgemässen Umsetzung zu unterwerfen. Geeignet sind hierfür die üblichen Lösungsmittel, die dem Fachmann für die jeweiligen Polymeren bekannt sind. Liegt das sekundäre Amidgruppen enthaltende Polymere in festem 45 Zustand vor, so kann es sich um Pulver oder um Formkörper, wie z. B. Schläuche oder dergleichen, handeln. Im Falle vor Formkörpern mit relativ geringer Oberfläche im Verhältnis zur Masse ist es zweckmässig, die für die Umsetzung vorgesehene Oberfläche zu aktivieren. Die Aktivierung erfolgt so vorzugsweise durch Abscheidung eines feinteiligen Polymers aus seiner Lösung. Beispielsweise können Polyamide wie Nylon in hierfür üblichen Lösungsmitteln gelöst und dann in feinteiliger amorpher und damit reaktionsfähiger Form auf der Oberfläche des Kunststofformkörpers abgeschieden wer- 55 den.

In analoger Weise ist es auch möglich, auf Formkörper, die nicht aus sekundäre Amidgruppen enthaltenden Polymeren bestehen, Überzüge aus Polymeren aufzubringen, welche sekundäre Amidgruppen enthalten. Vorzugsweise erfolgt60 dies wiederum durch Abscheidung dieser Polymeren aus ihren Lösungen in aktiver Form. Wahlweise ist es aber auch möglich, nach den üblichen Techniken der Überzugsauf-bringung, wie Aufextrudieren, Flüssigauftragen, Aufschmelzen, Folien Aufbringen und dergleichen zu arbeiten. 65

Die Erfindung ist jedoch nicht auf Polymere beschränkt, sondern generell auf alle Verbindungen anwendbar, die als Träger für biologisch aktive Proteine in Betracht kommen und eine Mehrzahl von sekundären Amidgruppen enthalten, wie z. B. Peptide.

Bevorzugtes Chlorierungsmittel für die Herstellung des Iminchlorids ist PCls. Andere geeignete Chlorierungsmittel sind z. B. PCI3, SOCI2, COCI2, POCI3 und SO2CI2. Die beiden letzteren sind zwar nicht so reaktionsfähig wie PCls, sie haben gegenüber letzterem jedoch den Vorteil, dass sie flüssig sind und daher ohne Lösungsmittel eingesetzt werden können. Bei der Umsetzung mit PCls ist dagegen ein Lösungsmittel erforderlich. Geeignet sind halogenierte Lösungsmittel wie Dichloräthan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und ähliche. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Herstellung des Iminchlorids mit PCls in Dichloräthan bei Temperaturen zwischen —38 und 0° C. Diese bevorzugten Bedingungen lassen sich leicht durch Zugabe von Trockeneis zur Dichloräthanlösung (oder der Lösung in einem anderen halogenierten Lösungsmittel) einstellen. Selbstverständlich sind aber auch andere Kühlungsmethoden geeignet.

Überschüssiges Chlorierungsmittel wird nach Beendigung der Umsetzung vorzugsweise entfernt, ehe das Diamin zugesetzt wird. Alternativ ist es aber auch möglich, ohne vorherige Entfernung von restlichem Chlorierungsmittel im Anschluss an die Chlorierungsreaktion unmittelbar die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltende, bifunktionelle Verbindung zuzusetzen, sofern keine unmittelbare Bindung mit dem biologisch aktiven Protein erfolgen soll. Wird das Chlorie-rungsmittel nicht vor Zugabe der bifunktionellen Verbindung entfernt, so kann eine Reaktion von überschüssigem Chlorierungsmittel mit der bifunktionellen Verbindung erfolgen. Wird beispielsweise als bifunktionelle Verbindung ein Diamin verwendet, so kann überschüssiges Halogenierungsmittel mit der zweiten freien Aminogruppe reagieren. Wird ein solches Zwischenprodukt dann direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht, so reagieren auch die durch Umsetzung des restlichen Chlorierungsmittels mit der freien Funktion der bifunktionellen Verbindung entstandenen Gruppen mit dem Protein. Wird beispielsweise als Chlorierungsmittel Phosphor-pentachlorid verwendet und nach der Umsetzung unter Bildung des Iminchlorids der Überschuss nicht abgetrennt, so wird das Enzym über ankondensierte Phosphorsäurechlorid-Gruppen an die freie Aminogruppe des Diamins gebunden. Es wurde festgestellt, dass auch unter diesen Umständen hohe Ausbeuten an biologischer Aktivität bei der Proteinfixierung erhalten werden können (vgl. Beispiel 8).

R und Ri sind aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Reste, die weitere sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen oder Iminchloridgruppen enthalten können. Vorzugsweise bedeuten R und Ri geradkettige, verzweigte oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Al-kylengruppen mit 1 bis 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylen-phenylgruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe, die miteinander durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind, Peptidketten aus natürlichen und/oder synthetischen Aminosäuren oder dergleichen. Typische Beispiele für Verbindungen, welche erfin-dungsgemäss über die Bildung von Iminchloridgruppen mit biologisch aktiven Proteinen gekoppelt werden können, sind 6-Polyamid, 6,6-Polyamid, 6,10-Polyamid, 11-Polyamid, 12-Polyamid, Polycyclamide wie Poly-(l,4-cyclohexylendimethy-lensuperamid), Polydodecanollactam, Wolle, Kasein, Naturseide, Polyarginin und ähnliche. Unter den synthetischen Polymeren werden solche bevorzugt, in denen R und Ri Alky-len- und Cycloalkylengruppen mit 6 bis 12 C-Atomen dar

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stellen, welche durch Amidgruppen miteinander verbunden sind.

Das Iminchlorid kann erfindungsgemäss direkt in einem wässrigen Lösungsmittel mit dem biologisch aktiven Protein umgesetzt werden. Das biologisch aktive Protein wird dabei zweckmässig in einem geeigneten wässrigen Puffer gelöst, mit dem festen Iminchlorid zusammengegeben und abreagieren gelassen. Eine derartige Arbeitsweise empfiehlt sich vor allem dann, wenn das Grundgerüst des Imins verzweigt ist, beispielsweise also bei Polyamiden, die Komponenten mit 3, 4 oder noch mehr Funktionen enthalten. Durch die dort auftretenden sterischen Verhältnisse wird die direkte Reaktion zwischen dem Iminchlorid und dem Protein begünstigt. Bei geradkettigen Polymeren hingegen erfolgt die Reaktion mit dem Protein zweckmässig über eine Zwischenverbindung, welche mindestens eine primäre Aminogruppe enthält (Spa-cer).

Die primäre Aminogruppe kann direkt mit einem Kohlenstoffatom verbunden sein oder als Hydrazidgruppe vorliegen, also an eine Säureamidogruppe gebunden vorliegen. Liegen zwei primäre Aminogruppen vor, so sollen die beiden Aminogruppen vorzugsweise durch eine Alkylen-,a,co-Di-oxialkylen- oder Dicarbonsäureamidgruppe mit 2—8 C-Atomen voneinander getrennt sein.

Wird anstelle eines Diamids ein Monoamid verwendet, so enthält dieses noch eine weitere funktionelle Gruppe, vorzugsweise eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Protein geeignete Gruppe. Diese zweite Gruppe der Zwischenverbindung, gleichgültig ob es sich um eine primäre Aminogruppe oder eine andere Gruppe handelt, kann wieder mit einem bifunktionellen Proteinreagens umgesetzt werden, ehe die endgültige Bindung des Proteins erfolgt. Derartige Verbindungen sind z. B. Dialdehyde wie Glutardialdehyd, Di-hydroxysuccinimidester, Diacetale, Bismaleinimide, bifunktionelle Iminoester wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipin-imidat, Diepoxide, Dicarbonsäurechloride, insbesondere <x,ß-ungesättigte Dicarbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diiso-thiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmässig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch längerkettig sein. Ein solches zweites Zwischenglied kann entfallen, wenn die Imin-chloridgruppe direkt mit einem heterobifunktionellen Reagens umgesetzt wird, dessen eine Funktion aus der primären Aminogruppe und die andere Funktion aus einer geschützten Funktion besteht, die in freier Form mit Proteinen reagieren kann, z. B. Acetal, sauer bzw. hydrogenolytisch bzw. schwach basisch verseifbare Ester, oder einer unreaktiven Vorstufe für eine solche Funktion wie z. B. Nitrii für Iminoester, Olefine zu Epoxiden und andere.

Die Umsetzung des Iminchorids mit der wenigstens eine Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Zwischenverbindung erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wenn die Zwischenverbindung (Spacer) nicht selbst flüssig ist, anderenfalls zweckmässig in der Zwischenverbindung selbst als flüssige Phase. Auch eine Umsetzung in wässrigem Medium ist möglich, da die primäre Aminogruppe rascher mit dem Iminchlorid reagiert als die OH-Gruppe. Ist die primäre Aminogruppe an eine Säureamidgruppe gebunden, handelt es sich also um ein Hydrazid, so wird in Lösungsmitteln wie Di-methylsulfoxid, Formamid und Dimethylformamid gearbeitet. Auch andere stark polare Lösungsmittel können in diesem Falle verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. die Fixierung biologisch aktiver Proteine an Trägermaterialien, die sich durch einen Gehalt von sekundären Amidgruppen im Molekül auszeichnen, in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften, insbesondere der Oberflächeneigenschaften dieser Trägermaterialien. Das Verfahren eignet sich sowohl zur direkten Kupplung der Proteine an die intermediär gebildeten Iminchloridgruppen als auch zur Kupplung der Proteine über Zwischenverbindungen (Spacern), die es erlauben, das Protein in einem gewissen Abstand zum eigentlichen Trägermolekül zu halten.

Die Bindung des Proteins an die freie Funktion der wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung kann, wie bereits erwähnt, direkt oder über ein weiteres bifunktionelles Proteinreagens erfolgen. Letzteres hat die Funktion eines Spacers, erhöht also den Abstand zwischen der eigentlichen Trägerverbindung und dem Protein in Fällen, wo dies gewünscht wird, oder wirkt als Proteinvernetzungsmittel, welches mehrere biologisch aktive Proteinmoleküle miteinander verbindet und die so erhaltenen vernetzten Proteinaggregate werden dann an den Träger fixiert. Diese Fixierung kann über das gleiche mehrfunktio-nelle Proteinreagens, über ein anderes mehrfunktionelles Proteinreagens oder direkt mit der zweiten zur Proteinbindung geeigneten Funktion der wenigstens eine primäre Aminogruppen enthaltenden bifunktionellen Verbindung erfolgen. Geeignete, mehrfunktionelle Proteinreagentien sind beispielsweise Glutardialdehyd, Bishydroxisuccinimidester und andere ähnliche Verbindungen, die dem Fachmann bekannt sind. Das mehrfunktionelle bzw. polyfunktionelle Proteinreagens kann zwei oder mehr mit dem Protein reagierende funktionelle Gruppen aufweisen. Geeignete Beispiele für derartige polyfunktionelle Proteinreagentien finden sich z. B. in den deutschen Offenlegungsschriften 22 37 083 und 19 15 970.

Letztere Ausführungsform der Erfindung wird in den Beispielen 11 und 13 erläutert. Gemäss Beispiel 11 wird das biologisch aktive Protein mit Succinimidester vernetzt und danach mittels Glutardialdehyd als bifunktionelles Proteinreagens an die freie Aminogruppe eines Diamins gebunden, welches zuvor mit der zweiten primären Aminogruppe zur Umsetzung mit der Iminchloridgruppe gebracht worden war. Da der Succinimidester etwa lOOfach reaktiver ist als der Glutardialdehyd, andererseits aber auch wesentlich teurer ist, kann auf diese Weise eine erhöhte Aktivitätsausbeute erzielt werden durch die Vernetzung, gleichzeitig aber mit dem billigen Glutardialdehyd die Bindung an das Polymer erfolgen. Die gleichzeitige Vernetzung und Fixierung mit einem einzigen polyfunktionellen Proteinreagens veranschaulicht Beispiel 13.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, eine Trägeroberfläche wie ein Gewebe, Fäden, Reagenzgläser oder andere beliebige gewünschte Oberflächen mit einer Klebeschicht zu versehen und nach dem Verfahren der elektrischen Beflockung Polyamidflocken oder -fasern und ergleichen aufzubringen. Die derartig hergestellte, grosse Oberfläche ergibt dann bei der Proteinfixierung gemäss Erfindung eine hohe spezifische Aktivität pro qcm des beflockten Trägers.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Beispiel 1 und 2

Je 2 Meter Nylon-6-Schlauch, Innendurchmesser 1 mm, werden mit absolutem Methanol und anschliessend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Dann wird der Schlauch auf — 40° C vorgekühlt und mit einer — 40° C kalten, 5%igen Lösung von PCls in CC14 gefüllt. Die exakte Einhaltung der Temperatur ist nicht kritisch, jedoch werden tiefe Temperaturen ab — 29° C bevorzugt. Die PCIs-Lösung wird nach 5 Stunden abgesaugt und mit trockenem CCI4 wird überschüssiges Reagens ausgespült. Dann wird Äthylendiamin (bzw. eine 2%ige Lösung von Oxalsäuredihydrazid in Dimethylsulfoxid) eingefüllt. Nach 2stündigem Stehen mit Amin (bzw. Hydrazid-Lösung) wird der Schlauch über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird

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der Schlauch mit absolutem Dioxan gespült, um Wasserreste zu entfernen, und eine Lösung von 50 mg Äthylenglykol-bis-propionsäure-bis-hydroxysuccinimidester in 2,5 ml Dioxan + 0,5ml N-Äthylmorpholin eingefüllt. Nach 30 Minuten wird die Lösung abgesaugt und mit 0,1 molarem Triäthanol-amin-Puffer, pH 8,5, gespült. Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucosedehydrogenase in 1 ml Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, eingefüllt und 3 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Danach wird mit 5 Liter 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, der einmolar an NaCl ist, gespült. Der Schlauch wei anschliessend eine Aktivität von 1,5 U/m (Aminschlauch) bzw. 1,6 U/m (Oxalsäurehydrazid-Schlauch) auf.

Beispiel 3

2 Meter Nylon-6-Schlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert. Bei der Enzymfixierung wird eine Lösung von 2 mg Glukoseoxidase in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und wie in Beispiel 1 anschliessend gespült. Wenn mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 1,5 U/m auf.

Beispiel 4

50 g Nylon-6-Granulat werden mit absolutem Methanol und anschliessend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Das auf — 40° C vorgekühlte Granulat wird mit einer — 40° C kalten, 5%>igen Lösung von PCls in CCk versetzt und gerührt. Nach 5 Stunden Rühren bei — 40° C wird abgesaugt und mit trockenem CCk überschüssiges Reagens ausgewaschen. Dann wird das Granulat mit einer 20%igen Lösung von Hexamethylendi-amin in CH3OH versetzt und nach 2 Stunden abgesaugt. Anschliessend wird das Granulat in eine Säule gefüllt und über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird das Granulat 12 Minuten mit einer 10%igen Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 molarem Boratpuffer, pH 8,5, gerührt. Anschliessend wird abgesaugt und mit 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 7,8, gespült. 10 g des aktivierten Granulats werden dann mit einer Lösung von 80 mg GOD in 40 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 7,8, versetzt und 3 Stunden bei 4° C gerührt. Das Granulat wird anschliessend in eine Säule gefüllt und mit 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 7,8, der einmolar an NaCl ist, gewaschen. Das Granulat weist anschliessend eine Aktivität von 240 U/g auf.

Beispiel 7

5 g Nylon-6-Granulat werden in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff suspendiert. Dann wird bei Raumtemperatur 25 Minu-5 ten lang Phosgen durch die Suspension durchgeperlt, anschliessend das Nylongranulat mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und das erhaltene Nylonpolyiminchlorid mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, versetzt. Das Granulat weist nach Wa-10 sehen, wie in Beispiel 4, eine Aktivität von 50 U/g auf.

Beispiel 8

In 40 ml Benzol, die 8,4 g PCls gelöst enthalten, werden 10 g Polyamid-6-Pulver unter Kühlung zugegeben und über 15 Nacht bei 4° C gehalten. Dann wird ohne Isolierung des reaktiven Iminehlorid-Zwischenproduktes in den gleichen Ansatz eine Lösung von 2,4 g Hexamethylendiamin in 20 ml Benzol zugegeben und der Ansatz für 2 Stunden am Rück-fluss gehalten. Danach wird abgesaugt, mit Äthanol nachge-20 waschen und nach kurzem Waschen mit destilliertem Wass.er werden 0,5 g des aktivierten Derivates zu 1 ml einer Lösung von 20 mg Glucoseoxidase in 1 ml M Phosphat-Puffer, pH 7,8, zugegeben. Nach Stehen über Nacht bei 4° C wird mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, der 1 M an NaCl ist, ge-25 waschen. Bei dem fixierten Glucoseoxidase-Nylonderivat wird eine Aktivität von 41 U/g, entsprechend 25 U/ml Schüttvolumen festgestellt.

Beispiel 9

30 10 g Polyamid-6-Pulver werden wie in Beispiel 8 mit PCIs-Lösung und anschliessend mit Hexamethylendiamin-Lö-sung umgesetzt. Zur Freisetzung der zweiten Aminogruppe des ankondensierten Diamins wird kurz mit 0,5 N NaOH nachgewaschen, das Produkt von Hydroxylionen freigewa-35 sehen und danach 15 Minuten mit einer 10%>igen Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH 8,5, ver- setzt. Nach weiterem Waschen mit destilliertem Wasser werden 5 g des aktivierten Nylonproduktes mit 5 ml einer Lösung von 20 mg Glucoseoxidase/ml 0,1 M Phosphat-Puffer, 40 pH 7,8, versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4° C wird abgesaugt und mit 0,1 m Phosphat-Puffer, pH 7,8, der 1 M an NaCl ist, gewaschen. Die Aktivität der fixierten Glucoseoxidase beträgt 78 U/g entsprechend 48 U/ml Schüttvolumen.

Beispiel 5 45

2 Meter Nylonschlauch, Innendurchmesser 1 mm, wurden auf — 30° C gekühlt und mit einer — 30° C kalten, 10-°/oigen Lösung von PCls in CCk gefüllt. Nach 5 Stunden wird mit trockenem Methylenchlorid gespült und sofort anschliessend eine wässrige Lösung von Glucoseoxidase mit ei- 50 ner Konzentration von 5 mg GOD/ml 0,3molarem TRA-Puffer, pH 8,0, eingefüllt. Nach 3 Stunden bei 4° C wird der Schlauch mit einer lmolaren Lösung von NaCl in 0,lmola-rem Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Die Aktivität des so hergestellten GOD-Schlauches liegt bei 0,15 U/m, wenn mit 55 einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute getestet wird.

Beispiel 6

2 Meter Nylonschlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert. 6Q Als Spacer wird Bernsteinsäurehydrazid (0,3-proz.-Lösung in Dimethylsulfoxid) und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet. Zur Fixierung wird eine Lösung von 2 mg Glycerokinase in 1 ml Phosphatpuffer, pH 7,8, verwendet und anschliessend, wie in Beispiel 1, gespült. Wenn 65 mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 0,4 U/m auf.

Beispiel 10

30 g Nylon-6 werden in 100 ml Ameisensäure gelöst. 10 g Tonpartikel mit einem Durchmesser von 0,315 bis 0,400 mm werden mit dieser Lösung versetzt, so dass die Poren der Partikel mit der Nylonlösung gefüllt sind, aber noch diskrete Einzelpartikel vorliegen. Nach Abziehen der Ameisensäure im Vakuum wird mit Natriumhydrogencarbónat gewaschen, mit destilliertem Wasser neutral gewaschen und das getrocknete Produkt wie in Beispiel 9 mit PCIs-Lösung und Hexa-methylendiamin-Lösung umgesetzt, kurz mit 0,5 N NaOH gewaschen, neutràlgewaschen und danach mit einer 5°/oigen Lösung eines Copolymeren aus Acrylsäure-hydroxysuccin-imidester und Aerylamid bei pH 7,8 4 Stunden umgesetzt. Ein Entgasen der Partikel ergibt eine bessere Umsetzung mit dem gelösten Copolymer. Danach wird mit destilliertem Wasser gewaschen und 1 g der Tonpartikel mit 2 ml einer Lösung von 5 mg Glucoseoxidase/ml 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,8 versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4° C wird abgesaugt und mit Phosphat-Puffer pH 7,0, der 0,1 M an NaCl ist, gewaschen. Die Partikel weisen eine Aktivität von 14 U/g entsprechend 15 U/ml Schüttvolumen auf.

Beispiel 11

In einem Gemisch aus 18,6 g CaCk und 18,6 g H2O +

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63 g Methanol und 1 bis 1000 Teilen Ameisensäure wird Polyamid bei erhöhter Temperatur von 30 bis 80° C gelöst und heiss in 2 m lange Nylon-6-Schläuche eingefüllt und danach sofort mit kaltem Wasser nachgespült. An der inneren Oberfläche des Schlauches bleibt eine Schicht amorphes, reaktionsfähigeres Nylon zurück. Der Schlauch wird mit getrocknetem Methanol wasserfrei gespült und mit einer 5°/o-igen Lösung von PCls in CHCk bei 4° C über Nacht stehen gelassen. Danach wird eine 20°/oige Lösung von Hexamethy-lendiamin in Methanol eingefüllt und nach einer Stunde wird mit 5 Litern destilliertem Wasser gewaschen. Dann wird eine 10°/oige Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer pH 8,5 eingefüllt und nach 15 Minuten mit 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,8 gewaschen. In der Zwischenzeit werden 372 mg Glucoseoxidase in 4,5 ml 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,8 gelöst und mit 6,4 mg Äthylenglycol-bis-propionsäure-bis-hydroxysuccinimidester in 0,5 ml Dioxan versetzt und über Nacht bei 4° C stehen gelassen. Diese Glucoseoxidase-Lö-sung wird 1,4 verdünnt und das vernetzte Glucoseoxidase-Produkt in die Nylonschläuche eingefüllt. Nach dem Waschen der Schläuche mit 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0, der 1 M an NaCl ist, werden 50 cm lange Stücke mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute getestet. Unter diesen Testbedingungen ergeben sich Aktivitäten von 5; 7,5 und 9 U/m (in 3 Ansätzen).

Beispiel 12

5 Ein TygonR-Schlauch wird kurz mit Cyclohexanon angelöst. Dann wird eine nach Beispiel 11 hergestellte Nylon-Lösung eingefüllt und wie in Beispiel 11 vorgegangen. Bei dem Test ergibt sich eine Aktivität von 3 U/m.

10 Beispiel 13

Ein Nylonschlauch wird wie in Beispiel 11 mit einer Nylon-Lösung sowie anschliessend mit PCIs-Lösung und Hexamethylendiamin-Lösung behandelt. Nach dem Waschen mit 5 Liter destilliertem Wasser analog zu Beispiel 11 wird

15 eine 5°/oige Lösung eines Copolymeren aus Methacrylsäure-hydroxisuccinimidester und Methacrylamid bei pH 7,8 eingefüllt. Nach 4 Stunden wird mit destilliertem Wasser gewaschen und eine Lösung von 2 mg Glucoseoxidase/ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8 eingefüllt und über Nacht bei 4° C stehen gelassen. Nach Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0, der 1 M an NaCl ist, ergibt sich beim Testen von 50 cm-Stücken bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute eine Aktivität von 2,4 U/m.

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Claims (10)

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1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Amidgruppen bei Temperaturen zwischen —80 und 50° C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Amidgruppen in Iminchloridgruppen der Formel I

R ~ C = N - FL

I 1 (i),

Cl worin R und Ri aliphatische, aromatische oder aliphatisch-aromatische Reste darstellen, und das so erhaltene Produkt a) in wässrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird; oder b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung umgesetzt wird und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der Formel II

R - C ='N - Rx

I (II),

NH - R2 - X

worin R2 eine Alkylengruppe, eine «,a>-DioxiaIkylengruppe oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung geeignete Funktion bedeutet, entweder direkt mit dem Protein oder zuerst mit wenigstens einem bifunktionellen oder polyfunktionellen Proteinreagens und danach mit dem Protein oder mit dem Reaktionsprodukt des Proteins mit dem Proteinreagens zur Reaktion gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspructh 1, dadurch gekennzeichnet, dass feste Polymere als Trägermaterialien verwendet werden.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial Polyamide verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Protein als Träger verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Chlorierungsmittel PCls, PCI3, SOCI2, COCI2, POCI3 oder SO2CI2 verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R und Ri sekundäre Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Aminchlorid-gruppen enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R und Ri geradkettige, verzweigte und/oder cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 bis 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenyl-gruppen bzw. Alkylphenylgruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe darstellen, die miteinander durch eine oder mehrere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Acetalgruppe, Estergruppe, Nitrilgruppe oder Olefingruppe darstellt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das bifunktionelle Proteinreagens ein Dialdehyd, Dihydr-oxysuccinimidester, Diacetal, Bismaleinimid, bifunktioneller Iminoester, Diepoxid und/oder Dicarbonsäure, Dichlorid, Diisocyanat und/oder Diisothiocyanat ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Trägermaterial verwendet wird, welches eine mit Polyamidfasern oder -flocken beflockte Oberfläche aufweist.