HU176482B - Process for the immobilization of proteins on carriers - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás proteinek — különösen biológiailag aktív proteinek — rögzítésére folyékony vagy szilárd hordozóanyagokon.

Az antigén-antitest és Hapten-antitest reakciókban résztvenni képes anyagok, koaguláló faktorok és hasonló, biológiailag aktív proteinek, mint enzimek, hormonok rögzítése, illetve helyhez kötése — különösen a preparatív és analitikai kémiában — az utóbbi években nagy, jelentőségűvé vált. Eddig számos rögzítési eljárást fejlesztettek ki. így például polimer hordozóhoz kötött biológiailag aktív fehérjék előállítását ismerteti a 169 972 sz. magyar szabadalmi leírás. A számos ismert megoldás ellenére azonban újabb és újabb olyan rögzítési problémák vetődnek fel, amelyek az eddig ismert módszerekkel megnyugtatóan nem oldhatók meg. Erre vezethető vissza az is, hogy dacára a biológiailag aktív vegyületek hordozóanyagokra történő rögzítése minden további nélkül belátható előnyeinek, a rögzített proteinek gyakorlati bevezetése sok területen nagyon késlekedik és a várt széleskörű alkalmazás még nem vált valóra.

Ehhez járul, hogy a legtöbb rögzítési módszer csak meghatározott hordozóanyagokra használható, vagy a hordozóanyag előállításához a biológiailag aktív protein jelenlétében vizes oldatban végzett polimerizációra (protein-kopolimerizációra) van szükség, ami az alkalmas hordozóanyagok körét szintén nagy mértékben korlátozza.

Különösen alkalmas hordozóanyagok lennének aktív proteinek rögzítésére az olyan anyagok, amelyek sze kunder aminocsoportokat tartalmaznak. Ezek közé tartoznak egyfelől olyan polimerek, amelyek különösen előnyös mechanikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, mint a poliamidok, poliuretánok és egyéb polipeptid-szerű szerkezettel rendelkező vegyületek, mint poliaminosavak és hasonlók. Az ilyen, szekunder aminocsoportokat tartalmazó anyagok bizonyos kémiai hasonlóságot mutatnak a protein szerkezettel, különösen a töltéselosztás tekintetében. Ennek az a következménye, hogy az ilyen vegyületekhez rögzített enzimek biológiai aktivitására nem hatnak negatív tényezők, feltéve, hogy nincsenek jelen e vegyületekben olyan egyéb csoportok, amelyek a proteinek aktivitására különösen hátrányos hatást gyakorolnak.

Ismeretes, hogy az imidoészterek — amelyek szekunder aminokból könnyen eiőállíthatók — a proteinek aminocsoportjaival specifikusan amidino-szerkezetek képződése közben reagálnak (lásd például ColowickKaplan „Methods in Enzymology” 25. köt. 646—648. old.). Az is ismeretes, hogy a poliamidok erős alkilezőszerekkel a poliiminoészterekké alakíthatók (3 340 210 számú amerikai szabadalmi leírás). A protein-rögzítés szempontjából az ilyen iminoésztereknek egy jelentős hátránya, hogy oldószerekben oldhatók, vagy legalábbis duzzadnak. Ez azzal jár, hogy e polimerek ragacsosak, és granulátum, fólia, tömlő vagy egyéb formatest alakjában való kezelésük nehézkes vagy éppenséggel lehetetlen.

A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi biológiailag aktív proteinek legalább két szekunder aminocsoportot tartalmazó anyagokhoz történő rögzítését anélkül, hogy e biológiailag aktív proteinek aktivitása csökkenne, illetve a fentiekben említett eljárások hátrányai jelentkeznének.

Ezt a feladatot a találmány szerint biológiailag aktív proteinek rögzítésére szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyet az jellemez, hogy 7000—120 000 molekulasúlyú poliamidhordozót — vagy az említett poliamiddal bevont egyéb hordozót — 80 és 50 C° közötti hőmérsékleten szervetlen klórozó-szerrel klórozunk, ily módon a szekunder aminocsoportokat I általános képletű — mely képletben R és R₁ jelentése 1—12 szénatomos egyenes, elágazó szénláncú és/vagy ciklikus alkilcsoport, illetve alkiléncsoport, fenilcsoport, illetve feniléncsoport vagy alkilfenilcsoport, illetve alkilénfeniléncsoport, ahol az alkilcsoport legfeljebb 6 szénatomos, amelyek egymáshoz egy vagy több szekunder vagy tercier aminocsoporton, észtercsoporton, amidcsoporton vagy iminkloridcsoporton keresztül kapcsolódnak, vagy természetes és/vagy szintetikus aminosavakból álló peptidláncok — iminklorid-csoport tartalmú vegyületté alakítjuk át, és az így kapott terméket

a) vizes oldatban közvetlenül reagáltatjuk valamely biológiailag aktív proteinnel, vagy

b) valamely, legalább egy primer aminocsoportot vagy hidrazidcsoportot tartalmazó, ismert bifunkciós vegyület — amelynek másik funkciós csoportja amino-, hidrazid-, acetál-, észter-, nitril- vagy olefincsoportból áll — egy mólos feleslegével reagáltatjuk, adott esetben vizes vagy szerves oldószerben, majd az így kapott, II általános képletű — mely képletben R₂ jelentése alkilén-, α,ω-dioxi-alkilén- vagy 2—8 szénatomos dikarbonsavamidcsoport és X jelentése primer amino-, hidrazid-,acetál-, észter-, nitril-vagy olefincsoport —csoportokat tartalmazó terméket vagy közvetlenül a proteinnel vagy először legalább egy ismert bifunkciós vagy polifunkciós protein-reagenssel — így dialdehiddel, diacetállal, bisz-maleinimiddel, bisz-iminoészterrel, diepoxiddal, dikarbonsavkloriddal, diizocianáttal vagy diizotiocianáttal-, majd ezután a proteinnel vagy a proteinnek a protein-reagenssel képezett reakciótermékével reagáltatjuk, emellett adott esetben olyan hordozóanyagot alkalmazunk, amelynek felülete poliamid rostokkal vagy -pelyhekkel bevont.

A találmány szerinti eljárásban az iminklórozási reakciót előnyösen folyékony vagy szilárd polimerrel, előnyösen nylonnal vagy perionnal és hasonlókkal hajtjuk végre. További alkalmas, szekunder aminocsoport tartalmú polimerek a poliuretánok.

Szilárd halmazállapotú polimerek esetében célszerű a polimert oldott állapotban reagáltatni. E célra alkalmasak a szakember számára ismert, szokásos oldószerek. Ha a szekunder aminocsoporttartalmú polimer szilárd halmazállapotban van, úgy reagáltatható por, vagy valamely formatest, például cső alakban. Ha a formatest felülete aránylag kicsiny a tömegéhez képest, akkor célszerű a reagáltatandó felületet aktiválni. Az aktiválás előnyösen úgy végezhető, hogy a felületre finomeloszlású polimert csapunk ki oldatából. így a poliamidokat, például nylont alkalmas oldószerben oldjuk, és finomeloszlású amorf és így reakcióképesebb alakban csapjuk ki a műanyag formatest felületére.

Hasonló módon arra is lehetőség van, hogy olyan formatestekre, amelyek szekunder aminocsoportokat nem tartalmazó polimerekből készültek, szekunder ami nocsoportokat tartalmazó polimerekből bevonatokat hordjunk fel. Ez előnyösen szintén a polimer oldatból végzett kicsapásával történhet. Arra is lehetőség van, hogy a szokásos bevonat-képzési módszerekkel, ráextrudálással, folyadék halmazállapotban végzett felhordással, ráolvasztással, fólia-felhordással és hasonló módszerekkel járjunk el.

A találmány szerinti eljárásban nemcsak polimerek, hanem általában minden, protein-hordozóanyagként számításba vehető, több szekunder aminocsoportot tartalmazó vegyület is felhasználható, így például a peptidek is.

Az iminklorid előállítására előnyösen használható klórozószer a PC1₅. Egyéb alkalmas klórozószerek például a PC1₃, SOC1₂, COCl₂. POC1₃ és SO₂C1₂. A két utóbbi anyag ugyan nem olyan reakcióképes mint a PC1₅, de a PCl₅-dal szemben előnyük, hogy folyékony halmazállapotúak, és ezért oldószer alkalmazása nélkül használhatók. Ha a klórozást PCI₅-dal végezzük, akkor oldószer alkalmazása szükséges. Alkalmas oldószerek a halogénezett oldószerek, mint diklóretán, metilénklorid, kloroform, széntetraklorid és hasonlók. Különösen előelőnyösen kivitelezhető az iminklorid előállítása PC1₅dal diklóretánban —38 és 0 C° közötti hőmérsékleten. Ezek az előnyös reakciókörülmények úgy biztosíthatók, hogy a diklóretános (vagy egyéb halogénezett oldószeres) oldathoz szárazjeget keverünk. Természetesen egyéb hűtési módszerek is alkalmazhatók.

A reakció befejeződése után, a diamin hozzáadása előtt a klórozószer-fölösleget eltávolítjuk. Alternatív módon azonban az is lehetséges, hogy a klórozószer fölöslegének előzetes eltávolítása nélkül, a klórozást közvetlenül követően a reakcióelegyhez adjuk a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó bifunkciós vegyületet, amennyiben az nem kapcsolódik közvetlenül a biológiailag aktív proteinhez. Abban az esetben, ha a klórozószert a bifunkciós vegyület hozzáadása előtt nem távolítjuk el, akkor a klórozószer fölöslege a bifunkciós vegyülettel reagálhat. Ha bifunkciós vegyületként például valamely diamint használunk, akkor a halogénezőszer fölöslege a második szabad aminocsoporttal reagálhat. Ha egy ilyen közbenső terméket ezután a proteinnel reagáltatunk, akkor a proteinnel a klórozószerfölöslegnek a bifunkciós vegyület szabad funkcionális csoportjaival végbement reakciója következtében képződött csoportok is reagálhatnak. Ha például klórozószerként foszforpentakloridot használunk, és az iminklorid-képzés után ennek fölöslegét nem távolítjuk el, akkor az enzim a diamin szabad aminocsoportjaivál kondenzált foszforsavklorid csoportokon keresztül kötődhet meg. Megállapítottuk, hogy a protein rögzítés során ilyen körülmények között is nagy kitermelés érhető el a biológiai aktivitás tekintetében (lásd 8. kiviteli példa).

Tipikus olyan vegyületek, melyek a találmány szerinti eljárással iminkloridcsoportok képződésén át biológiailag aktív proteinekhez kapcsolhatók, a 6-poliamid,

6,6-poliamid, 6,10-poliamid, 11-poliamid, 12-poliamid, poli-ciklikus amidok, mint a poii(l,4-ciklohexiléndimetilénszuperamid), polidodekanollaktám, gyapjú, kazein, természetes selyem, poliargínin és hasonlók. A szintetikus polimerek közül előnyösen azok használhatók, amelyekben R és Rj jelentése olyan 6—12 szénatomos alkilén- és cikloalkiléncsoport, amelyeket amidcsoportok kötnek össze.

A találmány szerinti eljárással az iminklorid vizes oldatban közvetlenül reagáltatható a biológiailag aktív proteinnel. Ez esetben célszerűen úgy járunk el, hogy a biológiailag aktív proteint alkalmas vizes pufferoldatban oldjuk, hozzáadjuk a szilárd iminkloridot, és a reagenseket hagyjuk lereagálni. Ez a módszer főként akkor ajánlatos, ha az imin elágazott-szerkezetű, például 3,4, vagy még több funkciót tartalmazó poliamid. Az ilyen esetben fellépő szterikus viszonyok között az iminklorid és a protein közötti direkt reakció serkentett. Ezzel szemben nyíltszénláncú polimerek esetében a reakció a proteinnel célszerűen valamely, legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó közbenső vegyületen („spacer”) keresztül végezhető.

A primer aminocsoport közvetlenül kapcsolódhat szénatomhoz vagy hidrazincsoportban, vagyis savamidcsoporthoz kötötten lehet jelen. Abban az esetben, ha két aminocsoport van jelen, akkor a két aminocsoportot egymástól előnyösen 2—-8 szénatomos α,ω-dioxialkilénvagy dikarbonsavamidcsoportnak kell elválasztania.

Ha diamid helyett monoamidot használunk, akkor ez egy további funkcionális csoportot, előnyösen egy proteinnel képezett kötés kialakítására alkalmas csoportot tartalmaz. A közbenső vegyület e második csoportja — attól függetlenül, hogy primer aminocsoportról vagy egyéb csoportról van szó — ismét reagálható egy bifunkciós protein-reagenssel, mielőtt még a protein végleges megkötése megtörténne. Ilyen vegyületek például a dialdehidek, mint glutáraldehid, dihidroszukcinimidészter, diacetálok, bisz-maleinimidek, bifunkciós iminoészterek, mint dietilmalonimidát, dimetiladipinimidát, diepoxidok, dikarbonsavkloridok, különösen a, β-telítetlen dikarbonsavdikloridok, diizocianátok, diizotiocianátok és hasonlók. E vegyületek célszerűen 2—-12 szénatomosak, de hosszabb szénláncúak is lehetnek. Elhagyható ez a második közbenső vegyület, ha az iminoklorid csoportot olyan heterobifunkciós reagenssel reagáltatjuk közvetlenül, amelynek egyik funkciója a polimer aminocsoportból, másik funkciója pedig olyan védett csoportból áll, amely szabad alakjában képes proteinnel reagálni, mint például acetálcsoport; savasan, hidrogenolízissel vagy enyhén bázikusan elszappanosítható észtercsoport; vagy ilyen csoport kialakítására alkalmas csoport, mint nitrilcsoport iminoésztercsoport esetében, olefin epoxidcsoport esetében; és egyéb csoportok.

Ha maga a közbenső vegyület nem folyékony, akkor az iminklorid reakcióját a legalább egy aminocsoportot tartalmazó bifunkcionális közbenső vegyülettel valamely szerves oldószerben végezzük. Az ellenkező esetben a közbenső vegyület szolgál folyékony fázisként. A reakció vizes közegben is végezhető, mert a primer aminocsoport gyorsabban reagál az iminkloriddal, mint az OH-csoport. Ha a primer aminocsoport savamid csoporthoz kötött, vagyis valamely hidrazidról van szó, akkor dimetilszulfoxid, formamid vagy dimetilformamid oldószerben hajtjuk végre a reakciót. Egyéb, erősen poláros oldószerek is alkalmazhatók ebben az esetben.

A találmány szerinti eljárás biológiailag aktív proteinek olyan hordozóanyagokra történő lekötését és rögzítését teszi lehetővé, amelyek molekulájukban szekunder aminocsoportot tartalmaznak. A rögzítés kíméletes módon, az előnyös tulajdonságok — különösen a hordozóanyag felületi tulajdonságainak — megtartása mellett történik. Az eljárás alkalmas mind a proteineknek az intermedier képződött iminkloridcsoportokhoz, mind azok közbenső vegyületeken (spacerek) keresztül történő kapcsolására, mely utóbbi esetben a közbenső 5 vegyületek a proteint bizonyos távolságban tartják a tulajdonképpeni hordozóanyagtól.

A proteinnek a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó bifunkciós vegyület szabad funkciójához kötése — mint már említettük — történhet közvetlenül, 10 vagy egy további bifunkciós proteinreagensen keresztül. A proteinreagensnek „spacer” szerepe van, vagyis növeli a hordozóanyag és a protein közötti távolságot, ahol ez kívánatos, vagy pedig protein-térhálósítószerként hat, amely több biológiailag aktív proteinmolekulát köt 15 össze egymással, és az így kapott térhálós protein-aggregátumokat rögzítjük azután a hordozóra. Ez a rögzítés történhet ugyanazon többfunkciós proteinreagensen, egy másik proteinreagensen keresztül, vagy történhet a legalább egy primer aminocsoportot tartalmazó több 20 funkciós vegyület második, proteinkötésre alkalmas funkciójával közvetlenül. Alkalmas, többfunkciós proteinreagensek például a glutárdialdehid, bisz-hidroxiszukcinimidészter és más, a szakember számára ismeretes vegyületek. A többfunkciós, ill. polifunkciós reagens25 nek két vagy több proteinnel reagáló funkcionális csoportja lehet. Alkalmas ilyen polifunkciós proteinreagenseket neveznek meg például a 2 237 083 és 1 915 970 számú német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratok.

A találmány szerinti eljárás utóbbi foganatosítási módját a 11. és 13. példák szemléltetik. A 11. kiviteli példa szerint a biológiailag aktív proteint szukcinimidészterrel térhálósítjuk, és ezután glutárdialdehiddel mint bifunkciós proteinreagenssel egy olyan diamin szabad aminocsoportjához kapcsoljuk, amelynek második primer aminocsoportját előzetesen az iminoklorid-csoporttal reagáltattuk. Mivel a szukcinimidészter kb. 100szor reakcióképesebb, mint a glutárdialdehid, másrészt viszont sokkal drágább is, ezért ily módon a térhálósítással nagyobb aktivitási-kitermelés érhető el, ugyanakkor azonban az olcsóbb glutárdialdehiddel végrehajtható egyidejűén a polimerre történő kötés. Egyetlen polifunkciós proteinreagenssel végzett egyidejű térhálósítást és rögzítést szemléltet a 13. kiviteli példa.

A találmány szerinti eljárás egy további foganatosítási módja abban áll, hogy valamely hordozóanyag, mint szövedék, szálak, kémcsövek, vagy egyéb kívánt hordozóanyag felületére ragasztóréteget viszünk fel, majd arra elektromos úton poliamidport, -pelyhet és hasonlókat hordunk fel. Az ily módon előállított nagy felület azután a proteinrögzítés találmány szerinti eljárásával a porral bevont hordozónak nagy fajlagos aktivitást kölcsönöz.

A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példák világítják meg.

1. és 2. példa

2—2 m hosszú, 1 mm belső átmérőjű nylon-6 csövet előbb abszolút metanollal, majd abszolút metilénkloriddal a nedvességnyomok eltávolítása végett kiöblítettünk. Ezután a csöveket —40 C°-ra lehűtöttük, és megtöltöttük PC1₅ 5%-os, CCI4-0S —40 C°-os oldatával. A hö fok pontos betartása nem kritikus paraméter, de —20 C-pál alacsonyabb hőfok előnyös. A PCl₅-oldatot 5 óra eltelte után leszivattuk, és a reagens fölöslegét vízmentes CCl₄-dal végzett öblítéssel távolítottuk el. Ezután az egyik csőbe etiléndiamint, a másikba oxálsavdihidrazid 2%-os dimetilszulfoxidos oldatát töltöttük. 2 órás állás után a csöveket egy éjszakán át vízzel öblítettük. Ezután a maradék víz eltávolítása végett a csöveket abszolút dioxánnal öblítettük, és 50 mg etilénglikol-bisz-propionsav-bisz-hidroxiszukcinimidészter 2,5 ml dioxánnal és 0,5 ml N-etilmorfolinnal készült oldatát töltöttük beléjük. 30 perc.múlva az oldatot leszívattuk, és a csöveket 0,1 mólos, 8,5 pH-jú, trietanolaminnal öblítettük. Ezután 2 mg glukóz-dehidrogenáz 1 ml 8,5 pH-jú trietanolamin-pufferral készült oldatát töltöttük beléjük, és a csöveket ezzel az oldattal 3 órán át 4 C^e-on állni hagytuk. Ezt követően 5 liter, NaCl-raegy mólos, 0,1 mólos, 8,5 pHjú trietanolamin-pufferral öblítettük ki őket. Az etiléndiaminnaL kezelt cső 1,5 U/m, az oxálsavhidrazjddal kezelt cső 1,6 U/m aktivitást mutatott.

3. példa

Két méteres nylon-6, csövet az 1. kiviteli példában leírt módón- aktiváltunk. Az enzimrögzítésnél 2 mg GOD. 1 ml 7,8 pH-jú foszfát-pufferral készült oldatát használtuk, majd a csövet az 1. kiviteli példában leírt módon öblítettük. 7 ml/perc átfolyási sebességnél vizsgálva a cső 1,5 U/m aktivitást mutatott.

4. példa >

g nylon-6 granulátumot abszolút metanollal, majd abszojút metilénkloriddal öblítettünk a nedvességnyomok eltávolítása céljából. A — 40Q^c-ra hűtött granulátumot —40 C -os, 5%-os CCl₄-os PC1₅ oldattal öntöttük le, és kevertük. 5 órás, —40 C°-on végzett keverés után leszivattuk, és a reagens fölöslegét vízmentes CCl₄-dal mostuk ki. Ezután a granulátumhoz hexametiléndiamin 20%-os CH₃OH-os oldatát adtuk, és 2 óra múlva az oldatot leszivattuk. Ezután a granulátumot egy oszlopba töltöttük, és éjszakán át vízzel öblítettük. Ezt követően a granulátumot 12 percig 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készített 10%-os glutárdialdehid oldattal kevertük. Az oldatot leszivattuk, a granulátumot 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpuíferral öblítettük. Az aktivált granulátum 10 g-jához ezután 80 mg GOD 40 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpuíferral készített oldatát adtuk, és abban 3 órán át 4 C°-on kevertük. A granulátumot ezután oszlopba töltöttük, és 0,1 mólos,

7,8 pH-jú foszfátpuíferral, amejy NaCl-ra 1 mólos volt, mostuk. A granulátum ezután 240 U/g aktivitást mutatott.

5. példa

Két méter hosszú, 1 mm belső átmérőjű nyloncsövet — 30 C°-ra hütöttünk, és —30 C°-os, 10%-os, CCl₄-os PClj-oldattal töltöttünk meg. 5 óra múlva vízmentes metilénkloriddal öblítettük, és ezután azonnal 5 ml GOD/ml koncentrációjú, 0,3 mólos, 8,0 pH-jú TRA pufferral készült glukózoxidáz-oldatot töltöttünk belé.

órán át 4 C°-on tartottuk a csövet, majd NaCl-ra 1 mólos, 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpuíferral öblítettük. Az így előállított GOD-csö aktivitása 7 ml/perc átfolyási sebességgel vizsgálva 0,15 U/m volt.

6. példa

Két méteres nyloncsövet az 1. kiviteli példában leírt módon aktiváltunk. „Spacer”-ként 0,3%-os, dimetil10 szulfoxidos borostyánkősav-hidrazidot, bifunkciós protein-reagensként pedig glutárdialdehidet használtunk. A rögzítéshez 2 mg glicerokinaze 1 ml 7,8 pH-jú foszfátpufferral készített oldatát használtuk, majd a csövet az

1. kiviteli példában leírt módon öblítettük. A cső 15 7 ml/perc átfolyási sebességgel vizsgálva 0,4 U/m aktivitást mutatott.

7. példa g nylon-6 granulátumot 20 ml széntetrakloridban szuszpendáltunk. Ezután szobahőmérsékleten 25 percen át foszgént buborékoltattunk át a szuszpenzión, mqjd a nylon-granulátumot széntetrakloriddal mostuk, és a 25 kapott nylon-poliiminkloridhoz 10 mg glukózoxidáz 10 ml, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpuíferral készült oldatát adtuk. A granulátum a 4. kiviteli példában leírt módon végzett mosás után 50 U/g aktivitást mutatott.

8. példa

8,4 g PC1₅ 40 ml benzollal készült oldatához keverés közben 10 g poliamid-6 port adtunk, és egy éjszakán át 35 4 C°-on tartottuk az elegyet. Ezután a reaktív iminklorid közbenső termék elválasztása nélkül a reakcióelegyhez 20 ml benzolban oldott 2,4 g hexametiléndiamint adtunk, és azt 2 órán át visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraltuk. Ezt követően a reakcióelegyet leszűr40 tűk, etanollal mostuk, majd rövid vizes desztillált mosás után az aktivált származék 0,5 g-ját 1 ml olyan oldathoz adtuk, amelyet 20 mg glukózoxidázból 1 ml 0,1 mólos,

7,8 pH-jú foszfátpuíferral készítettünk. Éjszakán át

C°-on állni hagytuk, majd NaCl-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 45 0,1 mólos foszfátpufferral mostuk. A rögzített glukózoxi- dáz-nylonszármazék aktivitása 41 U/g volt, ami 25 U/ml aktivitásnak felelt meg.

9. példa

A 8. kiviteli példában leírt módon 10 g poliamid-6 port PCl₅-dal, majd ezt követően hexametiiéndiamin-oldattal reagáltattunk. A kondenzált diamin második 55 aminocsoportjának szabaddá tétele után 0,5 n NaOH-n gyorsan átmostuk, a terméket hidroxilion-mentesre mostuk, majd 15 perc múlva glutárdialdehid 0,2 mólos,

8,5 pH-jú borát pufferral készült 10%-os oldatát adtuk hozzá. További desztillált vizes mosás után az aktivált 60 nylon-termék 5 g-jához 20 mg glukózoxidáz 0,1 mólos,

7,8 pH-jú foszfát pufferral készült 5 ml oldatát adtuk hozzá. Éjszakán át állni hagytuk 4 C°-on, leszivattuk, és NaCl-ra 1 mólos, 7,8 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpuíferral mostuk. A rögzített glukózoxidáz aktivitása 78 U/g 65 volt, ami 48 U/ml-nek felelt meg.

10. példa

13. példa g nylon-6-ot 100 ml hangyasavban oldottunk. Ehhez az oldathoz 10 g 0,315—0,400 mm szemcseméretű 5 (égetett) agyagot adtunk. A részecskék pórusai ily módon megteltek a nylon-oldattal, de a részecskék még különállóak voltak (nem tapadtak össze). A hangyasav vákuummal végzett leszívatása után nátriumhidrogénkarbonát oldattal, majd desztillált vízzel semlegesre 10 mostuk, a megszárított terméket a 9. kiviteli példában leírt módon PCl₅-oldattal és hexametiléndiamin-oldattal reagáltattuk, gyorsan 0,5 n NaOH-oldattal, majd semlegesre mostuk, végül akrilsav-hidroxiszukcinimidészter és akrilamid kopolimerének 5%-os oldatával 7,8 pH-n 15 4 órán át reagáltattuk. Ezt követően desztillált vízzel mostuk, és az agyagrészecskék 1 g-jához 2 ml olyan oldatot adtunk, amely 5 mg glukózoxidázt tartalmazott 1 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferre számítva. Éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk, leszívattuk, és NaCl- 20 ra 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpufferral mostuk. A részecskék 14 U/g aktivitást, térfogatra számítva 15 U/ml aktivitást mutattak.

11. példa

18,6 g CaCl₂, 16,8 g víz, 63 g metanol és 1—1000 rész 30 hangyasav elegyében 30—80 C° hőmérsékleten poliamidot oldottunk, és azt még melegen 2 m hosszú nylon-6 csövekbe töltöttük, majd ezután azokat hideg vízzel azonnal átöblítettük. A csövek belső falán amorf, reakcióképes nylon-réteg maradt vissza. A csöveket 35 metanollal vízmentesre öblítettük, és PCI₅ 5%-os kloroformos oldatával 4 C°-on éjszakán át állni hagytuk. Ezután hexametiléndiamin 20%-os metanolos oldatát töltöttük beléjük, és 1 órás állás után 5 liter desztillált vízzel mostuk ki őket. Ezt követően glutárdialdehid 40 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os oldatát töltöttük beléjük, majd 15 perc múlva 0,1 mólos,

7,8 pH-jú foszfátpufferral mostuk őket. Időközben 372 mg glukózoxidázt 4,5 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferban oldottunk, és 6,4 mg etilénglikol-bisz- 45 -propionsav-bisz-hidroxiszukcinimidészter 0,5 ml dioxánnal készült oldatát adtuk hozzá, majd éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk az elegyet. Ezt a glukózoxidáz-oldatot 1 :4 arányban hígítottuk, és a térhálósított glukózoxidáz-terméket a csövekbe töltöttük. A csövek 50 NaCl-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral végzett mosása után 50 cm-es csodarabokon 7 ml/perc áramlási sebességgel vizsgáltuk az aktivitást. Ilyen vizsgálati körülmények között három egymás utáni kísérletben 5, 7,5 és 9 U/m aktivitást mértünk. 55

12. példa

Egy TYGON-csövet, amely módosi vinilpolimer, rö- 60 vid ideig ciklohexanonnal oldottunk. Ezután a 11. kiviteli példában leírt módon készített nylon-oldatot töltöttünk belé, és a továbbiakban all. kiviteli példában leírt módon jártunk el. A vizsgálat során 3 U/m aktivitást mutattunk ki. 65

Egy nylon-csövet a 11. kiviteli példában leírtakhoz hasonlóan nylon-oldattal, majd PCl₅-oldattal és hexametiléndiamin oldattal kezeltünk. A 11. példában leírttal analóg módon, 5 liter desztillált vízzel végzett mosás után metakrilsav-hidroxiszukcinimidészter és metakrilamid kopolimer 5%-os oldatát töltöttünk bele 7,8 pH-n. 4 óra múlva desztillált vízzel kimostuk, és 2 mg glukózoxidáz/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült oldatát töltöttük bele, majd éjszakán át 4 C°-on állni hagytuk. NaCl-ra 1 mólos, 7,0 pH-jú, 0,1 mólos foszfátpufferral végzett mosás után a cső 50 cm-es darabjain 7 ml/perc átfolyási sebességgel végzett vizsgálatnál 2,4 U/m aktivitást mértünk.

14. példa

100 g nylon-6 granulátumot 300 mi tetrahidrofuránban (vízmentes) szuszpendálunk és a szuszpenziót háromnyakú lombikban szobahőmérsékleten 10 ml tionilklorid 89 ml tetrahidrofuránnal és 1 ml dimetilformamiddal készített oldatának lassú hozzáadása közben 1 órán keresztül keverjük. Ezután a folyékony fázist leszívatjuk, majd körülbelül 500 ml tetrahidrofuránnal (vízmentes) utánmossuk. Ezt követően 41 ml trietiléntetramin 59 ml tetrahidrofuránnal készített oldatával szobahőmérsékleten tovább reagáltatjuk. Körülbelül 2 óra múlva leszivatjuk, a szilárd maradékot 2 n nátriumhidroxid-oldattal, majd ioncserélőn tisztított vízzel mossuk.

Az aktivált granulátum 10 g-nyi mennyiségén a 4. példa szerint 300 mg GOD-t kötünk meg. A nem-kötött aktivitás kimosása után az anyag fajlagos aktivitása 50—80 U /g nedves anyag.

15. példa

Ragasztóanyaggal, majd nylon-pehellyel bevont szálakat az 1. példában ismertetettek szerint foszforpentakloriddal aktiválunk. „Spacerként” etiléndiamint és bifunkcionális protein-reagensként glutárdialdehidet alkalmazunk. 2 mg GOD 1 ml foszfát-pufferral, pH = 7,8 készített oldatát rögzítjük, majd öblítjük. A pehellyel bevont szál aktivitása ezután 0,73 U. Ha ugyanezt az eljárást, „spacer” nélkül végezzük és az aktív poliiminklorid-származékot közvetlenül alkalmazzuk a GOD rögzítésére, úgy a mosás után a bevont szál aktivitása 0,35 U/cm.

16. példa

A 14. példa szerint aktivált nylon-hordozó (granulátum) 5 g mennyiségén 1% Anti-T4-antitestet tartalmazó, 3 ml 0,1 mólos, pH = 6,8 foszfát-pufferben oldott, 60 mg mennyiségű immunglobulint kötünk meg glutárdialdehiddel, 0,05 ml glutárdialdehid (25%-os) hozzáadásával. 15 órán keresztül keverjük 4 °C-on. Ezután leszűrjük és 0,1 mólos, pH-6,8, 1 mólos nátriumkloridot tartalmazó foszfát-pufferral mossuk. A nylonon kötött antitestet a fentiekben említett foszfát-pufferben tároljuk, 0,05% nátriumazid hozzáadásával.

A T4-származékok tesztjénél a hordozó jó kötési aktivitást mutatott.

17. példa

100 mg GOD-t 50 ml 0,01 mólos foszfát-pufferben (pH=6,8) 0,5 ml glutárdialdehiddel (25%-os) keverés közben 4 °C-on 3 órán át térhálósítunk. A kapott terméket liofilizáljuk, 10 ml 0,01 mólos foszfát-pufferben (pH=7,0) oldjuk és a 4. példa szerint aktivált nylon 2 g mennyiségével reagáltatjuk. A reakciókörülmények a következők: szobahőmérséklet, 3 órán keresztül. 0,1 mólos foszfát-pufferrel, — amely NaCl-ra nézve 1 mólos és pH értéke 7,8-mosva a granulátum aktivitása 115 U/g.

Claims (4)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás biológiailag aktív proteinek rögzítésére, azzal jellemezve, hogy 7000—120 000 moiekulasúlyú poliamid-hordozót — vagy az említett poliamiddal bevont egyéb hordozót--80 és 50 ^GC közötti hőmérsékleten szervetlen klórozó-szerrel klórozzuk, és az így kapott terméket

   a) vizes oldatban közvetlenül reagáltatjuk valamely 5 biológiailag aktív proteinnel, vagy

   b) valamely, legalább egy primer aminocsoportot vagy hidrazidcsoportot tartalmazó ismert bifunkciós vegyület egy mólos feleslegével reagáltatjuk, adott esetben vizes közegben vagy szerves oldószerben, majd az

   10 így kapott terméket vagy közvetlenül a proteinnel vagy először legalább egy ismert bifunkciós vagy polifunkciós protein-reagenssel — előnyösen dialdehiddel—, majd ezután a proteinnel vagy a proteinnek a protein-reagenssel képezett reakciótermékével reagáltatjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy egyéb hordozóanyagként szilárd polimert használunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy klórozó-szerként PCl₅-ot, SOCl₂-t, COCl₂-t vagy SO₂Cl₂-t használunk.
4. 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan hordozóanyagot használunk, amely poliamidrostokkal,

   25 vagy -pelyhekkel bevont felülettel rendelkezik.

   1 db rajz

   A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója

   81.1227.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen ·— Felelős vezető: Benkő István igargatA