JPS6014028B2 - ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル誘導体及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、架橋もしくは担体固定の目的のため、タンパ
ク質、殊に生物学的に活性のタンパク質の共有結合をつ
くるのに有用な新規ヒドロキシースクシンィミドーェス
テル誘導体及びその製造法に関する。

固定された、殊に担体結合された酵素活性タンパク質に
対する関Ｄは、多くの工業分野において次第に増加して
いる。

タンパク質を担体物質と共有結合する多数の方法もすで
に公３印である（例えば西ドイツ国特許出願公告第２１
２８７４３号公報及び西ドイツ国特許公開第ね６０１８
５号公報参照）。固定された酵素に対するこういった関
○の最も重要な理由は、それによって惹起される生物学
的に活性な物質の安定化及びそれを水性反応媒体から容
易に分離することができることである。生物学的に活性
のタンパク質を共有結合するための従前の方法では、な
かんず〈担体母体中への活性基の導入が利用された。

該方法の著しい欠点は、迫体母体の密な隣接によりタン
パク質の活性配置が影響されるため活性収率が低いこと
である。従って、タンパク質と担体との間をスベーサ部
材（Ｓｐａｃｅｒ：橋形成体）で接続することによって
、この欠点を除去することが試みられた。該スベーサ部
材は、多くの場合、水溶液中のタンパク質と反応性の共
有結合を生じさせる官能基及び担体との結合を得るのに
好適なもう１つの官能基を有するホモ−又はへテロニ官
能性の化合物である橋形成体化合物に由来する。グルタ
ルジアルデヒド又はジェポキシドのようなホモ二官能性
橋形成体の場合、両方の官能基は同じものである。従っ
てタンパク質と担体を同時に反応させると、タンパク質
架橋ならびに担体との結合が並行して行なわれる。

まず橋かけ結合体分子がタンパク質又は担体と結合し、
引続き担体もしくはタンパク質と結合する２工程操作方
法で処理する方法が有利であることが判明した。該方法
にとって、異なる反応性の２種の官能基を有するへテロ
二官能性の橋かけ結合体化合物が有利であることが判明
した。更に、まず適当な担体の表面を物理的に吸着し、
次に多官能性の橋形成体をこの担体表面上に架橋するこ
とによって固定することは公知である。

該方法では、異なる橋形成体化合物は、結合すべきタン
パク質及び使用すべき担体材料によって異なる作用をし
、極めて種々雑多の結果を導くことは明らかである。

従って実際上、タンパク質団定の各々の特定の場合に対
して予備試験によってそのつど最も有利な橋形成体物質
を探す。多くの場合に好適な橋形成体は、他の場合には
全く不満足なものであることが判明した。多くの場合、
活性タンパク質の満足な共有結合は、結局これまで成功
しなかった。従って、依然として生物学的に活性のタン
パク質、殊に酵素の共有結合にもう１つの選択性を有す
る付加的な橋形成体化合物が必要である。特に、ホモ一
二官能性又はへテロ二官能性であってよい橋形成体化合
物が必要であり、この化合物は片方がタンパク質と特に
迅速かつ温和に反応する官能基を有し（ここで官能基間
の距離は、結合タンパク質の担体による配座変化が十分
に取除かれる程度である）、かつ、この化合物により２
つの官能基が結合する“橋”がその疎水性又は親水性特
性に関して所望に応じて変えられる。従って本発明の目
的は、このような化合物を得ることである。この目的は
一般式１： ・ 〔式中、Ｘはもう１つのカルボキシ−スクシンィミドー
ェステル基を表わすか、又は一般式：−ＣＯ−ＮＨ−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ（ＯＲ′）２ ０又は又は −ＣＯ−○−ＣＨ２一ＣＨ２一ＮＨ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ′）
２ Ｗで示される一つの基を表わし、Ａは、ｎが数２で
あり、Ｘがもう１つのカルボキシースクシンイミドーヱ
ステル基である場合には、一〇−ＣＨ２一Ｃ比基を表わ
し、ｍは数１又は２であり、他の場合には、Ａは単結合
を表わし、ｎは２〜５の整数を表わし、Ｒは水素原子又
はメチル基を表わし、かつＲはメチル基を表わす〕のヒ
ドロキシースクシンィミドーェステル誘導体によって解
決される。

これは、基×の種類に応じて、ホモ二官能性又はへテロ
二官能性化合物である。

ｍ及びｎの変化によって、橋の疎水性及び親水性の所望
程度を“あつらえる”こをができる。すなわち、ｎが大
きくなると、疎水性は増し、ｍが大きくなると、親水性
が増大する。タンパク費の架橋が所望の場合、本発明に
よるホモニ官能性化合物が有利であり、それに反して、
固体又は液体担体材料との結合を所望する場合は、Ｘは
式ロ、ｍ又はＮを表わすへテロ官能基化合物が有利であ
る。この錫合担体との結合を共重合によって行なうと、
特にＸが式ｍに相当する化合物が好適である。ヒドロキ
シースクシンィミドーェステル基（ＨＯＳｕ基）は、水
溶液中で選択的にアミンと反応し、すなわち特にタンパ
ク質の共有結合に好適である。本発明によって、ヒドロ
キシースクシンィミドーェステルの基礎となるモノー又
はジカルボン酸を、‘ａー 自体公知方法で酸塩化物又
は混合無水物のような反応性議導体に変じ、該反応性議
導体を有機溶剤中でＮーヒドロキシースクシンィミドと
反応させるか、又は‘ｂ｝ 直接極性有機溶剤中で、Ｎ
−ヒドロキシースクシンイミドとそれと当モル量のシク
ロヘキシルカルボジィミドの存在下で結合させることに
よって、一般式１の新規化合物を製造することができる
。

前記のモノカルボン酸としては、Ｎｂｋｒｏｍｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．第１７６巻、３０１７頁（１９７３年）に記載
の方法で得られるメタクリロィル−の−オキシカルボン
酸、有利にメタクリロィル一也ーオキシカプロン酸が使
用される。例えば塩化メチレン、フラン、ジオキサン及
び類似物のような有機溶剤中の混合無水物を経る化合物
の製造は、多くの場合、最も簡単かつ最良の方法である
ことが判明した。

この場合、反応性酸議導体として混合無水物をクロル蟻
酸と共に使用することが有利である。タンパク質の共有
結合のために本発明による化合物を使用する場合、担体
物質としては、Ｘで表わされた官能基と反応し得る水瀞
性ならびに非水溶性の固体又は液体物質が好適である。
この場合、反応性基は、ＯＨ基、アミノ基である。親水
性で、容易に膨化でき、十分に電荷のない、かつ微生物
に対して安定である坦体物質を使用するのが有利である
。有利な別法によれば、Ｘが式ｍの基である場合本発明
による化合物を、その場で適当なモノマーないしモノマ
ー混合物を重合することによって製造される担体との共
重合により結合されるか、又は直接適当なコモノマーと
の共重合によって、担体中に導入する。

この実施形で使用される共重合可能なモノマーは、水溶
性又は非水溶性であってよい。

水溶性モノマーは、本発明によるカップリング化合物を
まず生物学的に活性のタンパク質と反応させ、その後均
一な水溶液中で、共重合によってその場で形成される担
体に固定すべき場合に、有利に使用される。その代りに
、タンパク質と本発明による１式の化合物とのカップリ
ング生成物が分散水相中に存在し、非水溶性モノマー又
はモノマー混合物が分散相を表わす場合には、懸濁重合
又は乳化重合の方法で操作することもできる。コモノマ
ーとしては、アクリル酸又はメタクリル酸の水溶性又は
非水溶性誘導体、例えば該化合物のアミド、ニトリル及
びェステルが特に有利に使用される。水溶性コモノマー
はアクリルアミドが有利である。殊にアルキル基によっ
て置換されたアクリル酸又はメタクリル酸の非水落性誘
導体は、後に担体結合タンパク質を純粋な水系中でなく
有機水媒体中で使用しなければならない場合に、有利に
使用される。他の適当なモノマーは、例えばマレィン酸
又はフマル酸から誘導される。しかし、使用可能なモノ
マーは、ここの例で挙げたものに限定されるものではな
い。モノマ−としては、さらに不飽和共重合可能な基を
有するプレポリマーを使用することもできる。

共重合によって得られるこの種の坦体において物理的特
性を調整するために、相当する量の適当な架橋剤を添加
するのが有利である。

このような架橋剤の例は、Ｎ・Ｎ′−メチレンービスー
アクリルアミド及びエチレンージアクリレートのような
少なくとも２個の共重合可能な基を有する化合物である
。しかしラジカル作用する架橋剤、例えば特定の有機過
酸化物を使用することもできる。不均一相中の重合、す
なわち懸濁重合又は乳化重合を実施する場合、例えばジ
ビニルベンゾール及びェチし・ンジメタクリレートのよ
うな非水溶性架橋剤が適当である。他の多数の架橋剤は
当業者に公知であり、それぞれの場合に応じた選択は、
当業者の取扱いの範囲にある。しかし、重合体担体の製
造及び活性タンパク質との結合をすでに行なった後には
じめて架橋剤を付加的に供聯合して架橋を行なうことも
可能である。生成重合体の架橋を断念するならば、溶性
又は熱可塑性担体材料が得られる。

該担体材料は、担体結合タンパク質を例えば糸又はシー
トの形でそれから自体公知方法により得ることができる
紡糸可能又は押出し可能な溶液を得るために使用するこ
とができる。ヒドロキシ基含有の坦体物質とのカップリ
ングのために、特に×が式Ｗの基である一般式１の化合
物が好適である。

すなわち該基は、約１００ｏｏに加熱する際に例えばジ
メチルスルホキシドのような有機溶剤中で、ジェチルア
ミンの分解下に、式Ｗａ： ・−Ｎ＝Ｃ＝○ の相応するィソシアネートを形成し、これは０℃でヒド
ロキシル基と反応する。

該条件下で、ヒドロキシースクシンイミドーェステル基
（ＯＳｕ−ェステル）は依然として反応せず、分子の２
個の官能性基の選択反応がその都度の好適条件下での反
応により可能である。式中のＸが一般式０の基を表わす
一般式１の化合物を、まずＨＯＳｕ−基を介してアミノ
基含有の低分子又は高分子物質と反応させ、引続き弱酸
性水溶液中に入れ、さらに反応させる。

該条件下でアセタールから遊離アルデヒドが生じ、これ
は、次に同業者に公知の方法で、例えばアミ／基と反応
して、シッフ塩基を形成し、これは、その後、例えばホ
ウ水素化ナトリウムで還元されるか又はヒドｏキシアミ
ンー、ヒドラジンー又はセミカルバチド譲導体との類似
反応によって還元されて共有結合を形成する。更に、担
体としては、本発明による化合物の官能基と反応性の個
所を有しない固体物質を使用することもできる。

このような場合、本発明による化合物は、架橋剤として
使用される。この場合、有利にはまず活性タンパク質を
坦体の表面上に、例えば吸着、タンパク質又は類似物の
溶液での被覆等によって施こし、引続き本発明の化合物
との架橋によって該表面上に固定させ、この場合特にホ
モ二官能性誘導体、すなわちＸがもう１つのカルボキシ
ースクシンィミド−ェステル基を表わす化合物を使用す
るのが有利であるが、式中の×が式Ｗに相当する化合物
もこの架橋のために使用することができる。更に本発明
の新規化合物の使用法の有利な実施形は、生物学的に活
性のタンパク質を１式のホモ二官能性ならびにへテロ二
官能性化合物と反応させることにある。

例えば、タンパク質をまず式中の×が一般式ｍの基であ
る化合物と反応させる。これにより共重合可能な基を導
入させる。引続き、式中のＸがもう１つのカルボキシー
スクシソィミドーェステル基を表わす架橋可能な、特に
ホモ二官能性化合物を添加する。これにより架橋を生じ
させ、すなわち多数の分子を相接してカップリングさせ
る。次に多数のタンパク質単位からなるこの複雑な構造
物は、上記のように、それに付いている共重合可能な基
によって前記の担体へのタンパク質共重合の方法によっ
て固定させることができる。同様にして、共重合可能な
基の代りに、０式又はＮ式の基を、該方法によって導入
し、すでに予備形成された担体との結合を得ることもで
きる。もう１つの変法によれば、まず多数のタンパク質
分子の形成下にタンパク質を相接して架橋させ、その後
にまず担体を１式の同じ化合物又は他の化合物で固定さ
せる。

本発明の化合物と共有結合することができる生物学的に
活性のタンパク質は、酵素活性タンパク質、抗体、免疫
グロブリン及び類似物のような免疫学的活性タンパク質
ならびにホルモン活性タンパク質である。本発明の新規
化合物は、水溶液又は有機性水溶液中で生物学的活性度
を十分に保持しながら共有結合を生じるタンパク質に対
する反応性、ならびに共重合可能な二重結合、ヒドロキ
シ基及びアミノ基、ならびにタンパク質に対して担体物
質に近接している他の活性基との反応性で優れている。

該ェステルのもう１つの利点は、ェステルが良好に結晶
し、したがって純粋な形で容易に単離することができる
ことである。該ェステルは、タンパク質の生物学的活性
度が保持されたままの条件下で、この種の担体と共有結
合を導く状態にある。更に、該ェステルはその親水性又
は疎水性に関して所望に応じて容易に変化することがで
きる。従って、例えば対称的ビスヒドロキシースクシン
ィミドーェステルをそのつど適当な量で弱アルカリ性緩
衝液中のタンパク質溶液に添加することができる。この
場合、得られた架橋された生物学的に活性のタンパク質
は、例えば透析、限外嬢過等によって、例えばゲルクｏ
マトグラフイーによって分離することができるか、もし
くは例えば坦体への結合、又は担体中への重合導入によ
ってさらに反応させることができる。この場合、エチレ
ングリコールから誘導された本発明による化合物は、そ
の親水性に基づき単純なジカルボン酸−ヒドロキシース
クシンイミドーェステルよりも優れている。その良好な
水溶性に基づき該化合物は迅速に反応し、生物学的に活
性のタンパク質の変質を抑制する。非対称（ヘテロ二官
能性）化合物では、例えばヒドロキシースクシンィミド
基をタンパク質とカップリングした後、アミドアセトア
ルデヒドアセタール基を酸性化により遊離アルデヒドに
変えることができ、これはさらに前記と同様にもう１つ
のァミノ基含有の物質と反応する。

従って、２種の異なる酵素を相互に、又は１種の酵素を
アルプミンと、又は１抗原を牛血清アルプミン又はポリ
リジンのようなポリアミノ酸とカップリングさせること
ができる。共重合可能な二重結合を有する化合物は、例
えば西ドイツ国特許出願公告第２１３０９１３号公報及
び西ドイツ国特許公開第２１２８７４３号公報に記載さ
れている方法によってタンパク質共重合に使用すること
ができる。

全く同様に、該化合物をまず共重合に付すこともでき、
この場合コモノマーの選択により良好な又は僅かに良好
な水熔性共重合体が生じる。更に、任意の分子量を有し
て得られる該共重合体にタンパク質をヒドロキシースク
シンィミドーェステル基を介してカップリングすること
ができる。次例によって本発明による化合物、その製造
及び使用を詳述する。

例１ エチレングリコ‐ルービスープロピオン酸−ビスーヒド
ロキシスクシンイミドエステルエチレングリコ一ルービ
スープロピオン酸（Ｒ．Ｖ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ及びＲ
．Ｍ．Ｈｊｘｏｎ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．ＳＭ．第
７畔筈、１９４８王、第１３３３頁、ＮＯ．１２９１６
により製造）１０．３夕及びＮーヒドロキシースクシン
イミド１２．６夕の無水テトラヒドロフラン１５０の【
中の溶液に、蝉梓及び氷冷下に１時間でジシクロヘキシ
ルカルボジィミド２２．７夕のテトラヒドロフラン溶液
を滴加する。

該溶液を１報時間後に室温で蝿拝する。次に酢酸０．３
の【を添加する。更に数時間後、無水酢酸１５０の‘添
加し、次に生じたジシクロヘキシル尿素を櫨別する。該
櫨液を３分の１に濃縮し、水、重炭酸塩及び再び水で洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、かつ濃縮する。該濃
縮物をアセトニトリル中に入れ、２岬時間＋４℃で放置
し、新たに沈殿した尿素を櫨別し、再び濃縮させる残留
油分かる、十４℃で数日放置の後に、エチレングリコ−
ルービスープロピオン酸−ビスーヒドロキシスクシンィ
ミドェステルが晶出する。それを酢酸ェステルから再結
晶させる。収率：２５％ 融点：１１５０ Ｃ，６日２Ｎ２０，。

（４００．３５）計算値：Ｃ４７．９９日５．０４Ｎ６
．９９実測値：Ｃ４７．９５日５．０４Ｎ６．８７例２
例１と同様にして、オキシーピスープロピオン酸ーヒド
ロキシスクシンアミドェステルを製造した。

収率：３０％ 融点：１３１００ 例３ オキシスクシンィミドーグルタル酸−アミノアセトルデ
ヒド−ジメチルアセタールテトラヒドロフラン１００の
（中の無水グルタル酸１１．４夕の溶液に、トリェチル
アミン１０．１夕及びアミノアセトアルデヒドージメチ
ルアセタール１３．２夕を同時に滴加し、次いで更に３
船ン間渡洋する。

得られた溶液を十５℃に冷却し、クロル蟻酸エチルェス
テル９．５の‘を徐々に加える。該配合物をさらに３０
分間−５℃で保持する。次に０℃でヒドロキシスクシン
イミド１１．５夕及びトリェチルアミン１４．０の‘を
同時に滴加する。５時間の反応時間後に、十２５ｏ０で
沈殿したトリェチル塩化アンモニウムを猿則し、濃縮し
、再び酢酸ヱステルに入れ、水、重炭酸塩及び再び水で
洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、かつ濃縮させる
。

生成されたオキシスクシンィミドーグルタル酸ーアミノ
アセトァルデヒドージメチルアセタールを熱酢酸ェステ
ルから再結晶させる。収率：４５％ 融点：７０℃ Ｃ，３日２ぶ２０７（３１６．３） 計算値：Ｃ４９．６０日６．斑Ｎ８．８５実測値：Ｃ４
９．３４日６．３７Ｎ８．８１例４メタクリロイル−の
−ヒドロキシーカプロン酸−オキスクシンイミドエステ
ルメタクリロイル−のーオキシカプロン酸を“Ｎ燈ｋｒ
ｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．’’、第１７６巻、第３０１７頁
、１９７３年に記載の方法と同様にして製造する。

５００偽−三首フラスコ中に無水塩化メチレン及び無水
テトラヒドロフランからなる混合物中のそれぞれメタク
リロイルーヒド。

キシカプロン酸０．１モル及びＮ−ヒドロキシスクシン
イミド０．１１モルを装入し、氷裕中で十５℃に冷却す
る。次に雛拝しながら、無水塩化メチレン５０の‘中に
溶かしたジシクロヘキシルカルボジイミド０．１１モル
の溶液を滴加する。該混合物をさらに約１狐寺間蝿拝す
る。この場合温度は十２６０に上溢する。その後に、沈
殿したジシクロヘキシル尿素を櫨昇りし、櫨液を濃縮さ
せる。生じた油分をアセトニトリル中に入れ、数時間冷
蔵庫に入れておく。新たに沈殿した尿素を分離し、アセ
トニトリルを蒸発させる。該生成物は油状物の形で得ら
れる。収率：理論量の４０％ 薄層クロマトグラフィによるＲｆ値＝０．８６（酢酸ェ
ステル−ベンゾール−氷酢酸−水４０：４０：８：４）
例５ヒドロキシスクシンイミド−Ｎ一２−ヒドロキシェ
チル−Ｎ′・Ｎ′−ジメチル尿素−コハク酸一エステル
Ｎ一２−ヒドロキシエチル−Ｎ′−Ｎ′−ジメチル尿素
１３．２夕を無水ＴＨＦ中に溶かす。

次に水素化ナトリウム−懸濁液２．４夕を丁度５分間で
滴加する。該混合物を水素発生が完結するまで室温で縄
拝し、次に無水コハク酸１０夕を添加する。更に２独時
間蝿拝した後に濃縮させ、水を加える。日２発生の完結
後に有機分を分離し、該溶液を酸性化し、かつ塩化メチ
レンで振出させる。有機相を乾燥させ、濃縮させると、
淡黄色の油分が残る。収率：理論量の５３％この酸から
ヒドロキシスクシンィミドェステルを例４と同様にして
製造した。

収率：理論量の３５％； 融点；９７〜９８℃ 分析結果： Ｃ日Ｎ 計算値：４７．５ ５．８ １２．８ 実測値：４７．５ ５．８ １２．８ ジメチルスルホキシド中で約１００℃に加熱すると、ジ
チルアミンが離脱し、相当するイソシアネートを形成す
る。

使用例 例６ 種々の対称的二官能性化合物との架橋によるトリプシン
の安定化【ａ｝ 比較実験 トリプシンを第１実験でグルタルアルデヒドと反応させ
、２実験でコハク酸ービスィドェステルーヒドロクロリ
ドと反応させ、こうして架橋されたトリプシンと遊離ト
リプシンとの活性度低下を比較した。

この場合蒸留水２５の‘中のトリプシン５０の９ごとに
、０．０９Ｍの燐酸塩緩衝液（７．５ｐＨ）に溶かした
架橋剤を２仏Ｍずつ加え、室温で蝿拝した。２斑時間後
に、遊離トリプシンならびにグルタルアルデヒドで架橋
されたトリプシンの活性度は、当初活性度の１５％まで
低下した。

５加持間後、３つの試料全部の活性度は０まで減じた。

コハク酸−ビスィミドェステルヒドロクロリドで架橋さ
れたトリプシンは、２斑時間後なおも当初活性度の５０
％、５餌時間後なおも当初活性度の３０％及び１００時
間後なおも当初活性度の２０％を有していた。実験の例
２及び３で示された本発明によるェステルで繰り返した
。

２雌時間後、活性度は例３の化合物ではなお８５％、例
４の化合物ではなお５０％であった。

５畑時間後、例２の化合物で架橋されたトリプシンの活
性度は、例３の化合物の４３％もしくは２７％であった
。

１００時間後、例２の化合物では、依然として２５％の
活性度を測定した。

本例は公知の架橋剤に比べて本発明による化合物が優れ
ていることを示している。例７ 架橋による啓アシラーゼの安定化 ０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ４）中の腎アシラーゼの活
性度は、４℃の冷却にも拘らず３〜５日間以内に０の値
まで低下する。

これに対して、例１の化合物又はコハク酸ービスーヒド
ロキシスクシンイミドェステル（例１と同様に製造）を
添加すると、７０〜５０％までの当初活性度低下が起こ
る。この残存活性度を２ケ月間検査したら、この時間−
定に残った。この結果は、１：１〜１：８の間のタンパ
ク質対ェステルのモル比の変化の際に常に得られた。本
発明によるビスーェステルの代りにグルタルジアルデヒ
ドを使用する比較実験では全く安定化は得られなかった
。

例８ 共重合による賢アシラーゼの固定 固有活性度：１７．０Ｕ／の２を有するアミノアシラー
ゼ（凍結乾燥物）１０００雌をＩＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．３）２５．０肌中に十４℃で溶解する。

次にジオキサン中のメタク。イルヒドロキシーカプロン
酸ーヒドロキシスクシンィミドェステル（例４）３０．
７の夕の溶液２．５泌を添加する。反応時間：１幼時間
、温 度：＋４℃ アクリルアミド６夕、Ｎ・Ｎ′ーメチレンービスーアク
リルアミド０．５夕及び１％ＣｏＣ１２溶液０．６の‘
を上記のトリス緩衝液２２．５羽中に溶かした。

ビニル化された酵素溶液を添加した後、それぞれ５−％
のアンモニウムーベルオキソジスルフェート溶液１．５
地ならびに５％の３−ジメチルアミノプロピオニトリル
溶液１．５ｍ‘を用いて重合を開始する。得られたゲル
を、節（節目幅０．４肋）を通し、ＩＭ−燐酸塩緩衝液
（ｐＨ７．５）を用いてカラムで溶離させる。

１ 溶出液 緩衝液 ２夕港出液中
活性度 １．８８％ゲルの固有
活性度 １９３．１Ｕ／夕２ 溶出液緩
衝液 ２夕活性度収率：
６．９％この例を、本発明による化合物の代りにアクリ
ル酸クロリドを使用して繰り返した。

この場合、活性を担体に固定することはできなかった。
例９本発明による化合物との２工程反応、引続く共重合
によるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）の固定例８に
記載のように約２１０Ｕ′雌の固有活性度を有するＧＯ
Ｄを例４の化合物で予め処理し、引続き少量の例１の化
合物を添加した。

その後さらに２４時間放置し、引続き例８に記載のよう
に共重合を行なった。得られたゲルで、２９０Ｕ／夕の
活性度が測定された。

本発明による化合物の代りにアクリル酸クロリドを使用
してこの実験を繰り返すと、２３５Ｕ／夕の活性度が得
られた。例 １０ ＲＳＡ（牛血清アルブミン）へのアンキオテンシンのカ
ップリングアンギオテンシン２５の９をジオキサン／水
（１：１）１０の【中に溶かし、ジオキサン中の例４の
化合物６の９の溶液を加える。

次に５％Ｋ２Ｃ０３溶液を添加することによってｐＨ値
を８．０にし、室温で２日間燈拝した。テトラヒドロフ
ランを添加することによって生成物を沈殿させ、遠心分
離し、凍結乾燥させる。該中間生成物１９．６のｐをｐ
Ｈ＝４にし、１時間燈梓する。

引続きｐＨ値を再び８．０に調節し、該溶液にＲＳＡ１
６．６柵を加える。１時間損拝した後、ホウ水素化ナト
リウム１の９を加える。

更に２０分後にもう一度ホウ水素化ナトリウム１雌を加
える。更に６０分後に反応は終結した。該溶液を濃縮さ
せ、無水エタノール中に入れ、猿過し、水を加え、次に
４日間透析する。透析物から凍結乾燥物２４．収め三得
られる。これから、ＲＳＡＩ分子と少なくともアンギオ
テンシン２４分子がカップリングされることが明らかで
ある。例１１ メタクリロィルーヒドロキシカプロン酸ーヒドロキシー
スクシンイミドエステルとメタクリルアミドとの共重合
無水テトラヒドロフラン中の双方のモノマーの酸素不含
溶液（１モル／ｄで）を製造する（ェステル対アミドの
モノマー比１：５）。

重合は山ＢＮ（アソィン酪酸ジニトリル）０．８％（モ
ル／モル）の添加によって斑℃で行なう。４時間後に、
冷却（氷浴中に浸濃）によって重合を中断させ、沈殿し
た重合体を吸引櫨過する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式I： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｘはもう１つのカルボキシ−スクシンイミド−
   エステル基を表わすか、又は、一般式：−ＣＯ−ＮＨ−
   ＣＨ＿２−ＣＨ（ＯＲ′）＿２II又は▲数式、化学式、
   表等があります▼ 又は −ＣＯ−Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−ＮＨ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ
   ′）＿２IVで示される一つの基を表わし、Ａは、ｎが数
   ２であり、Ｘがもう１つのスクシンイミド−エステル基
   である場合には、−Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−基を表わ
   し、ｍは数１又は２であり、他の場合には、Ａは単結合
   を表わし、ｎは２〜５の整数を表わし、Ｒは水素原子又
   はメチル基を表わし、Ｒ′はメチル基を表わす〕のヒド
   ロキシ−スクシンイミド−エステル誘導体。 ２ 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｘはもう１つのカルボキシ−スクシンイミド−
   エステル基を表わすか、又は一般式：−ＣＯ−ＮＨ−Ｃ
   Ｈ＿２−ＣＨ（ＯＲ′）＿２II又は▲数式、化学式、表
   等があります▼ 又は −ＣＯ−Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−ＮＨ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ
   ′）＿２IVで示される一つの基を表わし、Ａは、ｎが数
   ２であり、Ｘがもう１つのスクシンイミド−エステル基
   である場合には、−Ｏ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−基を表わ
   し、ｍは数１又は２であり、他の場合にはＡは単結合を
   表わし、ｎは２〜５の整数を表わし、Ｒは水素原子又は
   メチル基を表わし、Ｒ′はメチル基を表わす〕のヒドロ
   キシ−スクシンイミド−エステル誘導体の製造法におい
   て、ヒドロキシ−スクシンイミド−エステルの基礎とな
   っているモノカルボン酸又はジカルボン酸を、（ａ）自
   体公知方法で酸塩化物又は混合無水物のような反応性誘
   導体に変換し、該反応性誘導体を有機溶剤中でＮ−ヒド
   ロキシ−スクシンイミドと反応させるか、又は（ｂ）直
   接、極性有機溶剤中でＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド
   と、これと当量のシクロヘキシルカルボジイミドの存在
   下で縮合させることを特徴とするヒドロキシ−スクシン
   イミド−エステル誘導体の製造法。 ３ 反応性酸誘導体として混合無水物をクロル蟻酸と共
   に使用する、特許請求の範囲第２項記載の方法。