JPS6169759A - タンパク質の架橋反応用修飾剤及びそれを用いる方法 - Google Patents
タンパク質の架橋反応用修飾剤及びそれを用いる方法Info
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- JPS6169759A JPS6169759A JP19326184A JP19326184A JPS6169759A JP S6169759 A JPS6169759 A JP S6169759A JP 19326184 A JP19326184 A JP 19326184A JP 19326184 A JP19326184 A JP 19326184A JP S6169759 A JPS6169759 A JP S6169759A
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- proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分！７）
本発明はバイオリアクターの触媒としての＃素の機部を
向しさせる■的で、タンパク賀分子とタンパク質分子−
とを架橋反応させるための修飾剤及びそれを用いる方１
人に関するものである。
向しさせる■的で、タンパク賀分子とタンパク質分子−
とを架橋反応させるための修飾剤及びそれを用いる方１
人に関するものである。
（従来の技術）
従来、タンパク質分子間の架橋反応修飾剤としては、ジ
ハロゲン試薬（Ｘ−Ｒ−Ｘ）、ジインシアネー） （０
＝Ｃ＝Ｎ−１１−Ｎ＝Ｃ−０）、ジチオイソシアネート
（Ｓ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｃ−５）、グルタルアルデヒド
、シマレイミド及び異反応性架橋試薬としてＮ −（ｍ
−マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド（に＋ｔ
ａｇａｗａ、 Ｔらｊ。
ハロゲン試薬（Ｘ−Ｒ−Ｘ）、ジインシアネー） （０
＝Ｃ＝Ｎ−１１−Ｎ＝Ｃ−０）、ジチオイソシアネート
（Ｓ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｃ−５）、グルタルアルデヒド
、シマレイミド及び異反応性架橋試薬としてＮ −（ｍ
−マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド（に＋ｔ
ａｇａｗａ、 Ｔらｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８３．１４９３（１！３７８））
、（１）−？Ｌ／イミドアルカノイルＮ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（Ｐａｒｔｉｓ、 Ｍ、 Ｄ、ら
Ｊ、 Ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
、（１）−？Ｌ／イミドアルカノイルＮ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（Ｐａｒｔｉｓ、 Ｍ、 Ｄ、ら
Ｊ、 Ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
２、２８３（１１１８３）） ｈ９が知られている。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、従来の架橋反応用修飾剤の中でグルタル
アルデヒドは、常温の水溶液中で反応を進行できる利点
がある一方で、架橋の炭素骨格の１Ｒふ鎖長（炭＾原ｆ
数）は５であるため、１ｕかすぎる場合があったり、あ
るいは架橋により大幅な酵素失活が起きる場合がある。
アルデヒドは、常温の水溶液中で反応を進行できる利点
がある一方で、架橋の炭素骨格の１Ｒふ鎖長（炭＾原ｆ
数）は５であるため、１ｕかすぎる場合があったり、あ
るいは架橋により大幅な酵素失活が起きる場合がある。
その他の架橋性修飾剤による場合も多くの酵素で大幅な
失活がみられるという欠点があった。
失活がみられるという欠点があった。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは、このような従来の架橋反応修飾剤の欠点
を克服するため鋭意研究を重ねた結果。
を克服するため鋭意研究を重ねた結果。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのモノカルボン酸エステ
ルが、脂溶性′ｊＩｉ買を触媒するｆＩＩ素に対しアシ
ル化反応による活性低ドが小さいが、タンパク質の巾な
る分子内修飾では十分な安定化が認められないのに文４
し、アルカン−酸ジスクシノイミドのある種のものは、
所定条ヂ１ドでタンパク質と分子間架橋反応させると酵
素の失活を起さず、かつ、安定性向り効果もすぐれるこ
とを見出し、この知見に基づき未発ＩＪＩをなすに至っ
た。
ルが、脂溶性′ｊＩｉ買を触媒するｆＩＩ素に対しアシ
ル化反応による活性低ドが小さいが、タンパク質の巾な
る分子内修飾では十分な安定化が認められないのに文４
し、アルカン−酸ジスクシノイミドのある種のものは、
所定条ヂ１ドでタンパク質と分子間架橋反応させると酵
素の失活を起さず、かつ、安定性向り効果もすぐれるこ
とを見出し、この知見に基づき未発ＩＪＩをなすに至っ
た。
すなわち未発１！Ｔ１．一般式
（式中、ｎは２〜１０の整数を示す）
で表わされる化合物よりなることを特徴とするタンパク
質の分子間架橋反応用修＋ｉＪ剤及び前記一般式［Ｉ］
で表わされる分子−間架橋反応用修飾剤とタンパク質
と反応させるに当り、ジメチルスルホ午シトを含有する
ｐＨ７〜９の溶液中で反応を行わせることを特徴とする
分子間架橋タンパク質の生成力法 を提供するものである。
質の分子間架橋反応用修＋ｉＪ剤及び前記一般式［Ｉ］
で表わされる分子−間架橋反応用修飾剤とタンパク質
と反応させるに当り、ジメチルスルホ午シトを含有する
ｐＨ７〜９の溶液中で反応を行わせることを特徴とする
分子間架橋タンパク質の生成力法 を提供するものである。
前記一般式［ｒｌで表わされる本発明の架橋反応用修飾
剤は次式（１）に従って合成することができる。
剤は次式（１）に従って合成することができる。
ＤＭＩＩ：；ジメ＋−し↑、ルム７ミμ上記反応は例え
ば次のようにして行うことができる。
ば次のようにして行うことができる。
１モルの［ｒｌｌと２モルの［Ｉ［１１をジオキサン、
テトラヒドロフランあるいはジメチルホルムアミドに溶
解し攪拌しながら、同一溶剤に溶かしたジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を徐々に滴ドする（約１ｈ
ｒ）、反応は室温で行い１反応系は水を嫌うため、用い
る溶剤は完全に脱水後使用する。ＤＣＣを滴卜すると［
＋７］の生成による山角がみられる０滴ド絆了後、３ｈ
ｒ室温に放置した後ろ別する。ｌす液をｅ４縮乾燥し、
粗生成、物（白色固体）を１りる。
テトラヒドロフランあるいはジメチルホルムアミドに溶
解し攪拌しながら、同一溶剤に溶かしたジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を徐々に滴ドする（約１ｈ
ｒ）、反応は室温で行い１反応系は水を嫌うため、用い
る溶剤は完全に脱水後使用する。ＤＣＣを滴卜すると［
＋７］の生成による山角がみられる０滴ド絆了後、３ｈ
ｒ室温に放置した後ろ別する。ｌす液をｅ４縮乾燥し、
粗生成、物（白色固体）を１りる。
粗生成物はへ翻ナノＩｌｌ溶部を除いた後、アルコール
による１１）結晶を行い、目的とする物質［１１を得る
。
による１１）結晶を行い、目的とする物質［１１を得る
。
このようにして１１１られる本発明の架橋反応用修飾剤
の物性値を以ドに小才。
の物性値を以ドに小才。
第１表
（注）ＴＬＣニ
ジリカゲル０．２５ｍｍ
クロロホルム／エタノール／酢酸（１００：５：ｌ）本
発明の前記一般式［ｒ］で表わされる＊＊剤は、水に対
するｆ？ＩＮ瓜が低く、アルカンの炭素鎖長が大きい程
、より溶けにくくなる。そこで修飾反応のために修飾剤
を前解させるための有機溶媒を必要とする。一方タンパ
ク真の多くは、水に溶けやすく、有機溶媒には溶けにく
い、これらの理由からタンパク質を溶かしやすい有機溶
媒としてジメチルスルホキシドを用いる必要がある。し
かしジメチルスルホキシドは高濃度では酵素を失活させ
る。したがって反応溶媒中のジメチルスルホキシドの濃
度は酵素により異なるが６０％以下に抑えるのが好まし
く、より好ましくは５０％程度である０反応溶媒として
はジメチルスルホキシドと共に水、ジメチルホルム７ミ
ドなどを用いることができる。
発明の前記一般式［ｒ］で表わされる＊＊剤は、水に対
するｆ？ＩＮ瓜が低く、アルカンの炭素鎖長が大きい程
、より溶けにくくなる。そこで修飾反応のために修飾剤
を前解させるための有機溶媒を必要とする。一方タンパ
ク真の多くは、水に溶けやすく、有機溶媒には溶けにく
い、これらの理由からタンパク質を溶かしやすい有機溶
媒としてジメチルスルホキシドを用いる必要がある。し
かしジメチルスルホキシドは高濃度では酵素を失活させ
る。したがって反応溶媒中のジメチルスルホキシドの濃
度は酵素により異なるが６０％以下に抑えるのが好まし
く、より好ましくは５０％程度である０反応溶媒として
はジメチルスルホキシドと共に水、ジメチルホルム７ミ
ドなどを用いることができる。
また前記一般式［ＩＩで表わされる本発明の修飾剤はア
ルカリ中で式（２〕に示すような分解を受ける。
ルカリ中で式（２〕に示すような分解を受ける。
υ
・・・（２）
一力１式（３）で示される修飾反応も一般にアルカリ中
で、すなわちｐＨ値の高い程、その反応速度が大きくな
る。
で、すなわちｐＨ値の高い程、その反応速度が大きくな
る。
υ
・・−（３）
したがって（２）の分解反応が生起しない条件ドでは（
３）の修飾反応も起きないため比較的高いｐＨで反応さ
せる必要がある。しかし高ＰＨ下では多くの酵素は不Ｉ
Ｉｆ逆的に失活するために、酵、にの失活がみられない
範囲で高いＰＨを選ぶことが必要となる。したがって修
飾反応はガラス電極で測定されるｐＨ７〜９の範囲で行
う。
３）の修飾反応も起きないため比較的高いｐＨで反応さ
せる必要がある。しかし高ＰＨ下では多くの酵素は不Ｉ
Ｉｆ逆的に失活するために、酵、にの失活がみられない
範囲で高いＰＨを選ぶことが必要となる。したがって修
飾反応はガラス電極で測定されるｐＨ７〜９の範囲で行
う。
このｐＨの調装は、緩衝溶液として行うのがよいが、具
体的には、ホウ酸緩衝液、リン酸！ｌ衝液、トリス−塩
類緩衝液、ＧＯＯｄＩ７）＃衝液などがＩｎいられる。
体的には、ホウ酸緩衝液、リン酸！ｌ衝液、トリス−塩
類緩衝液、ＧＯＯｄＩ７）＃衝液などがＩｎいられる。
なお、本発明の修飾反応の副反応として分子内架橋があ
ったり、あるいは反応式（３）に示したような２ ＩＩ
）体ではなく ３ 、４ 漬体も生成するが。
ったり、あるいは反応式（３）に示したような２ ＩＩ
）体ではなく ３ 、４ 漬体も生成するが。
これらは分子ｒ−が大さく異なるためにゲル口過法など
により、分取でさる。
により、分取でさる。
本発明の分子間架橋反応用修飾剤の使用量は、好ましく
は、タンパク質のリジン残基モル濃度に：に４ Ｌ １
〜１０＃ｓ当；１シの範囲である。
は、タンパク質のリジン残基モル濃度に：に４ Ｌ １
〜１０＃ｓ当；１シの範囲である。
（発１！１の効果）
本発明によれば、タンパク質を分子間架橋させてｆＩＪ
Ｊの失活を起さず、酵素分子の安定性を向上させ、また
分子量が大きくなることにより、バイオリアクターの触
媒としての利用性を高めるというすぐれた効果を奏する
。
Ｊの失活を起さず、酵素分子の安定性を向上させ、また
分子量が大きくなることにより、バイオリアクターの触
媒としての利用性を高めるというすぐれた効果を奏する
。
本発明の修飾剤及びその使用方法を適用する好ましい酵
素としてはりポキシゲナーゼ、リパーゼ、ホスホリパー
ゼ、チロシナーゼなどがあげられる。
素としてはりポキシゲナーゼ、リパーゼ、ホスホリパー
ゼ、チロシナーゼなどがあげられる。
（実施例及び参考例）
次に実施例及び参考例により１本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
参考例１
修飾剤として例示化合物（２）（前記一般式１式％
ｍ見のりオキサンに溶解し、０．１Ｍの各ｐＨの緩衝液
３ｍ見に、ｌＯ終交の（２）のジオキサン溶液を入れ、
攪拌ド、２５℃で分解産物のＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドを２５８ｎｍの紫外吸収で追跡した０分解反応は１
次反応であった。１次反応速度定数は第２表の通り（Ｖ
ｄｃｃｏ■ｐ＝／’ｒ１．ｄＸ［修飾剤］） ［］はＣ度を表わす。
３ｍ見に、ｌＯ終交の（２）のジオキサン溶液を入れ、
攪拌ド、２５℃で分解産物のＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドを２５８ｎｍの紫外吸収で追跡した０分解反応は１
次反応であった。１次反応速度定数は第２表の通り（Ｖ
ｄｃｃｏ■ｐ＝／’ｒ１．ｄＸ［修飾剤］） ［］はＣ度を表わす。
第２表 修飾剤（例示化合物（２））の分解反応速度
定ａ（２５℃） また温度の分解反応速度定数への影響（０，１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ８，４）は第３表の通り。
定ａ（２５℃） また温度の分解反応速度定数への影響（０，１Ｍリン酸
緩衝液、ｐＨ８，４）は第３表の通り。
第３表 ｔ１飾剤（例示化合物（２））の分解反応速
度定数（ｐＨ８，４） 五記表の結果より、ｐＨおよび温度の高い程分解反応速
度は大きく１分解反応を抑えるためには比較的低い温度
とｐＨが好ましいことがわかる。
度定数（ｐＨ８，４） 五記表の結果より、ｐＨおよび温度の高い程分解反応速
度は大きく１分解反応を抑えるためには比較的低い温度
とｐＨが好ましいことがわかる。
参考例２
分解速度および修飾反応速度に対する本発明の修飾剤の
炭Ｊ鎖長の影響を調べるために、ｐＨ７，４（リン酸１
４衝液）、２５℃における分解速度定数および牛血清ア
ルブミンとの２次反応速度定数を求めた。修飾剤の濃度
はｌＯ’Ｍ、牛血清アルブミンの濃度は１ｍｇ／ｍｕ（
リジン残基モルｅ度では８９７ 、Ｍ）とした、ｌｌ１
１定は１ｍｇ／ｍｌの生血７．１フルブミン溶液（ｐＨ
７，４のリン酸緩衝液中）、３ｍ見にＯ、ＯＩＭの６炭
よ鎖長（５，６，８，ｔｏおよび１２）の修飾剤のジメ
チルスルホキシド溶液を３０終見添加し、生成するＮ−
ヒドロキシスクシンイミドを２５８ｎｍの紫外吸収によ
りＪｌｌ定して行った。牛血清アルブミンと修飾剤との
２次反応速度定数は式（４）より求めた。
炭Ｊ鎖長の影響を調べるために、ｐＨ７，４（リン酸１
４衝液）、２５℃における分解速度定数および牛血清ア
ルブミンとの２次反応速度定数を求めた。修飾剤の濃度
はｌＯ’Ｍ、牛血清アルブミンの濃度は１ｍｇ／ｍｕ（
リジン残基モルｅ度では８９７ 、Ｍ）とした、ｌｌ１
１定は１ｍｇ／ｍｌの生血７．１フルブミン溶液（ｐＨ
７，４のリン酸緩衝液中）、３ｍ見にＯ、ＯＩＭの６炭
よ鎖長（５，６，８，ｔｏおよび１２）の修飾剤のジメ
チルスルホキシド溶液を３０終見添加し、生成するＮ−
ヒドロキシスクシンイミドを２５８ｎｍの紫外吸収によ
りＪｌｌ定して行った。牛血清アルブミンと修飾剤との
２次反応速度定数は式（４）より求めた。
Ｖ＝Ａ、、ｏｂｓＸ ［ｔｖｆＩＩ剤］＝ Ｃｋ 、、
ｄ＋４２［牛血清フルフミ７１） Ｃｆ５ｔｉ剤］ −
（４）結果を第４表に示す。
ｄ＋４２［牛血清フルフミ７１） Ｃｆ５ｔｉ剤］ −
（４）結果を第４表に示す。
第４表
１確な測定はできなかった。
ただし０．１６２よりかなり小さい。
すなわち分解反応速度は修飾剤の度素頻長の増加に従っ
て誠少するが、牛血清アルブミンとの修飾反応は炭Ｊ鎖
長の増加に従って増加する。
て誠少するが、牛血清アルブミンとの修飾反応は炭Ｊ鎖
長の増加に従って増加する。
実施例１（修飾剤９例示化合物（３）の合成）アジピン
酸１４．６ｇ（０，１モル）及びＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド２３．０ｇ（０，２モル）をｔｉの３７０フラ
スコに秤取しジオキサン４００ｍ文を加えマグネチック
スタラーで攪拌し完全に溶解した後、ＤＣＣ４１，２ｇ
（０，２ｎｏ ｌ）を含むジオキサン溶液２００ｍ見を
徐々に部下した６滴下すると白濁が生じ、わずかに発熱
するが特に冷却する必要はない、３時間放置後、沈殿を
ろ別する。溶剤を留去後、デシケータ−中で減圧乾燥し
粗生成物（白色固体）を得た。
酸１４．６ｇ（０，１モル）及びＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド２３．０ｇ（０，２モル）をｔｉの３７０フラ
スコに秤取しジオキサン４００ｍ文を加えマグネチック
スタラーで攪拌し完全に溶解した後、ＤＣＣ４１，２ｇ
（０，２ｎｏ ｌ）を含むジオキサン溶液２００ｍ見を
徐々に部下した６滴下すると白濁が生じ、わずかに発熱
するが特に冷却する必要はない、３時間放置後、沈殿を
ろ別する。溶剤を留去後、デシケータ−中で減圧乾燥し
粗生成物（白色固体）を得た。
粗生成物はＨＰＬＣ分析により数種類から成る混合物で
あることを確認したので以下の精製を行った。
あることを確認したので以下の精製を行った。
粗生成物にヘキサンを加えよく攪拌した後静置しデカン
テーンヨンによりヘキサン可溶部を除去（３００ｍ見×
３回）した、ヘキサン不溶部は溶剤を完全に留去した後
、エタノールにより再結晶を行い白色固体の例示化合物
（３）、２０．３ｇをｔＵだ、これはＨＰＬＣ分析によ
れば９５％以にノ純度であった。マススペクトルから分
子量（Ｍａｌ）を確認した。
テーンヨンによりヘキサン可溶部を除去（３００ｍ見×
３回）した、ヘキサン不溶部は溶剤を完全に留去した後
、エタノールにより再結晶を行い白色固体の例示化合物
（３）、２０．３ｇをｔＵだ、これはＨＰＬＣ分析によ
れば９５％以にノ純度であった。マススペクトルから分
子量（Ｍａｌ）を確認した。
実施例２ （修ｍ剤２例示化合物（２）ほかの合成）
アジピン酸の代りにグルタルａ ｌ ３ 、２ ｇ（０
，１モル）を用いた以外は実施例１と全く同様にして反
応を行い粗生成物を得た。実施例１と同様にしてＭ（溶
部を除去後、減圧乾燥した後、ジオキサン５０ｔｎＱを
加え溶解し、エタノール１５０ｍｕを加えると白色の結
晶が析出する。これをろ過して例示化合物（２）の白色
固体（２３，６ｇ）を得た。ＨＰＬＣ分析により純度は
９９％であった。
，１モル）を用いた以外は実施例１と全く同様にして反
応を行い粗生成物を得た。実施例１と同様にしてＭ（溶
部を除去後、減圧乾燥した後、ジオキサン５０ｔｎＱを
加え溶解し、エタノール１５０ｍｕを加えると白色の結
晶が析出する。これをろ過して例示化合物（２）の白色
固体（２３，６ｇ）を得た。ＨＰＬＣ分析により純度は
９９％であった。
グルタル酸の代りにコハク酸、ヘプタン二酸。
オクタン二階、ノナンニ酸、デカンニ酸、又はドデカン
二酸を００１モル用い、上記と同様にして合成を行って
、例示化合物（１）、（４）〜（８）を得た。この収率
、純度を第５表に示した。
二酸を００１モル用い、上記と同様にして合成を行って
、例示化合物（１）、（４）〜（８）を得た。この収率
、純度を第５表に示した。
第５表
実施例３
ジメチルスルホキシドの０．１０．２０〜８０．９０％
溶液を作り、それらの溶液のみかけのｐＨを７．０に調
製した。これらの溶液４．５ｍｌに、リポキシゲナーゼ
溶液（ｐＨ７，０のリン酸１次液にｃ度５ｍｇ／ｍｕで
溶解したもの）を０．５ｍｕづつ加え、２５℃でインキ
ュベートし、それらの酵素活性を測定した。１１４定条
件は。
溶液を作り、それらの溶液のみかけのｐＨを７．０に調
製した。これらの溶液４．５ｍｌに、リポキシゲナーゼ
溶液（ｐＨ７，０のリン酸１次液にｃ度５ｍｇ／ｍｕで
溶解したもの）を０．５ｍｕづつ加え、２５℃でインキ
ュベートし、それらの酵素活性を測定した。１１４定条
件は。
２５℃、ｐ Ｈ９、ノ、（質のリノール酸ナトリウム１
００終Ｍの基質溶液に１０棒見の各酵素溶液を加え、１
■拌ドで生成する過酸化物を２３４ｎｍの紫外吸収で追
跡した。その結果を第１図に示す。
００終Ｍの基質溶液に１０棒見の各酵素溶液を加え、１
■拌ドで生成する過酸化物を２３４ｎｍの紫外吸収で追
跡した。その結果を第１図に示す。
５１１間のインキュベーションでは、約５０％までのジ
メチルスルホキシドでよくその活性を保持したが、５０
％以１．で急激な失活を示した。
メチルスルホキシドでよくその活性を保持したが、５０
％以１．で急激な失活を示した。
ざらにリポキシゲナーゼをｐＨの異なる緩衝液に溶解し
、２５℃でインキュベートしてその活性変化をみた。そ
の結果を第２図に示す、ＰＨ４，０４〜ｐ Ｈ９、０１
の範囲では５０時間後まで活性低トはみられなかったが
、ＰＨ９，５１以上で、Ｈの高い程大きな活性低下がみ
られた。
、２５℃でインキュベートしてその活性変化をみた。そ
の結果を第２図に示す、ＰＨ４，０４〜ｐ Ｈ９、０１
の範囲では５０時間後まで活性低トはみられなかったが
、ＰＨ９，５１以上で、Ｈの高い程大きな活性低下がみ
られた。
実施例４
０．１Ｍ−酢ＭＳｌｅｔｔｉＭ（ｐＨ４，０） と０．
１Ｍホウ酸！Ｒ轡液（ｐＨ６，０）をそれぞれ等量のジ
メチルスルホキシドと混合するとみかけのｐＨ値はそれ
ぞれ５．７８と８．７０を示した。これらのジメチルス
ルホキシド５０％溶液にリポキシゲナーゼを５ ｍ ｇ
／ ｍ見で溶解し、０．１Ｍ修飾剤（例示化合物（２
）と（７）、すなわち炭素鎖長が５のものと１０のもの
の２種）のジメチルスルホキシド溶液を１％添加して、
室温で１日攪拌した。すなわち反応条件は、リポキシゲ
ナーゼ５ｍｇ／ｍＣ修飾剤０．００１Ｍ、ジメチルスル
ホキシド５０％であった。その後、０．１Ｍ−リンｍ緩
衝液で透析を行い、ゲルクロマトグラフィー（充層ｉ剤
トヨパールＨＷ −６０Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけた
結果を第３図に示す、ｐＨ４の場合は架橋リポキシゲナ
ーゼはみられなかったがＰＨ６，０の場合は二量体リポ
キシゲナーゼがみられた。また炭素鎖の長い方が！Ｊ橘
反応をしやすいことがわかった。
１Ｍホウ酸！Ｒ轡液（ｐＨ６，０）をそれぞれ等量のジ
メチルスルホキシドと混合するとみかけのｐＨ値はそれ
ぞれ５．７８と８．７０を示した。これらのジメチルス
ルホキシド５０％溶液にリポキシゲナーゼを５ ｍ ｇ
／ ｍ見で溶解し、０．１Ｍ修飾剤（例示化合物（２
）と（７）、すなわち炭素鎖長が５のものと１０のもの
の２種）のジメチルスルホキシド溶液を１％添加して、
室温で１日攪拌した。すなわち反応条件は、リポキシゲ
ナーゼ５ｍｇ／ｍＣ修飾剤０．００１Ｍ、ジメチルスル
ホキシド５０％であった。その後、０．１Ｍ−リンｍ緩
衝液で透析を行い、ゲルクロマトグラフィー（充層ｉ剤
トヨパールＨＷ −６０Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけた
結果を第３図に示す、ｐＨ４の場合は架橋リポキシゲナ
ーゼはみられなかったがＰＨ６，０の場合は二量体リポ
キシゲナーゼがみられた。また炭素鎖の長い方が！Ｊ橘
反応をしやすいことがわかった。
第１図は、ジメチルスルホキシド濃度と酵素活性との関
係を示すグラフ、第２図はｐＨとｆＷ素素性性の関係を
示すグラフ、第３図はゲルクロマトグラフィーによる溶
出液ψと溶出成分との関係を示すグラフである。 出願人 工業技術院長 用田裕部 指定代理人 化学技術研究所長 藤堂尚１〒第１ ＝＼− ，３３入
係を示すグラフ、第２図はｐＨとｆＷ素素性性の関係を
示すグラフ、第３図はゲルクロマトグラフィーによる溶
出液ψと溶出成分との関係を示すグラフである。 出願人 工業技術院長 用田裕部 指定代理人 化学技術研究所長 藤堂尚１〒第１ ＝＼− ，３３入
Claims (2)
- （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは２〜１０の整数を示す） で表わされる化合物よりなることを特徴とするタンパク
質の分子間架橋反応用修飾剤。 - （２）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは２〜１０の整数を示す） で表わされる化合物よりなるタンパク質の分子間架橋反
応用修飾剤をタンパク質と反応させるに当り、ジメチル
スルホキシドを含有するｐＨ７〜９の溶液中で反応を行
わせることを特徴とする分子間架橋タンパク質の生成方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19326184A JPS6169759A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | タンパク質の架橋反応用修飾剤及びそれを用いる方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP19326184A JPS6169759A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | タンパク質の架橋反応用修飾剤及びそれを用いる方法 |
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| JPS6169759A true JPS6169759A (ja) | 1986-04-10 |
Family
ID=16304999
Family Applications (1)
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| JP19326184A Pending JPS6169759A (ja) | 1984-09-14 | 1984-09-14 | タンパク質の架橋反応用修飾剤及びそれを用いる方法 |
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1984
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