DE2631656A1

DE2631656A1 - Neue hydroxy-succinimido-ester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2631656A1
Application number: DE19762631656
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr Rer Nat Batz; Juergen Dr Rer Nat Horn; Josef Maier; Michael D Nelboeck-Hochstetter; Klaus Dr Rer Nat Stellner; Guenter Dr Rer Nat Weimann
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1976-07-14
Filing date: 1976-07-14
Publication date: 1978-01-19
Also published as: SE424319B; US4248786A; JPS6014028B2; DK319277A; ATA376577A; JPS539762A; NL168220C; NL168220B; FR2358394B1; DE2631656C2; SE7707734L; IT1080882B; GB1523711A; NL7706944A; US4155914A; FR2358394A1; HU175883B; AT360981B

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. EWiuckmann, Dipl.-Phys.

Dipl.-Ing. F. AJ⁷EICKMANn₁ Dipl.-Chem. B. Huber

^ 8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820 MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim-Waldhof,

Sandhof er Str. 112-132

Neue Hydroxy-Succinimido-Ester, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Die Erfindung betrifft neue Hydroxy-Succinimido-Esterderivate, Verfahren zu Ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von kovalenten Verknüpfungen von Proteinen, insbesondere biologisch aktiven Proteinen, zum Zwecke der Vernetzung bzw. Trägerfixierung.

Das Interesse an immobilisierten, insbesondere an trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen nimmt in vielen Zweigen der Technik laufend zu. Es sind auch schon mehrere Verfahren zur kovalenten Verknüpfung von Proteinen mit Trägersubstanzen bekannt, z. B. aus DT-AS 21 28 743 und DT-OS 22 60 185. Zu den wichtigsten Gründen für dieses Interesse an immobilisierten Enzymen gehören die dadurch bewirkte Stabilisierung des biologisch aktiven Materials und die Möglichkeit, es leicht aus wässrigen Reaktionsmedien abtrennen zu können.

Bei den ältesten Verfahren zur kovalenten Bindung biologisch aktiver Proteine bediente man sich vor allem der Einführung aktivierender Gruppen in die Trägermatrix. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methoden besteht in den geringen Aktivitätsausbeuten, die auf eine Beeinflussung der aktiven Konfiguration des Proteins durch die enge Nachbarschaft der Trägermatrix beruht. Man hat daher ver-

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sucht, diesen Nachteil zu beseitigen, indem zwischen Protein und Träger Distanzglieder (Spacer; Brückenbildner) zwischengeschaltet wurden.

Diese Distanzglieder stammen von Brückenbildnerverbindungen ab, bei denen es sich zumeist um homo- oder heterodifunktionelle Verbindungen handelt, welche eine mit dem Protein in wässriger Lösung reaktive Funktion, die zur Herstellung einer kovalenten Bildung führt, und eine weitere zur Herstellung der Bindung mit dem Träger geeignete Funktion aufweist. Bei homodifunktioneilen Brückenbildnern wie Glutardialdehyd oder Diepoxiden sind beide funktioneilen Gruppen gleich.

Daher werden Protein und Träger gleichzeitig umgesetzt und es erfolgt sowohl eine Proteinvernetzung als auch eine Bindung mit dem Träger nebeneinander. Als günstiger erwiesen sich Verfahren, bei denen in zweistufiger Arbeitsweise gearbeitet wird, unter Verknüpfung des Brückenbildnermoleküls zuerst mit dem Protein oder mit dem Träger und anschließend mit dem Träger bzw. dem Protein. Für dieses Verfahren erwiesen sich die heterodifunktionellen Brückenbildnerverbindungen mit zwei verschiedenen funktioneilen Gruppen unterschiedlicher Reaktivität als zweckmäßiger.

Außerdem ist es bekannt, zuerst physikalisch an Oberflächen geeigneter Träger zu adsorbieren und dann durch Vernetzung mit polyfunktionellen Brückenbildnern auf diesen Oberflächen zu fixieren.

Bei diesen Verfahren hat sich gezeigt, daß sich verschiedene Brückenbildnerverbindungen je nach dem zu bindenden Protein und dem zu verwendenden Trägermaterial recht unterschiedlich verhalten und zu höchst unterschiedlichen Ergebnissen führen. In der Praxis wird daher für jeden speziellen Fall der Proteinimmobilisierung durch Vorversuche die jeweils günstigste Brückenbildnersubstanz gesucht. Für manche Fälle besonders geeignete Brückenbildner erwiesen sich dabei in anderen Fällen als völlig unbefriedigend. In vielen

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Fällen gelang eine zufriedenstellende kovalente Bindung von aktiven Proteinen bisher überhaupt noch nicht. Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf an zusätzlichen Brückenbildnerverbindungen, durch die eine weitere Alternative für die kovalente Bindung von biologisch aktiven Proteinen insbesondere von Enzymen, geschaffen wird. Vor allem besteht ein Bedarf an derartigen Brückenbildnerverbindungen, die homodifunktionell oder heterodifunktionell sein können, welche einerseits mit Proteinen besonders rasch und schonend reagierende funktioneile Gruppen aufweisen, bei denen der Abstand zwischen den funktioneilen Gruppen so groß ist, daß Konformationsänderungen des gebundenen Proteins durch den Träger weitgehend ausgeschaltet sind und bei welchen die "Brücke" welche die beiden funktioneilen Gruppen verbindet hinsichtlich ihrer hydrophoben oder hydrophilen Eigenschaften nach Wunsch variiert werden kann. Aufgabe der Erfindung ist es daher, derartige Verbindungen zu schaffen.

Gelöst wird diese Aufgabe durchHYdroxy-succinimido-Esterderivate der allgemeinen Formel I

CO - CH₂

X - (CH„)n - A - CO-O-N^ ^τ

2m \

CO - CH₂

in der X eine weitere Carboxy-Succinimido-Estergruppe oder einen Rest der allgemeinen Formel

-CO- NH- CH₂ - CH (OR¹) II

- 0 - CO - C = CH₂ III

- CO - 0 - CH₀ - CH₀ - NH - CO - N (R¹) IV

AA A

bedeutet,

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A eine - O - CH„ - CH« - Gruppe, wenn η die Zahl 2 ist und X eine weitere Carboxy-succinimido-estergruppe ist und anderenfalls eine Einfachbindung,

η eine ganze Zahl von 3 bis 7
m die Zahl 1, 2, 3 oder 4

R ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder Cyanidgruppe und R¹ eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet.

Je nach Art des Restes X handelt es sich um homodifunktionelle oder um heterodifunktionelle Verbindungen.■ Durch Variation von m und η läßt sich ein bestimmter gewünschter Grad an Hydrophobie oder Hydrophilie der Brücke "maßschneidern". Dabei nehmen die hydrophoben Eigenschaften zu, wenn η größer wird und die hydrophilen Eigenschaften nehmen zu, wenn m größer wird. Falls eine Vernetzung der Proteine gewünscht wird, werden die homodifunktionellen Verbindungen der Erfindung bevorzugt, bei gezielter Verknüpfung mit einem festen oder flüssigem Trägermaterial werden dagegen die heterofunktionellen Verbindungen, in denen X einen Rest der Formel II, III oder IV bedeutet, bevorzugt. Erfolgt dabei die Verknüpfung mit dem Träger durch Copolymerisation, so eignen sich besonders Verbindungen in denen X der Formel III entspricht. Die Hydroxysuccinimid-estergruppe (HOSu-Rest) reagiert in wässriger Lösung selektiv mit Aminen und ist daher besonders geeignet für die kovalente Bindung von Proteinen.

Erfindungsgemäß kann die Herstellung der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I erfolgen, indem die dem Hydroxy-succinimido-Ester zugrundeliegende Mono- oder Dicarbonsäure entweder

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a) in an sich bekannter Weise in ein reaktives Derivat, wie das Säurechlorid oder gemischte Anhydrid überführt, und das reaktive Derivat in einem organischen Lösungsmittel mit N-Hydroxy-Succinimid umgesetzt wird, oder

b) direkt in einem p°laren organischen Lösungsmittel mit N-Hydroxy-Succinimid in Gegenwart einer letzterem äquimolaren Menge Cyclohexylcarbodiimid kondensiert wird oder

c) in Form des .Alkalisalzes mit N-Rydroxy-Succinimidomethylsulfonat in Gegenwart einer Crown-Verbindung als Katalysator reagieren gelassen wird.

Die Herstellung der Verbindungen über die gemischten Anhydride in organischen Lösungsmittel wie z.B. Methylenchlorid, Furan, Dioxan und dergleichen, erwies sich in vielen Fällen als die einfachste und beste Methode. Vorzugsweise wird dabei als reaktives Säurederivat das gemischte Anhydrid mit der Chlor-Ameisensäure verwendet. Als Trägersubstanzen eignen sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur kovalenten Fixierung von Proteinen sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche, feste oder flüssige Substanzen, welche mit den durch X dargestellten funktionellen Gruppen zu reagieren vermögen. Reaktionsfähige Gruppen sind dabei OH-Gruppen, Aminogruppen.

Vorzugsweise werden solche Trägersubstanzen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber Mikroorganismen sind.

Gemäß einer bevorzugten VerfahrensVariante werden die erfindungsgemäßen Verbindungen , wenn X einen Rest der Formel III darstellt, .durch Copolymerisation mit einem Träger verknüpft, welcher in situ durch Polymerisation geeigneter Monomerer bzw. Monomergemisehe hergestellt wird oder direkt durch Copolymerisation mit geeigneten Comonomeren in einem Träger eingebaut.

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Das bei dieser Ausführungsform verwendete, copolymerisationsfähige Monomer kann wasserlöslich oder wasserunlöslich sein. Wasserlösliche Monomere werden bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Kupplungsverbindung zuerst mit dem biologisch aktiven Protein umgesetzt wurde und danach in homogener wässriger Lösung an den Träger fixiert werden soll, der dabei durch Copolymerisation in situ gebildet wird. Statt dessen ist es auch möglich, nach den Methoden der Suspensions- oder Emulsionspolymerisation zu arbeiten, wobei das Kupplungsprodukt von Protein und erfindungsgemäßer Verbindung der Formel I sich in der wässrigen dispersen Phase befindet und das wasserunlösliche Monomer oder Monomerengemisch die dispergierte Phase darstellt. Besonders bevorzugt werden als Comonomere wasserlösliche oder wasserunlösliche Derivate .der Acrylsäure oder Methacrylsäure wie beispielsweise die Amide, Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Unter den wasserlöslichen Comonomeren wird Acrylamid bevorzugt. Nichtwasserlösliche Derivate der Acrylsäure- oder Methacrylsäure, insbesondere solche, die durch Alkylreste substituiert sind, werden bevorzugt, wenn später das trägergebundene Protein in nicht rein wässrigen Systemen sondern in einem wässrig organischem Medium eingesetzt werden soll. Andere geeignete Monomere leiten sich beispielsweise von der Malein- oder Fumarsäure ab. Die brauchbaren Monomeren sind jedoch nicht auf die hier beispielsweise genannten beschränkt.

Als Monomer können auch Vorpolymerisate verwendet werden, die noch ungesättigte copolymerisationsfähige Gruppen enthalten.

Um bei derartigen durch Copolymerisation hergestellten Trägern die physikalischen Eigenschaften zu regulieren, werden zweckmäßig geeignete Vernetzer in entsprechenden Mengen zugesetzt. Beispiele für derartige Vernetzer sind Verbindungen mit wenigsten 2 copolymerisationfähigen Gruppen wie N, N¹ Methylen-bis-Acrylamid und Äthylendiacrylat. Es können aber auch radikalisch wirkende Vernetzer, z. B. bestimmte organische Peroxide verwendet werden.

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Bei Durchführung der Polymerisation in heterogener Phase, also als Suspensions- oder Emulsionspolymerisation, eignen sich z. B. wasserunlösliche Vernetzer wie Divinylbenzol und Äthylendimethacrylat. Zahlreiche andere Vernetzer sind dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl im jeweiligen Falle zu treffen liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Es ist jedoch auch möglich, Vernetzer erst nachträglich einzubringen und die Vernetzung vorzunehmen, nachdem die Herstellung des polymeren Trägers und die Verknüpfung mit dem aktiven Protein bereits erfolgt ist.

Wird auf eine Vernetzung des gebildeten Polymers verzichtet, so erhält man lösliche oder thermoplastische Trägermaterialien. Diese können für spinnfähige oder extrudierbare Lösungen verwendet werden, aus denen die trägergebundenen Proteine, z.B. in Form von Fäden oder Folien, nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können.

Für die Kupplung mit hydroxygruppenhaltigen Trägersubstanzen eignen sich besonders solche Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen X ein Rest der Formel IV ist. Dieser Rest bildet nämlich beim Erhitzen auf ca. 100 ⁰C in organischen Lösungsmitteln wie z. B. Dimethylsulfoxid unter Abspaltung von Diäthylamin das entsprechende Isocyanat der Formel IVa,

-N = C = O

welches bei 0 ⁰C mit Hydroxy-Gruppen reagiert. Unter diesen Bedingungen reagiert die Hydroxy-Succinimido-Estergruppe (OSu-Ester) noch nicht, so daß eine selektive Reaktion der beiden funktioneilen Gruppen des Moleküls durch Umsetzung unter den jeweils geeigneten Bedingungen möglich ist.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen X eine Gruppe der allgemeinen Formel II darstellt, werden zunächst über den HOSu-Rest mit einer aminogruppenhaltiqen niedermolekularen oder hochmolekularen Substanz zur Reaktion gebracht und anschließend in schwachsaure wässrige Lösung zur

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weiteren umsetzung gebracht. UnI er diesen Bedingungen bildet sich aus dem Acetal der freie Aldehyd, der dann in der dem Fachmann bekannten Weise weiter reagiert, beispielsweise mit Aminogruppen, unter Bildung einer Schiff'sehen Base, die danach unter Bildung einer kovalenten Bindung reduziert wird, z.B. mit Natriumborhydrid, oder durch analoge umsetzung mit Hydroxylamin-, Hydrazin- und Semicarboxidderivaten.

Als Träger können weiterhin auch solche festen Substanzen verwendet werden, die keine mit den funktioneilen Gruppen der erfindungsgemäßen Verbindungen reaktionsfähigen Stellen aufweisen. In solchen Fällen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen als Vernetzer eingesetzt. Hierbei wird zweckmäßig zuerst das aktive Protein auf die Oberfläche des Trägerkörpers gebracht, beispielsweise durch Adsorption, Beschichten mit einer Lösung des Proteins oder dergleichen und anschließend erfolgt die Verankerung auf dieser Oberfläche durch Vernetzung mit einer erfindungsgemäßen Verbindung, wobei vorzugsweise zwar die homodifunktionellen Derivate verwendet werden, also diejenigen Verbindungen, in denen X eine weitere Carboxy-succinimido-Estergruppe darstellt, jedoch können auch Verbindungen in denen X der Formel IV entspricht, für die Vernetzung eingesetzt werden.

Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Anwendungsweise der neuen Verbindungen besteht darin, daß das biologisch aktive Protein sowohl mit einer homodifunktionellen als auch mit einer heterodifunktioneIlen Verbindung von Formel I umgesetzt wird. Beispielsweise wird das Protein zuerst mit einer Verbindung zur Reaktion gebracht, in welcher X eine Gruppe der allgemeinen Formel III isto Dies führt zur Einführung von copolymerisationsfähigen Resten. Anschließend wird eine vernetzungsfähige, vorzugsweise eine homodifunktionelle Verbindung zugegeben, in der also X eine weitere Carboxysuccinimido-Estergruppe darstellt. Dies führt zu einer Vernetzung, also zur Kupplung mehrerer Moleküle aneinander. Dieses aus mehreren Proteineinheiten bestehende komplexe Gebilde läßt sich dann wie oben beschrieben, mittels der daran hängenden copolymerisationsfähigen Reste nach den oben beschriebenen Methoden der Protein-Copolymerisation

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an einem Träger immobilisieren. Ebenso ist es auch möglich, an Stelle einer copolymerisationsfähigen Gruppe eine Gruppe der Formel II oder IV nach dieser Methode einzuführen und die Bindung mit einem bereits vorgebildeten Träger herzustellen.

Nach einer weiteren Variante wird zuerst das Protein vernetzt unter Bindung mehrerer Proteinmoleküle aneinander und danach erfolgt erst die Immobilisierung an einem Träger mit der gleichen oder einer anderen Verbindung der Formel I.

Biologisch aktive Proteine, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kovalent gebunden werden können, sind enzymatisch aktive Proteine, immunologisch aktive Proteine wie Antikörper, Immunoglobuline und dergleichen sowie hormoneil aktive Proteine.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen zeichnen sich aus durch ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber Proteinen, die in wässriger oder wässrig- organischer Lösung zur Herstellung von kovalenten Bindungen unter weitgehendem Erhalt der biologischen Aktivität führt, sowie durch ihre Reaktionsfähigkeit mit copolymerisierbaren Doppelbindungen, Hydroxygruppen und Aminogruppen, sowie weiteren aktiven Gruppen, die an Trägersubstanzen für Proteine stehen. Ein weiterer Vorteil dieser Ester ist es, daß sie gut kristallisieren und daher leicht in reiner Form isoliert werden können. Sie sind in der Lage, mit derartigen Trägern kovalente Bindungen unter Bedingungen einzugehen, bei denen die biologische Aktivität von Proteinen erhalten bleibt. Außerdem können sie leicht hinsichtlich ihrer hydrophilen oder hydrophoben Eigenschaften nach Wunsch variiert werden. So können beispielsweise die symmetrischen Bishydroxysuccinimido-Ester in der jeweils geeigneten Menge zur Lösung eines Proteins in einem schwach alkalischen Puffer gegeben werden. Die dabei erhaltenen,vernetztenybiologiseh aktiven Proteine können entweder abgetrennt werden, beispielsweise durch Dialyse, Ultrafiltration und dergleichen, aufgetrennt werden, z. B. durch Gelchromatographie, oder

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-KT-

weiter umgesetzt werden, z. B. durch Bindung an einen Träger oder Einpolymerisation in einen solchen. Dabei sind die erfindungsgemäßen, vom Äthylenglycol abgeleiteten Verbindungen aufgrund ihrer Hydrophilie einfachen Dicarbonsäure-hydroxy-succinimido-Estern überlegen. Aufgrund ihrer besseren Wasserlöslichkeit reagieren sie schneller und die Denaturierung des biologisch aktiven Proteins wird zurückgedrängt.

Bei den unsymmetrischen (heterodifunktionellen) Verbindungen ist es z. B. möglich, die Amidoacetaldehydacetalgruppe nach Kupplung der Hydroxy-Succinimid-Gruppe mit einem Protein durch Ansäuern in den freien Aldehyd zu überführen, der dann mit einer weiteren aminogruppenhaltigen Substanz, wie oben beschrieben,umgesetzt wird.

Es können daher sowohl z. B. zwei verschiedene Enzyme miteinander oder ein Enzym an Albumin oder ein Antigen an Rinderserumalbumin oder an eine Polyaminosäure wie Polylysin gekuppelt werden.

Die eine copolymerisationsfähige Doppelbindung enthaltenden Verbindungen können z. B. nach den in DT-AS 21 30 913 und DT-OS 21 28 743 beschriebenen Methoden für die Proteincopolymerisation eingesetzt werden. Ebenso ist es möglich, diese Verbindungen auch erst einer Copolymerisation zu unterwerfen, wobei je nach Wahl des Comonomeren gut oder weniger gut wasserlösliche Copolymere entstehen. An diese mit beliebigen Molekulargewichten herstellbaren Copolymeren können dann Proteine über die Hydroxy-Succinimido-Estergruppe gekuppelt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die erfindungsgemäßen Verbindungen, ihre Herstellung und ihre Anwendung weiter.

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t. Äthylenglycol-bis-propionsäure-bis-hydroxysuccinimidester Zu einer Lösung von 10,3 g Äthylenglycol-bis-propionsäure (hergestellt nach R.V. Christian und R.M. Hixon, J.Amer. Chem. Soc 70(1948) , 1333, Dok.-Nr. 12916) und von 12,6 gN-Hydroxysuccinimid in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran wird unter Rühren und Eiskühlung während einer Stunde eine TetrahydrofuranLösung von 22,7 g Dicyclohexylcarbodiimid getropft. Die Lösung wird nach 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden 0,3 ml Essigsäure zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde werden 150 ml abs. Essigester zugegeben, dann wird von dem ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird auf ein Drittel eingeengt, mit Wasser, Bicarbonat und wieder mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wird in Acetonitril aufgenommen, 24 Stunden bei +4 ⁰C stehen gelassen, dann von erneut ausgefallenem Harnstoff abfiltriert und wieder eingeengt. Aus dem zurückbleibenden öl kristallisiert das Produkt gemäß Beispielsüberschrift nach mehrtägigem Stehen bei +4? C aus. Es wird aus Essigester umkristallisiert.

Ausbeute: 25 %
Fp: 115°

C ,.H_n^N_nO.. ^ (400, 35) berechnet: C 47,99 H 5,0.4 N 6,99 Ib ZO λ ΊΟ

gefunden : C 47,9 5 H 5,04 N 6,87

². In Analogie zu Beispiel 1 wurde der Oxy-bis-propionsäurehydroxysuccinimidester hergestellt.

Ausbeute: 30 %
Fp: 131°C

3. Qxysuccinimido-Glutarsäure-aminoacetaldehyd-dimethyacetal

Zu einer Lösung von 11,4 g Glutarsäure-anhydrid in 100 ml Tetrahydrofuran wird gleichzeitig 10,1g Tfiäthylamin· und 13,-2g Aminoacetaldehyd-dimethylacetal getropft und dann noch 30 Minuten gerührt. Die entstandene Lösung wird auf +5⁰C abgekühlt und langsam mit 9,5 ml Chlorameisensäure-äthylester versetzt. Der Ansatz wird noch 30 Minuten bei -5°C gehalten. Dann

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werden bei O⁰C gleichzeitig 11,5 g Hydroxysuccinimid und 14,0 ml Triäthylamin zugetropft. Nach 5-stündiger Reaktionszeit bei + 25°c wird von ausgefallenem Triäthylamoniumchlorid abfiltriert, eingeengt, in Essigester wieder aufgenommen, mit Wasser, Bicarbonat und wieder mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Produkt gemäß Beispielsüberschrift wird aus heißem Essigester umkristallisiert.

Ausbeute: 45 %
Fp: 70°C

C H₂₀N₂O₇ (316,3) berechnet: C 49,60 H 6,38 N 8,85

gefunden : C 49,34 H 6,37 N 8,81

4. Methacrylolyl-w-hydroxy-carbonsaure-oxysuccinimidester

Die Methacrylolyl-w-oxycarbonsäuren werden in Analogie zu dem in "Makromol·. Chem.", 176, 3017 (1973) beschriebenen Verfahren hergestellt. In einem 500 ml-Dreihalskolben werden 0,1 Mol der jeweiligen Methacrylolyl-hydroxysäure und 0,11 Mol N-Hydroxysuccinimid in einer Mischung aus abs. Methylenchlorid und abs. Tetrahydrofuran vorgelegt und im Eisbad auf +5 C gekühlt. Dazu wird unter Rühren eine Lösung von 0,11 Mol Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 50 ml abs. Methylenchlorid, zugetropft. Es wird noch etwa 12 Stunden gerührt, wobei die Temperatur auf +25⁰C ansteigt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird danach abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das entstandene öl wird in Acetonitril aufgenommen und mehrere Stunden im Kühlschrank stehen gelassen. Erneut ausgefallener Harnstoff wird abgetrennt und das Acetonitril abgedampft. Das Produkt wird so in Form eines Öls erhalten.

5. Hydroxysuccinimido-N-2-hydroxyäthyl-N,'N'-dimethylharnstoff-bernsteinsäure-ester

13,2 g N-2-Hydroxyäthyl-N¹,N¹ -dimethyl-harnstoff werden in absolutem THF gelöst. Dann werden 2,4 g Natriumhydrid-Suspension in knapp 5 min zugetropft. Es wird bis zur Beendigung der Wasserstoffentwicklung bei Raumtemperatur gerührt und dann 10 g Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Nach weiterem

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24-stündigen Rühren wird eingeengt und Wasser zugegeben. Nach Beendigung der !!^Entwicklung werden die organischen Anteile abgetrennt, die Lösung angesäuert und mit Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet und eingeengt, wobei ein hellgelbes öl zurückbleibt. Ausbeute: 53 % der Theorie*

Aus dieser Säure wurde der Hydroxysuccinimidester in Analogie zu Beispiel Nr. 4. hergestellt.

Ausbeute: 35 % der Theorie; Fp: 97 - 98°C.

Analyse	* •	Ber.:	47	C	5	H	1	N	,8
	Ge f.:	47	,5	5	,8	1	2	,8
		,5	,8	2

Durch Erhitzen auf ca. 100 ⁰C in Dimethylsulfoxid wird Diäthylamin abgespalten unter Bildung des entsprechenden Isocyanats.

Anwendungsbeispiele

6. Stabilisierung von Trypsin durch Vernetzung mit verschiedenen symmetrischen bifunktionellen Verbindungen. a) Vergleichsversuch

Trypsin wurde in einem ersten Versuch mit Glutaraldehyd, in einem zweiten Versuch mit Korksäure-bisimidoester Hydrochloric umgesetzt und der Aktivitätsabfall.des so vernetzten Trypsins mit dem des freien Trypsins verglichen. Dabei wurden zu je 50 mg Trypsin in 25 ml destillierten Wasser je 2 pM der Vernetzersubstanz, gelöst in 0,05 M Phosphat-Puffer (7,5 pH) gegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Stunden war die Aktivität des freien sowie"des mit Glutaraldehyd vernetzten Trypsins auf 15% der Ausgangsaktivität gefallen. Nach 50 Stunden war die Aktivität bei allen drei Proben auf 0 gesunken. Das mit Korksäure-bisimidoester Hydrochlorid vernetzte Trypsin · hatte nach 20 Stunden noch 50%, nach 50 Stunden noch 30% und nach 100 Stunden noch 20% der Ausgangsaktivität.

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IG

Der Versuch wurde wiederholt mit den erfindungsgemäßen Estern der Beispiele 2. und 3. Nach 20 Stunden betrug die Aktivität mit der Verbindung von Beispiel 3. noch 85 %, mit der von Beispiel 4. noch 50 %. Nach 50 Stunden betrug die Aktivität des mit der Verbindung von Beispiel 2. vernetzten Trypsins 43 % bzw. 2 7 % mit der Verbindung von Beispiel 3. Nach 100 Stunden wurde mit der Verbindung von Beispiel 2. immer noch eine Aktivität von 25 % gemessen. Das Beispiel zeigt die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber bekannten Vernetzungsmitteln.

7. Stabilisierung von Nierenacylase durch Vernetzung. Die Aktivität der Nierenacylase in 0,1 M-Phophat-Puffer (pH 4) sinkt trotz Kühlung bei 4°C innerhalb von 3 bis 5 Tagen auf den Wert 0. Setzt man hingegen die Verbindung von Beispiel 1 oder Korksäure-bis-Hydroxysuccinimidester (hergestellt analog Beispiel 1.) zu, so erfolgt ein anfänglicher Aktivitätsabfall auf 70 bis 50 %. Diese verbleibende Aktivität wurde 2 Monate kontrolliert und blieb in diesem Zeitraum konstant. Dieses Ergebnis wurde bei Variaton der Mol-Verhältnisse von Protein zum Ester zwischen 1:1 und 1:8 stets erreicht.

Ein Vergleichsversuch unter Verwendung von Glutardialdehyd an Stelle der erfindungsgemäßen Bis-Ester führte zu keinerlei Stabilisierung.

8. Immobilisierung von Nierenacylase unter Copolymerisation. 1000mg Aminoacylase (Lyophilisat) spez. Akt.: 17,0 U/mg, werden in 25,0 ml Tris-Puffer, pH 8,3, 1 M bei + 4°C gelöst. Dazu werden 2,5 ml einer Lösung von 30,7 mg Methacryliiydroxycapronsäure-hydroxysuccinimidoester, Beispiel 4, in Dioxan gegeben.

Reaktionszeit: 12 h, Temp.: +4⁰C

6 g Acrylamid, 0,5 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 0,6 ml einer 1-proz. CoC^-Lösung werden in 22,5 ml des obigen Tris-Puffers gelöst. Nach Zugabe der vinylierten Enzymlösung wird die Polymerisation mit jeweils 1,5 ml einer 5-proz. Ammoniumperoxodisulfatsowie einer 5-proz. 3-Dimethylaminopropionitril-Lösung gestartet.

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Das entstandene Gel wird durch ein Sieb (Maschenweite 0,4 mm) gepreßt und mit Phosphat-Puffer 1 M, pH 7,5, in einer Säule eluiert.

1. Eluat 2 1 Puffer 1,88 % Akt. im Eluat spez.Akt.am Gel

193,1 U/g

2. Eluat 2 1 Puffer - 193,1 U/g

Aktivitätsausbeute: 6,9 %

Das Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von Acrylsäurechlorid anstelle der erfindungsgemäßen Verbindung. Dabei konnte keine Aktivität an den Träger gebunden werden.

9. Immobilisierung von Glucoseoxidase (GOD) durch 2-stufige Umsetzung mit erfindungsgemäßen Verbindungen und anschließende Copolymerisation.

Wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde GOD mit einer spez. Aktivität von ca. 210 U/mg mit der Verbindung von Beispiel 4 vorinkubiert, anschließend wurde eine kleine Menge der Verbindung von Beispiel 1 zugesetzt. Danach wurde weitere 24 Stunden stehen gelassen und anschließend wie im Beispiel 8 beschrieben, die Copolymerisation durchgeführt.

Im erhaltenen Gel wurde eine Aktivität von 290 U/g gemessen.

Eine Wiederholung dieses Versuches unter Verwendung von Acrylsäurechlorid an Stelle der erfindungsgemäßen Verbindungen ergab eine Aktivität von 2 35 U/g.

10. Kupplung von Angiotensin an RSA (Rinderserumalbumin)

25 mg Angiotensin werden in 10 ml Dioxan/Wasser (1:1) gelöst und mit einer Lösung von 6 mg der Verbindung von Beispiel 4in Dioxan versetzt. Dann wurde der pH-Wert auf 8,0 gebracht durch Zugabe von 5 % K₂CO₃-Lösung und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird durch Zugabe von Tetrahydrofuran ausgefällt, abzentrifugiert und.lyophilisiert.

-..*_-. 7Ö98 83/0 330

Ausbeute: 19,6 mg <4#

Die 19,6 mg dieses Zwischenproduktes werden auf pH = 4 gebracht und 1 h gerührt. Anschließend wird der pH-Wert wieder auf 8,0 gestellt und die Lösung mit 16,6 mg RSA versetzt. Nach einstündigem Rühren wird mit 1 mg Natriumborhydrid versetzt. Nach weiteren 20 Minuten wird noch einmal 1 mg zugegeben. Nach weiteren 60 Minuten ist die Reaktion beendet. Die Lösung wird eingeengt, in abs. Äthanol aufgenommen, filtriert. Wasser zugegeben und dann 4 Tage dialysiert. Aus dem Dialysat werden 24,1 mg Lyophilisat erhalten. Daraus ergibt sich, daß mit 1 Molekül RSA mindestens 24 Moleküle Angiotensin gekuppelt sind.

11, Copolymerisation der -Methacryloyl-hydroxycarbonsäurehydroxy—succinimidester mit Methacrylamid. Es wird eine sauerstofffreie Lösung (1 Mol/dm ) der beiden Monomeren in abs. Tetrahydrofuran hergestellt. (Monomerverhältnis Ester: Amid = 1:5). Die Polymerisation erfolgt durch Zugabe von 0,8% (mol/mol) AIBN (Azoisobuttersäuredinitril) bei 58°C. Nach vier Stunden wird die Polymerisation durch Abkühlung (Eintauchen in ein Eisbad) abgebrochen und das ausgefallene Polymer abgesaugt. Es wird in Wasser wieder gelöst und durch Eintropfen in Aceton umgefällt.

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Claims

CO - CH₂

CO - CH

in der X eine weitere Carboxy-Succinimido-Estergruppe oder einen Rest der allgemeinen Formel

-CO-NH- CH₂ - CH (OR¹)₂ II

oder

-0-CO-C=CH₂ R

oder

- CO - 0 - CH₂ - CH₂ - NH - CO - N (R¹)2 IV

bedeutet,

A eine - C - CH₉ - CH₉ - Gruppe, wenn η die Zahl 2

und X eine weitere Succinimido-Estergruppe ist,

andernfalls eine Einfachbindung

η eine ganze Zahl von 2 bis 7
m die Zahl 1, 2, 3 oder 4

R ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder Cyanidgruppe, R¹ eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet.

709883/0330 _nDir>

ORlGfNAL INSPECTED
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allge-. meinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Hydroxy-Succinimido-Ester zugrunde liegende Mono- oder Dicarbonsäure entweder

a) in an sich bekannter Weise in ein reaktives Derivat, wie das"Säurechlorid oder gemischte Anhydrid, überführt und das reaktive Derivat in einem organischen Lösungsmittel mit N-Hydroxy-Succinimid umgesetzt wird, oder

b) direkt in einem polaren organischen Lösungsmittel mit N-Hydroxy-Succinimid in Gegenwart einer letzterem äquimolaren Menge Cyclohexylcarbodiimid kondensiert wird oder

c) in Form des Alkalisalzes mit N-Hydroxy-Succinimidomethylsulfonat in Gegenwart einer Crown-Verbindung als Katalysator reagieren gelassen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als reaktives Säurederivat das gemischte Anhydrid mit der Chlor-Ameisensäure hergestellt wird.
4. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Bindung biologisch aktiven Proteinen aneinander und/oder an flüssige oder feste Trägerstoffe.

709883/0330