DE2260185A1 - Traegergebundenes protein und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Traegergebundenes protein und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number
DE2260185A1
DE2260185A1 DE2260185A DE2260185A DE2260185A1 DE 2260185 A1 DE2260185 A1 DE 2260185A1 DE 2260185 A DE2260185 A DE 2260185A DE 2260185 A DE2260185 A DE 2260185A DE 2260185 A1 DE2260185 A1 DE 2260185A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
carrier
group
protein
functional group
production
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE2260185A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2260185B2 (de
DE2260185C3 (de
Inventor
Klaus Dr Rer Nat Beaucamp
Hans Ulrich Prof Dr Bergmeyer
Karl-Heinz Botsch
Dieter Dr Phil Jaworak
Michael D Nelboeckhoschstetter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19712128743 external-priority patent/DE2128743C3/de
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Priority to DE2260185A priority Critical patent/DE2260185C3/de
Priority to CA183,976A priority patent/CA1023287A/en
Priority to IL43476A priority patent/IL43476A/en
Priority to IT30523/73A priority patent/IT1045912B/it
Priority to NLAANVRAGE7314673,A priority patent/NL175194C/xx
Priority to DK642173A priority patent/DK141555C/da
Priority to US05/420,510 priority patent/US3969287A/en
Priority to GB5602473A priority patent/GB1407150A/en
Priority to CH1707673A priority patent/CH619003A5/de
Priority to BE138625A priority patent/BE808354A/xx
Priority to SE7316574A priority patent/SE420498B/xx
Priority to SU1982569A priority patent/SU524521A3/ru
Priority to FR7343831A priority patent/FR2209775B2/fr
Priority to HUBO1474A priority patent/HU169972B/hu
Priority to ZA739318A priority patent/ZA739318B/xx
Priority to JP48137279A priority patent/JPS5749197B2/ja
Publication of DE2260185A1 publication Critical patent/DE2260185A1/de
Publication of DE2260185B2 publication Critical patent/DE2260185B2/de
Publication of DE2260185C3 publication Critical patent/DE2260185C3/de
Application granted granted Critical
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F289/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to macromolecular compounds not provided for in groups C08F251/00 - C08F287/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/098—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer formed in the presence of the enzymes or microbial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/18—Multi-enzyme systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. RWeicemann,
Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl-Phys. Dr.K.Finckb Dipl.^Ing. EÄ-Weickmann, Dipl^-Chem. B. Huber
I MÖNCHEN 16, DEN
POSTFACH »60120
MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 913921/22
HKW -
BQEHRINGER MANNHEIK SMBH, 68 Mannheim, Sandhofer.Straße 112-132
Trägergebundes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung
/Zusatz zu Patent .. βββ «So (Patentanmeldung P 21 28 743.4-4117
Im Hauptpatent wird ein Verfahren zvtx Herstellung toh trägerge bundenen Proteinen offenbart und beansprucht, w#X©h®s (Safer© h gekennzeichnet ist, daB ©in Protein in wässriger iSstmg mit einer Verbindung umgesetzt wird, welche mindestens ein© Epoxjgruppe und mindestens eine weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem !Präger geeignete funktionelle Gruppe aufweist,, und anschließend diese weitere funktionelle Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft wirdo
Die Erfindung des Hauptpatentes beruht also auf"dem Prinzip der Vorfixierung des Proteins mit einer wenigstens difunktlo-, nellen Verbindung in wässriger Lösunge wobei die eine Funktion eine Bindung mit dem Protein* insbesondere mit einer Aminogruppe im Protein, eingeht und nach der Verknüpfung der beiden
Substanzen anschließend eine Bindung mit der zweiten Funktion des ursprünglichen Monomeren an einen Träger hergestellt wird.
Nunmehr wurde gefunden, daß die Durchführbarkeit des Verfahrens des Hauptpatentes nicht auf solche Verbindungen beschränkt ist, welche eine Epoxygruppe zur Kupplung mit dem Protein enthalten, sondern daß hierfür alle Verbindungen geeignet sind, welche eine zur Kupplung mit einem Protein in wässriger Lösung geeignete Gruppe enthalten und eine Epoxygruppe nur ein Sonderfall dieses allgemeinen Prinzips darstellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen durch Umsetzung eines Proteins in wässriger Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine weitere, zur Herateilung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe aufweist und anschließend diese weitere funktioneile Gruppe mit einer Trägersubstanz; verknüpft wird nach Patent (Patentanmeldung P 21 28 743.4)» welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Umsetzung eine Verbindung verwendet wird, welche mindestens ein® zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe und wenigstens eine in wässriger Lösung proteinacylierende oder -alkyl!erende Gruppe enthält.
Die Vorteile des Verfahrens des Hauptpatentes bleiben bei der erfindungsgemäßen Weiterbildung in vollem Umfang erhalten. Als in wässriger Lösung proteinacylierende oder -alkyllerende Gruppen innerhalb der mit dem Protein zur Umsetzung gebrachten und im folgenden als "Kupplungsverbindung" bezeichnete Verbindung eignen sich zahlreiche Gruppierungen, wie sie insbesondere aus der Peptidchemie bereits bekannt sind. Bevorzugte acylierende oder alkylierende Gruppen im Sinne der Erfindung sind Äthylenimingruppen, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppen, Säurehalogenidgruppen, Azidgruppen« Säureanhydridgihippen,
409821/0402
Aldehydgruppen,, Oxazolongruppen sowie Verbindungen der all-
gemeinen Formel E-C , worin X einer der folgenden Formeln
VX entspricht: -
- N = NH
0 - C - 0 - E' η 0
Ό - E'
- 0 - P
- ο - ρ
0 - S - OM
ο'
- O - As
,0 - E1 Ό - E
S-CH2- GOOH
CH2 - CN
40S828/0402
- h
- O - N
1O
R1
- O - O - N
NO,
Cl » I'"""1111 1^ ^- Cl
ο -, CH
H
CH 		Cl
I
CH
N - SO2 -// \ -CH3
.NH-
- O - C
- N
409828/0402
In den obigen Formeln 1 bia 18 bedeutet S eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine. Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
R eine Aryl-, Aralfcyl- oder Halogengruppe. Phenyl- und Benssylgruppen werden unter den Aryl- und Aralkylgruppen bevorzugt. R* hat die selbe Bedeutung wie R und kann zusätzlich auch ein Wasserstoffatom sein. Andere Beispiele für zur Kupplung mit dem Protein geeigneten Acylierungs- bzw. Alkyllerungsmitteln entsprechen den nachstehenden Formel 19 und 20s
R-GH
NH
C'
Il
R - GH — C
NH- G'
In den obigen Formeln bedeutet R den Rest der Kupplungsverbindung, welche die zur Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe enthält. ·
409828/0402
Als weitere zur Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe kommen vorzugsweise solche Gruppen in Frage, welche zur Addition oder Kondensation mit der eigentlichen Trägersubstanz geeignet sind. Soweit Kupplungsverbindungen mit einer kondensationsfähigen Gruppe verwendet werden, 1st darauf zu achten, daß bei der Kondensation keine Substanzen abgespalten werden, welche die Aktivität des gebundenen Proteins nachteilig beeinflussen. Die Feststellung, ob bei einer bestimmten kondensationsfähigen Gruppe die Abspaltung zu einem Produkt führt, welches die Aktivität des eingesetzten Enzyms beeinträchtigt, läßt sich jeweils anhand des bestimmten zu bindenen Proteins durch wenige einfache Vorversuche leicht bestimmen. Allgemeine Aussagen über die Eignung bestimmter Gruppen lassen sich nicht aufstellen, da die verschiedenen aktiven Proteine höchst unterschiedliche Empfindlichkeit aufweisen. Beispielsweise wurde gefunden, daß Abspaltung von Halogeniden bei vielen empfindlichen Proteinen zu einem Aktivitätsverlust führt, während andere aktive Proteine hierdurch nicht nachteilig beeinfluß werden.
Ganz besonders schonend kann die Verknüpfung des Zwischenproduktes mit der Trägersubstanz durch Einpolynieri sation in die Trägersubstanz erfolgen. Besondere bevorzugt wird daher im Rahmen des Verfahren der Erfindung die Verwendung einer Kupplungsverbindung, welche wenigstens eine copolymerisationsfähi-
ge Doppelbindung, insbesondere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung als weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe enthält.
Als Trägersubstanzen lassen sich im Rahmen des e-rfiiiduugsgemäßen Verfahrens alle solchen wasserunlöslichen fftften Substanzen verwenden, welche über die· weitere funktioneile Gruppe der Kupplungsverbindung unter schonenden Bedingungen in wässriger Lösung mit dieser verknüpft werden können. Vorzugsweise werden Trägersubstanzen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weitgehend ladungsfrei sowie stabil gegenüber Mikro-
A09828/CH02
organi.smen sind. Die Trägersubstanz kann als solche in die wässrige Lösung zur Herstellung der Bindung mit dem Zwischenprodukt eingebracht werden, vorzugsweise wird die Trägersubstanz jedoch in der wässrigen Lösung selbst durch Polymerisation wasserlöslicher Monomerer hergestellt. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Umsetzung des Proteins mit der Kupplungsverbindung entweder bereits in Anwesenheit des oder der polymerisationsfähigen Monomeren erfolgen, wobei anschließend die Polymerisation unter Einpolymerisation des Kupplungsverbindung-Protein-Zwischenproduktes vorgenommen wird, oder das polymerisationsfähige Monomere oder die Monomerenmischung wird der Lösung erst · nach der Umsetzung zwischen Protein und Kupplungsverbindung zugesetzt und dann die Polymerisation ausgelöst.
Als Monomere kommen im Rahmen dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens solche wasserlöslichen Verbindungen in Frage, welche zur Polyaddition oder Polykondensation geeignet sind. Bevorzugt werden polyadditionsfähige Monomere, insbesondere solche Monomere, welche wenigstens eine olefinische Unsättigung enthalten. In diesem Falle stellt die weitere funktioneile Gruppe der Kupplungsverbindung ebenfalls vorzugsweise eine copolymerisationsfähige Doppelbindung dar*
Typische Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte Kupplungsverbindopgen sind Maleinsäureanhydrid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome der C-C-Doppelbindung durch Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ersetzt sind, Allylhalogenide, insbesondere Allylbromid und dessen Homologe, Acrylsäurechlorid und dessen Homologe, in denen die Η-Atome durch ein oder mehrere niedrig-Alkylgruppen ersetzt sind, Maleinsäure oder Fumarsäurechlorid und deren Homologe entsprechend der obigen Definition bei Maleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid, Athyleniminverbindungen, wie 1-Allyloxy-3-(N-äthylenimin)-propanol-(2) und ähnliche. . . -: ■ .' ; -..- ;"-.-"
409828/0402
Das bei der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugesetzte Monomer muß wie bereits erwähnt wasserlöslich sein und gleichzeitig eine polymerisationsfähige olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Vorzugsweise werden auch hier Verbindungen mit dem Michael-System, also mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in Nachbarschaft zu einer Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppelbindung verwendet. Besonders bevorzugt werden als Monomere die wasserlöslichen Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure, wie beispielsweise die Amide, Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Ganz besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von Acrylamid erzielt. Die Verbindungen können auch durch Alkylreste substituiert sein, solange hierdurch die Wasserlöslichkeit der Verbindung nicht zu sehr herabgedrtickt wird. Derartige Verbindungen mit verringerter Wasserlöslichkeit sind Jedoch von Vorteil, falls später das trägergebundene Enzym im nicht rein wässrigen System eingesetzt werden soll, beispielsweise in einem wässrig-organischen Medium. Auch die entsprechenden Derivate der Malein- oder Fumarsäure sind gut geeignet.
Alternativ können auch nicht-wasserlösliche Monomere verwendet werden. In diesem Falle wird die Polymerisation nicht in Lösung, sondern in Suspension durchgeführt. Letztere Methode ist von Vorteil, falls eine feinteilige perlförmige Matrix ohne Quellfähigkeit in wässrigen Systemen gewünscht wird. Die nach bekannten Methoden der Suspensionspolymerisation (Perlpolymerisation) erhaltenen Polymerisatkügelchen enthalten dann an ihre Oberfläche anpolymerisiert das Protein-Kupplungsverbindung-Anlagerungsprodukt.
Es kann ein einziges polymerisationsfähiges Monomer oder eine Mischung von Monomeren verwendet werden. Es ist auch möglich, ein noch ungesättigte Gruppen enthaltendes Vorpolymerisat zusammen mit einem Monomer einzusetzen.
409828/OA02
Je nach der gewünschten Konsistenz des Endproduktes werden dem Monomer noch Vernetzerverbindungen zugesetzt, die mehr· als eine polymerisationsfähige Gruppe enthalten. Beispiele für derartige Vernetzer sind li.N'-Methylen-bis-acrylamid und Äthylendiacrylat. Diese werden bevorzugt beim Arbeiten in wässriger Lösung. Falls eine Polymerisation in heterogener Phase, also eine Suspensionspolymerisation durchgeführt wird, können auch wasserunlösliche Vernetzer wie z.B. Divinylbenzol und Äthylen-di-methacrylat verwendet werden. Zahlreiche andere Vernetzer sind dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl im jeweiligen Falle zu treffen, liegt im Rahmen fachmännischen Handelns. Es ist auch möglich, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene trägergebunden Proteine, deren Träger nicht vernetzt ist, noch nachträglich zu vernetzen.
Wird kein Vernetzer verwendet, so erhält man Trägermaterialien, welche löslich oder thermoplastisch sind. Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in dieser Form führt zu spinnfähigen oder extrudierbaren Lösungen, aus denen die trägergebundenen Proteine z.B. in Fadenform oder in Form von Folien nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können. Derartige mit aktiven Proteinen kovalent gebundene Fäden oder Folien können nach den Methoden der Kunststofftechnik verstreckt, gesponnen und zu sonstigen Produkten verarbeitet werden, welche die aktiven Proteine gebunden enthalten und für Zwecke eingesetzt werden können, in denen diese Formen besondere Vorteile bieten, beispielsweise zur Herstellung von enzymatisch aktiven Sieben, Geweben, einpflanzbaren Fäden und dgl.
Zum Verspinnen aus wässriger Lösung kann beispielsweise das Vakuum-Spinnverfahren angewendet werden, bei dem die Lösung durch eine Spinndüse in ein Vakuum ausgepreßt wird. Dies kann
unter den Bedingungen einer Lyophilisierung erfolgen, die von den meisten aktiven Proteinen ohne Aktivitätsverlust ertragen wird.
4G9828/0A02
- ίο -
Für die Umsetzung von Protein und Kupplungsverbindungen gelten die hierzu im Stamrapatent gemachten Ausführungen in gleicher Weise. Die Umsetzung kann wie dort erwähnt, auch bereits in Gegenwart des Trägers bzw. der Ausgangsprodukte für die Herstellung des Trägers durchgeführt werden, soweit sichergestellt iBt, daß zuerst die Umsetzung von Protein und Kupplungsverbindung ablaufen kann, ehe die Bindung an den Träger erfolgt. Wird in Gegenwart der Ausgangsprodukte für den Träger gearbeitet, so läßt sich dies beispielsweise bequem dadurch erreichen, daß der Initiator für die Polymerisäionsreaktion unter Bildung des Trägers erst zugesetzt wird, wenn Protein und Kupplungsverbindung miteinander umgesetzt sind.
Erfindung gestattet auch Erzielung der gleichen Vorteile wie bereits im Stammpatent ausgeführt. Insbesondere wird jedoch durch die wesentlich verbreiterte Skala der anwendbaren Kupplungsverbindungen auch die Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens insgesamt erweitert. Inabesondere wenn anorganische Träger wie Glas und Oxyde bzw. Halogenide der Nebengruppenelemente als Träger verwendet werden, lassen sich nunmehr für fast jeden Fall geeignete Kupplungsverbindungen, die sowohl mit dem Protein als auch mit dem Träger zu reagieren vermögen, anhand der bekannten Reaktivitäten der funktioneilen Gruppen heraussuchen.
Von den übrigen Vorteilen seien vor allem verbesserte Ausbeute, Beseitigung von restlichen reaktiven Gruppen am Träger, die eich beim Fixierungsverfahren über aktivierte Träger nicht ausecjtiließen lassen, Fehlen der unerwünschten Ionenaustauschereigenachaften und damit auch von Quellung oder Schrumpfung bei erfindungsgemäß gebundenen Proteinen, Vermeidung von heteropolaren Bindungen des Proteins an Träger, Vermeidung unerwünschter Adsorptionseigenschaften sowohl hinsichtlich Cubstrat als auch Reaktionsprodukt, keine unerwünschte Verschiebung des pH-
409828/0402
Optimums genannt. Verbesserte Ausbeuten werden insbesondere bei der Fixierung der Proteine mit höheren Molekulargewichten erzielt. Beispielsweise ergibt eine Einschlußpolymerisation von; Katalase eine maximale Fixierung von 10 % in Acrylamidgel, bei erfindungsgemäßer Arbeitsweise, beispielsweise mit Acry-, loylchlorid als Kupplungsverbindung, 75 i» Ausbeute. Weiter besteht ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß auch aus Untereinheiten bestehende Proteine, die aufgrund ihrer Empfindlichkeit nach bekannten Methoden nicht oder nur schwierig am Träger gebunden werden können, mit guter Ausbeute und hoher Stabilität fixiert werden können, überraschenderweise hat sich außerdem gezeigt, daß erfindungsgemäß fixierte Enzyme stabiler sind als in ungebundener löslicher Form. Beispielsweise wurde erfindungsgemäß trägerfixierte Urease mit einem Molekulargewicht von 480 000 noch bei 700C als voll aktiv gefunden, während sie bei gleicher Temperatur in ungebundenem Zustand innerhalb kürzester Zeit irreversibel inaktiviert wird.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß sich gleichzeitig mehrere Enzyme, beispielsweise Glucoseoxydase und Katalase, auch bei unterschiedlicher Reaktivität und unterschiedlichem Molekulargewicht in ^ statistischer Verteilung an einen Träger fixieren oder in denselben einschließen lassen. Dies gelingt auch dann, wenn die Proteine unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen. In besonders schwierigen Fällen ist es möglich, die verschiedenen Proteine getrennt mit einer oder verschiedenen Kupplungsverbindungen umzusetzen und dann gemeinsam am Träger zu.fixieren. Das Verfahren der Erfindung eignet sich natürlich auch zur Fixierung von Proteinen an geformte Trägerkörper, beispielsweise Folien, Schläuche, Stangen, Plumper und dgl.
4Q9828/0402
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
100 mg Glucoeeoxydase (GOD; 220 U/mg) werden in 10 ml 1 M Triäthanolaminpuffer pH 8,0 bei 100C unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Dann werden 0,03 ml Acryloylchlorid in 3 ml Äther zugegeben und die Mischung 30 Minuten gerührt. Anschließend wird über Nacht gegen 2 1 0,01 M Triäthanolaminpuffer pH 8,0 dialysiert und dann der Niederschlag abzentrifugiert und verworfen. Die enzymatische Aktivität beträgt 16 000 U.
Der so erhaltenen Lösung werden 0,4 ml 5/^iges Dime thy laminopropionitril und 0,4 ml 5#iges Ammoniumperoxydisulfat bei 5 bis 100C zugesetzt (enzymatische Aktivität 14 500). Danach werden 3 g Acrylamid, 0,015 g NjN'-Methylen-bis-acrylamid in 9 ml Wasser unter Stic-cstoffatmosphäre zugegeben. Die sofort einsetzende Polymerisation führt zu einem gelartigen Erstarren der Masse. Das erhaltene Produkt wird durch ein 0,4 mm Metallsieb zur Granulierung gedrückt und dann mit 2 1 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Die mit dem Waechwasser abgetrennte enzymatische Aktivität beträgt 600 U. Das Polymerisat wird lyophilisiert und ergibt 3 g Trockenprodukt mit einer enzymatischen Aktivität von 1 500 ü.
Das Verfahren wurde wiederholt ohne Zusatz von Acryloylchlorid. Die Einschlußpolymerisation führt zu 3 g eines Produktes mit einer Gesamtaktivität von 330 U.
Beispiel 2
300 mg Trypsin (1500) werden unter Stickstoffatmosphäre in 10 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 8,0 bei 100C gelöst. Die erhaltene Löeung wird mit 0,1 ml Acryloylchlorid in 10 ml Äther versetzt
409828/0402
und 30 Minuten gerührt. Dann werden
0,4 ml 5$iges Dimethylaminopropionitril und 0,4 ml 5 Ammoniuraperoxydisulfat zugesetzt und 30 Minuten gerührt. Anschließend werden 3 g Acrylamid, 0,015 g N,Nf-Methylen-blsacrylamid in 9 ml Wasser unter Stickstoffatmosphäre bei einer Temperatur von 5 bis 10° zugesetzt und diese Bedingungen aufrechterhalten, bis sich eine gelartige feste Masse gebildet hat. Letztere wird durch ein 0,4 mm Metallsieb granuliert und mit 3 1 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen. Im Waschwasser finden sich 23 U-. Das gewaschene Produkt wird gefriergetrocknet. Man erhält 3 g Lyophilisat mit einer spezifischen Aktivität von 12,9 U/g.
Eine Wiederholung des Verfahrens unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zusatz von Aeryloylchlorid ergab eine spezifische Aktivität von 0,5 U/g Lyophilisat. .
Beispiele 3 bis 12 .
Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde unter Verwendung der Kupplungsverbindungen Acryloylchlorid, Maleinsäureazid, Maleinsäureanhydrid, Allylbromid und 1-Allyloxy-3-(N-äthylenimin)-propanol-(2) die Fixierung der Enzyme Glueöseoxydase, Trypsin, Chymotrypsin, Uricase
und Hexokinase durchgeführt. In gleicher Weise wurde das Verfahren ohne Verwendung der jeweiligen Kupplungsverbindungen wiederholte Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die in diesen Beispielen und den Vergleichsversuchen erhaltenen Ergebnisse.
40982&/CU02
ω in
t- ο 		IT* τ-
·» *
ο ο 		ο
ι—
(Ti 		IA IA
·> m
IA t<^ 		ο ο
-«I- CJ
VO
VO O
O T-
Κ\ O 		mit
ohne		 •Ρ Φ
O
mit
ohne		 mit
ohne		 Uricase Hexokinase
Trypsin Chymotrypsin ca
O O
ι*·, τ-
CM τ- 		ω
Ο O
VO τ-
CVI τ-
Ο O
τ- O
O O
VO τ-
Κ\ τ-
mit
ohne
Glucoseoxydase
VD
ι
ω ω
* Φ
■5· α
O er
cn
Kupplung 8verbindung
D (
er er φ
CH0=CH-CH0-O-CH0-CH CH0
2 2 2 , |2
OH
1-Allyloxy-3-(N-äthylenimin)· propanol-2
CH=CH
I I C=O C=O
Maleinsäureanhydrid
CH2=CH-CH2-Br Allylbromld
.0
CH0=CH-C
C. \
"Cl Acryloylchlorid
Nx-C-CH=CH-C-N, 3 Il 8 3 0 0
Maleinsäureazid
409828/0402
Beispiel 13
Es.wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen unter Verwendung von Hexokinase als Protein. Das Polymerisationssystem bestand aus Stärkeallyläther, Acrylamid und Ν,-N-Methylen-bisaorylamid. Das erhaltene Produkt enthielt 120 U/g Lyophilisat.
409828/0402

Claims (6)

  1. Patentansprüche
    M/ Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteinen durch Umsetzung eines Proteins in wässriger Lösung mit einer Verbindung, welche mindestens eine Epoxygruppe und mindestens eine v/eitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktioneile Gruppe aufweist und anschließend diese weitere funktioneile Gruppe mit einer Trägersubstanz verknüpft
    wird nach Patent (Patentanmeldung P 21 28 743.4),
    dadurch gekennzeichnet, daß zur Umsetzung eine Verbindung verwendet wird, welche mindestens eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe und wenigstens eine in wässriger Lösung proteinacylierende oder -alkylierende Gruppe enthält.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als zur Umsetzung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe eine Äthylenimingruppe, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppe, Säurehalogenidgruppe, Azidgruppe oder Säureanhydridgruppe verwendet wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz in der gleichen wässrigen Lösung durch Polymerisation von Monomeren hergestellt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das polymerisationsfähige Monomere bzw. die Monomerenmisehung der Lösung nach der Umsetzung des Proteins mit der Kupplungsverbindung zugesetzt und polymerisiert wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4» dadurch gekennzeichnet, daß als Monoiaer ein Acrylsäure-, Methacrylsäure- oder Vinylalkoholderivat oder eine Mischung davon verwendet wird.
    409828/0402
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere, zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionelle Gruppe eine copolymerisationsfähige Doppelbindung verwendet wird.
    409828/0402
DE2260185A 1971-06-09 1972-12-08 Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung Expired DE2260185C3 (de)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2260185A DE2260185C3 (de) 1971-06-09 1972-12-08 Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung
CA183,976A CA1023287A (en) 1972-12-08 1973-10-23 Process for the preparation of carrier-bound proteins
IL43476A IL43476A (en) 1972-12-08 1973-10-24 Process for the production of carrier-bound protein and the product obtained thereby
IT30523/73A IT1045912B (it) 1972-12-08 1973-10-24 Proteina supportata e procedimento per la sua preparazione
NLAANVRAGE7314673,A NL175194C (nl) 1971-06-09 1973-10-25 Werkwijze voor het bereiden van aan drager gebonden eiwitten.
DK642173A DK141555C (da) 1972-12-08 1973-11-28 Fremgangsmaade til fremstilling af baererbundne proteiner
US05/420,510 US3969287A (en) 1972-12-08 1973-11-30 Carrier-bound protein prepared by reacting the protein with an acylating or alkylating compound having a carrier-bonding group and reacting the product with a carrier
GB5602473A GB1407150A (en) 1971-06-09 1973-12-04 Carrier-bound proteins
CH1707673A CH619003A5 (de) 1972-12-08 1973-12-05
BE138625A BE808354A (fr) 1972-12-08 1973-12-07 Proteine fixee sur un support et procede de fabrication
SE7316574A SE420498B (sv) 1972-12-08 1973-12-07 Sett att framstella berarbundna proteiner
SU1982569A SU524521A3 (ru) 1972-12-08 1973-12-07 Способ получени водонерастворимого ферментного комплекса
FR7343831A FR2209775B2 (de) 1971-06-09 1973-12-07
HUBO1474A HU169972B (de) 1972-12-08 1973-12-07
ZA739318A ZA739318B (en) 1972-12-08 1973-12-07 Protein bound to a carrier and process for its manufacture
JP48137279A JPS5749197B2 (de) 1972-12-08 1973-12-08

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19712128743 DE2128743C3 (de) 1971-06-09 Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Proteins
DE2260185A DE2260185C3 (de) 1971-06-09 1972-12-08 Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2260185A1 true DE2260185A1 (de) 1974-07-11
DE2260185B2 DE2260185B2 (de) 1978-10-19
DE2260185C3 DE2260185C3 (de) 1979-06-13

Family

ID=25761260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2260185A Expired DE2260185C3 (de) 1971-06-09 1972-12-08 Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung

Country Status (4)

Country Link
DE (1) DE2260185C3 (de)
FR (1) FR2209775B2 (de)
GB (1) GB1407150A (de)
NL (1) NL175194C (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2631656A1 (de) * 1976-07-14 1978-01-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue hydroxy-succinimido-ester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2708018A1 (de) * 1977-02-24 1978-09-07 Boehringer Mannheim Gmbh An polyamid fixiertes biologisch aktives protein und verfahren zu seiner herstellung

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2631656A1 (de) * 1976-07-14 1978-01-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue hydroxy-succinimido-ester, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
DE2260185B2 (de) 1978-10-19
FR2209775A2 (de) 1974-07-05
NL7314673A (de) 1974-06-11
FR2209775B2 (de) 1978-07-07
GB1407150A (en) 1975-09-24
NL175194B (nl) 1984-05-01
DE2260185C3 (de) 1979-06-13
NL175194C (nl) 1984-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CH619003A5 (de)
DE2426988C2 (de) Verfahren zur Trägerbindung biologisch aktiver Proteine
DE3116995C2 (de)
DE2631656C2 (de) Verwendung eines Hydroxysuccinimidoester-Derivats zur Bindung von biologisch aktiven Proteinen aneinander und/oder an flüssige oder feste Trägerstoffe
DE2655361C2 (de) Dextranderivat-Gel
EP0187391B1 (de) Pfropfcopolymerisate aus vernetzten Polymeren und Polyoxyethylen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP0450628B1 (de) Saccharid-modifizierte, wasserlösliche Proteine
DE3106456A1 (de) Verfahren zur herstellung von perlfoermigen, hydrophilen, gegenueber proteinen bindungsaktiven traegerpolymeren
DE3404021A1 (de) Makroporoese perlpolymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
DE1908290A1 (de) Zur Fixierung von Proteinen verwendbares Mischpolymerisat
DE3027929C2 (de) Herstellung von Polysaccharid-Copolymerisaten aus Träger mit enzymatischer Aktivität
DE2803421A1 (de) Hydrophile copolymere, sie enthaltende gele und deren verwendung
DE3130924A1 (de) Oberflaechenreiche systeme zur fixierung von nucleophile gruppen enthaltenden substraten
CH621561A5 (en) Process for producing a bromocyan-activated, hydrophilic, polymeric carrier for biologically active compounds in dried form
DE1948273A1 (de) Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung eines Substrates mittels einer Enzym-Polymer-Verbindung
WO1997036948A1 (de) Cyclodextringruppen enthaltende polymere, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DD143262A1 (de) Verfahren zur herstellung eines polymeren,zur bindung von nucleophilen gruppen aktivierten traegers
DE2366180C2 (de) Enzymanlagerungsprodukt
DE3132493A1 (de) Verfahren zur herstellung von acrylamid unter verwendung von immobilisierten zellen
WO1999040122A1 (de) Vorrichtung zur herstellung von trägerpolymermaterialien in form von porösen polymerperlen
DE2501840C3 (de) Verfahren zur Unlöslichmachung eines Enzyms
DE2014112A1 (de) Hydrophile wasserunlösliche Polymere
DE2260185C3 (de) Trägergebundenes Protein und Verfahren zu seiner Herstellung
DE3629177A1 (de) Vernetzte polymerisate und verfahren zu ihrer herstellung
DE2413694C3 (de)

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)