DE2631656C2 - Verwendung eines Hydroxysuccinimidoester-Derivats zur Bindung von biologisch aktiven Proteinen aneinander und/oder an flüssige oder feste Trägerstoffe - Google Patents

Description

oder

.CO-O-CH₂-CH₂-NH-CO-N(R'):

bedeutet,

A eine - O - CH₂ - CH₂ -Gruppe, wenn η die Zahl 2 und X eine weitere Succinimidoestergruppe ist, andernfalls eine Einfachbindung, η eine ganze Zahl von 2 bis 7, m die Zahl 1, 2, 3 oder 4, R ein WasserstolTalom, eine Methyl- oder Cyanid gruppc,

R' eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeuten, zur Bindung von biologisch aktiven Proteinen aneinander und/oder an flüssige oder feste Trägerstoffe.

Die Erfindung Ist im Patentanspruch angegeben.

Das Interesse an Immobilisierten, insbesondere an trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen nimmt In vielen Zweigen der Technik laufend zu. Es sind auch schon mehrere Verfahren zur kovalenten Verknüpfung von Proteinen mit Tragersubstanzen bekannt, z. B. aus DT-AS 21 28 743 und DT-OS 22 60 185. Zu den wichtigsten Gründen für dieses Interesse an Immobilisierten Enzymen gehören die dadurch bewirkte Stabilisierung des biologisch aktiven Materials und die Möglichkeit, es leicht aus wäßrigen Reaklionsmedlen abtrennen zu können.

Bei den ältesten Verfahren zur kovalenten Bindung biologisch aktiver Proteine bediente man sich vor allem der Einführung aktivierender Gruppen in die Trägermatrlx. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methoden besteht In den geringen Aktlvitatsausbeuten, die auf eine Beeinflussung der aktiven Konfiguration des Proteins durch die enge Nachbarschaft der Tragermatrix beruht. Man hat daher versucht, diesen Nachteil zu beseitigen. Indem zwischen Protein und Träger Distanzglieder (Spacer; Brückcnblldner) Zwischengeschäft wurden.

Diese Dlstanzglleder stammen von Brückenbildnerverbindungen ab. bei denen es sich zumeist um homo- oder hetcrndlfunkiionclle Verbindungen handelt, welche eine mit dem Protein In wäßriger Lösung reaktive Funktion, die zur Herstellung einer kovalenten Bildung führt, und eine weitere zur Herstellung der Bindung mit dem Träger geeignete Funktion aufweist. Bei homodifunktlonellen Brückenbildnern wie Glutardlaidehyd oder Dlepoxiden sind beide funktionellen Gruppen gleich.

Daher werden Protein und Träger gleichzeitig umgesetzt und es erfolgt sowohl eine Proteinvernetzung als auch eine Bindung mit dem Träger nebeneinander. Als günstiger erwiesen sich Verfahren, bei denen In zweistufiger Arbeitsweise gearbeitet wird, unter Verknüpfung

ίο des Brückenblldnermoleküls zuerst mit dem Protein oder mit dem Träger und anschließend mW dem Träger bzw. dem Protein. Für dieses Verfahren erwiesen sich die heterodifunktionellen Brückenbildnerverbindungen mit zwei verschiedenen funktionellen Gruppen unterschiedli eher Reaktivität als zweckmäßiger.

Außerdem ist es bekannt, zuerst physikalisch an Oberflächen geeigneter Träger zu adsorbieren und dann durch Vernetzung mit polyfunktionellen Brückenbildnern auf diesen Oberflächen zu fixieren.

μ Bei diesen Verfahren hat sich gezeigt, daß sich verschiedene Brückenbildnerverbindungen je nach dem zu bindenden Protein und dem zu verwendenden Trägermaterial recht unterschiedlich verhalten und zu höchst unterschiedlichen Ergebnissen führen. In der Praxis wird daher für jeden speziellen Fall der Protelnlmmobllisierung durch Vorversuche die jeweils günstigste Brückenbild nersubstanz gesucht. FOr manche Fälle besonders geeignete Brückenbildner erwiesen sich dabei in anderen Fällen als völlig unbefriedigend. In vielen Fällen gelang eine zufriedenstellende kovalente Bindung von aktiven Proteinen bisher überhaupt noch nicht. Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf an zusätzlichen Brückenbildnerverbindungen, durch die eine weitere Alternative für die kovalente Bindung von biologisch aktiven Proteinen, Ins besondere von Enzymen, geschaffen wird. Vor allem besteht ein Bedarf an derartigen Brückenbildnerverbindungen, die homodlfunkllonell oder heterodifunktionell sein können, welche einerseits mit Proteinen besonders rasch und schonend reagierende funktionell Gruppen aufweisen, bei denen der Abstand zwischen den funktionellen Gruppen so groß ist, daß Konformallonsänderungen des gebundenen Proteins durch den Träger weitgehend ausgeschaltet sind und bei welchen die »Brücke«, welche die beiden funktionellen Gruppen verbindet, hin sichtlich Ihrer hydrophoben oder hydrophilen Eigen schaften nach Wunsch variiert werden kann. Aufgabe der Erfindung ist es daher, derartige Verbindungen zu finden. Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung

so eines Hydroxysucclnlmldoesterderlvates der allgemeinen Formel I

X-(CH₂)„-A_M-CO-O-N

CO-CH₂

CO-CH₂

in der

X eine weitere Carboxysuccinimidoester-Gruppe oder einen Rest der allgemeinen Formel

oder

- CO - N H - C H₂-C H (OR)₂ (H").

r -0-CO-C = ClI, (III),

-CO-O-CH₃-CH₂-NH-CO-N(R'h

(IV),

A eine-O-CH₂-CH₂-Gruppe,wenn/idieZahl2 ist und X eine weitere Succinimidocster-Gruppe ist, andernfalls eine Einfachverbindung,

η eine ganze zahl von 2 bis 7,

m die Zahl 1,2,3 oder 4,

R ein Wasserstoffatom, eine Methyl- oder Cyanidgruppe und

R' eine methyl- oder Äthylgruppe

bedeutet für den im Patentanspruch angegebenen Zweck.

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Je nach Art des Restes X handelt es sich um homodlfunktlonelle oder um heterodlfunktionelle Verbindungen. Durch Variation von m und η läßt sich ein bestimmter gewünschter Grad an Hydrophobie oder Hydrophille der Brücke einstellen. Dabei nehmen die hydrophoben Eigenschaften zu, wean η großer wird und die hydrophilen Eigenschaften nehmen zu, wenn m grüocf wird. FaSIs eine Vernetzung der Proteine gewünscht wird, werden die homodifunktlonellen Verbindungen der Erfindung bevorzugt, bei gezielter Verknüpfung mit einem festen oder flüssigen Trägermaterial werden dagegen die heterofunktlonellen Verbindungen, in denen X einen Rest der Formel II, III oder IV bedeutet, bevorzugt. Erfolgt dabei die Verknüpfung mit dem Träger durch Copolymerisation, so eignen sich besonders Verbindungen, in denen X der Formel III entspricht. Die Hydroxysucclnimidester-Gruppe (HOSu-Rest) reagiert in wäßriger Lösung selektiv mit Aminen und Ist daher besonder·; geeignet für die kovalente Bindung von Proteinen.

Die Herstellung der erf1ndungsgem*3 verwendeten Verbindungen der Allgemeinen Formel 1 erfolgt, indem die dem Hydroxysucclnlmldoesler zugrundeliegende Mono- oder Dlcarbonsäure entweder

a) in an sich bekannter Weise In ein reaktives Derivat, wie das Säurechlorid oder gemischte Anhydrid überführt, und das reaktive Derivat in einem organischen Lösungsmittel mit N-Hydroxy-Succlnlmld umgesetzt wird, oder

b) direkt In einem polaren organischen Lösungsmittel _4S mit N-Hydroxy-Succinimld In Gegenwart einer letzterem äquimolaren Menge Cyclohexylcarbodiimld kondensiert wird oder

c) in Form des Alkalisalzes mit N-Hydroxy-Succlnlmldomethylsulfonat In Gegenwart einer Crown-Verbindung als Katalysator reagieren gelassen wird.

Die Herstellung der Verbindungen über die gemischten Anhydride in organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, Furan, Dioxan und dergleichen, erwies sich in vielen Fällen als die einfachste und beste Methode. Vorzugswelse wird dabei als reaktives Säurederivat das gemischte Anhydrid mit der Chlor-Ameisensäure verwendet. Als Trägersubstanzen eignen sich bei der Verwendung der erflndungsgemäß eingesetzten Verbindungen zur kovalenlen Fixierung von Proteinen μ sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche, feste oder flüssige Substanzen, welche mit den durch X dargestellten funktlonellen Gruppen zu reagieren vermögen. Reaktionsfähige Gruppen sind dabei OH-Gruppen. Aminogruppen. Vorzugswelse werden solche Trägersubstan- zen verwendet, welche hydrophil, leicht quellbar, weltgehend liidungsfrei sowie stabil gegenüber Mikroorganismen sind

50 Gemäß einer bevorzugten Verfahrensvariante werden die erflndungsgemäß eingesetzten Verbindungen, wenn X einen Rest der Formel III darstellt, durch Copolymerisation mit einem Träger verknüpft, welcher in situ durch Polymerisation geeigneter Monomerer bzw. Monomergemische hergestellt wird oder direkt durch Copolymerisation mit geeigneten Comonomeren In einem Träger eingebaut.

Das bei dieser Ausführungsform verwendete eopolymerisationsfählge Monomer kann wasserlöslich oder wasserunlöslich sein. Wasserlösliche Monomere werden bevorzugt, wenn die erflndungsgemäß eingesetzte Kupplungsverbindung zuerst mit dem biologisch aktiven Protein umgesetzt wurde und danach in homogener wäßriger Lösung an den Träger fixiert werden soll, der dabei durch Copolymerisation in situ gebildet wird. Statt dessen ist es auch möglich, nach den Methoden der Suspensions- oder Emulsionspolymerisation zu arbeiten, wobei das Kupplungsprodukt von Protein und erfindungsgemäß eingesetzter Verbindung der Formel I sich in der wäßrigen dispersen Phase befindet und das wasserunlösliche Monomer oder Moncmergemisch die dispergierte Phase darstellt. Besonders bevorzugt werden als Comonomere wasserlösliche oder wasserunlösliche Derivate der Acrylsäure oder Methacrylsäure wie beispielsweise die Amide, Nitrile und Ester dieser Verbindungen. Unter den wasserlöslichen Comonomeren wird Acrylamid bevorzugt. Nichtwasserlösliche Derivate der Acrylsäure- oder Methacrylsäure, insbesondere solche, die durch Alkylreste substituiert sind, werden bevorzugt, wenn später das trägergebundene Protein In nicht rein wäßrigen Systemen, sondern in einem wäßrig organischen Medium eingesetzt werden soll. Andere geeignete Monomere leiten sich beispielsweise von der Malein- oder Fumarsäure ab. Die brauchbaren Monomeren sind jedoch nicht auf die hier beispielsweise genannten beschränkt.

Als Monomer können auch Vorpolymerisate verwendet werden, die noch ungesättigte copolymerlsationsfähige Gruppen enthalten.

Um bei derartigen, durch Copolymerisation hergestellten Trägern die physikalischen Eigenschaften zu regulieren, werden zweckmäßig geeignete Vemetzer in entsprechenden Mengen zugesetzt. Beispiele für derartige Vernetzer sind Verbindungen mit wenigstens 2 copolymerisatlonsfählgen Gruppen wie N, N' Methylen-bls-Acrylamld und Äthylendiacrylat. Es können aber auch radikalisch wirkende Vemetzer, z.B. bestimmte organische Peroxide, verwendet werden.

Bei Durchführung der Polymerisation In heterogener Phase, also als Suspensions- oder Emulsionspolymerisation, eignen sich z. B. wasserunlösliche Vemetzer wie Dlvlnylbenzol und Äthylendlmethacrylai. Zahlreiche ander« Vernetzer sind dem Fachmann bekannt und die geeignete Auswahl Im jeweiligen Falle zu treffen, liegt Im Rahmen fachmännischen Handelns. Es Ist jedoch auch möglich, Vemetzer erst nachträglich einzubringen und die Vernetzung vorzunehmen, nachdem die Herstellung des polymeren Trägers und die Verknüpfung mit dem aktiven Protein bereits erfolgt Ist.

Wird auf eine Vernetzung des gebildeten Polymers verzichtet, so erhält man lösliche oder thermoplastische Trägermaterlallen. Diese können für splnniähige oder extrudlerbare Lösungen verwendet werden, aus denen die trägergebundenen Proteine, z. B. in Form von Fäden oder Folien, nach an sich bekannten Methoden erhalten werden können.

Für die Kupplung mit hydroxygruppenhalligen Trägersubstanzen eignen sich besonders solche Verbindungen

der allgemeinen Formel I, In denen X ein Rest der Formel IV Ist. Dieser Rest bildet nämlich beim Erhitzen auf ca. 100° C in organischen Lösungsmitteln wie z. B. Dimethylsulfoxid unter Abspaltung von Dläthylamin das entsprechende Isocyanat der Formel IVa,

-N=C=O

(IVa),

welches bei 0° C mit Hydroxy-Gruppen reagiert. Unter diesen Bedingungen reagiert die Hydroxysucclnlmidoester-Gruppe (HOSu-Ester) noch nicht, so daß eine selektive Reaktion der beiden funktioneilen Gruppen des Moleküls durch Umsetzung unter den jeweils geeigneten Bedingungen möglich ist.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen X eine Gruppe der allgemeinen Formel II darstellt, werden zunächst über den HSOu-Rest mit einer aminogruppenhaltigen niedermolekularen oder hochmolekularen Substanz zur Reaktion gebracht und anschließend in schwachsaure wäßrige Lösung zur weiteren Umsetzung gebracht. Unter diesen Bedingungen bildet sich aus dem Acetal der freie Aldehyd, der dann in der dem Fachmann bekannten Weise weiter reagiert, beispielsweise mit Aminogruppen, unter Bildung einer Schiffschen Base, die danach unter Bildung einer kovalenten Bindung reduziert wird, z. B. mit Natriumborhydrid, oder durch analoge Umsetzung mit Hydroxylamin-, Hydrazin- und Scmicarboxidderlvaien.

Als Träger können weiterhin auch solche festen Substanzen verwendet werden, die keine mit den funktionellen Gruppen der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen reaktionsfähige Stellen aufweisen. In solchen Fällen werden die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen als Vernetzer eingesetzt. Hierbei wird zweckmäßig zuerst das aktive Protein auf die Oberfläche des Trägerkörpers gebracht, beispielsweise durch Adsorption, Beschichten mit einer Lösung des Proteins oder dergleichen und anschließend erfolgt die Verankerung auf dieser Oberfläche durch Vernetzung mit einer erflndungsgemäß verwendeten Verbindung, wobei Vorzugsweise zwar die homodlfunktlonellen Derivate verwendet werden, also diejenigen Verbindungen, in denen X eine weitere Carboxysuccinlmldoester-Gruppe darstellt, jedoch können auch Verbindungen, In denen X der Formel IV entspricht, für die Vernetzung eingesetzt werden.

Eine weitere bevorzugte AusfQhrungsform der Erfindung besteht darin, daß das biologisch aktive Protein sowohl mit einer homodifunktlonellen als auch mit einer helerodifunktlonellen Verbindung von Formel I umgesetzt wird. Beispielsweise wird das Protein zuerst mit einer Verbindung zur Reaktion gebracht, In welcher X eine Gruppe der allgemeinen Formel III Ist. Dies führt zur Einführung von copolymerisationsfählgen Resten. Anschließend wird eine vernetzungsfähige, vorzugsweise eine homodlfunktlonelle Verbindung zugegeben. In der 5°> also X eine weitere Carboxysucclnlmodoester-Gruppe darstellt. Dies führt zu einer Vernetzung, also zur Kupplung mehrerer Moleküle aneinander. Dieses aus mehreren Proteineinheiten bestehende komplexe Geblide läßt sich dann, wie oben beschrieben, miUels der daran hängenden copolymerisatlonsfählgen Reste nach den oben beschriebenen Methoden der Proteln=Copolymer!satlon an einem Träger Immobilisieren. Ebenso Ist es auch möglich, an Stelle einer copolymerlsationsfählgen Gruppe eine Gruppe der Formel II oder IV nach dieser Methode einzuführen und die Bindung mit einem bereits vorgebildeten Trager herzustellen.

Nach einer weiteren Variante wird zuerst das Protein vernetzt unter Bindung mehrerer Proteinmoleküle aneinander und danach erfolgt erst die Immobilisierung an einem Träger mit der gleichen oder einer anderen Verbindung der Formel I,

Biologisch aktive Proteine, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kovalent gebunden werden können, sind enzymatisch aktive Proteine, immunologisch aktive Proteine wie Antikörper, Immunoglobuline und dergleichen, sowie hormonen aktive Proteine.

Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen zeichnen sich aus durch ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber Proteinen, die in wäßriger oder wäßrig-organischer Lösung zur Herstellung von kovalenten Bindungen unter weitgehendem Erhalt der biologischen Aktivität führt, sowie durch ihre Reaktionsfähigkeit mit copolymerislerbaren Doppelbindungen, Hydroxygruppen und Aminogruppen, sowie weiteren aktiven Gruppen, die an Trägersubstanzen für Proteine stehen. Ein weiterer Vorteil dieser Ester ist es, daß sie gut kristallisieren und daher leicht in reiner Form isoliert werden können. Sie sind in der Laße, mit derartigen Trägern kovalente Bindungen unter Bindungen einzugehen, b - denen die biologische Aktivität von Proteinen erhalten ble'.bt. Außerdem können sie leicht hinsichtlich ihrer hydrophilen oder hydrophoben Eigenschaften nach Wunsch variiert werden. So können beispielsweise die symmetrischen öishydroxysuci.fnimido-Ester in der jeweils geeigneten Menge zur Lösung eines Proteins in einem schwach alkalischen Puffer gegeben werden. Die dabei erhaltenen, vernetzten, biologisch aktiven Proteine können entweder abgetrennt werden, beispielsweise durch Dialyse, Ultrafiltration und dergleichen, aufgetrennt werden, z. B. durch Gelchromatographie, oder weiter umgesetzt werden, z. B. durch Bindung an einen Träger oder Elnpolymerisation in einen solchen. Dabei sind die erfindungsgemäß eingesetzten, von Äthylenglycol abgeleiteten Verbindungen aufgrund Ihrer Hydrophllie einfachen Dicarbonsäurehydroxysuccinfm'.do-Ester überlegen. Aufgrund Ihrer besseren Wasserlöslichkeit reagieren sie schneller und die Denaturierung des biologisch aktiven Proteins wlrtf zurückgedrängt.

Daher eignen sich die Hydroxysucclnlmldo-Ester ganz Besonders zur Trägerfixierung sehr empfindlicher Proteine, die durch die üblichen Brückenbildner Inaktiviert werden. So findet man Im Fall des Enzyms GIukoseoxldase eine um 23% höhere spezifische Aktivität, wenn sie durch Hydroxysucclnlmldo-Ester fixiert wird, als wenn zu diesem Zweck das aus der DE-OS 22 60 185 als Brückenbildner bekannte Acrylsäurechiorid eingesetzt wird. Noch empfindlicher als die Glucoseoxldase Ist die Nlerenacylase. Dieses Enzym verliert seine biologische Aktivität vollständig, wenn es mit Acrylsäurechiorid an Trägermaterial gebunden wird, während die Fixierung mit den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen g-ne Resultate liefert.

Bei den unsymmetrischen (heterodlfunktlonellen) Verbindungen Ist λ* ζ. B. möglich, die Aiiridoacetaldehydacetalgmppe nach Kupplung der Hydroxysucclntmld-Gruppe mit einem Protein durch Ansäuern in den freien Aldehyd zu überführen, der dann mit einer weiteren amlnogruppenhaltigen Substanz, wie oben beschrieben, umgesetzt wird. Es können daher sowohl 7,, B, zwei verschiedene Enzyme miteinander oder ein Enzym an Albumin oder ein Antigen an Rlnderseruinalbumln oder an eine Polyaminosäure wie Polylysln gekuppelt werden.

DIf eine copolymerlsatlonsfählge Doppelbindung enthaltenden Verbinclungen können z. B. nach den In DT-AS 2130 913 und DT-OS 2128 743 beschriebener,

Methoden für die l'rotelncopolynierisaiion eingesetzt werden, Ebenso Ist es nvtgllch. diese Verbindungen auch erst einer Copolymerisation /u in.ierwerlen. wobei ie nach Wahl des Comonomercn gut oder weniger «in wasserlösliche Copolymere entstehen An diese mit bcliebi- i gen Molekulargewichten herstellbaren C opolymeren können dann Proteine über die llydroxvsuccinimldoestcr-Ciruppe gekuppelt werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die erflndungsgcmiiß verwendeten Verbindungen, ihre Herstellung und m ihre erHndungsgema'ße Verwendung weiter.

I. Äthylenylycol-his-propionsiiure-bi.shydrnxysuceininiidester

Zu einer Lösung von 10,3 g Athylenglycol-bls-pro- ι > pionsiiiirc (hergestellt nach R. V. Christian und R M. llixon. J. Anier. Chem. Soe. 70 [I948|. 1.133. Dok.-Nr. 12916) und von 12,6 gN-Hydroxysuecinlmid in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran wird unter Kühren und FiIskühiung während einer Stunde eine Teirahydroiurari- .'» Lösung von 22,7 g Dlcyclohexylcarbodlimlcl getropft. Die Lösung wird nach 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Dann werden 0,3 ml Essigsäure zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde werden 150 ml abs. Essigester zugegeben, dann wird von dem ausgefallenen Dicyclo- _>i hexylharnstoff abfiltriert. Das Filtrat wird auf ein Drittel eingeengt, mit Wasser. Bicarbonat und wieder mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. F.s wird in Acetonitril aufgenommen. 24 Stunden bei ^- 4 C stehengelassen, dann von erneut ausgefallenem )" Harnstoff abfiltriert und wieder eingeengt. Aus dem zurückbleibenden Öl kristallisiert das Produkt gemäß ßeispielsüberschrift nach mehrtägigem Stehen bei ■>- 4' C ms Fs wird aus Essigester unikristallisiert.
Ausbeute: 25'V, r>

Fp: 115

C₁JIj₁₁N₂O,,, (400.35)
berechnet: C 47.99 H 5.04 N 6.99
gefunden: C 47.95 H 5.04 N 6,87

2. In Analogie zu Beispiel 1 wurde der O.xy-bls-propion-

säurehydroxysuccinimidester hergestellt.
Ausbeute: 30%
Fp: 13I⁰C

3. Oxys'jccinimido-Glutarsäure-aminoacetaldehyddimethyacetal

Zu einer Lösung von II.4g Glutarsäure-anhydrid in 100 ml Tetrahydrofuran wird gleichzeitig 10,1 g Triäthylamin und 13.2 g Aminoacetaldehyd-dimethylacetal getropft und dann noch 30 Minuten gerührt. Die entstandene Lösung wird auf+ 5'C abgekühlt und langsam mit 9.5 ml Chlorameisensäure-äthylester versetzt. Der Ansatz wird noch 30 Minuten bei - 5° C gehalten. Dann werden bei 0° C gleichzeitig 11,5 g Hydroxysuccinimid und 14.0 ml Triäthylamin zugetropft, nach 5stündiger Reaktionszeit bei + 25° C wird von ausgefallenem Triäthylamoniumchlorid abfiltriert, eingeengt, in Essigester wieder aufgenommen, mit Wasser, Bicarbonat und wieder mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt Das Produkt gemäß Beispielsüberschrift wird aus heißem Essigester umkristallisiert.
Ausbeute: 45%
Fp: 70° C

C₁₃H₂₀N₂O₇ (3163)

berechnet: C 49,60 H 6,38 N 8,85
gefunden: C 49,34 H 6,37 N 8,81

4. Methacrvlolyl-w -Im roxy-carbonsäure oxy sued ni midester

Die Methacrylolyl-w-oxvcarhonsauren werden In Analogie zu dem in »Mukromol. Chem«. I7(>. 3017 (197?) beschriebenen Verfahren hergestellt. In einem 500-ml-Dreihalsknlben werden 0,1 Mol der jeweiligen Mülhacrylolyl-hydro\ysiluro und 0,11 Mol N-Ilydroxysuccinimid in einer Mischung aus abs Methylenchlorid und abs. Tetrahydrofuran vorgelegt und Im Flsbad auf ^ 5 C gekühlt. Dazu wird unter Rühren eine Lösung von 0,11 Mol Dlcyclohexylcarbodlimlcl, gelöst in 50 ml abs Mcthylenchlorld. zuftropft. Fs wird noch etwa 12 Stunden gerührt, w .hei die Temperatur auf * 25 C ansteigt. Der ausgefallene Dicyclohexvlharnsioll wird danach abflltrlert und das FHtral eingeeny: Das entstandene Öl wird in Acetonitril aufgenommen und mehrere Stunden im Kühlschrank stehengelassen. I rneut ausgefallener Harnstoff wird abgetrennt und das Acetonitril abgedampft Das Produkt wird so in Form eines Öls erhalten.

5. Hyclroxy:.'ucclnimido-N-2-hydroxy;ithyl-N'.N'-

dimethy! harnstoff-bernsteinsäure-ester

13.2 g N-2-Hvdroxyäihy! N'.N'-dimethyl-harnsioff werden In absolutem THF gelöst. Dann werden 2.4 g Natrlumhydrld-Suspension In knapp 5 min zugetropft Fs wird bis zur Beendigung der Wasserstoffentwicklung hei Raumtempt.jtur gerührt und dann K) g Bernsteinsäureanhydrid zugesetzt. Nich weiterem 24slündlgen Rühren wird eingeengt und Wasser zugegeben. Nach Beendigung der Hj-F.ntwicklung wf.rden die anoiganischen Anteile abgetrennt, die Lösung angesiiuert und mit Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet und eingeengt, wobei ein hellgelbes Öl zurückbleibt.
Ausbeute: 53% der Theorie.

Aus dieser Säure wurde der Hydroxysucclnimidester in Analogie zu Beispiel Nr. 4 hergestellt.

Ausbeute: 35 % der Theorie: Fp: 97 bis 98 T.

Analyse: C H N

Ber: 47.5 5.8 12.8

GeL: 47,5 5.8 12.8

Durch Erhitzen auf ca. 100° C in Dimethylsulfoxld wird Diäthylamln abgespalten unter Bildung des entsprechenden [socyanats.

Erfindungsgemäße Anwendungsbeispiele und Vergleich

6. Stabilisierung von Trypsin durch Vernetzung mit verschiedenen symmetrischen bifunktionellen

Verbindungen

Vergleichsversuch

Trypsin wurde in einem ersten Versuch mit Glutaraldehyd, in einem zweiten Versuch mit Korksäure-bisimidoester Hydrochlorid umgesetzt und der Aktivitätsabfall des so vernetzten Trypsins mit dem des freien Trypsins verglichen. Dabei wurden zu je 50 mg Trypsin in 25 ml destilliertem Wasser je 2 μΜ der Vernetzersubstanz, gelöst in 0,05 M Phosphat-Puffer (7,5 pH) gegeben und bei Raumtemperatur geröhrt. Nach 20 Stunden war die Aktivität des freien sowie des mit Glutaraldehyd vernetzten Trypsins auf 15% der Ausgangsaktivität gefallen. Nach 50 Stunden war die Aktivität bei allen drei Proben auf 0 gesunken. Das mit Korksäure-bisimidoester Hydrochlorid vernetzte Trypsin hatte nach 20 Stunden

230 266/149

50

!κκΐι 5(1'-. nach 50 Stunden noch VI··. und nach 100 Stunden noch 20' der Ausgangsaktivltat.

Per Versuch wurde wiederholt mil den erfindungsgemäU elnsel/hann Kstern der Beispiele 2 und 3. Nach 20 Stunden betrug die Aktivität mit der Verbindung von Beispiel 3 noch 85'*.. mit der von Beispiel 4 noch 50v,. Nach 50 Stunden betrug die Aktivität des mit der Verbin''jng von Beispiel 2 vernetzten Trypslns 4.Vv. bzw. 27·*. mit der Verbindung von Beispiel .V Nach 100 Stunden wurde mit der Verbindung von Beispiel 2 immer noch eine Aktivität von 25'*, gemessen. Das Beispiel /eigt die Überlegenheit der erlindungsgemäß einsetzbaren Verbindungen gegenüber bekannten VerneUungsmitteln.

Stabilisierung von Nierenacjl.ise durch Vernetzung

Hie AktKltät der Nierenacylase in 0,1-M-Phosphal-Pti'ier IpII 4) sinkt trot/ Kühlung bei 4' C innerhalb von λ K-. 5 Tagen auf den Wert 0 SeUt man hingegen die Verbindung von Beispiel I oiler Korksäure-bts-Hydroxy-Miccinlmldester (hergestellt analog Beispiel 1) zu. so erfolgt ein anfänglicher Aktivitätsabfall auf 70 bis 50v Diese verbleibende Aktivität wurde 2 Monate kontrolliert und blieb In diesem Zeitraum konstant. Dieses Ergebnis wurde bei Variaton der Mol-Verhältnisse von Protein /um Ester zwischen I : I und I : 8 stets erreicht.

Hin Verglelchsversuch unter Verwendung von Glutardialdehyd anstelle der erfindungsgemäßen Bis-Ester führte /u keinerlei Stabilisierung.

S Immobilisierung von Nierenacylase
unter ( !!polymerisation

IfMin mg Aminoacylase (Lyophillsat) spez. Akt.: 17.0 i;/mg werden in 25,0 ml Tris-Puffer. pH 8.3, 1 M bei > 4" C gelöst. Dazu werden 2,5 ml einer Lösung von 30.7 mg Methacrylhydroxycapronsäure-hydroxysucclnimidoester. Beispiel 4. In Dloxan gegeben.
Reaktionszelt: 12 h. Temp.: +4⁰C

6 g Acrylamid, 0,5 g N.N'-Methylen-bls-acrylamid und 0.6 ml einer l%lgen CoClj-Lösung werden in 22.5 ml des obigen Trls-Puffers gelöst. Nach Zugabe der vinylierten Enzymlösung wird die Polymerisation mit jeweils 1,5 ml einer 5%tgen Ammoniumperoxodisulfat- sowie einer feigen 3-Dimethylamlnopropionltrll-Lösung gestartet.

Das entstandene Gel wird durch ein Sieb (Maschenweite 0,4 mm) gepreßt und mit Phosphat-Puffer 1 M, pH 7.5. in einer Säule elulert.
1. Eluat 2-l-Puffer 1.88% Akt. Im Eluat
spez. Akt. im Gel 193,1 U/g

2 r.luat 2-l-Pulfer l⁽)3.i 17g

Aktivitätsausbeute: 6,9%

Das Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von ■\<.rylsiiurechlorld anstelle der erHndungsgemäß verwendeten Verbindung. Dabei konnte keine Aktivität an den Träger gebunden werden.

9. Immobilisierung von Glucoseoxldase (GOD) durch 2stufige Umsetzung mit erflndungsgemiiß verwendeten Verbindungen und anschließende Copolymerisation

Wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde GOD mit einer spez. Aktivität von ca. 210 U/mg mit der Verbindung von Beispiel 4 vorlnkublert. anschließend wurde eine kleine Menge der Verbindung von Beispiel I zugesetzt

i". Danach wurde weitere 24 Stunden stehengelassen und anschließend, wie Im Beispiel 8 beschrieben, hi.· Copolymerisation durchgeführt.

Im erhaltenen Gel wurde eine Aktivität von 290 U/g gemessen.

:i> Eine Wiederholung dieses Versuches unter Verwendung von Acrylsäurechlorld anstelle der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen ergab eine Aktivität von 235 U/mg.

10. Kupplung von Angiotensln an RSA
"' (Rinderserumalbumin)

25 mg Anglotensin werden In 10 ml Dloxan/Wasser (1:1) gelöst und mit einer Lösung von 6 mg der Verbindung von Beispiel 4 In Dloxan versetzt. Dann wurde der

s" pH-Wert auf 8.0 gebracht durch Zugabe von 5% KiCO,-Lösung und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird durch Zugabe von Tetrahydrofuran ausgefällt, abzentrlfuglert und lyophlllsiert.
Ausbeute: 19,6 mg

r. Die 19,6 mg dieses Zwischenproduktes werden auf pH = 4 gebracht und I h gerührt. Anschließend wird der pH-Wert wieder auf 8,0 gestellt und die Lösung mit 16,6 mg RSA versetzt. Nach einstündigem Rühren wird mit 1 mg Natriumborhydrid versetzt Nach weiteren

■"> 20 Minuten wird noch einmal 1 mg zugegeben. Nach weiteren 60 Minuten ist die Reaktion beendet. P:e Lösung wird eingeengt. In abs. Äthanol aufgenommen, filtriert. Wasser zugegeben und dann 4 Tage dlalyslert. Aus dem Dialysat werden 24,1 mg Lyophillsat erhalten.

« Daraus ergibt sich, daß mit 1 Molekül RSA mindestens 24 Moleküle Angiotensln gekuppelt sind.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verwendung eines Hydroxysuccinimidoester-Derivats der allgemeinen Formel I

   CO-CH,

   X-(CH₂K-A „,-CO-O-N

   CO-CH₂

   in der

   X eine weitere Carboxysuccinimidoester-Gruppe oder einen Rest der allgemeinen Formel

   -CO-NH-CH₁-CH(OR)₂ (II).

   oder

   -0-CO-C = CH, (Π1).