DE1948273A1

DE1948273A1 - Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung eines Substrates mittels einer Enzym-Polymer-Verbindung

Info

Publication number: DE1948273A1
Application number: DE19691948273
Authority: DE
Inventors: Westman Thomas L
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1968-09-27
Filing date: 1969-09-24
Publication date: 1970-04-16
Also published as: BE739462A; FR2019083A1; US3649457A; GB1284925A; NL6914619A

Description

Monsanto Company, St. Louis (Missouri, USA)

Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung eines Substrates mittels einer Enzyin-Polymer-Verbindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf

ein neues Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung eines Substrates mittels einer Enzym-Polymer-Verbindung. Dieses Verfahren beruht auf der enzymatischen Wirkung der verwendeten Enzym-Polymer-Verbindung, in welcher das Enzym kovalent gebunden ist und wobei das Produkt der enzymatischen Reaktion praktisch frei von Verunreinigungen durch die Enzym-Polymer-Verbindung ist.

La-mr _ , 21937

16.S^.69 ^

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Verschiedene wasserunlösliche Enzym-Polymer-Verbin-

Lsind bekannt.
dünger^ wasserlösliche Enzym-Polymer-Verbindungen sind seit kurzem im Handel erhältlich. Derartige Produkte weisen enzymatische Aktivität auf und besitzen als stabile, lang wirksame enzymatische Materialien einen weiten Anwendungsbereich. Im allgemeinen haben sie die gleiche Aktivität wie das Ausgangsenzym, aber oft mit einer verschiedenen pH-Optimum-Aktivität und einem verschiedenen Anwendungsbereich. Wasserunlösliche Enzym-Polymer-Produkte sind stabil, praktisch färb- und geruchlos, besitzen eine lange Wirksamkeit und unterliegen keiner autogenen Zerstörung oder Zersetzung durch andere Enzyme. Den löslichen Enzym-Polymer-Verbindungen sind die gleichen Eigenschaften zu eigen, siejkönnen aber zusätzlich in wässriger Lösung mit dem Substrat, mit welchem die gewünschte enzymatische Reaktion ausgeführt werden eoll; in innigen Kontakt treten. In beiden Formen kann man eie für eine Wiederverwertung oder für einen Kreislauf in enzymatisehen Verfahren wiedergewinnen, und sie weisen dann immer noch ein grossen Teil ihrer ursprünglichen enzymatischen Aktivität auf.

Man konnte jedoch feststellen, dass die Wiedergewinnung dieser wasserlöslichen Polymer-Enzym-Produkte aus den Reaktionsprodukten der enzymatischen Verarbeitung nicht immer einfach ist.

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Ausserdem wurde die Isolierung der Reaktionsprodukte enzymatischer Umwandlungen von der wasserlöslichen Enzyra-Polymer-Verbindung als ein schwer zu lösendes Problem betrachtet. Sogar für den Fall, dass die enzymatisch aktive Ausgangsverbindung durch eine unlöslichePolymer-Enzym-Verbindung dargestellt wird, konnte festgestellt werden, dass die Abtrennung der Endprodukte der encymatischen Reaktion von einem Substrat unter Verwendung der unlöslichen Enzym-Polymer-Produkte von dem wasserunlöslichen Eneym-Polymer-Produkt nicht immer ohne beträchtliche Schwierigkeiten nach Beendung der Reaktion ausgeführt werden kann.

Es würde daher höchst vorteilhaft sein, eine zugängliche Methode zur Verarbeitung der neuen, enzymatisch aktiven Ensym-Polymer-Verbindung, insbesondere ein wasserlöslicher Enzym-Polymer- Verbindung, zur Verfügung zu haben, durch welche eine schnelle und leichte Isolierung der Reaktionsprodukte der. enzy matischen Umsetzung möglich wäre, und durch deren Anwendung man

vonein Endprodukt erhalten kann, das wesentlich freifcfer Enzym- Polymer-Verbindung ist. Durch Anwendung dieser Methode .sollte es ausserdem möglich sein, eine leicht durchführbare Reinigung der Enzym-Polymer-Verbindung nach beendeter Umsetzung mit einem Substrat durchzuführen, wie zum Beispiel durch Anwendung eines [lösungsmittel8 und ohne Verlust der enzymatischen Aktivität der

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Enzym-Polymer-Verbindung, insbesondere, wenn die Enzym-Polymer-Verbindung in wasserlöslicher Form vorliegt; oder die Methode sollte zumindest die Ausführung einer Operation erlauben, durch welche man das enzymatisch aktive Polymer-Enzym-Produkt leicht dissoziieren oder von nicht umgesetzten Protein oder auch anderen Substraten frei machen kann.

W Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für

die enzymatische Reaktion mit einem ausgewählten Substrat mit einer enzymatisch aktiven Polymer-Enzym-Verbindung. Das Verfahren umfasst ebenfalls eine schnelle und leichte Isolierung der Reaktionsprodukte, die praktisch frei von Verunreinigungen durch die Enzym-Polyner-Verbindung sind, und das neue Verfahren ermöglicht ebenfalle die Reinigung oder Wiederaktivierung des enzymatisch aktiven Polymer-Enzym-Produktes bevor der Wiederverwendung durch ein Lösungsmittel, ohne Verlust der enzymatisch aktiven Enzym-

'■ Polymer-Verbindung, sogar dann, wenn die Enzym-Verbindung wasserlöslich ist. Die Isolierung der Reaktionsprodukte kann auch dann Anwendung finden, wenn die Enzym-Polymer-Verbindung wasserlöslich ist.

Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens befindet sich die enzymatisch aktive Enzym-Polymer-Verbindung in einer Reaktionszone, die an einer Seite mit einer semipermeablen Membran abgegrenzt ist. Diese Membran ist permselektiv und

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erlaubt nur den Durchtritt der Reaktionsprodukte der enzymatischen Reaktion, schliesst aber den Durchtritt der Enzym-Polymer-Verbindung aus, sogar wenn diese in der wasserlöslichen Form vorliegt, und manchmal kann sie auch den Druchtritt der Ausgangsverbindung verhindern.

Die wasserlösliche Enzym-Polymer-Verbindung kann also in einem enzymatischen Reaktor enthalten sein, der eine mit einer semipermeablen Membran begrenzte Fläche aufweist. Diese poröse Membran besitzt die Fähigkeit, Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht hindurchzulassen und Substanzen mit höherem Molekulargewicht zurückzuhalten, und insbesondere auch die enzymatisch akitven, wasserlöslichen Enzym-Polymer-Derivate. Man wendet das wasserlösliche Enzym-Polymer-Produkt zur enzymatiechen Umsetzung des Substrates auf solche Weise an, dass nach der Umsetzung die Abbauprodukte des Substrates durch Durchgang durch die die Grosse begrenzende semipermeable Membran von der löslichen Enzym-Polymer-Verbindung abgetrennt werden, während die lösliche Enzym-Polymer-Verbindungen, und falls erwünscht, zusammen mit dem nicht umgesetzten Substrat, für nachfolgende Isolierung, Weiterverwendung oder eventuell einen Kreisprozess zurückbleiben.

Nachfolgend wird ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel beschrieben: SEMAT (lösuches-Aethylen-Maleinsäureanhydrid-

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Polymer-Trypein) in wässriger Pufferlösung, vorzugsweise bei pH-Wert von etwa 9 wird in einen Diaplex-Ultra-Apparat (Diaplex Ultrafil Model 400.Cell [TM-Amicon Corp., Cambridge, Mass.]) gegeben, an dessen Boden sich eine UM-lJDiaflo-(TM)-Membrane (Amicon Corp.) befindet. Die Membrane hat eine Permselektivität von etwa 10 ¹OOO. Ebenfalls gibt man mit Perameisensäure oxydierte Rinder-Riblonucleaee (RIBOX), gelöet in einem wässrigen Puffer, zusammen mit der SEMAT-Lösung in den Reaktor und rührt. Man lässt die Reaktion eine bestimmte Zeit lang fortschreiten und dann werden die abgebauten RIBOX-Anteile durch Durchtritt durch die Membran getrennt, entweder während oder nach der Umsetzung. Man wendet Druck aowie ein Lösungsmittel an. Das SEMAT sowie auch die nichtumgeeetzte RIBOX bleiben im Reaktor zurück. Man kann anschliessend abermals RIBOX-Lösung in den Reaktor geben, es treten wieder Abbaureaktionen ein und man kann die Produkte wieder wie oben beschrieben isolieren. Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst also, abhängig von der benötigten oder erlaubten Zeitdauer der enzymatischen Reaktion im enzymatischen Reaktor, eine kontinuierliche, halbkontinuierliche oder periodische biologische Verarbeitung des Substrates, eine Fraktionierung der Produkte von dem enzymatisch aktiven Ausgangsmaterial und in vielen Fällen auch von dem nichtumgesetzten Substrat, mit nachfolgender Wiederverwendung der enzymatisch aktiven unlöslichen

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oder löslichen Polymer-Enzym-Verbindung, die als biologischer Katalysator in dem Verfahren verwendet wurde.

Andere Reaktoren sind für die Ausführung des Verfahrens ebenfalls geeignet. Die einzigen Anforderungen beruhen darauf, dass der Reaktor die Ausgangsmaterialien enthalten muss und er eine Ausgangsöffnung besitzt, die mit einer semipermeabler! Membrane, wie welter oben beschrieben ist, verschlossen werden kann. Beim Auftreten von Reaktionsprodukten mit niedrigerem oder höherem Molekulargewicht kann man Membranen anwenden, die eine niedrigere oder höhere Permselektivität besitzen. Zum Beispiel kann man eine UM-2 Diaflo (TM)-Membrane anwenden, um den Durchgang von Reaktionsprodukten aus der Reaktionszone zu ermöglichen, die ein Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 1000 besitzen. Es sind ebenfalls Membranen zugänglich, die den Durchgang von Produkten mit grösserem Molekulargewicht ermöglichen, zum Beispiel mit zahlreichen daiwischenliegenden Ausschluesbereich-Oreneen bis etwa 50*000, wie eine Diaflo (TM) Modtl XM-50-Membrane. Bei richtiger Anwendung der Reaktionsbedingungtn und Membranen, sowie bei geeigneter Auswahl der Ausgangsprodukte sowie der Enzym-Polymer-Verbindung kann man das Verfahren auf solche Weise an- i wenden, dass die Endprodukte schnell und leicht von der Enzym-Polymer-Verbindung sowie von der Substratreaktion abgetrennt

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werden. Die Reaktionszone wird vorzugsweise mit Mitteln ausgestattet, welche die Anwendung von Druck ermöglichen, der von dem Druck ausserhalb des Diaphragmas oder der Membrane verschieden ist, und dass in gewissem Sinn die Membrane durch Bildung eines periodischen, und eines maximalen oder teilweisen Druckunt-erschiedes "geöffnet" wird, um die Reaktionsprodukte nach Been-

fc digung der Reaktion zu entfernen oder, falle gewünscht, auch kontinuierlich oder halbkontinuierlich abzuziehen. Ausserdem besteht die Möglichkeit, falls gewünscht, das Verfahren . kontinuierlich oder halbkontinuierlich auszuführen, indem Mittel zur kontinuierlichen oder halbkontinuierlichen Einführung von zusätzlichem Substrat in Lösung angebracht sind. Eine derartige weitere Einführung des Ausgangsproduktes kann bequem ausgeführt werden während der Druckunterschied auf die Membrane ausgeübt wird. Im Pail der Anwendung eines waseerunlöBlichen Enzym-Polymer-

\ Produkteβ als enzymatischee Mittel in dem Verfahren sind die Resultate nicht immer so kompliziert als wie bei Anwendung des

wasserlöslichen Enzym-Polymer-Produktes. Die lösliche Enzym-Polymer-Verbindung wird dennochfln der Reaktionszone für Wiederverwendung zurückbehalten, während die Reaktionsprodukte im Reaktor nach Oeffnung der Membrane verlassen und leicht ohne wesentliche Verunreinigungen mit dem Enzym-Polymer-Produkt

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isoliert werden können. Die Enzym-Polymer-Verbindung kann entweder leicht durch Waschen gereinigt werden oder man kann sie auch durch Ausblasen der Reaktionsprodukte reinigen und durch Waschen nichtumgesetztes Substrat oder Zwischenprodukte der Reaktion entfernen. Nach dieser Reinigung sind die Enzym-Polymer-Produkte in der Regel für eine Wiederverwendung oder ein Kreis- laufver.fahr.eii· über e i t.

Die Substrate des erfindungsgemässen Verfahrens können beliebige Verbindungen organischer Natur sein; das Substrat kann ein hohes oder auch ein niedriges Molekulargewicht besitzen. Es kann auch biologisch aktiv oder nichtbiologisch aktiv sein. Bei Verwendung eines Proteins oder eines Polypeptide oder anderer. Verbindungen mit einem hohen Molekulargewicht erhält man durch die enzymatische Umsetzung mit dem Enzym-Polymer-Produkt (EPP) in dem enzymatisehen Reaktor im allgemeinen Produkte, die ein niedrigeres Molekulargewicht als das Ausgangssubstrat aufweisen. In diesem Fall gehen die Reaktionsprodukte nach "Oeffnung" der Membran, zum Beispiel durch Anwendung von Druck oder Vakuum oder beiden zur Erzielung eines Druckunterschiedes auf der entgegengesetzten Seite der Membrane, durch diese hindurch und können' isoliert werden. Sie sind praktisch frei von EPP sowie auch von Ausgangsverbindungen. Zusammen mit dem EPP, das eine geeignete

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sowie ausgewählte enzymatisehe Aktivität zur Herstellung gewünschter Verbindungen aufweist, können als Ausgangsprodukte Kohlenhydrate, Stärke, Cellulosematerial, Lipoide und dergleichen verwendet werden. Die Auswahl geeigneter EPP sowie Substrate zur Herstellung gewünschter Endprodukte stellt für den Fachmann kein Problem dar. Falls das Substrat ein niedriges Molekulargewicht besitzt, so kann es gleichzeitig mit'dem Endprodukt der enzymatieehen Reaktion nach "Oeffnung" der Membrane den Reaktor verlassen, und in diesem Fall findet die Trennung des Reaktionsproduktes von dem nichtumgesetzten Substrat nach Durchgang der Produkte durch die Membrane und deren Isolierung statt. Beispiele zusätzlicher Substrate mit hohem Molekulargewicht, die in dem enzy.-matisehen neuen Verfahren verwendet werden können, sind die weiter ober angeführten sowie auch die Produkte der nachfolgenden Beispiele. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass nicht nur hier erwähnte Produkte verarbeitet werden können. Ai^sgangsprodukte mit niedrigem Molekulargewicht für das Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung sind zum Beispiel Harnstoff, Ester und Amide mit niedrigem Molekulargewicht, Peptide mit niedrigerem Molekulargewicht und dergleichen sowie auch zahlreiche, hier nicht angeführte Verbindungen.

Unter der Bezeichnung "EMA" versteht man in der vor-

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liegenden Beechreibung ein Polymer, welches aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid besteht. Polymere dieser Art sind von grossera Wtrt für das erfindungsgemässe Verfahren.

"EMA-Typ"-Polymere werden nachfolgend definiert.

Mit "EMA-Enzym" oder "EMA/Enzym" (oder umgekehrt) wird ein Copolymer bezeichnet, das aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid besteht und in welchem das Enzym kovalent gebunden ist. Das Produkt ist in jedem Fall dasselbe, gleichgültig, ob man das EnBym direkt mit der Anhydridgruppe des Aethylen-Maleinsäure-Anhydrid-Copolymers oder mit einer Carbonsäuregruppe des Aethylen-Maleinsäure-Anhydrid-Copolymers umgesrtzt hatte, oder ob eine Aktivierung für Carbonsäuregruppen der polymeren Verbindung stattfand. Anhydridgruppen, die an der Umsetzung im wässrigen Medium bei der Herstellung des Produktes nicht teilgenommen haben, sind in dem Endprodukt in Form von Caboxyl- oder Carboxylatgruppen vorhanden. Derartige nicht umgesetzte Gruppen können jedoch in Aeid-,Liid-, Ester- und ähnliche Gruppen überführt werden und in den EMA-Typ-Polymeren, die später definiert werden, anwesend seien.

"Waβserunlöslich" bedeutet, dass sich das Produkt nicht in Wasser oder wässriger Lösung löst, obwohl es aufgrund einer Solvation in Wasser im höchsten Grad anschwellen kann, sogar bis zu einem Zustand in Gel-Form.

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"Wasserlöslich" bedeutet nicht, das der Stoff in Wasser unlöslich ist. Die Wasserlöslichkeit ist dadurch gekennzeichnet, dass sich das betreffende Produkt in Wasser oder wässrigen Lösungen löst, aber es muss nicht heissen, dass bei allen Konzentrationen oder allen pH-Werten eine vollständige Lösung stattfindet. Diese wasserlöslichen Produkte weisen die Eigenschaften auf, da sie sich mit verschiedenen Konzentrationen und bei verschiedenen' pH-Werten lösen, und sie sind im allgemeinen bei einem pH-Wert von 7 oder höher löslich. In ihrer wasserlöslichen Form besitzen die Polymer-Enzym-Verbindungen (SEPP) die gleiche enzymatische Wirkung als die ursprünglichen .'!, Enzyme, aus denen sie hergestellt wurden, und sie weisen zusätz lich die Vorteile auf, die durch Anwendbarkeit in Lösung oder - Suspension zusammen mit der erhöhten Stabilität und der verlängern

ten Aktivität hervorgerufen werden. Da dit Polymer-Enzym-Produlct· ' in polymerer und . löslicher Form vorliegen, können si· von den Ausgangs-Enzymen oder Substraten sowie auch von Verunreinigungen und Färbungen, unerwünschten Beimischungen durch normale Trennung·· verfahren, wie zum Beispiel Zentrifugieren, Elektrophorese oder Chromatographie, abgetrennt werden. Die hier verwendeten EPP können durch beliebige Verbindungen dargestellt werden, aber vorzugsweise befinden sie sich in der wasserlöslichen Form (SEPP).

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ORIGINAL I=NJoP=CTED I

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Polymer-Enzym-Derivate können hergestellt werden,

indem man ein kristallines oder rohes Enzym oder eine Enzymin

mischung mit dem Polymer Lösung umsetzt, wobei sich das polymere Produkt bildet, in welchem das Enzym kovalent gebunden ist. Wenn in dem Polymer, zum Beispiel ein EMA-Typ-Polymer eine Anhydrid- oder Carbonsäuregruppe anwesend ist, so kann man die kovalente Bindung des Enzyms mit dem Polymer durch direkte Reaktion oder Kupplung mit einer Anhydridgruppe bewirken, oder auch mit einer Carbonsäuregruppe, indem man ein Carbonsäureaktivierungsmittel verwendet. Das Produkt ist in beiden Fällen da» gleiche. Der pH-Bereich der umsetzung hängt von dem verwendeten Enzym sowie von dessen Stabilität ab. Im allgemeinen verwendet man einen pH-Bereich von etwa 5 bis 9»51 vorzugsweise etwa 6 bis 8, aber ftir bestimmte Fälle müssen selbstverständlich Verbesserungen vorgenommen werden. Die- Isolierung sowie Reinigung führt man im allgemeinen nach bekannten biochemischen Methoden sowie auch nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren aus. Da eine kovalente Bindung des Enzyms an die polymere Verbindung gewünscht wird, wird die Umsetzung in der Regel bei niedrigen Temperaturen und verhältnismässig neutralen pH-Werten ausgeführt,. entweder in Wasser oder einem verdünnten wässrigen Puffe'r als Lösungsmittel.

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Bei Ausführung des Verfahrens nach dieser Art erhält man gewöhnlich das gewünschte aktive Polymer-Enzym-Derivat, aber die Aktivität, welche das polymere Produkt aufweist, ist manchmal niedriger als gewünscht, möglicherweise wegen einer teilweisen Inaktivierung des Enzyms während Ausführung des Verfahrens. Man kann häufig vorteilhaft dazu übergehen, ein gemischtes Lösungsmittelsystem zu verwenden, in welchem ein Lösungsmittel auftritt, in welchem das Enzym mindestens teilweise löslich ist, üblicherweise in einer Menge bis zu etwa 50 Volumenprozent. Dimethylsulfoxyd (DMSO) ist insbesondere zusammen mit Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung als Lösungsmittel in einem gemischten Lösungsmittelsystem geeignet. Unter Verwendung solcher gemischten Lösungsmittelsysteme ist im allgemeinen die gewünschte Aktivität in dem Enzym-Polymer-Produkt sowie auch die Konversionen zu der verlangten aktiven Verbindung höher, und auf diese Weise ist es in der Regel weniger schwierig, genügend hohe Enzymaktivitäten in das Polymermolekül einzuführen.

Wie schon vorher erwähnt wurde, sollte das Polymer für diese Reaktionen im allgemeinen Carboxyl- oder Anhydridbindungen aufweisen, insbesondere dann, wenn das Enzym eine Amino-, Hydroxyl-,phenolische Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe enthält, die für die enzymatische Aktivität des Enzyms keine Rolle spielt.

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Dae Polymer let vorzugsweise ein EMA oder ein ΕΜΑ-Typ-Polymer, •8 können hier aber auch andere Polymere verwendet werden, die eich mit einem Enzym kuppeln oder umsetzen lassen. Auf jeden Fall iet ee wichtig, dass eine kovalente Bindung mit dem Enzym erhalten wird, um ein Enzym-Polymer-Produkt entweder direkt oder indirekt unter Verwendung eines Aktivierungsmittels herzustellen. Insofern gewünscht wird, die enzymatische Aktivität des als Auegangeprodukt verwendeten Enzyme im Endprodukt zurückzubehalten, eo ist es selbstverständlich vor allem notwendig, dass die Bindung dee Enzyms an das Polymer durch eine Gruppe geschieht, welche die aktive Stellung des Enzym-Moleküls nicht inaktivieren wird. Zu solchen reaktionsfähigen Gruppen der Enzym-Moleküle gehören neben Amino- und Sulfhydrylgruppen ebenfalls Hydroxyl-, phenolieche Hydroxyl-, Carboxyl- und Imidazolylgruppen. Derartige Gruppen sind in freier oder ungebundener Form in den aktiven Teilen des Enzym-Moleküls anwesend,wie zum Beispiel Lysin, Cystein, Serin, Threonin, Histidin oder dem Thyroeinteil eines Enzym-Moleküls, und wo dieser besondere Teil als nicht wichtig für die enzymatische Aktivität betrachtet wird, weder auf katalytischem Weg oder für die Bindung des Substrats. Die Anlagerung an das Polymer-Molekül kann daher durch Umsetzung der polymeren Verbindung mit solchen Gruppen derartig ausgeführt werden, dass

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eine Inaktivierung des Enzyms während der Verbindung mit dem Polymer-Molekül vermieden wird. Im allgemeinen wird die Bindung durch eine Amid-, Imid-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppe dargestellt, wie sie durch die Umsetzung einer Carbonsäure- oder Anhydridgruppe mit einer Amin- oder Hydroxylgruppe in dem nicht wesentlichen Teil der Enzym-Protein-Kette gebildet wird. Amide kann man leicht herstellen, indem man Aminogruppen des Enzyms mit einer Carbonsäureanhydridgruppe auf dem Träger-Polymer in Wasser, in einem wässrigen Puffermedium oder in einer Lösungsmittelmischung umsetzt. Amide, Imide und Ester werden leicht gebildet, indem man Carboxylgruppen des Polymers oder auch Carboxylgruppen des Enzyme aktiviert und diese dann mit den entsprechenden -Hydroxyl-, Amin-oder Mercaptogruppen des anderen Ausgangsstoffes umsetzt. Eine derartige Aktivierung kann durch verschiedene Carbodiimide, Carbodiimidazole, das Woodward-oder Sheehanreagenz oder dergleichen herbeigeführt werden, wobei hochaktiv· Zwischen- ; verbindungen entstehen, die die Fähigkeit aufweisen, unter milden Bedingungen mit den weiter ober erwähnten Gruppen in dem

Enzym zu reagieren, und wobei die Zurückhaltung der enzymatisehen

j Aktivität begünstigt wird. Derartige Aktivatoren wendet man bei ^!

Reaktion mit einer Polysaure, zum Beispiel Polyacrylsäure, PoIyaminsäure, Polyglutaminsäure oder ähnlichen Polymeren an.

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Das für eine derartige Umsetzung ausgewählte Polymer kann daher, wie schon weiter ober erwähnt wurde, mit dem Enzym gekuppelt oder umgesetzt werden, entweder-direkt oder indirekt unter Verwendung eines Aktivierungsmittels, wie ebenfalls weiter oben beschriebenWurde, und auf jeden Fall wird bewirkt, eine kovalente Bindung mit dem Enzym herbeizuführen. Die Anlagerungsverfahren können nach bekannten Methoden ausgeführt werden, einschliesslich solcher Verfahren, bei welchem die enzymatiscch aktive Stelle oder Stellen in den Enzymen durch eine reversible

Blockierung geschützt werden. So kann man zum Beispiel bei der

von

Umsetzung Papain>,.Mereurip"apain oder Zink p^Japain als Zwischenprodukt bei der Reaktion mit dem Polymer anwenden; hierbei wird eine grössere Ausbeute bei der Anlagerung erzielt und die Schutzatome können nach erfolgter Anlagerung wieder entfernt werden.

Die polymere Verbindung, an welcher das Enzym gekuppelt \

werden muss, ' rthält also Carbonsäurt- oder Carboneäureanhydrid- : bindungen, insbesondere für den Fall, wenn das Enzym eine Amino-, I Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe aufweist, die für die enzymatisch· _t Aktivität nicht wichtig sind. Wenn ein Enzym eine für die tnzy-

matische Aktivität nicht wesentliche Carbonsäuregruppen aufweist, ; so kann das Polymer Hydroxyl- oder Aminogruppen enthalten, die ; dann mit dem Enzym reagieren. Das Polymer kann ein EMA- oder ein

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EMA-Typ-Polymer sein, oder eine solche polymere Verbindung, die sich zur Kupplung oder Umsetzung mit einem Enzym eignet. Auf jeden Fall muss das Polymer in der Lage sein, durch Kupplung oder Umsetzung mit dem Enzym eine kovalente Bindung zu bilden, wobei das gewünschte Polyraer-Enzym-Produkt entsteht.

Da man eine kovalente Bindung wünscht, muss das Träger-Polymer so gebaut sein, dass es wenigstens «ine reaktionsfähige Gruppe für jedes Polymer-Molekül enthält, mit welchem das Enzym entweder direkt oder indirekt reagieren kann, um eine kovalente Bindung zu bilden. Diese reaktionsfähige Gruppe oder Gruppen werden vorzugsweise durch Carbonsäure- oder Carbonsäureanhydrid-Gruppen dargestellt.

Zu den polymeren Verbindungen, welche sich hierfür eignen, gehören polymere Polyelektrolyte der folgenden Formel

-Z-CR.

I O=C

-fB-C=O

I y

In dieser Formel bedeuten R. und R„ Wasserstoff, Halogen, vorzugsweise Chlor, einen All;jlrest mit 1 feie 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise den Kethylrest, einen Cy<anrest_? dsn Phenylrest oder

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Mischungen dieser Reste; «it der Massgabe, dass nicht mehr als einer der Rest« R. und R_R einen Phenyl rest darstellt. Z ist ein zweiwertiger Beet, vorzugsweise ein Alkylen^Phenylalkylen-, Nieder-alkoxyalkylen- oder Nieder-aliphatisch-acyloxyalkylenrest, der eine Kohlenstoffkette mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen enthält, vorzugsweise «Ine zweiwertige Kohlenstoffkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei die Kohlenstoffkette einen Teil einer Einheit bildet, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; q ist 0 oder 1 und X und Y eind Hydroxyl,-O-Alkalimetall, OR, -OH-NH₃, -OH-R₃Rf-OK-K₂IIH, -OH-RNH₂, -WRR·, -(Q)_p -W-(NR ^fR^f)_x oder -(Q) -W-(-OH) , in welchen Formeln χ 1 bis 4 ist und ρ O oder 1 bedeutet, R einen Alkyl-, Phenylalkyl- oder den Phenylreet bedeutet, wobei jeder dieser Reste 1 bis 18 Kohlenstoff atome ent-' hält, R' Wasserstoff oder gleich R ist, Q Sauerstoff oder -NR- oder -N-W-(NS¹RO_x bedeutet und .W einen zweiwertigen Rest darstellt, vorzugsweise einen Nieder-alkyl·η-, den Phenyl-, einen Fhanylalkyl-, «inen Alkylphenylalkyl- oder einen Alkylphenylalkylreat »it bis tu 20 Kohlenstoffatomen; X und Y können zusammen Sauerstoff bedeuten^ und bevorzugt sind solche Verbindungen, in welchen mindestens einer der Substituenten X und Y eine Hydroxylgruppe darstellen oder X und Y ein Sauerstoffatom bilden. Viele dieser'polymeren Verbindungen sind im Handel erhältlich und andere

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stellen einfache Derivate handelsüblicher Produkte dar, die entweder vor oder gleichzeitig mit der Heretellung der Polymer- Enzym- Verbindung dargestellt werden können; ee ist aber auch möglich, geringe Modifikationen der polymeren Verbindung erst nach der Umsetzung mit dem Enzym durchzuführen. Derartige polymere Verbindungen enthalten die weiter oben beschriebenen EMA- Typ-Einheiten und werden in der vorliegenden Beschreibung als "EMA-Typ-Polymer" bezeichnet.

Da die Enzym-MoIektile ein äueserst hohes Molekulargewicht aufweisen, sogar in dem Fall, wo die Polymer-Einheit, die sich für die Anlagerung an das Enzym als nützlich erweist, nur einmal in der Polymerkette vorkommt, wie zum Beispiel einmal in einigen hundert Einheiten, gibt die Umsetzung des Enzyms mit dieser Einheit eine Enzym-Polymer-Verbindung als Endprodukt, die wesentliche enzymatieche Aktivität besitzt und in welcher der Eneymantiil einen wesentlichen Anteil dee Molekulargewichts der Polymer-Enzym»Verbindung ausmacht. Wenn mehrere der genannten Einheiten vorhanden sind, so können mehrere Bindungen mit erhöhter enzymatischem Aktivität des Endproduktes erhalten werden. Die Einheiten der angeführten Formel wiederholen sich, und η sollte mindestens einen Wert von 8 haben. Für den Fall der Wiederholung von Einheiten müssen die Symbole in den verschiedenen,

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eich wiederholenden Einheiten nicht unbedingt die gleiche Bedeutung besitzen. Wenn eich die Einheiten wiederholen, so können einige der Gruppen X und Y auch eine andere Bedeutung als Hydroxyl oder Sauerstoff aufweisen. So können z.B. einige der Gruppen, aber nicht alle, in Form von Imidgruppen anwesend sein, d.h. solche Gruppen, in denen X und Y zusammen den Rest -NH- oder -N-W-(NR¹R¹) bilden, in welchen Formeln die Substituenten R, W und R' die weiter oben angeführte Bedeutung besitzen.

Ein bevorzugter Typ fUr ein polymeres Material ist das Polymer einer olefinisch ungesättigten PoIycarbonsäure oder Derivaten davon mit sich selber oder mit mindestens einem an- tderen mit .diesen Säuren copolymerisierbarem Monomer in unge- % fähr äquimolaren Mengen. Die Polycarbonsäurederivate können z.B. . Acrylsäure, Acrylsäureanhydrid, Methacrylsäure, Crotonsäure oder ihre entsprechenden Derivate darstellen, einschlieselioh der Teilsalze, Amide und Ester, sie können aber auch Malein«, Itacon-, Citracon-, α, α-Dimethylmalein-, a-Butylmalein-, a-Phenylmalein-, Fumar-, Aconitin-, a-Chlormalein-, a-Brommalein*- und a-Cyanmaleinsäure, einschliesslich der Teilsalze, Amide und Ester, aufweisen. Anhydride der weiter oben erwähnten Säuren werden mit Vorteil verwendet.

Zu den Comonoraeren, die mit den beschriebenen funktionellen Monomeren verwendet werden können, gehören ce-Olefine, wie

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E.B. Aethylen, Propylen, Isobutylen, 1- oder 2-Buten, 1-Hexen, 1-Octen, 1-Decen, 1-Dodecen, 1-Octadecen und andere Vinylmono-

ι/

mere, wie z.B. Styrol, α-Methylstyrol, Vinyltoluol, Vinylacetat, Vinylamin, Vinylchlorid, Vinylformiat, Vinylpropionat, Vinylalkyläther, wie Methylvinylather, Alkylacrylate, Alkylmethacrylate, Acrylamide und AlkylacryJair-iu« oder Mischungen dieser monomeren Verbindungen. Die Reaktionsfähigkeit einiger dieser funktioneilen Gruppen in den aus den erwähnten Monomeren gebildeten Copolymeren ermöglicht die Bildung anderer nützlicher, funktioneller Gruppen in dem neu gebildeten Copolymer, einschlieaB-lich Hydroxyl-, lacton-, Amin- und Lactamgruppen.

Jedes der Derivate dieser erwähnten mehrbasischen Säuren kann mit jeder der weiter oben angeführten monomeren Verbindung copolymeresiert werden, aber auch mit beliebigen anderen Monomeren, die mit 2-basisehen Säurederivaten Copolymere bilden. Die mehrbasischen Säurederivate können mit vielen Comonoraeren Copolymere bilden. Das bevorzugte Ausgangspolymer ist ein etwa 1 s 1 Copolymer von Aethylen und Maleinsäure.

Jm allgemeinen stellt man wasserunlösliche Enzym-Polymerprodukte her, in dem ein Enzym mit einem waeserunlös- ! liehen Polymer umgesetzt wird, man kann aber auch das Reaktionsprodukt aus cl&a Eßs^Ei ure ieai Polymer unlSolicii Essener« indem

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man entweder mit einem polyfunktionellen vernetzenden Mittel, wie B.B. einem Polyamin oder einem Folyol (einschliesslich Glykol ') umsetzt, falls dies notwendig ist. Das Enzym-Polymer-Produkt ist häufig per se wegen der Zwisohenwirkung des Enzymanteils und der zusätzlichen Folyaerkette wenigstens teilweise unlöslich. Wenn das Polymer schon vorher vernetzt ist und daher eine dreidimensionale Struktur besitzt, oder in einigen fällen eine genügend lange lineare Kette aufweist, ist das Ausgangspolymer bereits wasserunlöslich. Ee bestehen auch andere Verfahren, die gut bekannt sind, zum Vernetzen. *

Wenn unlösliche Produkte erhalten werden sollen, so ist es häufig vorteilhaft, Copolymere zu verwenden, die schon teilweise vernetzt sind. Solche vernetzten Copolymere sind bekannt und können dargestellt werden, indem man die Polymerisation entsprechend leitet, wie z.B. die Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid und einem Kohlenwasserstoff-Olefin in Gegenwart , eines vernetzend wirkenden Mittels, wie z.B. einer Verbindung, -die 2 olefinische Doppelbindungen enthält. Solche Verbindungen sind unter anderem Divinylbenzol oder Vinylcrotonat, Poly-1,2-butadien oder α,Α-Diolefine. Die Menge des vernetzend wirkenden Mittels hängt von dem Grad der gewünschten Unlöslichkeit ab. In der Regel genügen 0,1 bis 10 Gew.jC, bezogen auf die Gesamt-

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menge der monomeren Mischung.

Man kann z.B., falls es erwünscht oder notwendig ist, ein vernetztes dreidimensionaleβ Polymer herstellen, indem man eine difunktionelle Verbindung zum Vernetzen eines vorgeformten dibasischen Säure/Cp-C^g-Monoolefin-Copolymers verwendet. Diese Umsetzung wird im allgemeinen erzielt, indem man das Copolymer und ein Folyamin, z.B. 0,1 bis 10 Molprozent Aethylendiamin, miteinander umsetzt. Auf diese Weise ist es möglich, die Vernetzung dee Polymers zu kontrollieren. Es ist selbstverständlich, dass Aethylendiamin ein typisches Beispiel fUr ein Vernetzungsmittel

darstellt» man kann aber auch andere Verbindungen, wie z.B. Alkylen- oder andere Polyamine für diesen Zweck anwenden. Andererseits werden in der Regel lösliche Enzym-Polymer-Produkte vorteilhaft durch etwas andersartige Verfahren hergestellt.

Um hohe Ausbeuten an wasserlöslichen Enzym-Polymer-. Produkten zu erhalten, ist es wünschenswert, eine Vernetzung : zu vermeiden, die Unlöslichkeit hervorruft. Zur Herstellung der löslichen Enzym-Polymer-Derivate wird daher die Umsetzung vorzugsweise unter nicht vernetzenden Bedingungen ausgeführt. Man kann eine unerwünschte Vernetzung herabsetzen, indem man die Anlagerungsreaktion in hoher Verdünnung ausfuhrt, so dass weniger Reaktionen zwischen den verschiedenen Polymer-Molekülen und einem einzigen Enzym-Molekül stattfinden können. Andererseits

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is

begünstigen hohe Verhältnisse des Enzyme sum Polymer die Umsetzung mehrer Enzym-Moleküle mit einem einzigen Polymer-Molekül. Hierdurch wird bedingt, dass sich ein agglomeriertes Enzym/Polymer-System bildet, in welchem die gewünschten löslichen Eigenschaften der einzelnen Enzym-Moleküle beibehalten werden.

Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von Enzym-Polymer-Verbindungen kann folgendermassen ausgeführt werden: Man lässt eine kalte Lösung von Enzymen in geeigneten Pufferlösungen über Nacht bei einer Temperatur von 4⁰C zusammen mit einer kalten, homogenisierten Suspension der polymeren Verbindung, z.B. eine EMA-Suspension, stehen. Vorzugsweise verwendet man EMA-21, welches ein Molekulargewicht von etwa 20*000 bis etwa 30*000 besitzt. Es können aber auch polymere Verbindungen mit anderen Molekulargewichten verwendet werden. So z.B. EMA-Il mit einem Molekulargewicht von etwa 2 '000 bis 3 '000 und EMA-31 mit einem Molekulargewicht von etwa 60*000.

Sie Abtrennung der löslichen sowie unlöslichen Addukte nach der Umsetzung kann durch Zentrifugieren in der Kälte mit einer Zentrifuge (Sorval SS-3 [TM]) bei etwa 10*000 Umdrehungen pro Minute und bei einer Zentrifugationszeit von 10 Minuten stattfinden. Die löslichen Addukte werden gewöhnlich in der Kälte sorgfältig gegen Wasser dialysiert und anschliessend

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lyophilisiert. Unlösliche Addukte kann mem waschen ( und zentrifugieren), üblicherweise 10 mal mit kalter Pufferlösung und 5 mal mit kaltem destilliertem Wasser; anschliessen wird lyophilisiert.

Die Umsetzung der polymeren Verbindung mit mehreren Enzymen kann im allgemeinen stufenweise ausgeführt werden, mit ■ einem Enzym pro Stufe, mit oder ohne Isolierung der Zwischenprodukte·, es ist aber auch möglich, alle Enzyme auf einmal umzusetzen. Wegen Zeitersparnis, leichter Anwendbarkeit sowie auch aus Wirtschaftlichkeit wird das zuletzt erwähnte Verfahren bevorzugt.

Nachfolgend sind Beispiele verwendbarer Polymer-Enzym-Produkte zusammengestellt. Diese Produkte sind sowohl wasserlöslich und auch wasserunlöslich und können nach dtm vorhergehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. All diese Produkte we is en mindestens einen wesentlichen Prozentsatz der enzymatisehen Aktivität des Ausgangsenzyms auf, zusammen mit erhöhter Stabilität, längerer Wirkungsdauer der Aktivität und Wiedergewinnbarkeit für eine erneute Verwendung sowie für Kreislaufverfahren:

EMA-Trypsin (IHET & SEMAT), Chymotrypsin-EMA ( MAC & EMAG)₉

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Lipaee-EMA, Aeylaee-EMA, Cellulaet-EMA,

' B.subtilis neutrale und alkalische Protease-EtfA,

B.subtilis neutrale und alkalische Protease und Lipase-BiA, Oxynitrilaei-IMA, Asparagin* β·-Ε1!Λ, Oxynitrilase-Polymaleinsäureanhydrid-Polymere, SXA-Papain und Zink-Papain, Pepein-BIAy saure Protease-MA, Lipase-Styrol^laleineäureanhydrid-Copolyaere,

Cellulaee/neutrale und alkalische Protease-Vinylnethyläther/ Maleineäureanhydrid-Copolystere, Cellulaee-Vinylacetat/Haleineäureanhydrid-Copolymere, Dext ranaet-Vinylace ta t/Male inaäureanhydrid-Copolyaiere,

Ctllulaet/Lipaee/alkalische Protease-Divinyläther/Ilaleinsäureanhydrid-Cyclooopolymere,

Chyaotrypiin-Polymaleinsäureanhydrid-Poly«ere,

frypsin-PolyMüLeinsslureanhydrid-Polymere,

Aeparaginaee-Polyacryleäureanhydrid-Polyaer, Alkalische und neutrale Proteaee-Polymaleineäureanhydrid-Polymere, Alkalische Protease-Polyacryleäureanhydrid-Polymere, B.subtilis neutrale und alkalische Proteasen und Amylase-EMA, HIA-Dextranase und OIA-Dextranase/neutrale Protease.

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Dae verwendete Polymer-Enzym-Produkt kann z.B. ali wasserlösliches oder wasserunlösliches Produkt verwendet werden, in welchem man die polymere Verbindung in der Regel aus den folgenden Gruppen auswählt.'

Aethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Styrol/toaleinsäureanhydrid-Copolymer, Vinylmethyläther/ Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Vinylacetat/Maleinsäure-

anhydrid-Copolymer,

Divinyläther/Male in säureanhydri d-Cyclo copolymer, Polymaleinsäureanhydrid, und Polyacrylsäureanhydrid»

In den Polymer-Enzym-Verbindungen umfasst der Enzymanteil mindestens ein Enzym der folgenden Gruppe:

neutrale Protease, alkalische Protease, Trypsin, Chymotrypsin, Lipase, Cellulaee, Oxynitrilase, Pepsin, Dextranse, Amylase und Papain.

Beispiel 1 Cellulaee/Polymer Umsetzung mit Cellulo··

Lösliche sowie unlösliche Cellulase/EMA-Produkte werden durch Umsetzung von Cellulase und EMA-21 (Aethylen-Ma-Ieinsäureanhydrid 1 : 1 Copolymer, Molekulargewicht etwa 20 bis iO ¹OOO) in kalter 0,1 molarer Phosphatlösung, die einen pH-Wert von 7,5 hat, hergestellt. Man trennt durch Zentrifugieren und

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isoliert durch . Dialyse sowie Lyophilieieren.

Ein Diaplex (TM)-Apparat mit einer UM-I(TM)-Membrane wird mit 350 ml einer 0,001 molaren Phosphatlösung, pH-Wert 7i5_f die 150 mg eines löslichen Cellulase/EMA-Produktes enthält, beschickt. Zu dieser Lösung gibt man 500 mg a-Celluloeefasern (Sigma Chemical Co.). Die Mischung wird 24 Std. lang bei Zimmertemperatur gerührt. Man wendet auf die Mischung einen Druck von 3,5 kg/cm an und leitet die Lösung durch die Membran· Die erhaltene Lösung wird gesammelt und auf Glucose nach der Glueοstat

geprüft/ (TM)-Methode (Worthington Biochemical CoT)(T Die auf diese Weise hergestellte Glucose kann nach bekannten Methoden isoliert werden, wie zum Beispiel Lyophilisation.

Die Cellulase/EMA, welche im Diaplex-Apparat zurückbleibt, wird mit Wasser gewaschen und dann gibt man erneut den verdünnten Puffer und Cellulose in das Haktionegefäss. Man rührt di· Mischung und die auf diese Weist gebildet· Glucose wird abermais wie weiter oben beschrieben isoliert.

Nach diesem Verfahren kann man ebenfalls unlösliche Cellulase/EMA anwenden. Die Ausbeute an gebildeter Glucose unter vergleichbaren Bedingungen der Zeit sowie Reaktionsbedingungen ist jedoch etwas niedriger als bei der Anwendung löslicher Cellulase/EMA.

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Anstelle von Cellulase/EMA-Produkten ist es ebenfalls möglich, andere Polymer-Cellulase-Produkte für das beschriebene Verfahren anzuwenden.

Beispiel 2 "Lipase/Polymer, Umsetzung mit Olivenöl.

Durch Umsetzung von Lipase mit EMA in kalter 0,1 molarer Phophatpufferlösung stellt man lösliche sowie unlösliche Lipase/HIA-Produkte her. Die Pufferlösung besitzt einen pH-Wert von 7»5· Man trennt durch Zentrifugation und isoliert sowohldurch Dialyse ale auch durch Lyophilisation.

Man beschickt einen Diaplex (TM)-Apparat, der mit einer UM-I (TM)-Membrane versehen ist, mit 325 ml handelsüblicher Lipase, einer Olivenölemulsion und 200 mg eines löslichen Lipase/ EMA-Produktes. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur 24 Std. lang gerührt. Man wendet einen Druck von 3,5 kg/cm auf die Mischung an und leitet die Lösung durch die Membrane. Die durchgelassen· Lösung wird gesammelt und auf freie Fettsäuren durch Titration Bit einer normalisierten Natronlauge lösung geprüft. Die auf diese Weise erhaltenen Fettsäuren können auf übliche Weise isoliert werden, wie zum Beispiel durch Liophilisation und/oder Extraktion mit organischen Lösungsmitteln«

Die in dem Diaplsx-Apparat zurückgebliebene Lipase/EMA wird mit Wasser gewaschen und man beschickt den Reaktor aber-

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mala ait βintr Emulsion aus Olivenöl. Die Mischung wird gerührt und MUi isoliert die gebildeten Fettsäuren abermals, wie weiter ober beschrieben ist. Unter Verwendung anderer Lypoide als Ausgangematerialien erhält man die gleichen Resultate.

Auf die gleiche V/eise kann man auch ein unlösliches Lipase/EMA-Produkt verwenden. Unter den gleichen Reaktionsbedingungen werden ebenfalls Fettsäuren gebildet, jedoch mit einer geringeren Ausbeute als bei Verwendung des löslichen Lipase/DtA-Produktt.

Unter Verwendung anderer Polymer-Lipase-Produkte in dem Verfahren dieses Beispiels erhält man im wesentlichen die gleichen Resultate.

, Beispiel 3 Oxynitrilase/Polymer. Umsetzung mit dem Nitril der

dl-Mandelsäure. (Stereoselektive Bildung von Nitril der 1-Mandelsäure)

Durch Umsetzung von Oxynitrilase und EMAfkaltem, 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH-Wert 7,3 stellt man lösliche sowie unlösliche Oxynitrilase/EMA-Produkte her. Die Produkte werden durch Zentrifugation abgetrennt und sowohl durch Dialyse und Lyophilisation gereinigt.

Man beschickt einen Diaplex-Apparat, der mit einer UM-2-tfembrane versehen ist, mit 5 g des Nitrile der dl-Mandel-

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säure in Seigern Methanol/Acetatpuffer, pH-Wert 5,4. Die Lösung wird mit Stickstoff gespUhlt und dann werden 250 mg lösliche Oxynitrilase/EMA hinzugefügt. Man rührt die Mischung in einer Stickstoffatmosphäre in der Kälte. Ein Druck von 3i5 kg/cm wird unter Verwendung von Stickstoff angewendet und dann leitet man die Lösung durch die Membrane. Sie durchgelassene Lösung wird gesammelt. Um das Nitril der d-Mandelsäure -zu isolieren, entfernt man das Methanol im Vakuum und extrahiert die Lösung mit Chloroform oder Aether. Die organischen Extrakte werden anschliessend mit gesättigter Natriumbisulfitlösung und Wasser gewaschen und anschlies8end getrocknet. Man verwendet die Bisulfitlösung, um das während der umsetzung des Oxynitrilaee/EMA-Produktes mit dem Nitril der dl-Mandelsäure gebildete Benzaldehyd zu entfernen. Nach Entfernung des organischen Lösungsmittels erhalt man das Nitril der !-Mandelsäure in Form eines niedrig schmelzenden Feststoffes. Die optimale Reinheit des Produktes hängt von der Reaktionszeit der Ausgangsprodukte ab, bezogen auf die optische Dreh- ung in Chloroform. Die optimale Reinheit beträgt 60 bis bl1°· Das lösliche Oxynitrilase/EMA-Produkt, welches in dem Diaplex- : Apparat zurückbleibt, wird gut mit Wasser gewaschen,und dann beschickt man den Reaktor erneut mit dem Nitril der dl-Mandeleäure.. Die Mischung wird gerührt und man isoliert das auf diese Weise gebildete Nitril der 1-Mandelsäure wie weiter oben beschrie-

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009816/1284 BAD₀RfGlNAL

ben let.

In dem gleichen, weiter oben beschriebenen Verfahren verwendet man ein unlösliches Oxynitrilase/EMA-Produkt. Das unter vergleichbaren Bedingungen gebildete Nitril der 1-Mandelsäure besitzt eine vergleichbare optische Reinheit zu dem Produkt, das unter Verwendung des löslichen Oxynitrilase/EMA-Produktes hergestellt wurde. Unter Verwendung anderer Oxynitrilase-Polymer-Produkte im Verfahren dieses Beispiels kann man im wesentlichen die gleichen Resultate erhalten.

Beispiel 4 Oxynitrilase/Polymer-Reaktion mit Benzaldehyd und Cyanwasserstoff (Bildung von dem Nitril der d-Mandelsäure)

In einen Diaplex-Apparat, der mit einer UM-2-Membrane versehen let, gibt man eine wässrige LUsung, welche in bezug auf Benzaldehyd 0,2 molar (frisch gereinigt) und in bezug auf Cyanwasserstoff 0,3 molar ist; der pH-Wert der Lösung beträgt 5 »4. Zu dieser Lösung werden 350 mg lösliche Oxynitrilase/EMA gegeben, man spült.die Mischung sorgfältig mit Stickstoff aus und rührt anschliessend in der Kälte unter Stickstoff über Nacht. Danaoh wendet man einen Druck von 3,5 kg/cm auf die Lösung an und lässt sie durch die Membrane hindurchgehen. Man extrahiert daθ auf diese Weise gebildete Nitril der d-Mandelsäure durch

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Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel. Dieses wird dann mit gesättigter Natriumbisulfitlösung gewaschen, getrocknet und weiter entfernt man das organische Lösungsmittel. Die Ausbeute des Nitrile der d-Mandelsäure beträgt etwa 75 bis 90#j das erhaltene Produkt besitzt eine optische Reinheit von 75 bis 95Jt.

Das in dem Diaplex-Apparat zurückgebliebene lösliche Oxynitrilese/EMA-Produkt wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann gibt man eine erneute Menge der Benzaldehyd-Cyanwasseretoff-Löeung in den Reaktor. Die Mischung wird gerührt und das Nitril der g-Mandelsäure wird wie weiter oben beschrieben isoliert.

Auf die gleiche Weise kann man in dem weiter oben beschriebenen Verfahren e_%in unlösliches Oxynitrilase/EMA-Produkt anwenden. Das unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen gebildete Nitril der d-Mandelsäure besitzt eine vergleichbare optische Reinheit in bezug auf die mit dem löslichen Oxynitrilase/EMA-Produkt hergestellte Verbindung.

Unter Verwendung anderer Polymer-Oxynitrilase-Produkte in dem,weiter oben beschriebenen Verfahren erhält man im wesentlichen die gleichen Resultate.

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Beispiel 5 Stereoselektive Hydrolyse von dl-Tryptophan-Methyl-Eeter, katalysiert durch lösliche und unlösliche Trypein/Polymer-Produkte

In einen Diaplex-Apparat, welcher mit einer UM-I Membrane versehen ist, gibt man 75 ml Wasser, in welchem 1,5 g Tryptophanmethylester gelöst sind. Durch Zugabe verdünnter Natronlauge wird der pH-Wert der Lösung auf 8,2 eingestellt. Dann werden 71 »7 mg unlösliches Trypein/EMA-Produlct hinzugefügt und man rührt die Mischung. Nachdem etwa 64 £ des Produktes hydrolysiert waren (Bestinmung durch Titration), Uess man die Lösung durch die Membrane hindurchgehen und das Tryptophan wurde nach der Methode von Qreenstein(J.P. Greenstein in "Methods of Enzymology¹*, S.P. Colowich und N.O. Kaplan (ede.), Academic Press, New York, 1957» Vol. III, Seite 554) isoliert. Das Produkt besass eine optiache Drehung von<jy_D-4,8 (c»l, H₂O), was bedeutete» daaa eine Anreicherung von 16 + 1-Tryptophan in dem Produkt eingetreten war. Das in dem Diaplex-Apparat zurückgebliebene unlösliche Trypsin/EMA-Produkt wurde mit Wasser gewaschen und dann gab man eine neue Charge des Substrates, nimlich dl-Trypto-. phanmethylester, in den Apparat. Die Reaktion fand auf gleiche Weise wie weiter oben beschrieben statt und man erhielt ein Tryptophan, welches mit 23 £ L-Isomers angereichert war.

In einem anderen Eeispiel besitzt der Tryptophane thyl-

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ester, der nach der ersten Umsetzung isoliert wurde, eine optische Aktivität vonc^]_D+l;2; das bedeutete, dass eine Anreicherung von etwa 4 f> des D-Ieomers stattfand. Andere Tryptophanester, insbesondere Nieder-alkylester sowie auch daß Tryptophanamid können auf die gleiche Weise mit wesentlich den gleichen Resultaten umgesetzt werden. Es können auch andere geometrische und optische isomere Mischungen von Estern umgesetzt werden, unabhängig davon ob sie biologisch aktiv sind oder nicht.

Auf die gleiche, weiter oben beschriebene Weise, kann man das lösliche Trypsin/EMA-Produkt zur katalytisehen Hydrolyse von dl-Tryptophanmethylester verwenden. Nach Druchtritt durch die Membrane ist das isolierte Tryptophan mit 32 % an dem L-Isomer angereichert. Der isolierte Tryptophanmethylester weist eine Anreicherung von 30 ^ an dem D-Isomer auf.

Das in dem Diaplex-Apparat zurückgebliebene lösliche Trypsin/EMA-Produkt wird mit Wasser gewaschen und dann gibt man erneut Substrat, nämlich dl-Tryptophanmethylester, in den Reaktor. Die Reaktion wird auf die weiter oben beschriebene Weise ausgeführt , und man erhält Tryptophan, welches mit 42 f> des L-Isomers angereichert ist. Der isolierte nicht hydrolyeierte Tryptophanmethylester ist mit 44 $> an dem D-Isomer angereichert. Unter Verwendung anderer Polymer-Trypsinprodukte kann man nach diesem Verfahren im wesentlichen die gleichen Resultate erhal-

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Beispiel 6 Asparaginase-Polymer-Umsetzung mit Asparagin

Lösliche und unlösliche Asparaginase-EMA-Produkte werden hergestellt, indem man Asparaginase und-EMA-21 (Aethylm/ Maleinsäureanhydrid 1 : 1 Copolymer, Molekulargewicht etwa 20 bis 30¹OOO) in einem kalten_;0,l molaren Phosphatpuffer bei einem pH-Wert 7,5 umsetzt. Man trennt durch Zentrifugieren und die erhaltenen Produkte werden durch Dialyse und Lyophilisation isoliert.

In einen Diaplex - Apparat, der mit einer UM-2-Membrane versehen ist, gibt man 350 ml einer 0,001 molaren Phosphatlöeung mit einem pH-Wert von 7,5· Diese Phosphatlösung enthält 150 mg des löslichen Asparaginase-EMA-Produktes. Zu dieser Lösung werden 500 mg 1-Asparaginase hinzugefügt und man rührt die Mischung bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang. Es wird ein Druck von 3,5 kg/cm auf die Mischung angewendet und die Lösung geht durch die Membrane hindurch. Die Lösung wird gesammelt und man prüft auf Asparaginsäure. Die auf diese Weise hergestellte Asparaginsäure wird unter Verwendung üblicher Methoden isoliert, wie z.B. durch Extraktion.

Das in dem Diaplex-Apparat zurückgebliebene Asparagi-

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naee-aiA-Produkt wird mit Wasser gewaschen und dann gibt man erneut verdünnte Pufferlösung und Asparagin in den Reaktor. Man rührt die Mischung und isoliert die auf diese Weise gebildete Asparaginsäure nach der weiter oben beschriebenen Methode.

Auf die gleiche Weise kann man auch unlösliches Asparaginaee-EMA verwenden. Die Ausbeute an Asparaginsäure, die P unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen gebildet wurde, ist mit derjenigen der Asparaginsäure vergleichbar, die unter Anwendung dee löslichen Asparaginese-EMA-Produktes hergestellt wurde.

Unter Verwendung anderer Asparaginase-Polymer-Produkte in dem Verfahren dieses Beispiels erhält man im wesentlichen die gleichen Resultate.

Beispiel 7 SEMAT-Digestion von RIBOX (mit Perameisensäure

™ oxidierte Rinder-Ribonuclease)

in

Man gab einem Diaplex-Apparat (Amicon Corp. (Cambridge,

Mass.) von 50 ml Inhalt, der mit einer UM-1-Membrane(Permselektivität für ein Molekulargewicht von 10 ¹OOO) versehen war, 20 mg oxidierte RIBOX-und SEMAT-Lösung (200 X) (3,29 mg/ml) in 20 ml Ammoniumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,5 in den Raaktionsraum und liees die Mischung über Nacht stehen.

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Es wurde Druck angewendet und die Lösung ging durch dit Membrane hindurch. Die Lösung wurde gesammelt. Man gab erneut 20 ml RIBOX (20 mg) in Ammoniumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,5, in den Realetionsraum und erlaubte der Reaktions fortzuschreiten. Di· erste Lösung wurde lyophilisiert. Man sammelte die 2. Lösung und lyophilieierte ebenfalls.

Bti der Papierchromatographie während 6 Stunden unter Verwendung von Proben beider Versuche sowie von nicht umge-■eteten RIBOX erhielt man Muster, die von denjenigen des nicht uagesetsten, RIBOX verschieden waren, wie man durch Bestimmung ■1t Ninhydrin feststellen konnte.

Unter Verwendung änderer löslicher Trypsin-Polymer-Produkte in dta Verfahren dieses Beispiels kann man im wesent-' liehen die gleichen Resultate erhalten.

Beispiel 8

Jedes der xusätelichen löslichen sowie unlöslichen Polyeer-Eneym-Produkte, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben sind, wird nach den Verfahren der vorhergehenden Beispiele praktisch gleich angewendet, indem man ein Substrat verwendet, für welches das Polymer-Enzym-Produkt enzymatisch aktiv ist. Die Reaktionsprodukte werden nach Durchgang durch

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die Membrane isoliert, während mindestens das Polymer-Enzyra Produkt zurückgehalten wird, vorzugsweise in löslicher Form, damit_f falls gewünscht, nach dem Waschen mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen Pufferlösung ein inniger Kontakt mit dem Substrat während eines Kreislaufprozesses innerhalb der Reaktionszone eintreten kann. Man setzt z.B. die folgenden Produkte um: Pepsin-Polymer-, Papain-Polymer- und Proteinase-Polymer-Produkte und Protein, wie z.B. Casein; Amylase-Polymer-Produkte und Stärke; Dextranase-Polymer-Produkte und Dextran; Chymotrypsin-Polymer-Produkte und Milch; Urease-Polymer-Produkte und Harnstoff und dergleichen.

Aus dem vorher Beschriebenen geht hervor, dass die Reaktionsprodukte ein niedrigeres Molekulargewicht als das Ausgangeprodukt aufweisen können, das Reaktionsprodukt kann aber auch ein höheres Molekulargewicht als das Ausgangssubstrat besitzen, wenn z.B. das Substrat mehrere Reaktanten enthält, die enzymatisch miteinander umgesetzt werden, um ein Produkt mit höherem Molekulargewicht zu bilden. Aus diesem Grund versteht man unter dem in der Beschreibung sowie Ansprüchen verwendeten Ausdruck "niedrigeres Molekulargewicht" eine Definition, die den Gegensatz des Molekulargewichtes der verwendeten Enzym-Polymer- Verbindung oder löslichen Enzym-Polymer-Verbindung zeigen soll, und nicht den Gegensatz in bezug auf das Molekulargewicht

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des Ausgangssubstrats, falls nicht anders angegeben ist.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur enzymatischen Verarbeitung eines Substrates mittels einer Enzym-Polymer-Verbindung, welches auf der enzymatischen Wirkung der verwendeten Enzym-Polymer-Verbindung, in welcher das Enzym !covalent gebunden ist, beruht, und wobei das Produkt der enzymatIschen Reaktion praktisch frei von Verunreinigungen durch die Enzym-Polymer-Verbindung ist, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Ausgangsprodukt und die Enzym-Polymer-Verbindung in einem mit einer Ausgangsöffnung versehenen Reaktor befinden, in welchem die Ausgangβöffnung mit einer semi-permeablen, permselektiv wirkenden Membrane versehen ist, die Materialien mit niedrigerem Molekulargewicht hindurchläßt, aber den Durchtritt von Materialien mit höherem Molekulargewicht ausschließt, wobei man die Permselektivität der Membrane so auswählt, daß Reaktionsprodukte durch sie hindurchgehen können, aber die Ausgangs-Enzym-Polymer-Verbindung zurückgehalten wird, und daß die Ausgangsprodukte für eine bestimmte Zeitdauer zur Hervorrufung der enzymatischen Reaktion zwischen der Enzym-Polymer-Verbind'ing und dem Substrat miteinander in Kontakt bleiben, und daß man schließlich nach dem Durchgang durch die semipermaabla Membran des Reaktionsprodukt mit

.·■

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niedrigeren Molekulargewicht, das praktisch frei von Verunreinigungen durch die Enzym-Polymer-Verbindung ist, isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym-Polymer-Verbindung ein wasserlösliches Produkt ißt und daß tfich die lösliche Enzym-Folymer-Verblndung und dr..s Substrat im Reaktor in Lösung befinden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssubstrat ebenfalls ein Molekulargewicht besitzt, das vom Durchgang e*.:rch die semi-permeable Membran ausgeschlossen ist, und daß man das Reaktionsprodukt praktisch frei von der Enzym-Polymer-Verbindung sowie auch vor; dem Ausgangssubstrat isoliert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das* Substrat ein genügend niedriges Molekulargewicht besitzt, um den Durchgang zusammen mit dem Reaktionsprodukt durch die semi-permeable Membran zu ermöglichen.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat Proteine oder Polypeptide verwendet.
6. Verfahren nach einem d«r Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß der Durchgang des Reaktionsproduktes durch Anwendung/eines Druckdifferentials auf die gegenüberliegende Seite der Membran erleichtert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bie 6, dadurch gekenn zeichnet, daß man zusätzliches Substrat anschließend in den Reaktor gibt.
8. Verfahren nach Anspruch 7% dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym-Polymer-Verbindung durch Durchle'iten eines Lösungsmittels vor der Wiederverwendung gewaschen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bi3 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine lösliche Enzym-Polymer-Verbindunc verwendet, in welcher das Enzym kovalent gebunden ist, daß sich das Ausgangssubstrat und die lösliche Enzym-Polymer-Verbindung in Lösung befinden und daß man nach beendeter

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Umsetzung und nach Durchgang durch die semi-permeable Membran ein Reaktionsprodukt erhält¹, welches praktisch frei von Verunreinigungen durch di\i lösliche Enzym-Polymer-Verbindung ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß

man das eich in Lösung befindliche Substrat auf kontinuierliche oder halbkontinuierliche Weise in den Reaktor gibt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratzugabe durch die Aufrechterhaltung einer Druckdifferenz auf der entgegengesetzten Seite der Membran ausgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym-Polymer-Verbindung nach beendeter Umsetzung aus dem Reaktor wiedergewonnen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die lösliche Enzym-Polymer-Verbindung nach beendeter Umsetzung aus dem Reaktor gewonnen wird»

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14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 t dadurch, gekennzeichnet, daß die Ausgangs-Enzym-Polymer-Verbindung ein Cellulose-Polymer-Produkt ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-Enzym-Pölymer-Verbindung ein Lipase-Polymer-Produkt ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-Enzym-Polymer-Verbindung ein öxynitrilase-Polymer-Produkt ist.
17. Vorfahren.nach einem der Ansprüche 1 bis 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangs-Enzym-Polymer-Verbindung ein Trypsin-Polymer-Produkt ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13» dadurch-gekennzeichnet, daß die Ausgangs-Enzym-Polymer-Verbindung ein Asparaginase-Polymer-Produkt ist.

BAD ORfGIMAL

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