DE1948298A1 - Stabile,Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltende Mundhygiene-Mittel - Google Patents
Stabile,Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltende Mundhygiene-MittelInfo
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Description
Monsanto Company, St. Louis (Missouri, USA)
***tt*WX*W**W*XM*XXMMWW
Stabile, Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltende, Mundhygiene-Mittel
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf stabile,
Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltende, Mundhygiene-Mittel sowie auf ein Verfahren zu deren Herstellung.
Es werden insbesondere neue sowie verbesserte enzymatisch aktive Mundhygiene-Mittel gewünscht, die eine verbesserte
Farbe, Stabilität, Fehlen eines schlechten Geruches sowie verlängerte Lagerbeständigkeit, insbesondere in Form von
La~mr - 1 - 21949
9.9.69 λ d1™*
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wässrigen Zusammensetzungen, aufweisen. Ein derartiges Mundwasser
sollte enzymatisch aktiv sein und es sollte ausserdem
die Möglichkeit bestehen, verschiedene enzymatiache Aktivitäten
miteinander zu kombinieren, ohne dass dabei eine Selbstzerstörung der Enzyme oder des anwesenden Enzyms eintritt.
Ausserdem sollte es denkbar sein, in einem neuen Mundwasser zusätzliche enzymatisehe Aktivitäten anzuwenden,, obgleich die
Aktivitäten oder das Optimum des Aktivitäts- pH-Bereiches des nativen Enzyms selbst ausserhalb dem verhältnismässig neutralen:
pH-Wert der Mundhöhle liegt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Mundhygiene-Mittel, das mindestens eine aktive Polymer-Enzym-Verbindung
enthält, in welcher das Enzym kovalent gebunden ist. Es ist ausserdem möglich, dass in dem neuen Mundwasser
mehrere Polymer-Enzym-Produkte anwesend sind und dadurch auch mehrere enzymatische Aktivitäten. Derartige Mittel weisen den
Vorteil auf, dass der enzymatisch aktive Bestandteil oder die
Bestandteile von Natur aus wegen des Polymer-Enzym-Moleküls
stabiler sind; ausserdem zerstören sich die vorhandenen Enzyme
nicht gegenseitig, wodurch die Aktivität der Zusammensetzung nicht herabgesetzt wird, da verschiedene Enzymanteile sich
in den verschiedenen Umgebungen befinden* In einer bevorzugten
Ausführungsform enthält das neue Mundhygiene-Mittel ein Polymer-
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Enzym-Produkt, in welchem mehrere Enzyme an das gleiche Polymer-Molekül
gebunden sind. Auf diese Weise kann man orale Hygiene-Mittel erhalten, die keiner antigenen Zerstörung der Enzyme
durch eich selbst unterliegen, und die entweder ein einziges Enzym-Polymer-Produkt aufweisen oder zusätzlich mehrere Enzym-Polymer-Produkte
oder auch eine Polymer-Enzym-Verbindung, die verschiedene Enzyme enthält; es ist ausserdem möglich, Kombinationen
dieser Polymer-Enzym-Verbindungen anzuwenden. Alle diese Kombinationen sind enzymatisch aktiv, sie sind viel
stabiler und weisen eine längere Wirkung während der Anwendung auf. Sie sind ebenfalls während der Lagerung weniger empfindlich
gegen eine Zerstörung. Diese bevorzugten Eigenschaften sind darauf zurückzuführen, dass die enzymatischen Bestandteile
keiner Zerstörung durch sich selbst oder durch andere Enzyme der Zusammensetzung unterliegen. Falls z.B. eines oder mehrere
der in einem üblichen oralen Hygiene-Mittel anwesenden Enzyme durch eine Protease dargestellt werden sollte, so wird diese
auch andere Protease-Moleküle, Dextranase-MolekUle, Amyläse
oder dergleichen angreifen; eine alkalische Protease wird ein neutrales Protease-Molekül zerstören, falls beide anwesend sind,
und neutrale Protease-MolekUle können sogar sich selber angreifen oder zerstören. Die erfindungsgemässen Mundhygiene-Mittel weisen
keine derartige autogene Herabsetzung der enzymatischen Aktivität auf.
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Da auBserdera einige Enzyme eine pH-Aktivität
oder eine pH-Optimum-Aktivität in einem Bereich aufweisen, der für eine orale Anwendung nicht geeignet ist, so z.B. hat
Dextranase ein pH-Optimum bei 4 bis 5, sind sie entweder bei der Verwendung als Mundhygiene-Mittel nicht oder nur wenig
aktiv. Da Mundhygiene-Mittel pharmazeutisch annehmbar sein sollten ist es ebenfalls nicht möglich, dass die verwendeten
Mittel weder stark sauer noch stark basisch gemacht werden, um eine Aktivität oder eine optimale Aktivität der enzymatisch
aktiven Komponente hervorzurufen. Bei Anwesenheit einer kovalenten Bindung in einem anionischen Polymer-Molekül wird
die optimale pH-Aktivität im allgemeinen wesentlich heraufgesetzt; für den Fall, dass diese Bindung in einem kationischen
Polymer vorhanden ist, wird die optimale pH-Aktivität des . Enzyms in der Regel wesentlich nach unten verschoben. Aue
diesem Grund ist es jetzt möglich, über neue Hundhygiene-Mittel zu verfügen, die enzymatisch aktive Bestandteile enthalten,
welche aktiv oder optimal aktiv innerhalb eines verhältnismässig
neutralen pH-Bereiches der Mundhöhle wirken* Bisher konnten derartige Mundpflegemittel nicht hergestellt
werden, da die zur Verfügung stehenden nativen Enzyme in. diesem pH-Bereich entweder inaktiv oder nur wenig aktiv waren·
So z.B. hat Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer-Dextranase^
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(in der nachfolgenden Beschreibung wird das Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer
mit EMA abgekürzt), ein in dem neuen Mundpflegemittel zu verwendes Polymer-Enzym-Produkt
eine optimale pH-Aktivität, die wesentlich höher iet als die Aktivität der Dextranase. Ausserdem ist es möglich, wie schon
weiter oben erwähnt wurde, unzählbare Kombinationen enzymatischer
Aktivitäten in den neuen Mundhygiene-Mittel anzuwenden, und zwar in Form von wasserlöslichen sowie auch
wasserunlöslicher* Materialien; jeder dieser Stoffe ist enzymatisch
aktiv^ und unabhängig voneinander weisen sie die Fähigkeit auf, Bestandteile, die sich auf der Oberfläche der Mundhöhle
absetzen und bakterielle Infektionen und damit einen Angriff der Zähne hervorrufen, abzubauen.
Die erfindungsgemässen Mundhygiene-Mittel enthalten die üblichen Bestandteile, mit der Ausnahme, dass zusätzlich
ein enzymatisch aktiver Bestandteil vorhanden ist.. Dieser enzymatisch 'aktive Bestandteil wird durch eine Polymer-Enzym-Verbindung
dargestellt und vorzugsweise besteht er aus einer Mischung solcher Produkte? dieser Bestandteil
kann aber auch ein mehrere Enzyme enthaltendes Polymer-Enzym-Produkt
oder eine Mischung verschiedener Polymer-Enzym-Produkte sein. Abhängig von der gewünschten Zusammensetzung
des neuen Mundpflegemittels sowie von der beabsichtigten An-
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Wendung kann das Polymer-Enzym-Produkt in waeeerlö si icher oder
wasserunlöslicher Form vorliegen. Die Anwendung oder der Gebrauch beruht darauf, dass man eine enzymatisch aktive Menge
einer derartigen Zusammensetzung oder den enzymatisch aktiven Bestandteil der Zusammensetzung, welcher bei einem verhältnismäesig
neutralen pH-Wert der Mundhöhle aktiv ist, entweder allein oder zusammen mit einem geeigneten Träger, Bindemittel
oder einem ähnlichen Mittel oder einer Zusammensetzung mit
der Mundhöhle oder einem ausgewählten Teil der Mundhöhle in
Kontakt bringt, wobei selbstverständlich die Kontaktzeit ausreichen
muss, damit das Polymer-Enzym-Material seine gewünschte enzymatische Wirkung auf das Substrat ausüben kann, welches
während dieser Kontaktzeit zerstört wird.
Das erfinduiigsgemässe Mundhygiene-Mittel ist dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polymer-Enzym-Produkt
enthält, vorzugsweise mehrere verschiedene Polymer-Enzym-Produkte, es kann aber auch ein Polymer-Enzym-Produkt vor- ,
handen sein, das mehrere Enzyme gebunden enthält, oder auch eine Mischung derartiger Produkte. Das Polymer-Enzym-Produkt'
ist in der Regel wasserlöslich oder nicht in Wasserlöslich, aber auf jeden Fall sind die Enzyme in dein Produkt kovalent
an das Polymer-Molekül gebunden. Ein derartiges Enzym-Polymer-Produkt kann z.B. vorzugsweise ein Polymer-neutrale Prote-
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aee-Produkt oder ein Polymer-neutrale Protease-Produkt zusammen
mit einem Polymer-Dextranase-Produkt umfaesen, oder es
kann auch ein einziges Polymer aufweisen, das sowohl eine neutrale Protease und Dextranase enthält, die beide kovalent
gebunden sind; es ist aber auch möglich, dass Mischungen der
verschiedensten Arten von Polymer-Enzym-Produkten auftreten.
Das verwendete Polymer ist vorzugsweise eine polymere Verbindung, die eine freie Carbonsäuregruppe oder
CarboneHureanhydridgruppe enthält, welche dazu fähig sind,
das Enzym entweder direkt oder durch Aktivierung einer Carbonsäuregruppe kovalent zu binden. Das Polymer kann ein verhliltnismlissig
niedriges Molekulargewicht haben und braucht in nicht vernetztem Zustand anwesend zu sein, wenn wasserlösliche
Produkte gewünscht werden, oder es kann ein höheres Molekulargewicht besitzen und selbst wasserunlöslich sein,
falls man wasseiXUnlösliche Polymer-Enzym-Produkte wünscht.
Es ist selbstverständlich, dass diese verschiedene Arten der Produkte bei Anwendung zur Kundhygiene ihre bestimmten, bevorzugten
Wirkungsbereiche besitzen. Für jeden Fall sind sie verhältniemässig stabil und weisen eine langdauernde Wirkung
auf.
Unterder Bezeichnung 11EMA" versteht man in der
vorliegenden Beschreibung ein Polymer, welches aus Aethylen
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und Maleinsäureanhydrid besteht* Polymere dieser Art sind zur
Verwendung in dem erfindungsgemässen Mundhygiene-Mittel von grosser Bedeutung.
Polymere des "EMA^'-Typs werden nachfolgend
näher definiert.
Mit "EMA-Enzym" oder "EMA/Enzym" wird ein
Copolymer bezeichnet, das aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid
besteht und in welchem das Enzym kovalent gebunden ist. Das Produkt ist in jedem Fall dasselbe, gleichgültig, ob man das
Enzym direkt mit der Anhydridgruppe des Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymers
oder mit einer Carbonsäuregruppe des Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymers umgesetzt hatte, oder'
ob eine Aktivierung für Carbonsäuregruppen der polymeren Verbindung
stattfand. Anhydridgruppen, die an der Umsetzung im wässrigen Medium bei Herstellung des Produktes nicht teilgenommen
haben, sind in dem Produkt in Form von Carboxyl- oder Carboxylatgruppen vorhanden. Derartige nicht umgesetzte Gruppen
können jedoch in Amid-, Imid-, Ester- und ähnliche Gruppen überfuhrt
werden und in den EMA-Typ-Polymeren, die später
definiert werden, anwesend sein.
"Wasserunlöslich11 bedeutet, dass sich das Produkt nicht in Wasser oder wässrigen Lösungen löst, obwohl es
aufgrund einer Solvation in Wasser im höchsten Grad anschwellen
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kann, eogar bis zu einem Zustand in Gel-Form.
"Wasserlöslich" bedeutet nicht, dass der Stoff in Wasser unlöslich ist; eine genauere Definition wird nachfolgend
gegeben.
Polymer-Enzym-Derivate können hergestellt werden, indem man ein Enzym in kristalliner oder roher Form oder eine
Mischung von Enzymen mit dem Polymer in Lösung umsetzt, wobei sich ein polymeres Produkt bildet, in welchem das Enzym
kovalent gebunden ist.
Die Umsetzung der polymeren Verbindung mit mehreren Enzymen kann im allgemeinen stufenweise ausgeführt werden,
mit einem Enzym pro Stufe, mit oder ohne Isolierung der Zwischenprodukte, es ist aber auch möglich, alle Enzyme auf
einmal umzusetzen. Wegen Zeitersparnis, Bequemlichkeit sowie auch Wirtschaftlichkeit wird das zuletzt erwähnte Verfahren
bevorzugt.
Da in dem Polymer, z.B. EMA-Typ-Polymer, eine Anhydrid- oder Carbonsäuregruppe anwesend ist, kann eine
kovalente Bindung des Enzyms an das Polymer durch direkte Umsetzung oder Kupplung mit einer Anhydridgruppe oder mit
einer Carbonsäuregruppe unter Verwendung eines Garbonsäurer-Aktivierungsmittels
durchgeführt werden, In beiden Fällen er-
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hält man das gleiche Produkt. Der pH-Bereich für dieee Reaktion
hängt von dem verwendeten Enzym sowie von seinem Stabilit:itsbereich
ab. Dieser Bereich beträgt gewöhnlich etwa 5 bis 9,5, vorzugsweise etwa 6 bis 8, aber für die einzelnen Fälle müssen
entsprechende Verbesserungen eingeführt werden. Die Isolierung und Reinigung kann nach üblichen biochemischen Verfahren
stattfinden und ist auch in den nachstehenden Beispielen beschrieben· Da eine kovalente Bindung des Enzyms mit dem
Polymeren erwünscht ist, führt man die Umsetzung in der Regel bei niedrigen Temperaturen und bei relativ neutralen pH-Werten
in Wasser oder in einer verdünnten, wässrigen Puffer-Losung
als Lösungsmittel aus.
Wird das Verfahren auf diese Weise durchgeführt, so erhält man die gewünschten aktiven Polymer-Enzym-Derivate.
Der Aktivitätsgrad des polymeren Produktes ist jedoch manchmal niedriger als erwünscht, wahrscheinlich wegen
der teilweisen Inaktivierung des Enzyms während der Ausführung dee Verfahrens» Aus'diesem Grund ist es häufig vorteilhaft,
ein gemischtes Lööungsmittelsystem anzuwenden, wobei man ein Lösungsmittel verwendet, in welchem das Enzym wenigstens teil-,
weiee löslich ist, im allgemeinen in einer Menge bis zu etwa 50 Volumprozent. " .DimethylBulfοxyd ist besonders.als Lösungs-
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mittel geeignet, zusammen mit Wasser oder einer wässrigen
Pufferlösung in einem gemischten Lösungsmittelsystem. Bei Verwendung eines solchen gemischten Lösungsmittelsystems erhält man das gewünschte aktive Enzym-Polymer-Produkt im allgemeinen in hoher Ausbeute und die Konversionen in das gewünschte
aktive Produkt sowie auch die Einführung einer wünschenswerten hohen Menge der Enzymaktivität in das Polymer-Molekül wird
im allgemeinen leicht erreicht.
Vorzugsweise enthält die polymere Verbindung in derartigen Reaktionen Carboxyl- oder Anhydridbindungen, insbesondere, wenn die Enzyme Amino-, Hydroxyl-, phenolische
Hydroxyl- oder SuIfhydrylgruppen besitzen, die für die enzymatiBche Aktivität nicht wesentlich sind. Wenn das Enzym eine
für die Aktivität nicht wichtige Carbonsäuregruppe aufweist, so kann das Polymer freie Hydroxyl- oder Aminogruppen besitzen,
die sich mit dieser Gruppe umsetzen. Das Polymer ist vorzugsweise ein Aethylen-Maleinsäure-Copolymer oder ein Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Polymer-Typ, es können hier aber auch
andere Polymere verwendet werden, die sich mit einem Enzym. kuppeln oder umsetzen lassen. Auf jeden Fall ist es wichtig,
dass eine kovalente Bindung mit dem Enzym erzielt wird, um ein Enzym-Polymer-Produkt entweder direkt oder indirekt unter
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Verwendung eines Aktivierungsmittels herzustellen. Insofern gewünscht wird, die enzymatische Aktivität des als Ausgangsprodukt
verwendeten Enzyms im Endprodukt zurückzubehalten, so ist es selbstverständlich zuerst notwendig, dass die Bindung
des Enzyms an das Polymer durch eine Gruppe geschieht, welche die aktive Stellung des Enzym-Moleküls nicht #!ctivieren wird.
Zu solchen reaktionsfähigen Gruppen der Enzym-Moleküle ger hören neben Amino- und Sulfhydrylgruppen ebenfalls Hydroxyl-,
phenolische Hydroxyl-, Carboxyl und Imidazolylgruppen. Derartige Gruppen sind in freier oder ungebundener Form in den
aktiven Teilen des Enzym-Moleküls anwesend, wie z.B. in Lysin^ Cystein, Serin, Threonin, Histidin oder dem Tyrosinteil eines
Enzym-Moleküls, und wo dieser besondere Teil als nicht wichtig für die enzymatische Aktivität betrachtet wird, weder auf . '
katalytischem Weg oder für die Bindung des Substrats. Die Anlagerung
an das Polymer-Molekül wird daher durch Umsetzung der polymeren Verbindung mit solchen Gruppen derartig ausgeführt,
dass eine Inaktivierung des Enzyms während der Verbindung mit dem Polymer-Molekül vermieden wird. Im allgemeinen wird
die Bindung durch eine Amid-, Imid-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppe dargestellt, wie sie durch die Umsetzung einer
^1 a pp. Polymer s /
Carboxyl-» oder AnhydridgruppaJJWiT einer'Amine- oder Hydroxyl-
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gruppe in dem nicht wesentlichen Teil der Enzym- Protein-Kette gebildet werden* Amide kann man leicht herstellen, indem
man Aminogruppen des Enzyms mit einer Carboxyl-Anhydridgruppe auf dem Träger-Polymer in Wasser, in einem wässrigen
Puffermedium oder in einer Lösungsmittelmischung umsetzt.
Amide, Imide und Ester werden leicht gebildet, indem man Carboxylgruppen des Polymers oder auch Carboxylgruppen des
Enzyms aktiviert und diese dann mit den entsprechenden Hydroxyl-, Amin- oder Mercaptogruppen des anderen Ausgangsstoffes
umsetzt. Eine derartige Aktivierung kann durch verschiedene Carbodiimide, Carbodiimidazole, das Woodward oder-Sheehan
Reagenz oder dergleichen herbeigeführt werden, wobei
hochaktive Zwischenverbindungen entstehen, die die Fähigkeit aufweisen, unter milden Bedingungen mit den weiter oben,
erwähnten Gruppen in dem Enzym zu reagieren, und wobei die Zurückhaltung der enzymatisehen Aktivität begünstigt wird.
Das für eine derartige Reaktion ausgewählte Polymer kann daher, wie schon weiter oben erwähnt wurde, mit
dem Enzym gekuppelt oder umgesetzt werden, entweder direkt oder indirekt unter Verwendung eines Aktivierungsmittels,
wie ebenfalls weiter oben beschrieben wurde, und auf jeden Fall wird bewirkt, eine kovalente Bindung mit dem Emzym herbei-
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zuführen. Die Anlagerungsverfahren können nach bekannten
Methoden ausgeführt werden, einschliesslich solcher Verfahren,,
bei welchen die enzymatisch aktive Stelle oder Stellen in den Enzymen durch eine reversible Blockierung geschützt werden.
So kann man z.B. bei der Umsetzung mit Papain, Mercuripapain oder Zinkpapain als Zwischenprodukt bei der Reaktion mit dem
Polymer anwenden; hierbei wird eine grössere Ausbeute, durch die Anlagerung erzielt und die Schutzatome können nach erfolgter
Anlagerung entfernt werden.
Man gewinnt die enzyniatisehen Ausgangsmaterialien
in der Regel aus beliebigen Quellen, und vorzugsweise sind sie pflanzlichen, tierischen oder mikrobischen Ursprungs.
Viele dieser Enzyme sind im Handel erhältlich. Zusätzlich zu den bevorzugten Polymer-neutrale Protease-Verbindungen können
auch änderet, verschieden aktive Polymer-Enzym-Produkte mit
Vorteil fUr eine maximale enzymatische Aktivität verwendet werden. So können eine andere Protease, eine Amylase oder
Diastase, Dextranase, eine Lipase oder eine Carbohydrase vorteilhafterweise
in dem gleiohen oder in einem anderen, gleichzeitig verwendeten Polymer-Enzym-Produkt anwesend sein. Bei
Verwendung einer Polymer-saure Protease oder eines anderen sauer wirkenden Enzyms ist das Polymer vorzugsweise anionischer
Natur, um die pH-Aktivität und den optimalen Aktivitäts-Bereich
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zu erhöhen. Dies bezieht sich z.B. auf ein Polymer-Pepsin-Produkt sowie auf Polymer-Dextranase-Produkte. Bei Anwendung
eines Polymer-Trypsin-Produktes oder anderer Polymer-alkalische
Protease-Produkte sind diese vorzugsweise an ein kationisches
Polymer-Moleklil gebunden, um den Wirksamkeits- sowie optimalen pH-Aktivitätsbereich des Produktes herabzusetzen. Auf
jeden Fall befinden sich im allgemeinen mindestens eine neutrale Protease und vorzugsweise eine neutrale Protease und
entweder eine saure oder alkalische Protease oder beide zusammen kovalent gebunden in einem oder mehreren Polymer-Enzym-Molekülen. Falls sogar eine alkalische Protease in einem
anionischen Polymer-Molekül anwesend iet oder ein anderes Enzym in einem Polymer gebunden ist, welches seine pH-Aktivität
oder seine optimale pH-Aktivität nicht in dem verhältnisraässig
neutralen pH- Bereich der Mundhöhle verschiebt, und obwohl nicht von maximaler Wirksamkeit, übt seine Anwesenheit keinen
schädlichen Einfluss auf andere Enzyme in dem gleichen oder in verschiedenen Polymer-Molekülen der Zusammensetzung aus,
da der autogene Abbau nicht aufgrund verschiedener Umgebungen, in welchem sich die Enzymanteile befinden, stattfindet. Das
Enzym oder die Enzyme, die sich in dem Polymer-Enzym-Produkt befinden, sind vorzugsweise mikrobiologischen Ursprungs. Es
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ist daher nicht nötig, in dem erfindungsgemässen Mundhygi'ene-Mittel
Enzyme zu verwenden, die im Handel nicht zugänglich Bind, und für die Herstellung des neuen Mundhygiene-Mittels
bestehen daher aufgrund nicht erhältlicherEnzyme keine Begrenzungen.
Diese Tatsache stellt auch einen grossen Vorteil für die neuen Mundhygiene-Mittel dar.
Viele dieser Enzyme können leicht aus Mikroorganismen,
wie z.B. Bakterien, Hefen, Pilzen und dergleichen, unter Anwendung gut bekannter Fermentationsverfahren hergestellt
werden. Derartige Verfahren sind in· KIRK-OTHMER,
& Encyclopedia of Chemical Technology 8, 173-204 beschrieben;
und eine grosse Anzahl auf mikrobiologische .Weise erhältlicher
Enzyme sind im Handel zugänglich.
Die genaue Aktivität des als Auegangsprodukt verwendeten Enzyms oder der Enzyme ist nicht kritisch. Es
muss nur dafür Sorge getragen werden, dass das Ausgangsenzym
* die gewünschte Aktivität aufweist, die es für die beabsichtigte
Verwendung in dem Polymer-Enzym-Produkt geeignet macht. Es
gibt verschiedene Analysenmethoden, um die Aktivität von Enzymen sowie von enzymisch aktivem Material zu bestimmen. So
z.B. kann man die Protease-Aktivität von pro teoly/ti sehen Enzymen
mittels der bekannten Casein-Abbau-Verfahren bestimmen.
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Bei diesem Verfahren katalysiert die Protease die Hydrolyse von Casein während einer bestimmten Zeitdauer und einer bestimmten
Temperatur sowie auch bei einem bestimmten pH-Wert. Durch Zugabe von Trichloressigsäure wird diese Reaktion im
allgemeinen unterbrochen und dann kann man die Lösung filtrieren. Man entwickelt die Parbe des Filtrate mit dem Phenol-Reagenz
von Polin und der Grad der enzymatischen Aktivität wird spektroskopisch in Einheiten von Casein-Tyrosin gemessen.
Dieses Verfahren ist im Journal of General Physiology 3Of
(1547) und in "Methods of Enzymology 2, 33 by Academic Press
N.Y. (1S55)" ausführlich beschrieben. Die Aktivität der Amylase
kann in der Regel durch die bekannte Dinitrosalicyl-Bäuremethode
von Bernfeld festgelegt werden. Auch andere Verfahren sind bekannt und ausführlich beschrieben.
Eine insbesondere wirksame Quelle für gemischte Enzyme, die als Ausgangsmaterial verwendet werden können, ist
ein mutierter Bazillus subtilis Organismus. Das Verfahren zur Herstellung dieses Organismus und des Enzyms aus dem erwähnten
Organismus ist in dem U.S.Patent Nr. 3 03I 38Ο beschrieben.
Eine Kultur des Stammes AM von Bazillus subtilis ist in United States Department of Agriculture, Agricultural
Research Service, Northern Utilization Research and Develop-
ment Division, 1815 North University Street, Peoria, Illinois
- 17 009848/192B
61604 niedergelegt und hat die Nummer NHRL B-3411 erhalten.
Es wurde festgestellt, dass das enzymatisch aktive Material, das durch diesen Organismus produziert wird, im allgemeinen
aus 2 Proteasen besteht, etwa aus 65 bis 75 $>
neutraler Protease (Aktivität bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5) und aus
etwa 25 bis 35 $> alkalischer Protease (Aktivität bei einem
pH-Wert von 9 bis 10). Ebenfalls sind bedeutende Mengen von Araylase vorhanden. Die neutrale Protease besitzt in der Regel
eine Aktivität von 700000 bis 1,2 Millionen Einheiten pro Gramm isolierter Peststoffe und die alkalische, Protease hat eine
Aktivität von etwa 250000 bis etwa 400000 Einheiten pro Gramm. Beide Aktivitäten konnten nach dem Casein-Abbau-Verfahren von
Kunitz bestimmt werden. Die vorhandene Amylase besitzt gewöhnlich eine Aktivität von etwa 300000 bis etwa 35OOOO Einheiten
pro Gramm, was nach dem Verfahren von Bernfeld bestimmt werden konnte. Wie auch schon in der weiter oben erwähnten
Patentschrift beschrieben wurde, hängen die relativen Mengenverhältnisse der Protease zu der Amylase von den genauen
WachstuMsbedingungen des Mikroorganismus ab. Es konnte jedoch
festgestellt werden, dass neutrale und alkalische Protease und Amylase immer in geringen Mengen erzeugt werden, fast
unabhängig von den Aenderungen im Kulturmedium und unabhängig
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von den anderen Wachstumsbedingungen dee Mikroorganismus.
Das Verhältnis der Aktivität der alkalischen Protease zur Aktivität der neutralen Protease im Ausgangsprodukt sowie
auch in der Polymer-Enzym-Verbindung ist vorzugsweise nicht
grosser als etwa 0,25 zu 1,2 zu 1.
Eine andere Quelle für Enzyme, die als Ausgangsmaterial verwendet werden können, ist B. subtilie Stamm NHRL
644, B. subtilis Stamm NRRL 941 und B. subtilis Stamm IAM 1523
(japanische Kultursammlung). Ein anderer B. subtilis Mikroorganismus ist dee weiteren zugünglich, welcher Protease,
eine Mischung aus Proteasen oder Protease und Amylase in begrenzten
Mengen wenn auch nicht in optimaler Menge erzeugt. Die neutrale Protease aus dem sogenannten Streptomycee griseus
besitzt eine Aktivität innerhalb eines weiten pH-Bereicheβ
und kann ein Ausgangeenzym für die Polymer-Enzym-Produkte des erfindungBgeraäeeen Mundhygiene-Mittels darstellen. Mit Vorteil
kann man auch die hauptsächlich saure Protease aus Aspergillus oryzae verwenden, insbesondere, wenn sie mit einem anionischen
Polymer verbunden wird.
Beispiele für Enzyme, die sich zur Herstellung von Polymer-Enzym-Produkten für orale Anwendung in dem neuen
Mundmittel eignen, sind z.B. die folgenden:
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Neutrale Proteasen aus B. subtilis, wie z.B. B. eubtilis AM
neutrale Protease (Monsanto),
neutrale Protease aus B. subtilis var, amylosacchariticus,
kristalline, thermophile,bakterielle, neutrale Protease
(Thermolysin oder kristalline Thermoase-Daiwa Kasei), neutrale Protease aus B. subtilis (Miles Labs) ,
rohe oder verdünnte Formen von Enzymen, wie z.B. einer
B. subtilis AM Enzymmischung (Monsanto)
Bakterielle Proteinase Novo oder Thermoase.
Ebenfalls sind Mischungen der weiter oben erwähnten Enzyme mit einer Diastase, Carbohydrase, Amylase oder
anderen Protease, wie z.B. alkalische Proteasen aus Bazillus
subtilis besonders wirksam, wenn sie an das kationische Polymer gebunden sind.
subtilis besonders wirksam, wenn sie an das kationische Polymer gebunden sind.
Saure Protease aus Aspergillus oryzae, wie z.B. aus A. oryzae
ATCC 14,605,
Protease aus Streptomyces griseus, Streptomyase (Streptomyces rectus Protease),
Andere Proteasen, die unter den .Handelsnahmen "Prolysin",
"Pronase", "Morcin", "Molsin", "Prosin" oder "Rhozymes" wie
"A4", "Pll" (TM-Rohm & Haas) bekannt sind,
Asclepain,
Ficin,
Lipaee,
Bromelain
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Papain, Pepsin oder Dextranase - insbesondere, wenn an ein anionisches Polymer gebunden,
Enzym C aus Myxobacter AL-I Protease,eLn bakteriolytisches
Enzym (R.L. Jackson und R.S. Wolfe, J. Biol. Chera. 243* 879
(1968); Lysozyme oder andere lytische Enzyme.
Es können ebenfalls die verschiedensten Kombinationen der weiter oben erwähnten Enzyme verwendet werden.
Wie schon festgestellt wurde, enthält das Polymer, an welches das Enzym oder die Enzyme gebunden sind,
Carbonsäure oder Carbonsäureanhydridbindungen, insbesondere, wenn das Enzym eine Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe
aufweist, die für die enzymatische Aktivität nicht wesentlich sind. Wenn ein Enzym ein für die enzymatische Aktivität nicht
wesentliche Carbonsäuregruppe aufweist, so kann das Polymer Hydroxyl- oder Aminogruppen enthalten, die mit dem Enzym reagieren
können. Das Polymer kann durch ein Aethylen- Maleinsäureanhydrid-Copolymer
oder durch ein Aethylen-Maleinsäureanhydrid-Polymer-Typ
dargestellt werden, oder ein solches Polymer sein, welches sich zur Kupplung oder Umsetzung mit
einem Enzym eignet. Auf jeden Fall muss das Polymer in der Lage sein, durch Kupplung oder Umsetzung mit dem Enzym eine
kovalente Bindung zu bilden, wobei das gewünschte Polymer-Enzym-Produkt entsteht.
Da man eine kovalente Bindung wünscht, muss - 21 -
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das Trägerpolymer so gebaut sein, dass es wenigstens eine reaktionsfähige Gruppe für jedes Polymer-Molekül enthält,
mit welcher das Enzym entweder direkt oder indirekt reagieren kann, um eine kovalente Bindung zu bilden. Diese reaktionsfähigen
Gruppen werden vorzugsweise durch Carbonsäure- oder Carbonsäureanhydridgruppen dargestellt.
Das polymere Ausgangsprodukt ist vorzugsweise ein Polymer, welches (a) Ketten von Garbonsäure-Einheiten oder
von Carbonsäureanhydrid-Einheiten aufweist» oder das (b) Carbonsäureeinheiten
oder Einheiten von Garbonsäureanhydriden besitzt, die durch Kohlenstoffketten von 1 bis nicht mehr als
4 Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind. Diese Kohlenstoffketten sind in der Regel Teile von Einheiten, die nicht
mehr als 18 Kohlenstoffatome enthalten, und sie können gebildet werden, indem man polymerisierbare Säuren oder Anhydride
polymerisiert oder durch Copolymerisation einer polymerisierbaren Säure oder eines Anhydrids mit einem anderen copolymerisierbaren
Monomeren; vorzugsweise enthalten die Ausgangssäure oder das Anhydrid oder beliebige zusätzliche copolymerisierbare
monomere Verbindungen ungesättigte Bindungen, wobei eine derartige Polymerisation oder Copolymerisation eine
Additionspolymerisation oder -Copolymerisation derartigefunge-
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0098A8/192 5
sättigterBindungen umfasst. .
Zu den Polymeren, die eich zur Anwendung in den neuen Mundhygiene-Mitteln eignen, gehören polymere
Polyelektrolyte der folgenden Formel:
-Z-CI O=C
C=O I Y
In dieser Formel bedeuten R. und Rfi Wasserstoff , Halogen, vorzugsweise Chlor, einen Alkylrest mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise den Methylrest, einen Cyanrest, den Phenylrest oder Mischungen dieser Reste; mit der
Massgabe, dass nicht mehr ale einer der Reste R- und R£ einen
Phenylrest darstellt. Z ist ein zweiwertiger Rest, Vorzugs·^·
weise ein Alkylen-, Phenylalkylen-, Nieder-alkoxyalkylen- oder Nieder-aliphatiach-acyloxyalkylenreet, der eine Kohlenstoffkette mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen enthält, vorzugsweise eine zweiwertige Kohlenstoffkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei die Kohlenstoffkette den Teil einer Einheit bildet, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist; q ist
0 oder 1 und X und Y sind Hydroxyl, -0-Alkalimetall, OR, -OH-NH3, -OH-R^N1 -OH-R2NH, -OH-RNH2, -NRR1, -(Q)p-W-(NR'R·)χ oder
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-(Q) -W-(-OH)'χ, in welchen Formeln χ 1 bis 4 ist und ρ O oder
1 bedeutet, R einen Alkyl-, Phenylalkyl- oder den Phenylrest bedeutet, wobei jeder dieser Reste 1 bie 18 Kohlenstoffatome
enthält, R1 Wasserstoff oder gleich R ist, Q Sauerstoff
oder -NR'- bedeutet und V/ einen zweiwertigen Rest darstellt,
vorzugsweise einen Nieder-alkylen, den Phenyl-, einen Phenylalkyl-,
einen Phenylalkylphenyl- oder einen Alkylphenylalkylrest mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen; X und Y können zusammen
Sauerstoff bedeuten und bevorzugt sind solche Verbindungen, in welchen mindestens einer der Substituenten X
und Y eine Hydroxylgruppe darstellen oder X und Y ein Sauerstoffatom bilden. Viele dieser polymeren Verbindungen sind
im Handel erhältlich und andere stellen einfache Derivate handelsüblicher Produkte dar, die entweder vor oder gleichzeitig
mit der Herstellung der Polymer-Enzym-Verbindung dargestellt
werden können; es ist aber auch möglich, geringe Modifikationen des Polymers erst nach der Umsetzung mit dem
Enzym durchzuführen. Derartige polymere Verbindungen enthalten die weiter oben beschriebenen EMA-Typ-Einheiten und werden
in der vorliegenden Beschreibung als "EMA-Typ-Polymer" bezeichnet.
Da die Enzym-Moleküle ein äusserst hohe Molekulargewicht aufweisen, sogar in dem Fall, wo die Polymer- Ein-
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009848/1925
IS"
heit, die sich für die Anlagerung an das Enzym als nützlich
erweist, nur einmal in der Polymerkette vorkommt, wie z.B. einmal in einigen hundert Einheiten, ergibt die Umsetzung des
Enzyms mit dieser Einheit eine Enzym-Polymer-Verbindung, die wesentliche enzymatische Aktivität besitzt und in welcher der
Enzymanteil einen wesentlichen Anteil-des Molekulargewichtes der Polyraer-Enzym-Verbindung ausmacht. Wenn mehrere der genannten
Einheiten vorhanden sind, so können mehrere Bindungen mit erhöhter enzymatischer Aktivität des Produktes erhalten
werden. Wie nachstehend noch beschrieben werden soll, wiederholen sich vorzugsweise die Einheiten der angeführten Formel
und η sollte mindestens einen Wert von 8 haben. Für den Fall der Wiederholung von Einheiten müssen die Symbole in den verschiedenen,
sich wiederholenden Einheiten nicht unbedingt die gleiche Bedeutung besitzen. Wenn sich die Einheiten wieder
holen, so können einige der Gruppen X und Y auch eine andere Bedeutung als Hydroxyl oder Sauerstoff haben. So können z.B.
einige der Gruppen, aber nicht alle, in Form von Imidgruppen anwesend sein, d.h. solche Gruppen, in welchen X und Y zusammen
den Rest -NR oder -N-W-(NR'Rf) bilden, wobei die Sub-
stituenten R, W und R1 die weiter oben angeführte Bedeutung
besitzen.
Ein bevorzugter Typ für ein polymeres Material - 25 -
00 9848/192 5
ist daa Polymer einer olefinisch ungesättigten*Polycarbonsäure
oder Derivaten davon mit sich selber oder mit mindestens einem anderen mit diesen Säuren copolymer!sierbarem Monomer
in ungefähr äquimolaren Mengen. Die Polycarbonsäurederivate können z.B. Acrylsäure, Acrylsäureanhydrid,.Methacrylsäure,
Crotonaäure oder ihre entsprechenden Derivate darstellen, einschliesslich
der Teilsalze, Amide und Ester, sie können aber auch Malein—, Itacon-, Citracon-, α,α-Dimethylmalein-, a-But—
ylmalein-, oc-Phenylmalein-, Pumar-, Aconitin-, oc-Chlormalein-,
α-Brommalein- und a-Cyanmaleinsäure, einschliesslich der Teilsalze,
Amide und Ester, aufweisen. Anhydride der weiter oben erwähnten Säuren werden mit Vorteil verwendet.
Zu den Comonoraeren, die mit den beschriebenen funktionellen Monomeren verwendet werden können, gehören
a-Olefine, wie z.B. Aethylen, Propylen, Isobutylen, 1- oder
2-Buten, 1-Hexen, 1-Octen, 1-Decen, 1-Dodecen, 1-Octadecen und
andere Vinylmonomere, wie z.B. Styrol, α-Methylstyrol, Vinyltoluol,
Vinylacetat; Vinylamin, Vinylchlorid, Vinylformiat, Vinylpropionat, Vinylalkyläther, nämlich Methylvinyläther,
Alkylacrylate, Alkylmethacrylatef Acrylamide und Alkylacrylamide
oder Mischungen dieser monomeren Verbindungen. Die Reaktionsfähigkeit einiger dieser funktioneilen Gruppen in
den aus den erwähnten monomeren gebildeten Copolymeren er-
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möglicht die Bildung anderer nützlicher, funktioneller Gruppen
in dem neu gebildeten Copolymer, einschliesslich Hydroxy-, Lacton-, Amin und Lactamgruppen.
Jedes der Derivate dieser erwähnten mehrbasischen Siuren kann mit jeder der weiter oben angeführten monomeren
Verbindungen copolymer!siert werden, aber auch mit beliebigen
anderen Monomeren, die mit 2-baßischen Säurederivaten Copolymere
bilden. Die mehrbasischen Säurederivate können mit vielen Comonomeren Copolymere bilden, wobei die Gesamtmenge des Comonomere
in bezug auf das Derivat der mehrbasischen Säure vorzugsweise etwa iiquimolekular sein wird. Obgleich man diese
Copolymere durch direkte Polymerisation der verschiedenen Monomeren herstellen kann, können sie leichter häufig durch
eine nach der Umsetzung vorgenommene Modifikation eines bereits bestehenden Copolymers erhalten werden.
Copolymere von Anhydriden und einem anderen
Monomer kann man durch Umsetzung mit Wasser in Carboxylgruppen
enthaltende Copolymere Überführen. Durch die Umsetzung mit
Alkalimetallverbindungen, Erdalkaiimetallverbindungen, Aminen
oder Ammoniak, entweder vor, während oder nach der Bindung der Enzyme/ kann man die Ammonium-, Alkali-, Erdalkali- oder
Alkylaminsalze der entsprechenden Copolymere erhalten. Andere
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geeignete Derivate der weiter oben angeführten polymeren Verbindungen
sind die Teilalkylester oder andere Ester sowie
Teilamide, Alkylamide, Dialkylamide, Phenylalkylamide oder
Phenylamide, die man durch Umsetzung von Carboxylgruppen der Polymerkette mit den entsprechenden Aminen oder Alkyl- oder
Phenylalkylalkoholen erhält, sowie auch Aminoester, Amir.oamide,
Hydroxyamide und Hydroxyester, in welchen die funktioneilen Gruppen durch Nieder-alkylen, Phenyl, Phenylalkyl,
Phenylalkylphenyl oder Alkylphenylalkyl getrennt sind} diese Verbindungen können für jeden Fall auf die gleiche Weise hergestellt
werden, aber unter Berücksichtigung, dass die für die Bindung der Enzyme notwendigen Reste nicht blockiert werden.
Es können auch andere Arylgruppen anstelle der Phenylgruppen anwesend sein. Insbesondere wertvoll sind solche Derivate,
in welchen die negativ geladenen Carboxylgruppen teilweise durch Amino- oder Aminosalz-Gruppen ersetzt sind. Diese
können durch Umsetzung der Carboxylgruppen mit Polyaminen, wie z.B. Dimethylaminopropylamin, oder Di'-alkylaminoalko holen,
wie z.B. Dimethylaminoäthanol, erhalten werden, wobei die
Amine mit dem Polymer Amidbindungen hervorrufen und-die Alkohle
eine Esterbindung bedingen. Durch geeignete Auswahl dieser beschriebenen Derivate kann man verschiedene Parameter
für das Verhalten der verwendeten Enzym-Polymer-Verbindung
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009848/1925
bestimmen.
Polymere Verbindungen aus dibasischen Säuren oder Anhydriden und Olefinen, insbesondere Maleinsäure- oder
Maleinsäureanhydrid-Olefin-Polymere des EMA-Typs sind bekannt.
Zahlreiche der polymeren Verbindungen sind im Handel erhältlich. Insbesondere wertvolle Copolymere sind
diejenigen Verbindungen, die sich aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid ableiten und etwa äquimolekulare Mengen dieser Bestandteile aufweisen. Die Produkte sind käuflich.
diejenigen Verbindungen, die sich aus Aethylen und Maleinsäureanhydrid ableiten und etwa äquimolekulare Mengen dieser Bestandteile aufweisen. Die Produkte sind käuflich.
Die auf diese Weise erhaltenen Maleinsäureanhydrid-Copolymere
enthalten sich wiederholende Anhydridbindungen im Molekül, die durch Wasser leicht hydrolysiert werden
können, wobei sich die saure Form des Copolymers bildet und die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Temperatur proportional
ist. Da die Anlagerungsreaktionen in wässrigen Lösungen oder Suspensionen oder unter Verwendung von Wasser-Lösungsmittelmischungen
ausgeführt werden, besitzt das Produkt, in welchem das Enzym kovalent mit dem EMA verbunden ist, anstelle
von Anhydridgruppen Carboxyl- oder Carboxylatgruppen
an seinen Ketten, die dem gebundenen Enzym benachbart sind. Diese Gruppen treten auf, da während der Umsetzung die An-
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009848/1925
hydridgruppen nicht mit dem Enzym reagieren, dafür aber
hydrolysiert werden. Dasselbe gilt auch für sich nicht umsetzende
Anhydridgruppen, die in anderen Polymeren anwesend sind, wie z.B. EMA-Typ-Polymere, die zu Carboxyl- oder Garbo
xylat gruppen während der Anlagerungsreaktion hydrolysieren.
Der Ausdruck "wasserunlöslich" wie schon weiter oben erwähnt wurde, bedeutet, dass sich das betreffende Produkt
nicht in Wasser oder wässriger Lösung löst, obwohl es sogar aufgrund einer Solvation in Wasser in höchstem Urad
anschwellen kann, sogar bis zu einem Zustand in Gel-Form. "Wasserunlösliche" Produkte können durch Filtration, Zentrifugieren
oder Sedimentation abgetrennt werden. Derartige Eigenschaften werden durch Vernetzung verliehen. Zusätzliche
Unlöslichkeit kann auch durch Konversion der Polymer-Enzym-Verbindung in ein unlösliches Salz hervorgerufen werden, z.B.
das Calciumsalz, das man durch Umsetzung des Polymers oder der Polymer-Enzym-Verbindung mit Kalkwasser erhält.
Der verwendete Ausdruck "wasserlöslich" bedeutet, dass sich das betreffende Produkt in Wasser oder
wässriger Lösung löst. Im allgemeinen versteht man jedoch darunter, dass sich- das Produkt nicht vollständig bei allen
Konzentrationen oder allen pH-Werten lösen muss. Andererseits zeichnen sich diese wasserlöslichen Produkte durch ihre
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009848/1925
Löslichkeit bei verschiedenen Konzentrationen oder pH-Werten aus, und sie sind gewöhnlich bei einem pH-Wert von 7 sowie
auch höheren Werten löslich.
In ihrer wasserlöslichen Form besitzen die
neuen Polymer-Enzym-Produkte die gleiche enzymatische Wirkung
als die ursprünglichen Enzyme, aus denen sie hergestellt wurden, und sie besitzen zusätzlich die Vorteile, die durch
Anwendbarkeit in Lösung oder Suspension zusammen mit der erhöhten Stabilität und der verringerten Aktivität hervorgerufen
werden. Da die neuen Polymer-Enzym-Produkte in polymerer und löslicher Form vorliegen, können sie von den Ausgänge-Enzymen
oder Substraten sowie auch von Verunreinigungen und färbenden, unerwünschten Beimischungen durch normale Trennungsverfahren,
wie z.B. Zentrifugieren, Elektrophorese oder Chromatographie, abgetrennt werden.
Im allgemeinen stellt man wasserunlösliche
Polymer-Enzym-Produkte her, indem ein Enzym mit einem wasserunlöslichen
Polymer umgesetzt wird, man kann aber auch das Reaktionsprodukt aus dem Eneyr. und dem Polymer unlöslich
machen, indem man entweder mit einem polyfunktionellen, vernetzenden Mittel, wie z.B. einem Polyamin oder einem Polyol
(einschliesslich Glycol) umsetzt, falls dies notwendig ist.
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009848/1925 bad original
Das Enzym-Polymer-Produkt ist häufig per se wegen der Zwischenwirkung
des Enzymanteils und der zusätzlichen Polymerkette wenigstens teilweise unlöslich. Wenn das1 Polymer schon vorher
vernetzt ist und daher eine dreidimensionale Struktur besitzt, oder in einigen Fällen eine genügend lange lineare
Kette aufweist, ist das Ausgangspolymer bereits wasserunlöslich. Es bestehen auch andere Verfahren zum Vernetzen und sind ebenfalls
gut bekannt.
Wenn unlösliche Produkte erhalten werden sollen, so ist es häufig vorteilhaft, Copolymere zu verwenden, die
schon teilweise vernetzt sind. Solche vernetzten Copolymere
sind bekannt und können erhalten werden, indem man die Polymerisation entsprechend leitet, wie z.B. die Copolymerisation
von Maleinsäureanhydrid und einem Kohlenwasserstoff-Olefin
in Gegenwart eines vernetzend wirkenden Mittels, wie z.B. einer Verbindung, die zwei olefinische Doppelbindungen
enthält. Solche Verbindungen sind unter anderem Divinylbenzol oder Vinylcrotonat, Polyt-l,2-butadien oder α, fl-Diolefine.
Die Menge des vernetzend wirkenden Mittels hängt von dem Grad der gewünschten Unlöslichkeit ab. In der Regel
genügen 0,1 bis 10 Gew. #, bezogen auf die Gesamtmenge der
monomeren Mischung.
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Man kann z.B., falls es notwendig oder erwünscht ist» ein vernetztes dreidimensionales Polymer herstellen,
indem man eine difunktionelle Verbindung zum vernetzen eines vorgeformten dibasisehe Säure/Cp-C, ο Monoolefin-Copolymers
verwendet. Diese Umsetzung kann erzielt werden, indem man das Copolymer und ein Polyamin, z.B. 0,1 bis 10 Molprozent
Aethylendiamin^miteinander umsetzt. Auf diese V/eise
ist es möglich, die Vernetzung des Polymers zu kontrollieren. Es ist verständlich, dass Aethylendiamin ein typisches Beispiel
für ein Vernetzungsmittel darstellt, dass man aber auch andere Verbindungen, wie z.B. Alkylen- oder andere Polyamine
für diesen Zweck anwenden kann. Andererseits werden in der Regel lösliche Enzym-Polymer-Proudkte vorteilhaft durch etwas
verschiedene Verfahren hergestellt.
IM hohe Ausbeuten an wasserlöslichen Enzym-Polymer-Produkten
zu erhalten, ist es wünschenswert, eine Vernetzung zu vermeiden, die Unlöslichkeit hervorruft.
Zur Herstellung der löslichen Enzym-Polymer-Derivate wird daher die Umsetzung vorzugsweise unter nichtvernetzenden
Bedingungen hindurchgeführt. Man kann eine unerwünschte Vernetzung herabsetzen, indem man die Anlagerungsreaktion in hoher Verdünnung ausführt, so dass weniger Reaktionen
zwischen den verschiedenen Polymer-Molekülen und
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einem einzigen Enzym-Molekül stattfinden können. Andererseits begünstigen hohe Verhältnisse des Enzyms zum Polymer
die Umsetzung mehrerer Enzym-Moleküle mit einem einzigen
Polymer-Molekül. Hierdurch wird bedingt, dass sich ein agglomeriertes Enzym/Polymer-System bildet, in welchem die
gewünschten löslichen Eigenschaften der einzelnen Enzym-Moleküle beibehalten werden/ Ein zusätzlicher Weg zur Bildung
löslicher Produkte beruht auf der Umsetzung bei hoher ionischer Stärke, um die Aggregation des ursprünglichen Proteins herabzusetzen.
Während derartige, weiter oben beschriebene Verfahren oft sehr wünschenswert sind, ist es nicht immer nötig,
verdünnte Lösungen oder hohe Enzym/Polymer-Verhältnisse zur
Bildung der löslichen Enzym/Polymer-Derivate anzuwenden.
Bevorzugte polymere Verbindungen sind die folgenden:
(a) Aethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Styrol/Maleinsäureanhydrid-Copolymer,
Vihylmethyläther/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Vinylacetat/Maleinsäureanhydrid-Copolymer,
Divinyl-äther/Maleinsäureanhydrid-Cyclocopolymer,
Polymaleinsäureanhydrid und Polyacrylsäureanhydrid
sowie kationische Derivative dieser Produkte.
- 34 009848/1925
ir
Bevorzugte Enzyme umfassen mindestens 1 Enzym der folgenden Gruppe:
(b) neutrale Protease, saure Protease, alkalische Protease,
Amylase, Dextranase, Lipase, Lysozyme oder
Myxobacter AL-I Protease oder andere Iytisehe
Enzyme
alkalische Protease, insbesondere, wenn an einen kationischen oder basischen Polyelektrolyten
gebunden.
Alle diese Enzyme sind insbesondere mikrobiologischen Ursprungs* Man kann auch Mischungen dieser Enzyme
verwenden. Solche Mischungen von 2 oder mehr Enzym-Polymer-Verbindungen ergeben in allgemeinen ein viel besseres Resultat,
als wenn nur ein einziges Enzym-Polymer-Produkt verwendet wird. Es ist ebenfalls möglich, in dem neuen Mundhygiene-Mittel
ein Polymer-Enzym-Produkt anzuwenden, welches mehrere Enzyme enthält. Die Verwendung einer derartigen Enzym-Polymer-Verbindung
mit mehreren Enzymen stellt eine bevorzugte Ausführungsform des neuen Mundhygiene-Mittels dar. In diesem
Fall können mehrere enzymatische Aktivitäten gleichzeitig
in dem neuen Mittel enthalten sein und der enzymatisch aktive Bestandteil des neuen Mittels liegt in Form eines stabilen
Produktes vor, und unterliegt keiner Autolyse, wie sonst
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Mischungen oder Kombinationen von Enzymen allein. So kann
z.B. ein Polymer-Enzym-Produkt eine neutrale Protease und/oder Amylase und/oder Lipase und/oder Dextranase und/oder lytisches
Enzym enthalten, wie z.B. Lysozyme oder Myxobacter AL-I
Protease. Eine derartige Kombination hat sich für die An-Wendung im erfindungsgemässen Mundhygiene-Mittel als besonders
bevorzugt erwiesen und stellt eine bevorzugte AusfUhrungsform
der Erfindung dar. Es ist selbstverständlich, dass auch andere Enzyme als die weiter oben beschriebenen in dem Molekül
des Polymer-Enzym-Produktes für eine wirksame Aktivität verwendet werden können, wie z.B. eine alkalische Protease,
welche mit einem kationischen oder basischen Polyelektrolyt-Polymer-Molekül
verbunden ist, es können aber auch andere oder beliebige der weiter oben beschriebenen Enzyme Anwendung
finden und jedes dieser Enzyme wird auf einem bestimmten Bereich wirksam sein«
Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung der Enzym-Polymer-Verbindung kann folgendennassen ausgeführt
werden: man lässt eine kalte Lösung von Enzymen in geeigneten Pufferlösungen über Nacht bei einer Temperatur von 40C
mit einer kalten, homogenisierten Suspension der polymeren Verbindung, z.B. eine MA-Suspension, stehen. Vorzugsweise
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ORiG)MAL IKSPEOTE
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3Ϊ-
verwendet man EMA-21, welches ein Molekulargewicht von etwa
20000 bis 30000 besitzt. Es können aber auch Polymere mit anderen Molekulargewichten verwendet werden. So z.B. EMA-Il
mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis 3000 und EMA-3I mit einem Molekulargewicht von etwa 60000. Die Abtrennung
der löslichen sowie unlöslichen Addukte nach der Umsetzung kann durch Zentrifugieren in der Kälte mit einer Zentrifuge
(Sorval SS-3 (TM) bei etwa 10000 Umdrehungen pro Minute und bei einer Zentrifugationszeit von 10 Minuten stattfinden.
Die löslichen Addukte werden gewöhnlich in der Kälte sorgfältig gegen Wasser dialysiert und anschliessend lyophilisiert.
Unlösliche Addukte kann man waschen (und zentrifugieren), üblicherweise 10 mal mit kalter Pufferlösung und 5 mal mit
kaltem destilliertem Wasser; anschliessend wird lyophilisiert. Präparationen 1-11
EMA-neutrale Protease, alkalische Protease und Amylase-polymere Produkte
Die zur Herstellung eines Bazillus subtilis-Enzymmischung/EMA-21-Adduktes
verwendeten Ausgangsprodukte können folgendermassen hergestellt werden:
1. Wasserfreies EMA-21 wurde aus HEMA-21 (hydrolysiertes
EMA) durch Erhitzen im Vakuum bei einer Temperatur von 1050C über Nacht hergestellt. Das Molekulargewicht
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von EMA-21 betrug etwa 20000 bis 30000.
2. Die verwendete Veronal-Pufferlösung war
0,05 Molar und wies einen pH-Wert von 7,8 auf*
3. Die verwendete Lösung von Calciumacetat war 1 Molar. Diese wurde in doppelter Volummenge zugesetzt,
um der Lösung des Enzyms die erforderliche Konzentration
an Calciumionen zu geben. Es konnte aber auch ein .2-molare Lösung Anwendung finden.
Man verwendete verschiedene Proben einer
Bacillus subtilis AM Enzymmischung von denen jede neutrale
Protease, alkalische Protease und Amylase enthielt. Das Material für die drei Typen hatte die folgende Zusammensetzung:
1. B. subtilis Stamm AM Enzymmisehung mit einer Aktivität von 1,9 x 10 Protease μ/g (pH T)
und teilweise unlöslich.
2. B. subtilis Stamm AM Egzymmischung mit einer Aktivität von 1,0 χ 10° Protease u/g (pH 7)
und teilweise unlöslich.
3· B. subtilis Stamm AM Enzymmischung mit einer
Aktivität von 1,43 x 106 Protease jx/g (pH 7)
und vollständig löslieh.
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung des Polymer-Enzym-Produktes kann folgendermassen beschrieben
werden: Das rohe Enzymgemisch aus B. subtilis wird in kaltem destilliertem Wasser suspendiert und magnetisch eine Stunde
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lang bei 40C gerührt. Dann zentrifugiert man die erhaltene
Mischung bei 8000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang, um die suspendierten und inaktiven Peststoffe zu entfernen.
(Bei Anwendung des vollständig löslichen Enzymsystems Nr. SG-2144 kann man diese Stufe fortlassen). Die überstehende
Lösung wird abgetrennt^ und durch Zugabe einer einmolaren Lösung von Calciumacetat kann man die Konzentration der
Calciumionen in der Lösung auf eine Molarität von 0,065 bringen. Dann rührt man 30 Minuten lang ,bei 40C und änschliessend
wird das Gemisch 10 Minuten lang mit 8000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um ausgeschiedene sowie inaktive
Feststoffe zu entfernen. Zu der überstehenden klaren Lösung
gibt man unter Rühren eine kalte 0,05 molare Veronal-Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,8. Während der Herstellung dieser Lösungen löst man die erforderliche Menge von EMA
(B.subtilis Enzyme: EMA 21, 8 : 1 Gew./Gew.) in Dimethylsulfoxyd. Diese Lösung wird tropfenweise zu der gerührten,
kalten Lösung des Enzyms gegeben und anschlieesend wird noch
über Nacht bei einer Temperatur von 40G weiter gerührt. Die
Mischung wird dann bei 8000 Umdrehungen pro Minute während
10 Minuten zentrifugiert und man sammelt das feste Produkt. Diese feste Polymer-Enzym-Verbindung wird mit der doppelten
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Menge an kaltem destilliertem Wasser unter Rühren und Zentrifugafion
gewaschen. Das Waschen wird 15 mal wiederholt, worauf man das Produkt durch Lyophilisieren isoliert. Die Ausbeute
und enzymatischen Aktivitäten der so hergestellten Addukte ,sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Zur Herstellung unlöslicher Produkte ist es vorteilhaft, dass man die Umsetzung in Gegenwart eines vernetzend
wirkenden Mittels ausführt, wie z.B. Hexamethylendiamin, und zwar bei Konzentrationen von etwa 1 bis 2 $yin
bezug auf die Menge des angewendeten Polymers.
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Enzymgemisch Ursprüngliche Menge des Mengenver- Erhaltene Erhaltenes Zurückbe- Ausbei
von B.sub- Aktivität der Enzymge- hältnis des Protease Addukt haltene Gewic]
Präparat tilis Protease misches v. B.subtilis Aktivität (g) Aktivität (<$>'.
Nr. Nr. , (10°/u/g) B.subtilis Enzymgem.
zu EMA
| 1 |
O
CD CO |
R.G.A. |
| 2 |
OO
■t* |
SG-2046 |
| 3 | OO | SG-2046 |
| 4 | CO | SG-2046 |
| 5 | cn | SG-2046 |
| 6 | SG-2046 | |
| 7 | SG-2046 | |
| 8 | SG-2046 | |
| 9 | SG-208S | |
| 10 | SG-2144 | |
| 11 | SG-2144 | |
6,0 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 1,0 1,4
| 3 | 8:1 |
| 20 | 8:1 |
| 20 | 8:1 |
| 20 | 8:1 |
| 150 | 8:1 |
| 55 | 8:1 |
| ■55 | 8:1 |
| 750 mg | 8:1 |
| 55 | 8:1 |
| 4X55* | 8:1 |
| 9X55** | 8:1 |
* Kombination von vier Versuchen mit je 55 g ** Kombination von neun Versuchen mit je 55 g
3.045.000 0,780
1.400.000 5,493
1.050.000 5,260
1,515.000 4,962
1.400.000 52,70
1.400.000 5,493
1.050.000 5,260
1,515.000 4,962
1.400.000 52,70
670.000 11,10
288.000 12,90
1.312.500 0,163
1.312.500 0,163
375.000 119,2
1.250.000 70,0
1.250.000 70,0
650.000 400
50,7 '
73,7
55,2
79,7
73,7
35,2
43,0
68,9
37,5
87,3
45,4
26,0
27,5
26,3
24,8
35,1
20,0
23,4
21,7
30,9
31,8
46,0
OO K) CD CX)
Zur Prüfung der Amylase verwendete man das
bekannte Verfahren von Bernfeld, indem man 5 Minuten lang zur
Entwicklung der Farbe erhitzte.
Bei Prüfung auf Protease bei einem pH-Wert von
7 arbeitete man nach dem bekannten Verfahren von Anson; Proben
bei einem pH-Wert von 10 unterscheiden sich lediglich dadurch, dass die Caseinlösung mit verdünnter Phosphorsäure auf einen
pH-Wert von 10 neutralisiert wurde.
Die Prüfung der Stabilität von Bestandteilen
des Enzymgemisches aus B. subtilis Stamm AM (Amylase, Protease, geprüft bei pH 7s0 und pH 10>0) sowie der entsprechenden unlöslichen
EMA-Derivate wurden bei Temperaturen von 25°, 37° und 5O0C während Zeitperioden von bis zu 22 Tagen ausgeführt. Die
Wirkung von zugesetztem Calcium auf die Stabilität von EKA-Enzym-Derivaten war deutlich zu erkennen, höchstwahrscheinlich
wegen der Tatsache, dass ursprüngliches Calcium während der
Herstellung entfernt wurde. Die Amylaseaktivität war ziemlich stabil und zeigte bei pH-Werten von 10 bis 12 in dem EMA-Enzym-Derivat
eine erhöhte Wirkung auf. Man konnte eine gleiche Wirkung
bei der Aktivität der gesamten Protease (geprüft bei einem pH-Wert von 7,0) sowie auch der alkalischen Protease (geprüft
bei einem pH-Wert von 10,0) bei längeren Prüfungen bei pH-Werten von 7 bis 10 und bei Temperaturen von 25 bis 37 C
- 42 -
009848/1925
feetetellen. Bei höheren Temperaturen bis zu 8O0C während
eines nur 30-minütigen Erhitzens zeigte sich die erhöhte Stabilität der Amylaseaktivität von EMA-Enzym-Derivaten auch höheren
pH-Werten. Die Protease zeigt keine entsprechende erhöhte thermische Stabilität, obwohl die Stabilität der neutralen
Protease in dem EMA-Addukt selbst"etwa 2 mal soviel betrug
als diejenigen des nativen Enzyms und die Stabilität der alkalischen
Protease in EKA-Addukt etwa 4 mal so hoch war wie diejenige des natürlichen Enzyms nach einem Erhitzen von 30
Minuten bei 800C.
Ein positiver Beweis dafür» dass alle drei Arten von Enzymen in dem polymeren Molekül enthalten sind,
kann folgendermassen ausgeführt werden:
(1) Das EMA-Ensym-Produkt mit mehreren Enzymen
besitzt eine Amylaseaktivität mit einer spezifischen Aktivität,
die fast so hoch ist wie die von 2 ungebundenen Enzymmischungen, die man als Kontrollverbir.dur.gen verwendete; die Angaben sind
in Tabelle 2 zusammengestellt.
(2) Das EMA-Enzym-Produkt mit mehreren Enzymen
besitzt eine Proteaseaktivität bei einem pH-Wert von 7 sowie einem pH-Wert von 10, die ungefähr gleich gross ist als das Verhältnis,
welches zwischen der ungebundenen Enzymmischung be-
- 43 -
009848/1925 BAD ORIGINAL*
«if
eteht, die als Kontrollverbindung benutzt wurde. Die spezifische
Aktivität des EMA-Enzym-Produktee mit mehreren Enzymen bei den
2 geprüften pH-Werten ist jedoch fast gleich mit den Werten, die für die 2 Kontroll-Enzymmischungen"gefunden wurden, wie
in Tabelle 2 gezeigt wird.
Amylase
/
/
neutrale Pro- alkalische tease Protease pH 7,0 μ/g pH 10,0 μ/g
| unlösliches EMA-En- zymprodukt mit meh reren Enzymen |
405 | .000 | 1 | .090 | .000 | 680. | 000 |
| Enzym A | 666 | .000 | 1 | .720 | .000 | 9S0. | 000 |
| Enzym B | 340 | .000 | 960 | .000 | 550. | 000 |
Durch Untersuchungen der Stabilität kann man eine nicht voraussehbar hohe Stabilität für die Polymer-Enzym-Produkte
feststellen, wie in den Tabellen III - VIII gezeigt wird.
_ 44 _
009848/1928
Die Wirkung der Bindung an EMA auf die Stabilität der Amylase
aus B. subtilis
Die Erwärmungsperiode beträgt 30 Minuten,
pH-Wert 10,0
unlösliches EMA-Enzym-
Produkt mit mehreren
Enzymen (100) 104 100 70 16
Vergleichsenzym (100) 99 85 43 2
Die Wirkung der Bindung an EMA auf die Stabilität von neutraler
Protease aus B. subtilis
Erwärmung während 30 Minuten bei einem pH-Wert
von 8,0
Protease-Probe bei pH 10,0
Temperatur 25°C 50°C 600C 70°C 8Q0Q
unlösliches EMA-Enzym-
Produkt mit mehreren
Enzymen (100) 92 63 19 11
Vergleichsenzym (100) 79 54 12 6
_ 45 -
009848/1925
Die Stabilität alkalischer Protease und ihrer EMA-Derivative
bei einem pH-Wert von 10
Erwärmung während 30 Minuten .bei einem pH-Wert
von 10,0
Tempratur
250C 5O0C 6O0C 70°C 80° C
unlösliches EMA-Enzym-Produkt mit mehreren Enzymen
(100) 70 3Z 35 13
Vergleichsenzym (100) 68 49 8 3
■ Tabelle VI
Die Wirkung von EMA-Bindung auf die Stabilität von neutraler
Protease aus B. subtilis
Temperatur 25°C; pH-Wert 9,0; Probe bei pH 7,0
in 0,1 ^igem Calciumazetat
unlösliches EMA-En-
zym Produkt mit
mehreren Enzymen (100) 67 28 28 27 23
Vergleichsenzym (100) 28 15 20 14 2
- 46 -
009848/1925
Die Wirkung der Bindung an EMA auf die Stabilität von alkalischer
Protease aus B. subtilis
Temperatur 250C; pH 7,0 in O,l#igera CaI-ciumazetat;
Probe bei pH 10,0
Zeit in Stunden 0 22 46 94. 166
unlösliches EMA-Enzym-Produkt mit
mehreren Enzymen (100) 90 100 50 <?2
Vergleichsenzym (100) 83 71 17 4
Die Wirkung der 3indung an EMA auf die Stabilität von alkalischer
Protease aus B. subtilis
Temperatur 500C; pH 10,0 in 0,1 Jtigem CaIciumazetat
; Probe bei pH 10,0
Zeit in Stunden C) 22 46 94 166 ISO
unlbBliches EMA-Enzyra-Produkt
mit mehreren Enzymen
Vergleichsenzym
- 47 -
009848/1925
| (ICO) | 62 | 27 | 23 | 19 | 12 | 12 |
| (100) | 22 | S | 3 | 2 | 6 | 1 |
Bacillus subtilis. neutrale Protease und Dextranase-EMA lösliche und unlösliche Produkte
100 mg neutrale Protease aus Bacillus subtilis sowie 100 mg Dextranase werden in 75 ml eines kalten 0,1 molaren
Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst, welcher ebenfalls in beEUg auf CaIciumazetat 0,01 molar ist* Zu dieser
Lösung gibt man eine homogenisierte Mischung von 250 mg EMA in 100 ml eines kalten, 0,1 molaren Phosphatpuffers mit einem
pH-Wert von 7,5· Man rUhrt die vereinigten Mischungen in der
Kälte (40C) über Nacht und trennt dann den Feststoff von der
überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugation. Nach Dialyse und Lyophilisation besitzt das unlösliche B. subtilis neutrale
Protease und Dextranase-EMA-Produkt 43 i» der ursprünglichen
Proteaseaktivität und 27 i> der ursprünglichen Dextranaseaktivi*-
tät. Man dialysiert und lyophilisiert die überstehende Flüssigkeit, wobei man ein lösliches festes B. subtilis neutrale Protease- und Dextranase-EMA-Produkt'erhält, welches 64 H der ursprünglichen Proteaseaktivität und 62 i>
der ursprünglichen Dextranaseaktivität aufweist.
Die Anwendung von 1 jC Hexamethylendiamin erhöht die Menge an unlöslichem vernetzten Produkt.
- 48 -0098 4 8/1925 . oRtcüNAL kspscted
" Präparation 13
Dextranase-EMA lösliche und unlösliche Produkte
Man erhielt Dextranase als Feststoff, der durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels zu einer Fermentationsbrühe von Penicillium funiculosum (Stamm NRRL 1132) gegeben
wurde.
* 100 mg Dextranase werden in 50 ml kaltem, 0,1 molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 gelöst.
Dieser Puffer ist ebenfalls in bezug auf Calciumacetat 0,01 molar. Zu dieser Lösung gibt man eine homogenisierte Mischung
von 100 mg MA. in 50 ml eines kalten 0,1 molaren Phosphatpuffers.
-·.- Die vereinigte Mischung wird über Nacht in der Kälte.(40C) gerührt und dann trennt man den entstandenen Feststoff durch
Zentrifugieren von der überstehenden Lösung ab. Nach Dialyse
und Lyophilisation besitzt das unlösliche Dextranase-EMA-Produkt noch 35 % der ursprünglichen Dextranaseaktivität.
. lyophilieiert, wob·! man .ein lösliche«, festes Dextranaee-EMJl·».
:;; Produkt erhält, welches noch 68 jC der ursprünglichen Dextra- :
naseaktivität aufweist. ·
Präparationen 14 bJB 56 Andere Polymer-Enzym-Produkte
• ' ' - 49 -."
009848/1925
Nach dem Verfahren von Präparation 1 konnten die zusätzlichen Polymer-Enzym-Produkte hergestellt werden.
Die Prosentangaben beziehen sich auf die Prozente der enzymatisehen Aktivität, die in dem Polymer-Enzym-Produkt enthalten ist, im Vergleich zu der Aktivität der als Ausgangsverbindungen verwendeten nativen Enzyme.
14. slüre, neutrale und alkalische Protease-EMA-Produkt
(saure Protease aus A. oryzae)
lösliches Produkt: 47 #, 45#, 52jt
unlösliches Produkt: 35 Jt, 34?t, 48#
15· saure und neutrale Protease-EMA-Produkt (saure Protease aus
A. oryzae)
lösliches Produkt: 32 1>K 48Jt
' unlösliches Produkt; 30 Jt, 42 Jt
16. B. eubtilis neutrale Protease/Papain und Pepsin-EMA-Produkt
lifeliches Produkt: 42 $δ, 57 Jt, 45?ί
... . unlöiliches Produkt: 32 %, 48 Jt, 38 Jt
17. saure Protease/Papain/Pepsin (saure Protease aus A. oryzae)·
EMA-Produkt
lösliches Produkt: 52 i» (einechlieselich Pepsin,
unlösliches Produkt: 54 #( " M) ,
- - 50 -
009848/1925
18· Neutrale Erotease/Lipase-Styrol/Maleineäureanhydrid-Copolymer-Produkt
unlö eliche s Produkt: etwa je 20 Jt
19. Neutrale Protease/alkalische Protease-Vinylmethyläther/
Melelneäureanhydrid-Copolymer-Produkt
unlösliches Produkt: etwa je 50 i»
20. Neutrale Protease/alkalische Protease/Amylaee-Vinylacetat/
Maleinsäureanhydrid-Copolymer-Produkt,
unlösliches Produkt: etwa je 60 i»
21. Neutrale Protease/Lipase-Divinyläther/Maleineäureanhydrid-Cyclocopolymer-Produkt
unlösliches Produkt: etwa je 50 Jt
22.Neutrale Protease/alkalisehe Protease-Polymaleinsäureanhydrid-Polyaer-Produkt
unlösliches Produkt: etwa je 70 JC
23· Neutrale Protease/alkalische Protease/Lipase-Polyacrylsäureanhydrid-Poljfmer-Produkt
unlösliches Produkt: etwa je 50 Jt
- 51 009848/1925
24. Β» awbtilie neutrale und alkaliβehe Protease und Amylase-HIA-Produkt
lösliches Produkt: 42 £, 57 f, 69 f>
unlösliches Produkt: 32 #, 48jt, 62J*
25. Wtutrale Protease/Dextranase-Polyacryleaureanhydrid-Produk* .ν,·
lö all ehe θ Produkt: 62 Jt, 52 *
unlösliches Produkt: 40 #, 28 £
26. 6. subtilie neutrale und alkalische Protease-EHA-Produkt
lösliches Produkt: 47 *, 59 t
unlösliches Produkt: 38 *, 52 1*
27. B. subtilis neutrale und alkalische Protease und Lipaee-EMA-Produkt .
lösliches Produkt: 43 J^, 56 Jt, 17 Ji
unlösliohes Produkt: 35 j6, 47 Jt, 72 Jt
28. ÄA-Irypein-Produkt ;
29. Chyeotrypein-EMA-Produkt -' ·
30. Lip«ee-EMA-Produlrt = "
31· LysoByae-EÄA-Produkt * ·'
32. B. subtilis neutrale und alkalische Protease/saure Protease/
Dextranaee-EMA-Produkt
- 52 - ^
009848/192 5 . bad original
33· B. subtilis neutrale und alkalische Protease /Amylaee und
Dextranase-EMA-Produkt
34. Neutrale Protease (B. subtilis var. amylosacchariticus}-MA-
34. Neutrale Protease (B. subtilis var. amylosacchariticus}-MA-
Produkt.
35· Asparaginase-EMA-Produkt 36. EMA-Papain-Produkt
37» Neutrale Protease-Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer-Pro-
»·
. dukt
. dukt
38.- Neutrale Protease/Ainylase-Vinylmethyläther/Maleinsäurean-
hydrid-Copolymer-Produkt
39· Ficin-vinylacetat/Maleinsäureanhydrid-Copolymer-Produkt
40. Dextranase/neutrale Protease-Divinyläther/Maleinsäurean-
hydrid-Cyclocopolymer-Produkt
41« Chymotrypsin-Polymaleinsäureanhydrid-Polymer-Produkt
42. Trypsin-polymaleinsäureanhydrid-Polymer-Produkt
43» Alkalische und neutrale Protease-Polymaleinsäureanhydrid-
Polymer-Produkt
44. Saure Protease (A. oryzae)-Polyacrylsäureanhydrid Polymer-Produkt
45· Saure Protease (A. oryzae)-EMA-Produkt
45· Saure Protease (A. oryzae)-EMA-Produkt
46. Myxobacter AL-I Protease-EMA-Produkt
47. Alkalische Protease-Diniethylaminopropylaniid von EMA-Produkt
- 53 009848/1925
48. B. subtilis neutrale und alkalische Protease/Amylase-Dimethylaminoäthyliiaid
von EMA-Produkt
49. Bromelain-EMA-Produkt
50. Alkalische Protease-Dimethylaninopropanplester von -EMA-Pro*-
dukt
51. B. subtilis neutrale und alkalische Protease/Amylase und
Myxobacter AL-I Protease-EMA-Prοdukt
52. Pepsin-EMA-Produkt
53. EHA-Zinkpapain-Produkt
54. B. eubtilis AM neutrale Protease-EMA-Produkt
55. B, subtilis AM neutrale Protease/Dextranase-EMA-Produkt
56. Lysozyme/heutrale Protease/alkalische Protease-Diäthylaminopropylimid
von EKA-?rodukt *
Beispiel 1 ' Polymer-Enzymprodukte enthaltendes Mundwasser
Typische Mundwasser können aus den folgenden B*- Ji itmndteilen hergestellt werden;
Gew.
j,
?; Wasser 30-99
Alkohol 0-70
Glycerin Q-w-25
Oberflächenaktives Mittel 0-0 1
Antimikrobisch wirkendes Mittel, z.B.
Cetylpyridiniumchlorid 0,01-0 1
BAD ORIQ/NAL
Gew.
Bei. Verwendung einer oder mehrerer der Polymer-Enzym-Verbindungen der Präparationen 1 bis 55, vorzugsweise
werden mehrere verwendet, als enzymatisch aktive Bestandteile in der weiter oben angegebenen Formulierung sind die Kompositionen sogar nach längerer Lagerung stabil, besitzen eine :
lang dauernde Wirkung bei der Anwendung und sind äusserst wirksam, um sowohl Flecke als auch sonst schwer zu entfernende
weiche Anlagerungen sowie auch Zahnstein bei längerem Gebrauch zu entfernen. Die Kompositionen haben ein äusserst gutes Aussehen und sie sind sehr wirksam, falls sie wasserlösliche
Polymer-Enzym-Produkte enthalten; die Wirkung dauert jedoch länger an, wenn sie unlösliche Polymer-Enzym-Verbindungen aufweisen.
Insbesondere wirksame Kompositionen sind diejenigen, welche lösliche und/oder unlösliche Polymer-Enzym-Verbindungen der vorher beschriebenen Präparationen enthalten.
In der nachfolgenden Tabelle beziehen sich die Zahlen auf die Nummern der Präparationen.
- 55 -
00S8A8/1925 . . · '
'
BAD ORIGINAL
| A. | 1 ♦ | 1 | 13 | F* | 1+13+31 | K. | 51 | P* | 12 | + 44 |
| B. | 12 | G. | 32 | L. | 55 | Q. | 18 | + 13 | ||
| C. | 2 4- | 30 | H* | 33 | M. | ■ 48 | R. | 25 | ||
| D. | £4 | I. | 46 | N. | 3 + 44 | S. | 4 | + 31 | ||
| ε. | ir. | 45 | 0. | 3+44+13 | T. | 40 | ||||
* Aueserst wirksame Polymer-Enzyra-Produkte mit
«ehrertn Enaymen sind diejenigen, die ein Polymer-neutrale
Proteast oder ein Polymer-neutrale Protease plus Polymer-Dextranaee UBifaesenf eowie insbesondere ein Polymer-neutrale Pro-.
teaee/Dextranase-Produkt. Ausserdem ist eine Komposition, die
Polymer-Myxobacter AL-I Protease enthält, äusserst wirksam.
Beispiel 2 Typische, Pclymer-Enzym-Verbindungen enthaltende
Zahnpaste
Gew.
ja
1. Polier- oder Schleifmittel 40-60
2. Excipient 20-30
3. Verdickungsmittel 0,5 - 3»0
4. Detegtns 0,5-5,0
5. Wasser 10-20
6. Polymer-Enzym-Produkt 0,4 - 4,0
7. Geschmacks- oder Süs3stoff
- 56 - '
009848/1925 ■ - - - ,
BAD ORIGINAL
19*8
29^
1. CftCO,, CDP (Dicalciumphosphat), CaP oder CaSO. stellen
Beispiele dar.
2« Beispiele sind Glycerin, Propylenglycol oder Sorbitol
3. Beispiele sind Tragacanth, Karaya, Carrageen, Guar, Carboxymethylcellulose oder Carbopol
4. Beispiele sind Erdalkali- oder Alkalisalze von Fettsäuren
oder Mono- oder Diglyceride von Fettsäuren oder synthetisch· Waechaktivstoffe.
Falls man in der weiter oben beschriebenen Formulierung 1 oder mehrere Polymer-Enzym-Produkte der Präparationen
1 bis 55 ale enzymatisch aktive Bestandteile verwendet, so sind
die Kompositionen sogar nach langer .Lagerung stabil, sie weisen eine langdauernde Wirkung während der Verwendung auf und sind
äusserst wirksam, um sowohl Flecke als auch sonst schwer zu
entfernende weiche Anlagerung sowie auch Zahnstein von Zähnen zu entfernen, falls man sie längere Zeit verwendet. Die Kompositionen sind äusseret wirksam, falls sie wasserlösliche
Polymer-Ensym-Produkte enthalten; falls sie jedoch unlösliche
Produkte aufweisen, so sind sie länger wirksam.
Insbesondere wirksame Kompositionen eind diejenigen, welche lösliche und/oder unlösliche Polymer-Enzym-Ver-
- 57 .
009848/1925 ' bad original
bindungen der vorher beschriebenen Präparationen enthalten.
In der nachfolgenden Tabelle beziehen sich die Zahlen auf die Nummern der Präparationen:
| A. | 1 | 1 | F. 1 | +13+31 | K. | 51 | P. | 12 + 44 |
| B. | + 13 | C-. | 32 | L. | 55 | Q. | 18 +13 | |
| C. | 2+ | 12 | H. | 33 | M. | 48 | R. | 25 |
| D. | 30" | I. | 46 | N. | 3 + 44. | S. | 4 + 31 | |
| £. | 24 | J. | 45 | O. | 3 + 44+13 | T. | 40 | |
Diejenigen Polymer-Enzym-Produkte-mit mehreren
Enzymen, welche ein Polymer-neutrale Protease oder ein Polymerneutrale
Protease und ein Polymer-Eextranse enthalten, er-
scheinen auch hier am wirksamsten zu sein, vor allem aber ein
Il
Polymer-neutrale Protease/Dextranase-Produkt. Ausserst wirksam
sind auch Produkte, die ein Polymer-Myxobacter AL-I-Protease
enthalten.
Beispiel 3 eine Polymer-Enzym-Verbindung enthaltender Kaugummi
Typische Kaugummi-Zusammensetzungen können nach der folgenden Formulierung hergestellt werden:
- 58 -
BAD ORIGINAL
009848/1925
1946298
Gew.
j»
Gunncibaeis (natürliche und synthetische 20 - 35
Elastomere und Füllstoffe)
Glucoee 10 - 20
Sucrose 50 - 70
Polymer-Enzya-Produkt 0,4-2
GeschmackBBtoff
Bei Verwendung von einer oder mehreren der
Polymer-Entym-Verbindur.gen der Präparationen 1 bis 55 als
tntymatiech aktive Bestandteile in der weiter oben angegebenen
Formulierung erhält man Kompositionen, die sogar nach langer
Lagerung in Verpackungen stabil sind, eine langdauernde Wirkung besitzen und sich insbesondere gut dazu eignen, um sowohl
Flecke als auch sonst schwer zu entfernende weiche Anlagerungen
sowie auch Zahnstein von Zihrcn bei längerer Anwendung zu
entfernen. Die Zusamensetzur.cer. rind äusserst wirksam, wenn
si« ein wasserlösliches Fclyner-Znzym-Produkt enthalten, weisen
aber bei Gegenwart eines unlöslichen Polymer-Enzym-Produktes eine längere Wirkung auf.
Insbesondere wirksame Kompoeitionen sind diejenigen,
welche lösliche und/cder unlösliche Polyraer-Enzyrc-Produkte
der vorhergehenden Prärarationen enthalten. In der
— '· C _
009848/1925
BAD ORSGiNAL
ie
nachfolgenden Tabelle beziehen sich die Zahlen auf die Nummern
der Präparationen.
| A. | 1 | 1 + | 13 | F. | I+I3+3I | K. | 51 | P. | 12 + | 44 |
| B. | 12 | G. | 32 | L. | 55 | Q. | 18 + | 13 | ||
| C. | 2 + | 30 | H. | 33 - | iii · | 48 | R. | 25 | ||
| D. | 24 | I. | 46 | N. | 3+44 | S. | 4 + | |||
| E. | J. | 45 | O. | 3+44+13 | 1. | 40 |
Diejenigen Folyr.er-Enzym-Produkte mit mehreren
Enzymen, welche ein Polymer-neutrale Protease oder ein Polymer-neutrale
Protease und ein Polymer-Dextranase enthalten, Bind ebenfalls hier am wirksamsten, vor allem aber ein PoIyjnerneutrale
Protease/rextrEnase-Frodukt. Ausserst wirksam
Produkt sind auch Produkte, die ein Pclymer-Myxobacter AL-l-Proteaee
enthalten.
Beispiel 4 weitere, Folymor-Enzyte-Verbindungen enthaltende
Zahnpaste
Kach der fcle&ndcn Formulierung kann eine
zusätzliche Zahnpaste hergestellt werden, welche ein Polymer-Enzym-Produkt
enthält:
- 60 -
BAD ORfGiNAL
009848/1925
Gew.
j»
| CDP (Calciumdiphosphat) | 70 |
| Bentonit | 5 |
| Tragacanth | 0,1 |
| Wasser | 10 |
| Glycerin | 20 |
| Pfefferminzcl | 0,5 |
| * Menthol |
0,02 |
| Saccharin, Natriumsalz | 0,05 |
| Methylparaben (Konservierungs mittel) |
0,05 |
| Polymer-Enzym-Produkt | 0,11 |
Bei Verwendung von einem oder mehreren der Polymer-Enzym-Verbindungen der Präparationen 1 bis 55, vorzugsweise
werden mehrere Verbindungen angewendet, als enzymatiBCh aktive Bestandteile in der weiter oben angegebenen
Formulierung sind die Kompositionen sogar nach langer Lagerung stabil, sie besitzen eine langdauernde Wirkung bei der Anwendung
und sind äusserst wirksam, um sowohl Flecke als auch
sonst echwer zu entfernende weiche Anlagerungen sowie auch
Zahnstein von Zähnen bei längerem Gebrauch zu entfernen. Die Kompositionen sind äusserst wirksam, wenn sie wasserlösliche
Polymer-Enzym-Produkte enthalten; ihre Wirkung dauert länger
- 61 -
009848/192 5 bad original
an, falls sie unlösliche Po lymer-Enzym- Verb indungen aufweisen.
Insbesondere wirksame Kompositionen sind die jenigen, welche lösliche und/oder unlösliche Polymer- En/.ym-
Verbindungen der vorher beschriebenen Präparationen enthalten.
In der nachfolgenden Tabelle beziehen sich die Zahlen auf die
Nummer der Präparationen:
| A. | 1 | 13. | F. | 1+13+31 | K. | 51 | P. | 12 + | 44 |
| B. | 1 + | G. | 32 | L. | 55 | Q. | 18 + | ||
| σ. | 12 | 3.0 | H. | 33 | M. | 48 | R. | 25 | |
| D. | 2 + | I. | 46 | N. | 3+44 | . 4 + | 31 | ||
| E. | 24 | J. | 45 | 0. | 3+44+13 | T. | 40 | ||
Diejenigen Polymer-Enzym-Produkte mit mehreren
Enzymen, welche ein Polder-neutrale Protease oder ein Polymerneutrale
Protease und ein Polymer-Dextranase enthalten, erscheinen auch in dieser Formulierung am wirksamsten zu sein,.
vor allem aber ein Polymer-neutrale Protease/Lextranase-Pro—
dukt. Ausserst wirksam sind auch Produkte, die ein Polymer-
Myxobacter AL-1-Protcase enthalten.
Bsi spiel 5 eine Polymer-Enzym-Verbindung enthaltender Kaugummi
Ein zusätzlicher Kaugummi, welcher Polymer- Eh-
zym-Produkte enthält, kann nach der nachfolgenden Formulierung
00 9 8A8/1925 BAD original
hergestellt werden:
| Guffiffiibasis | 28,3 |
| Sucrose | 56,2 |
| Glucose | 14,0 |
| Geschmacksetoff | 0,7 |
| Polymer-Enzym-Frodukt | 0,8 |
Bei Verwendung von einer oder mehreren der Polymer-Enstym-Verbindungen der Präparationen 1 bis 55 als
enzymatisch aktive Bestandteile in der weiter oben angegebenen
Formulierung sind die Kompositionen sogar nach langer Lagerung
stabil, besitzen eine lar.gandauernde Wirkung bei der Anwendung
und sind auseerst wirksam, ur. eowohl Flecke als auch sonst
schwer tu entfernende weiche Anlagerungen sowie auch Zahnstein von Zähnen bei längerem Gebrauch zu entfernen. Die Kompositionen
sind äuseerst. wirksam, wenn sie wasserlösliche Polymer-Enzym-Produkte enthalten; ihre Wirkung dauert länger an, falls unlbeliche Polymer-Enzym-Frodukte im Innern enthalten sind.
Insbesondere wirksame Kompositionen sind diejenigen, welche lösliche und/oder unlösliche Polytner-Enzym-Verbindungen der vorher beschriebenen Präparationen enthalten.
In der nachfolgenden Tabelle beziehen sich die Zahlen auf die
0098t8/1925 BADORiGlMAL
tv
| A. | - | 1 | 1 | .- F. | 1+13+31 | K. | 51 | P. | • 12+44 |
| B. | + 13 | G. | 32 | . L. | 55 | Q. | 18+13 | ||
| C. | 2+ | 12 | H. | 33 | M. | 48 | R. | 25 | |
| D. | 3.° | I. | 46 | N. | 3 + 44 | S. | 4+31 | ||
| E. | 24 | J. | 45 ' | O. | 3+44+13 | T. | 40 |
Diejenigen Polymer-Ensym-Produkte mit mehreren
Eneyntn, welche ein Polymer-neutrale Protease oder ein Poly- '
mer-neutrale Protease und ein Polymer-Dextranase enthalten,
erscheinen auch hier am wirksamsten zu sein, vor allem aber
ein Polymer-neutrale Protease/Dextranase-Produkt, Äuseerst
wirksam sind auch Produkte, die ein Polymer-Myxobacter AL-I
Protease enthalten.
Obgleich in den vorhergehenden Beispielen Mundhygiene-Mittel in wässriger Form gezeigt wurden, d.h. ,
dass sie eine bestimmte Menge Wasser enthalten, können derartige Kompositionen auch in wasserfreiem Zustand hergestellt .
werden, und in diesem Fall basieren sie auf dem flüssigen Bestandteil, welcher durch eine pharmazeutisch annehmbare Flüssig-/
keit dargestellt wird, wie z.B. Glycerin, Aethylenglycol oder
009848/ 1325
BAD
ίΓ
Monoäthyläther odor Ester dieser Verbindung, wie z.B. das
Acetat,'oder auch ein Carbowax (TM), wie z.B. Polyäthylenglycole
mit niedrigem Molekulargewicht oder ähnliche Materialien können auch verwendet werden. Auf jeden Fall dürfen alle angewendeten
Materialien nicht giftig sein und sie müssen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbar sein.
* Derartige Kompositionen enthalten also enzymatisch
aktive Polymer-Ensym-Produkte zusammen mit einem
Träger, welcher fest, halbfest oder ein Elastomer (natürlich oder synthetisch) sein kann, er kann aber auch durch eine
Flüssigkeit dargestellt werden. Diese Flüssigkeit kann, wie bereits erwähnt wurde, durch V/asser dargestellt werden, es
i3t aber auch möglich, nicht wässrige Flüssigkeiten anzuwenden,
Sehr oft verwendet man als Mundwasser oder Gurgelflüssigkeiten nicht wässrige Zusammensetzungen, die direkt vor Gebrauch verdünnt
werden müssen. Paher können diese Kompositionen entweder wässrig oder wasserfrei sein. Falls man einen flüssigen
Träger anwendet, eher als einen festen, halbfesten oder elastomer en Träger, können die Mundhygiene-Mittel ein antimikrobiellea
Mittel enthalten, welches entweder ein Bakterizid ist oder bakterizide Wirkung aufweist, um eine weitere b&kteriologiechi>
Deterioration der Mundhöhle nach der Behandlung mit dem
erflndungsgemässen Mittel, welches eine Polymer-Ensym-Verbin<lung
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enthält, zu vtrhindern; es kann aber auch ein Suspensionsmittel
anwesend sein, z.B. ein Emulgier- oder Dispergiermittel, insbesondere dann, wenn das verwendete Polymer-Enzym-Produkt
unlöslich ist, obgleich man gewöhnlich mit Vorteil auch ein Dispergitr- oder Emulgiermittel oder ein anderee Suspensionemi
tttl anwendet, falls der Träger eine Flüssigkeit darstellt, lind BQgßT in denjenigen Fällen, wo das Polymer-Enzym-Produkt
löfliich ist. Im allgemeinen verwendet man ale antimikrobielle
Mitfctl übliche bekannte Mittel an. Eine beträchtliche Konzentration
das Alkohols in der Zusammensetzung bedingt in der Tat eine wirksame antimikrobielle Wirkung, falls man wünscht,
die üblichen Typen antiraikrobieller Mittel aus der Komposition
zu eliminieren* Antimikrobielle Mittel sowie auch Emulgier-,
Diapergier oder andere Suspensionsmittel können selbutverständlich
in nicht flüssiger Form in dsr Komposition enthalten
sein, einschliesslich nicht flüssiger Träger, aber die Einverleibung
von Suspenaionsmitteln, z.B. Diapergier- oder Emulgiermitteln
in fester, halbfester oder elaatomerer Form in dia Komposition ist wagen Anwesenheit anderer Bestandteile
dlaoer Art in dsr Komposition aufgrund der Gegenwart anderer,
derartiger'Komponenten nioht immer wesentlich,, da sine flüssige
nawtsung vorliegt, insbesondre ein»' wäasriga Kompo- ..
- 66 - ■ -
BAD ORiGIMAL
sition, und die Anwendung flüssiger Träger ohne gleichzeitige
Anwendung eines antir.ikrobi ollen Mittels und/oder eines Suspensionsmittel,
einschliesslich Eraulgier- oder Dispergiermitteln, vom Standpunkt der Gesamtwirksamkeit der flüssigen
Komposition viel zu wünschen übrig lassen würde, ganz abgesehen von dem Aussehen der Komposition.
Die gleichen und/oder wesentlich gleiche Resultate können erzielt werden, indem man andere oder zusätzliche
Polyraer-Enzym-Produkte in das erfindungsgemäese Kundhygiene-Mittel
einverleibt. Diese Kompositionen können ausserdem in Perm von Kundwasser oder Gurgelmitteln vorliegen, vorzugsweise
konzentriert, um vor dem direkten Gebrauch beträchtlich verdünnt zu werden; sie können aber auch in Form von
Bonbons, insbesondere kaubarer. Bonbons, Pastillen, Tabletten, Zahnpulvern, Spraye aus Druckflächen oder Aerosolsprays,
Zahnzenente oder Zahnhilfsmittel, falls gewünscht zusammen mit einen Lokalanästhetikum, oder in Form andere ähnliche
Mundhygiene-Mittel vorkommen.
Die erfindun^scemässen Mundhygiene-Mittel
können z.B. ale stark imprägnierte oder überzogene Zahnflusemittel
vorliegen, in welchen die Imprägnierung oder der Uebersug
ein Folymer-Eiizym-Proiukt enthält, das entweder löslich
- 67 -
0 0 9 8 4 8/1925 bad original
oder unlöslich ist; es kann auch mit dem Polymer-Enzym-Produkt
imprägnierte oder überzogene Gaze vorkommen, ebenfalls sind
Gewebe möglich, die mit dem Polymer-Enzym-Produkt überzogen
oder imprägniert sind. Man kennt ebenfalls mit der Polymer-Enzym-Verbindung
imprägnierte oder überzogene Schwämme, ausserdem Zahnstocher oder Zahnstäbe aus Holz, Plastik oder Metall, '
die mi^ dem Polymer-Enzym-Produkt entweder alleine oder zusammen
mit einem Bindemittel überzogen oder,imprägniert sind.
Weiterhin eind Zahnbürsten bekannt, die mit dem Polymer-Enzym-Produkt
imprägnierte Borsten besitzen. Es kommen Mundbandagen vor, die eine Adhäsion an das Innere der Mundhöhle aufweisen,
pder^
z.B. Adhäsion mit dem SchleimVoem Gaumen oder den Mundv/änden oder an einen Zahn, und die dabei imprägniert oder überzogen sind oder auf andere Weise ein lösliches oder unlösliches Polymer-Enzym-Produkt enthalten. Vorrichtungen zum Herabdrücken der Zunge oder ähnliche Gegenstände,· die mit einer löslichen oder unlöslichen Form der Polymer-Enzym-Verbindung imprägniert oder überzogen sind, alleine oder in zusammengesetzter Form, sind ebenfalls bekannt. Man kennt auch mit einem Polymer-Enzym-Produkt imprägnierte oder überzogene Baumwolle, übliche Krems, Salben oder Balcame, die entweder die lösliche oder unlösliche Form einer Polymer-Enzym-Verbindung aufweisen. Andere,.
z.B. Adhäsion mit dem SchleimVoem Gaumen oder den Mundv/änden oder an einen Zahn, und die dabei imprägniert oder überzogen sind oder auf andere Weise ein lösliches oder unlösliches Polymer-Enzym-Produkt enthalten. Vorrichtungen zum Herabdrücken der Zunge oder ähnliche Gegenstände,· die mit einer löslichen oder unlöslichen Form der Polymer-Enzym-Verbindung imprägniert oder überzogen sind, alleine oder in zusammengesetzter Form, sind ebenfalls bekannt. Man kennt auch mit einem Polymer-Enzym-Produkt imprägnierte oder überzogene Baumwolle, übliche Krems, Salben oder Balcame, die entweder die lösliche oder unlösliche Form einer Polymer-Enzym-Verbindung aufweisen. Andere,.
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hier nicht erwähnte Verabreichungsformen zur Behandlung der Mundhöhle sind für den Fachmann leicht ersichtlich und werden
wegen der grossen Anzahl in der vorliegenden Beschreibung nicht
näher erwähnt. Alle diese Verabreichungsformen enthalten das Polymer-Enzym-Produkt in löslicher oder unlöslicher Form,
alleine oder aber auch zusammen mit einem Bindemittel, einem Träger oder einem ähnlichen Material oder zusammen mit einer
entsprechenden Zusammensetzung.
Falls die neue Muhdhygiene-Mittel in Form von
Kaugummi oder einer ähnlichen Verbindung vorliegen, so ist die Auswahl der wasserlöslichen oder unlöslichen Form von der
späteren Verwendung abhängig. Für eine maximale Schleiffähigkeit und einen Fülleffekt bevorzugt man unlösliche Formen,
hingegen werden für eine normale Haftwirkung des Kaugummis und für einen maximalen Kontakt des enzymatisch aktiven Bestandteils
mit dem Substrat die wasserlöslichen Formen bevorzugt. In ihrer unlöslichen Form besitzen die Polymer-Enzym-Verbindungen
sowie auch die Produkte, welche diese enthalten, eine langandauernde Wirkung für die enzymatische Aktivität,
sogar nach langer Kauzeit, höchstwahrscheinlich wegen der grösseren Affinität des unlöslichen Polymer-Enzym-Produktes
mit der Oberfläche der Zähne oder wegen der Bildung eines Ueber-,
der eich auf den Zahnoberflächen während des Kauens
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bilden kann. Das gleiche ist auch für Pastillen, Tabletten,
Drage*9, Bonbons oder ähnliche Produkte gültig, welche bevorzugte Formen des erfindungsgemässen Mundhygiene-Mittels darstellen.
Die Anwendung der enzymatisch, aktiven Bestandteile
in den erfindungsgemässen Mundhygiene-Mitteln ist nicht-auf Menschen beschränkt, da ebenfalls für Tieref insbesondere
Haushaltstiere wie Hunde und Katzen, Tiere im Zoologischen
Garten und dergleichen ähnliche Probleme der Mundhygiene bestehen. Zur Anwendung auf diesem Gebiet kosciaen die enzymatisch
aktiven "Polymer-Enzym-Produkte in der Regel zusammen mit einem geeigneten Träger vor, der vorzugsweise kaubar istj im allgemeinen
kann dieser Träger nur zur Anwendung für Menschen geeignet
sein, aber er kann auch in anderen Formen, speziell in einer Form, die sich zur Anwendung für Tiere eignet, vorliegen.
So z.B. kann man Kekse, Nahrungsmittelgemische, Mahlzeiten oder andere Nahrung&nittelformen oder Futter in verschiedenen
Ausfiihrungafonnen und Gestalten mit verschiedenen
Geechmacks8toffen verwenden, die sich, dasu eignen, die Aufmerksamkeit
und eine Attraktion des Tieres darauf zu richten. Obgleich man die Komposition im allgemeinen vorzugsweise herstellt
und/oder als trockene Zusammensetzungen verkauft,
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ff
können derartige Kompositionen auch in Form von Büchsen oder
verpackter Nahrung vorliegen, insbesondere, jedoch nicht unbedingt nötig, in kaubarer Form, zusammen mit verschiedenen Mengen
an Dampf oder Wasser. Gewöhnlich begünstigt ein langes Stehen, 2.B. bei erhöhter Temperatur, die enzymatische Aktivität
und -flerschlechtert dadurch die Stabilität, so dass eine
kalte lagerung, empfohlen werden sollte. In einer weiteren Ausführungsform
kann das erfindungsgeraässe Mittel auch in Form
von Kapseln, Pastillen, Mikrokapseln, Koazervaten mit Fettstoffen,
Kolloiden oder dergleichen vorliegen, entweder zur Verteilung in Lebensmitteln oder schon verteilt in Nahrung
verschiedenerArten. Falls die neuen Kompositionen in einer
derartigen Fora vorliegen, so können sie unabhängig von den Nahrungsmitteln verpackt werden, mit welchen man sich schliesslich
vereinigt. Die Verteilung geschieht im allgemeinen entweder getrennt oder zusammen mit der Nahrung, in welcher sie
dispergiert oder gelöst werden sollen, wobei ersichtliche Stabilitätsvorteile, wie z.B. durch das Packen, auftreten. Es
ist eelbstveretändlich, dass vom Standpunkt der menschlichen
Annehmbarkeit die gleichen Zusammensetzungen sowie auch Verabreichungsformen
sowohl für Menschen als auch für Tiere angewendet werden können.
Da die Polyner-Enzym-Produkte im allgemeinen
- 71 009148/1925
BAD ORrGiNAL
weniger als 100 ^'der Aktivität des nativen Enzyms besitzen,
ist ee häufig vorteilhaft, etwas grcssere Kengen des Polymer-Enzym-Produktes
zu verwenden, als bei Anwendung des nativen Enzyms der Pail sein würde, aber es ist ersichtlich, dac3 durch
das Fehlen einer Deterioration oder eines Abbaus während der Herstellung, der Lagerung und der Verwendung die effektiv
zugängliche enzymatische Aktivität in der Komposition während
der Verwendung wesentlich erhöht ist, falls man Polymer-Enzym-Verbindungen
anwendet, so dass es möglichiist, etwa äquivalente
Mengen ohne weiteres zu verwenden. Im allgemeinen sollte man Polymer-Enzym-Produkte in einer Menge von etwa 0,1 bis
4 Gew.Jt, gewöhnlich etwa 0,2 bis 2 Gew.^, in Zahnpflegemitteln
oder ähnlichen Produkten anwenden, insbesondere wenn das Enzym eine Protease-Aktivität von etwa 1,0 - 2,0 χ 10 μ/g oder
dergleichen besitzt (Casein-Abbau-Probe bei einem pH-Wert von
7,0). In Mundwasser und ähnlichen Nahrungsmittelzusammensetzungen sollte man in der Regel entsprechende Mengen in bezug
auf das Gewicht anwenden, um eine tägliche orale "Dosierung" von etwa 2000 bis 2Ö000 Einheiten zu ermöglichen. Andere Anwendungsgebiete
und Losierung3mengen sind für den Fachmann
leicht ersichtlich. Eei der Anwendung in flüssigen Dosierungsfonnen
oder flüssigen Zusammensetzungen ist das Polymer-Bnzym-jProdukt
insbesondere in der wasserlöslichen Form vorhanden,
- 72 - .
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um einen maximalen Kontakt mit dem Substrat zu erleichtern.
Hingegen ist bei Pasten und dergleichen die Bestimmung, ob dae Polymer-Enzym-Produkt in wasserlöslicher oder unlöslicher
Form vorliegen soll, von der Auswahl der Anwendung abhängig,
ob z.B. die maximale Schleifwirkung oder Füllwirkung grosser
sein soll, als der maximale Kontakt des enzymatisch aktiven Bestandteils mit dem Substrat, und es muss darauf Rücksicht
genommen werden, dass die unlösliche Form der Polymer-Enzym-Verbindung eine etwa längere enzymatische Wirkung aueübt.
Die neuen Aspekte des erfindungegemäseen Kund- .
hygitne-Mittels beruhen darauf, dass man das neue Produkt, :
welcheβ eine wirksame Menge einer Polymer-Enzym-Verbindung ent-
* hält, auf Übliche Wtiee mit der Mundhöhle oder dem Teil der
su behandelnden Kundhöhle in Berührung bringt, wobei das enzy- ,
' matiech aktive Polymer-Enzym-Produkt bei dem pH-Wert der Kund·,,
höhle, in welchem es angewendet wird, aktiv ist, unabhängig davon, ob die Anwendung durch Putzen der Zähne,Gurgeln,Spülung des Kundes oder dergleichen stattfindet. Die neuen Kundhygiene-Kittel, unabhängig von der beabsichtigten oralen Ver- <
wendung, enthalten im allgemeinen die enzymatisch aktiven
Polymer-Eneym-Produkte in wasserlöslicher oder waeeerunlös- .
lioher Form, entweder als einzigen aktiven Bestandteil, allein·^!
oder susammen mit einem Bindemittel oder mit einem geeigneten y
009848/1925 bad original
4(3,
oral physiologisch annehmbaren Träger, oder ale einen Bestandteil der Zusammensetzung, die andere chemisch oder physikalisch
aktive oder inaktive Bestandteile aufweist, welche man für Mundhygienezwecke anwenden kann; solche Bestandteile sind z.B.
die bereits erwähnten oberflächenaktiven Mittel, Germicice,
Schleifmittel und dergleichen.
Überraschenderweise festgestellt werden, dass die Polymer-Enzym-Produkte» welche die enzymatisch aktiven Bestandteile
des trfindungegemäßsen Mittels darstellen, eine relativ starke
Attraktion oder Affinität zur Oberfläche dtr Zähne besitzen,
insbesondere, wenn eine neutrale Protease in dem Polymer-Ensym-Produkt kovalent gebunden ist. Ohne dass die Zusammeneetsung, die Form odtr auch die Vermbreichungsart einen Einfluss ausüben, setzt sich ein wesentlicher Teil des enzymatisch
aktiven Polymer-Enzym-Produktes auf der Oberfläche der Zähne
fest, von wo es eine äusserst erwünschte enzyraatische Wirkung
während einer längeren Zeitperiode ausüben kann. Diese Wirkung trifft insbesondere dann ein, wenn Ban die unlösliche ^
Form der Polymer-Enzym-Verbindung verwendet. Für jede Form, gleichgültig, ob wasserlöslich oder wasserunlöslich, hält die ;..-.
enzymatische Wirkung der erfindungsgemäesen Zusammensetzung
sogar nach dem Aufhören der verschiedenen Anwendungearten an. ^h
- 74 -
0098*8/1926 bad or,q,nal'
Dieee Tateache ist äusserst wichtig, da es nicht möglich ist,
nach jeder Mahlzeit der. Kund zu npülen, die Zähne zu bürsten
oder zu gurgeln. Sogar nach Beendigung der Behandlung wird
z.B. der Abbau von Zahnstein, die Entfernung von Flecken uew. ,
durch die enzymatische Aktivität noch eine gewisse Zeitlang
fortgesetzt.
- 75 -
S\D ORIGINAL
009848/1925
Claims (1)
- Patentansprüche1. Stabiles, Polymer-Enzym-Verbindungen enthaltendes Mundhygiene-Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine enzymatisch wirksame Menge einer enzymatisch aktiven Polymer-Enzym-Verbindung, in welcher das Enzym kovalent gebunden ist und die in dem praktisch neutralen pH-Bereich der Mundhöhle aktiv ist, sowie einen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbaren Träger enthält, wobei der Träger in fester, halbfester, elastoinerer Form oder flüssiger Form vorliegt und der letztere ein Suspensionsmittel und/oder ein antimikrobielles Mittel aufweist.2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Forir: eines Zahnpflegemittels, als Kaugummi, als Mundwasser oder Gurgelmittels vorliegt.3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer-Enzym-Produkt in wasserlöslicher oder wasser-' unlöslicher Form vorliegt,4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, da3 der Enzymanteil der Polymer-Enzym-Verbindung neutrale Protease, alkalische Protease, saure Protease, Amylase, Lipase, Dextranase oder ein lytisches Enzym ist.- 76 - BAD ORIGINAL009848/19255. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polymer-Dextranase-Produkt, ein Polymer-Amylase-Produkt oder ein Polymer-Lipase-Produkt enthält.6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere enzymatisch aktive Polymer-Enzym-Verbindungen enthält, vorzugsweise mindestens ein polymerneutrales Protease-Produkt, ein polymer-alkalisches Protease-Produkt, ein polymer-saures Protease-Produkt, ein Polymer-Amylase-Produkt, ein Polymer-Lipase-Produkt, ein Polymer-Dextranase-Produkt oder ein polymer-lytisches Enzym-Produkt.7. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein enzymatisch aktives Polymer-Enzym-Produkt mit mehreren Enzymen enthält, vorzugsweise mindestens ein Enzym der Gruppe neutrale Protease, alkalische Protease, saure Protease, Amylase, Lipase, Dextranase und ein lytisches Enzym.8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Polymer-Enzym-Produkt mit mehreren Enzymen die Enzyme neutrale Protease oder neutrale Protease und Amylase oder neutrale Protease und Dextranase oder neutrale Protease- 77 -009848/1925und Lipase oder neutrale Protease und alkalische Protease oder neutrale Protease, Amylase und alkalische Protease bedeuten.9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es alkalische und neutrale Protease enthält und daß das Verhältnis der Aktivität der alkalischen Protease zur Aktivität der neutralen Protease in der Polymer-iOnzym-Verbindung mit mehreren Enzymen nicht größer als etwa 0,25 zu 1,2 zu 1 ist.10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ein Polymer-Enzym-Produkt sowie ein Polymer-Enzym-Prqdukt mit mehreren Enzymen enthält, in welchen vorzugsv/eise der Enzymanteil eines jeden der beiden Polymer-Enzym-Produkte mindestens ein Enzym der Gruppe neutrale Protease, alkalische Protease, saure Protease, Amylase, Lipase, Dextranase und lytisches Enzym enthält.11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymanteil der Polymer-Enzym-Verbindung mit mehreren Enzymen neutrale Protease, alkalische Protease und Amylase78 * " BAD ORIGINAL9848/1925enthält, und daß der Enzymanteil der Polymer-Enzym-Verbindung vorzugsweise Lipase, Dextranase, ein lytisches Enzym oder saure Protease ist.12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer (a) Ketten aus Carbonsäuren ier Carbonsäureanhydrideinheiten enthält, oder (b) Einheiten V'-m Carbonsäuren- oder Carbonsäureanhydridgruppen :rifwei::t, die durch Kohlenstoff ketten von mindestens 1 Mi- r:irht mehr als 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind, wobei diese Letten Teile einer Einheit bilden, welche bis zu 1H ?:·}.] ennt off atome enthält und worin das Polymer der verwer. \e4 er: I ^lynier-Ensym-Verhindung vorsugsweipe ein Äthylen-Mal ein!';iureanhyirid-Coj :Iymer-Tyr ist.1 *. Vei*fahren na^h einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurchpe-cer.r.reirhnet, daß das 1 olymer ein Äthylen-Haleinsäurear.hy irid-Copolyner, ein Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolyr.er, ein Vinylmetiij-läther-Kaleinsäureanhydrid-Copolymer, ein Vinylacetat-Maleinsäureanhydrid-Copolyner, ein Pivinyläther-Maleinsäureanhydrid-Cyclocopolyner, ein Polymaleinsäureanhydrid, ein Polyacrylsäureanhydrid oder ein katicnisches Derivat dieser Verbindungen ist und daß009848/1925 bad originalder Enzymanteil vorzugsweise mindestens 1 Enzym der Gruppe neutrale Protease, alkalische Protease, saure Protease, Amylase, Lipase, Dextranase und ein lytisches Enzym enthält14. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer der verwendeten Polymer-Enzym-Verbindung ein Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymer ist.15. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß alle verwendeten Polymer-Enzym-Verbindungen als Enzymanteil oder Enzymanteile ausschließlich Enzyme mikrobiologischen Ursprungs enthalten.16. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Verabreichung an Tiere verpackt ist, daß der verwendete Träger für Tiere oral annehmbar ist und daß es sich zur Verabreichung an Tiere eignet.17. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine . enzymatisch wirksame Menge einer Polymer-Enzym-Verbindung, in welcher das Enzym kovalent gebunden ist und die inner-- 80 009848/1925halb des verhältnismäßig neutralen pH-Wertes der Mundhöhle enzymatisch aktiv wirkt, mit einem Träger vereinigt, wobei dieser Träger zur Anwendung innerhalb der Mundhöhle physiologisch annehmbar ist und in fester, halbfester, elastomerer Form oder flüssiger Form vorliegt und wobei ein flüssiger Träger zusätzlich ein Suspensionsmittel und/oder ein antimikrobielles Mittel enthält.-- B1 -009848/ 1925
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- 1969-09-26 FR FR6933028A patent/FR2070058A1/fr not_active Withdrawn
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