DE2143945C3

DE2143945C3 -

Info

Publication number: DE2143945C3
Application number: DE19712143945
Authority: DE
Inventors: H-U Geyer; G Hartmann
Original assignee: Kali Chemie AG
Current assignee: Kali Chemie AG
Priority date: 1971-09-02
Filing date: 1971-09-02
Publication date: 1980-07-24
Also published as: HU165816B; NL7211170A; IT1048936B; DK139819C; CH575962A5; NL173065B; JPS5539318B2; NL173065C; CS166816B2; DE2143945B2; DE2143945A1; FR2154447A1; YU219572A; FR2154447B1; DK139819B; GB1403257A; YU37187B; JPS4833087A; LU65913A1; SE375322B

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellcn proteasehaltigcn Enzymen und Polyphenolen pflanzll· '.ler Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln, die auch Perverbindungen enthalten können.

Enzyme werden in vielen Bereichen des täglichen Lebens benutzt, wie z. B. bei der Herstellung von Käse. Bier, Wein und anderem. Seit einigen Jahren werden auch speziell ausgewählte Enzyme in Waschmittel eingesetzt, um Eiweiß- und Stärkeverschmutzungen zu entfernen. Unter den vielen bekannten Proteasen haben sich insbesondere die durch Fermentation bestimmter Stämme der Bacillus subtilis und Bacillus lichcnifoiuiis Gruppe erzeugten durchgesetzt. Diese haben ein pH-Aktivitätsoptimum bei pH 9,5 und ein Temperaturoptimum von 60 bis 70⁰C.

Ähnlich werden auch oi-Amylasen in Waschmitteln eingesetzt, wenn auch das pH-Optimum nicht im stark alkalischen Gebiet, sondern zwischen pH 5,5 und 7,0 liegt, während die Temperatur les Optimums bei 75^r'C gefunden wurde. Im allgemeinen enthalten auch die Λ-Amylaseprodukie aus Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis begleitende proteolytische Aktivität. Zwar steht der Nutzen der Enzyme in Waschmitteln außer Frage; doch besitzen die Waschmittelcnzyme gewisse Nachteile, wie z. B. die Reizung der Haut und der Schleimhäute, was eintritt, wenn Enzymstaub auf die Haut, besonders wenn sie feucht ist, gelangt. Personen, die mit Enzymstaub in Berührung kamen, klagen über Feuchtwerden und Rötung der Haut und Auftreten von Blutungen. Dadurch können unter Umständen Störun= gen bei der Verarbeitung von Enzymen auftreten.

Durch Verfahrensumstellungen ist bereits erreicht worden, daß die heute benutzten Enzymprodukte in granulierter Form praktisch staubfrei geworden sind. Dadurch werden zwar Irritationen und Erytheme beim Endverbraucher vermieden, dennoch bestehen vor dem Erhalt der granulierten Form und beim Verwender der pulverigen Produkte nach wie vor starke Probleme in der Vermeidung von Kontakt zwischen Mensch und Enzym.

Es wurde nun gefunden, daß diese Störungen nicht

auftreten, wenn die Enzyme in eine unlösliche Form gebracht werden. Sie können dann ihre hydrolytische

Wirkung auf die Haut wegen mangelnder Beweglichkeit

der Moleküle nicht ausüben.

Da aber andererseits die Enzyme ihre e/wünschte

ίο schmutzlösende Wirkung nur entfalten können, wenn diese Beweglichkeit vorliegt, galt es Bedingungen zu finden, unter welchen das Enzym auf der Haut unlöslich und in der Waschflotte löslich, d. h. enzymatisch aktiv ist.

Die Lösung des Problems gelingt erfindungsgemäß

rs durch Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellen proteasehaltigen Enzymen und Polyphenolen pflanzlicher Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln, die auch Perverbindungen enthalten können.

2(i Zur Gewirnung der erfindungsgemäß zu verwendenden proteasehaltigen unlöslichen Enzym-Addukte werden einer Enzymlösung, vorzugsweise der filtrierten Fermenterbrühe, Polyphenole pflanzlicher Herkunft zugesetzt. Dabei fällt ein gut filtrierbarer Niederschlag

2"> aus, der von der Lösung abgetrennt wird.

Die so erhaltenen Addukte sind auf der Haut unlöslich, so daß keine nachteiligen Wirkungen beim Kontakt mit der Haut auftreten, während in der Waschflotte die Enzyme ihre erwünschten lytischen

s<> Wirkungen voll entfalten. Eine zusätzliche Granulierung, wie sie bisher zur Vermeidung nachteiliger Effekte beim Endverbraucher vorgenommen wurde ohne dadurch die Nachteile für die in der Herstellung der Waschmittelen/.ymc und deren Granulierung tätigen

r. Personen zu vermeiden, ist nicht erforderlich.

Besonders geeignete Füllmittel sind Tannin und löslich gemachtes Lignin, wie z. B. Ligninsulfonat. Unier Tannin werden dabei die Naturstoffe verstanden, wie sie im Ullmann, Enzyklopädie der technischen Chemie,

in 3. Auflage, Band 11, Seilen 59i bis 594 bzw. im Kirk-Othmcr, Encyclopedia of Chemical Technology, 2. Auflage Vol. 12 (1967), Seilen 319 bis 325, definiert sind.

Ebenso wie die Tanninc sind die verschiedenen

r. Lignine und ligninderivate, die durch chemische Behandlung in eine wasserlösliche Form überführt worden sind, wie beispielsweise Ligninsulfonat, geeignet. Zur Feststellung der optimalen Fällungsbedingungen

vi wurde Fermenterbrühe mit bekanntem Gehalt an Protease mit wechselnden Mengen an Tannin bei verschiedenen pH-Werten umgesetzt. Die Ergebnisse sind in A b b. I dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, daß im pH-Bereich von 5,5 bis 6,3 durch 5 bis 7 g Tannin pro

">■> Liter dieser F'ermenterbrühc eine praktisch quantitative Fällung des Enzyms erfolgt. In Abb. 2 ist dargestellt, wie bei einem konstanten pH-Wert von 5,5 die Menge an ausgefälltem Enzym von der Menge an zugesetztem Tannin abhängt. Natürlich hängt die zur quantitativen

mi Enzymfällung erforderliche Tanninmenge von dem Gesamtproteingchalt der Fcrmcnterbrühc ab, da das

Tannin auch mit den anderen vorliegenden Proteinen

reagiert, die nicht aus dem Enzym stammen.

Analog wurde durch Zusatz von 8 g pro Liter eines

h^r, technischen Ligninsulfonats zum Erslfiltrat des Kulturmediums bei verschiedenen pH-Werten ermittelt, daß das Optimum der Fällung bei etwa pH 3,5 liegt (s. A b b. 3).

Bei Verwendung von Tannin sollte daher die Protease-Fällung bei einem pH-Wert zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 5 und 6,5, erfolgen, bei Lignin im pH-Bereich zwischen 3 und 5, vorzugsweise zwischen 33 und 3,8.

Zur Ermittlung des günstigsten pH-Wertes für die Fällung von «-Amylase wurden 1 Liter Fermentbrühe mit einer Ausgangsakiivität von 5950 DUN/ml bei verschiedenen pH-Werten jeweils mit 8 g Tannin versetzt. In Abb.4 ist die Aktivität im Oberstand in iü Abhängigkeit vom Fäll-pH dargestellt Daraus ergibt sieb, daß bei Verwendung von Tannin zur «-Amylase-Fällung der pH-Wert zwischen 3 und 8, vorzugsweise zwischen 5,5 und 7, liegen sollte. Die üblicherweise zur Fällung von «-Amylase ausreichende Menge an Tannin liegt zwischen 3,0 und 0,3 g pro Liter Fermentbrühe je nach Aktivität und Anwesenheit von anderen Proteinen.

Die Fälltemperatur spielt in beiden Fällen keine Rolle, d. h. die filtrierten Fennenterbrühen können bei der Temperatur, bei der sie anfallen, die je nach Jahreszeit _>< > sehr unterschiedlich sein kann, verwendet werden, eine Kühlung oder Erwärmung ist nicht erforder'ich.

Das Fällmittel wird zweckmäßigerweise in einer solchen Menge zugesetzt, daß in dem zurückbleibenden Klarfiltrat praktisch keine oder zumindest nur eine sehr 2 > geringe enzymatische Aktivität gemessen werden kann.

Diese Fällung hat gegenüber den üblichen Fällmethoden durch Aussalzen oder Zusatz organischer Lösungsmittel den Vorteil, daß die Abwasserbehandlung beträchtlich erleichtert und ein damit wesentlicher «ι Beitrag zur Verhinderung der Umweltverschmutzung geleistet wird.

Die Behandlung von Enzymen bzw. enzymhaitigen Lösungen mit Tannin ist an sich seit langem bekannt. Schon in der deutschen Patentschrift 1 28 419 wird r> empfohlen, durch Behandlung von Pankreatin mil Gerbsäure ein unlösliches Pankreaspräparat herzustellen, das im sauren Magensaft unlöslich ist, aber im Darm seine verdauenden Eigenschaften entfalten kann. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß dabei eine j» erhebliche Schädigung der Enzymwirkung eintritt, wie aus der deutschen Palcntschrift 1 83 713 zu entnehmen ist.

Später sind noch weitere Vorschläge zur Fällung von Enzymen mit Tannin gemacht worden. Diese halten r, jedoch entweder den Zweck, ein möglichst reines Enzympräparat zu erhalten, indem entweder durch den Tanninzusatz die die Enzyme begleitenden Verunreinigungen ausgefällt werden sollten, oder aus dem Enzym-Tannin-Nicdcrschlag wurde das Enzym in reiner -,n Form mit organischen Lösungsmitteln herausgelöst. Die Enzym-Tannin-Nicdersrhldgc wurden jedoch niemals als solche isoliert, getrocknet und verwendet.

Zum Beispiel wird in der britischen Patentschrift 11 56 900 eine Fällung der Enzyme mit Tannin v> vorgeschlagen, um die Fällung wirtschaftlicher zu gestalten. In dieser britischen Patentschrift wird jedoch festgestellt, daß häufig mit Tannin keine Fällung zu erzielen ist. Deshalb wird der gleichzeitige Zusatz von Protein vorgeschrieben. Aus dem gefällten Produkt mi wird das Enzym wieder mit Aceton herausgelöst, um eine reine pharmazeutische Enzympräparation zu erhalten.

Ein ähnliches Reinigungsverfahren wird in der DE-OS 16 42 619 beschrieben, bei dem als Fällmittel h-> synthetische Gerbstoffe eingesetzt werden. Aus dein Niederschlag werden die anorganischen Salze und die Gerbstoffe durch Waschen mit Wasser bzw. mit Gemischen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln entfernt, um so ein reines Enzym zu erhalten. Die Verwendung synthetischer Gerbstoffe hat jedoch den Nachteil, daß das Ausfallen des Enzym-Gerbstoff-Adduktes, besonders bei gealterten Gerbstoffen, verzögert wird oder gänzlich unterbleibt, wie aus der nachfolgenden Zusatzanmeldung DE-OS 19 14 309 ersichtlich. Daher wird in der DE-OS 19 14 309 vorgeschlagen, zusätzlich zu den synthetischen Gerbstoffen Salze organischer oder anorganischer Säuren einzusetzen. Die dabei anfallenden salzhaltigen Abwasser stellen ein ernstes Problem dar.

Schließlich ist aus der DE-OS 19 48177 bekannt, Addukte aus Enzymen und Polymeren in Waschmitteln einzusetzen. Als Polymere werden vorzugsweise Äthylenmaleinsäureanhydrid-Copolymere verwandt. Bei dieser Fällung tritt jedoch eine teilweise Inaktivierung des Enzyms ein, deshalb wird empfohlen, ein Lösi ngsmittelgemisch anzuwenden, das eine organische Komponente enthält, in der das Enzym wenigstens teilweise löslich ist, wie z. B. Dimethylsulfoxid. Die Verwendung eines organischen Lösungsmittels belastet den Prozeß natürlich wirtschaftlich und wirft ebenfalls erhebliche Abwasserprobleme auf.

In keiner dieser Veröffentlichungen ist jedoch die Isolierung und Trocknung eines Enzym-Tannin-Adduktes beschrieben, und es ist auch niemals in Waschmitteln eingesetzt worden, da befürchtet werden mußte, daß die Waschwirkung durch die Unlöslichmachung des Enzyms beeinträchtigt werden würde und daß bei eisenhaltigem Wasser eine Verfärbung der Waschflotte auftreten würde.

Überraschenderweise treten bei Einsatz des erfindungsgemäßen Produktes in Waschmitteln diese Störungen nicht auf. Wie Waschversuche gezeigt haben, ist die Reinigungswirkung eines Waschmittels, dem das erfindungsgemäße Enzym-Tannin-Addukt zugesetzt wurde, gleich der eines Waschmittels, das das herkömmliche freie Enzym enthält. Wider Erwarten wurde bei Versuchen mit einer Waschflotte, die 1 g FeCIj · 6 H2O pro Liter enthielt, das ist ein Vielfaches ües höchsten überhaupt vorkommenden Eisengehaltes von Trinkwasser, keine Verfärbung der Waschflotte festgestellt. Auch bei starker Überdcsierung des Enzym-Tannin-Adduktes im Waschmittel trat keine Tintenfärbung auf.

Ein wesentlicher bisher nicht beobachteter Vorteil der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzym-Adduktc ist ihre ausgezeichnete Hautverträglichkeit. Die unlöslich gemachten Enzyme können ihre hydrolytische Wirkung auf die I laut wegen mangelnder Beweglichkeit der Moleküle nicht ausüben. Die sonst im Umfang mit staubförmigen Enzymkonzentraten eingangs beschriebt leii Reizungen der Haut und Schleimhäute treten daher nicht auf. Da bereits bei der Herstellung ein nicht haulrei/cndes Lnzym-Polyphenol-Adduki anfällt, ist somit die Gefahr einer Haulaffektion ausgeschaltet.

Die Hautverträglichkeit der erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzym-Addukte wurde wie folgt getestet:

50 mg des nach Beispiel I erhaltenen Enzym-Tannin= Adduktes mit einer enzymatischen Aktivität von 150 000 DU wurden als Pulver auf 23x2,5 cm große Zellstoffstreifen aufgebracht bzw. Zellstoffstreifen gleicher Größe wurden mit 0,5 ml einer Suspension des Enzym-Tannin-Adduktes getränkt, deren Aktivität 450 000 DU betrug. Diese Zellstoffpflaster wurden mit Klebestreifen auf der rasierten Haut von männlichen

Kaninchen (weiße Neuseelander, Durchschnittsgewicht: 2500 g) befestigt. Parallel wurden an dem gleichen Tier Pflaster befestigt, die analog mit löslicher Protease beaufschlagt waren.

Nach 24 Stunden wurden die Pflaster entfernt und die behandelte Stelle nach folgender Skala bewertet:

Keine Rötung Geringe Rötung

0 Kein ödem

1 Geringes ödem

Gut begrenzte Rötung 2 Gut begrenztes ödem

Mittel-bis hochgrad. Erythem 3 Mittelgrad.ödem Schweres Erythem mit Schorf 4 Schweres Ödem

Nach jeweils 24 Stunden wurden die behandelter Stellen wieder beobachtet und neu bewertet.

Die Lage der Plaster war den Beurteilern nich bekannt. Insgesamt wurden 6 Versuchstiere getestet Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Tabelle I

Hautreizung von löslicher und unlöslicher Protease

Applikation

Stunden n;ich Beginn der Applikation Lösliches Kn/.yrn
Addition der
Punkte von
6 Kaninchen

Unlösliches Kn-/ym-Tannin-Addukt
Addition der
Punkte von
ft Kaninchen

Pulver
Pflaster mit 150 000 DU

Suspension
Pflaster mit 450 000 DU

24 h 48 h 72 h 96 h 120 h

13
5
6

10
6
8
4

Die Werte zeigen deutlich, daß das erfindungsgemäße unlösliche Enzym-Addukt kaum die Haut angreift, während durch lösliche Protease deutliche Hautreizungen hervorgerufen werden, die erst nach längerer Zeit abklingen.

Andererseits wurue überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Produkte in der Waschflotte ihre volle Aktivität entfalten. Unter den in der Waschflotte vorliegenden Bedingungen wird die dem pH-Wert entsprechende Aktivität des Ausgangsenzyms freigesetzt.

Zur Prüfung der Abhängigkeit der Aktivität des erfindungsgemäßen Produktes vom pH-Wert wurde ein Enzym-Tannin-Addukt in bidestilliertes Wasser eingebracht und nach 15 Minuten die Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle 2 zu ersehen.

Tabelle 2

Abhängigkeit der Aktivität des unlöslichen Enzym-Adduktes vom pH-Wert

pH Gefundene Aktivität

im Überstand

PUN/ml

In Lösung gegangene Aktivität

% der Ursprungsaktivität

60 000

75 000

263 000

6 8

27

pll

i.

Gefundene Aktivität
im Überstand

PUN/ml

In Lösung gegangene Aktivität

% der Ursprungsaklivität

9.5 622 000
768 000
975 000

64

79

100

Beispiel 1

100 Liter einer filtrierten Fermenterbriihe von einer Temperatur von 25°C, die alkalische Protease au; Bacillus subtilis in einer Konzentration von 36 800 DU/ml enthielt, wurden mit 600 g Tannin bei pH 5,5 versetzt. Die Filtration erfolgte nach 30 Minuten in einer Filterpresse. Das Enzym-Tannin-Addukt wurde mit Wasser gewaschen, mit Aceton vom anhaftenden Wasser befreit und abschließend im Vakuum bei 45° C getrocknet.

Ausbeute: 750 g eines beige-farbenen unlöslichen Pro tease-Enzym-Adduktes mit 3 340 000 DU/f = 68% der Ausgangsaktivität.

Gegenüber der üblichen Fällung mit Natriumsulfat bei der die Ausbeute 60% beträgt wurde also eine erhebliche Ausbeuteverbesserung erzielt.

Beispiel 2

1 Liier einer filtrierten Lösung, die eine proteasehaltige vAmylase aus Bacillus subtilis mit einer Aktivität von 5000 DlJN/ml enthielt, wurde mit einer wäßrigen Lösung von 10 g Tannin bei pH 6 versetzt. Es entstand sofort ein flockiger, gut filtrierbarer Niederschlag, der mit Wass,.- gewaschen, anschließend mit Aceton und zum Schluß im Vakuum bei 45" C getrocknet wurde.

Ausbeute: 7.2 g mit 436 000 DUN/g = 63% des

^Λ usga'igsw crtes.

B ι- ι s ρ ι e I !

! Liter eine filtrierten klaren Losung, enthaltend bakterielle Protease und vAnnlase nut 42 000[X¹Zm! und 400 I)I !N'inl wurde mit 8 g I.innin in

Dcstandtcile	Vorwasch	Vollwasch
	mittel	mittel
Waschaktive Substanz	17%	11%
Silikat	6 %	4 %
l'erborat		35 %
Sulfat	6%	12%
Natriumtripoly-	51 %	32 %
phosphat
Rest Optische Au(Ti	eil er. Carhowmelhvlcellulos
Seile und Wasser

U/..ii»r K... .,Il ς·". ,.,.«,.tii lii.r K..II..

ri

H)OmI

i-w.L·

In da¹- Waschmittel wurden unlösliche b/w. lösliche En/\me in einer solchen Menge eingemischt, dal! 3000 DU'g Waschmittel \orlagen. l-'ür Versuch 1 wurde das mich Beispiel I hergestellte Protease-Tannin-Addukt verwendet, für Versuch 2 wurde lösliche Protease ,!,.,■ ,,Ι.,Ι,.Ι,οη IJ.irlio ....,-.. ,,„i, /ι,.,, W.-.tI.m,-Ii ti.iir/l»!!

Niederschlag wurde abfiltnert und mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung im Vakuum wurde ein helles gerucharmes Pulver erhalten.

Ausbeute: 1 '>,$ g unlösliches Protcasc-Amylase-Tanin-Addukt
Protease = 5 4JOOOOnUZg

= 88% vom Ausgangswert
Amylase = 18 000 DUN/g

= 69% vom Ausgangswert.

Beispiel 4

10 Liter einer Lösung, enthaltend Baktericn-Protease (Aktivität 30 800 DU/ml) wurden mit 80 g Ligninsulfonat versetzt. Der pH-Wert wurde mit Säure auf 3.5 eingestcll¹. Das ausgefällte unlösliche Enzym wurde abfiltriert und getracknet. Es wurden 48 g eines Protease-Lignin-Adduktcs mit 4 500 000 DU/g erhalten. Die Ausbeute betragt also 70% der Ausgangsaktivität.

Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen Enzymen, wie z. B. Glucoamvlasc aus Aspergillus niger. Cellulase aus Aspergillus niger. Glucoscoxydasc aus Aspergilius niger und Glucoseisomerase. erhalten.

Waschversuche

Das erfindungsgemäße Enzym-Adciukt wurde auf seine Waschwirkung im Vergleich mit einem löslichen auf dem Markt befindlichen Enzymprodukt sowohl im Vorwaschmittel ohne Perborat wie auch im Vollwaschmittel mit Perborat getestet.

Die Waschmittel hatten etwa folgende Zusammensetzung:

auch Versuche mit den Waschmitteln ohne Enzvmzusat/. durchgeführt.

Die W'aschmitteldosierung betrug 4 g pro Liter, d. h. 12 DU/ml Waschflotte, die einen pH· Wert von 9.5 hatte.

Für die Versuche wurde das l.initestgerät und das Testgewebc EMPA 112 (Kakaoverschmutzung) verwandt.

Wasch programm

Zunächst wurde 30 Minuten auf 60 C aufgeheizt und dann 30 Minuten bei dieser Temperatur gewaschen. Anschließend wurde in etwa 15 Minuten auf 90C aufgeheizt und weitere 15 Minuten bei dieser Temperatur gewaschen.

Die Ergebnisse wurden mit dem lichtelektrischen Remissionsphotometer gegen MgO= 100% gemessen. Es wurden folgende Werte erhalten:

WeiUgradc MgI) - KK)'

ohne
Knzvm

mit löslichem
En/vm

mit unlöslichem En/ym-Tannin-Addukt

Vorwaschmittel
EMPA 112*)

Vollwaschmittel
EMPA 112*)

32,4

38.0

41,6

44,0

40.6

43.6

*) Standardiliniertes verschmutztes Testgewebe.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Waschwirkung der Enzyme durch die Unlöslichmachung in keiner Weise beeinträchtigt wird.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1, Verwendung eines wasserunlöslichen, hautverträglichen, getrockneten Enzym-Addukts aus mikrobiellen proteasehaltigen Enzymen und Polyphenolen pflanzlicher Herkunft in Wasch- und Reinigungsmitteln.

Z Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine alkalische Protease isL

3. Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-A my läse enthält

4. Verwendung eines Enzym-Addukts nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyphenol Tannin ist.

5. Verwendung eines Enzym-Addukts nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyphenol ein wasserlöslich gemachtes Lignin ist.

6. Verwendung eines Enzym-Addukts nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlöslich gemachte Lignin Ligninsulfonat ist.