DE2715893A1 - Verfahren zur selektiven inaktivierung von amylase - Google Patents
Verfahren zur selektiven inaktivierung von amylaseInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf proteolytische Enzympräparate,
die von Amy laseakt i v/itä t praktisch frei sind, auf
ein Verfahren zu ihrer Herstellung und insbesondere auf proteolytische
Enzympräparate, die nach einem einmaligen Verfahren zur .differentiellen oder selektiven Aktivierung der Amy läse in
Mischungen aus Protease und Amylase hergestellt werden.
Proteolytische Enzympräparate werden nach bekannten Verfahren aus
Bakterien- und Pilzkulturen sowie Tierorganen, wie Pankreas, hergeleitet. Besonders bekannt ist die Herstellung von proteasehaltigen
Enzymmischungen aus bakteriellen Quellen. Gewöhnlich werden mährend des Wachstum des Mikroorganismus gleichzeitig
Amylaseenzyme mitgebildet. Für bestimmte Zwecke ist es wünschenswert, ein proteasehaltiges, von jeglichem Amylaseenzym praktisch
freies Präparat zu schaffen. So würde man für Zwecke, diß oine
EnzymoinuJirkunr) diif riio P rootrinphnse einer Substanz ohne Benin-
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trächtiqung ihrna Anylacegehaltes fordern, zweckmäßig ein von
amylolyt:scher Aktivität freies Protcaseenzympräparat verwenden.
So ist es bei der Behandlung von Sojamehl mit Protease Tür
bestimmte Zwecke wünschenswert, ein amylasefreies Enzympräparat
zu verwenden.
Die verschiedenen bekannten Verfahren zur Reinigung und Isolierung
von Enzymen umfassen die fraktionierte Ausfällung mit anorganischen
Salzen, wie Natrium- und Ammoniumsulfate oder polymere Ausfällungsmittel;
organischen Lösungsmittel, uiie Alkohole und Ketone;
die Ionenaustausch-chromatographie: die selektive Absorotion
und Eluierung mit Calciumphosphatgelen; die Trennung auf
Kolonnen aus CMC oder DEAE Cellulose; die Sephadex-Gelfiltr?tion;
die Differentialuärmeiriaktivierung bei unterschiedlichen pH-Werten;
die isoe]uktrische Ausfällung, Ultrafiltration und Ultrazentifugierung.
Die weitere Beschreibung üblicher Verfahren zur Enzymreinigung und -isolierung findet sich in "Process Biochemistry"
Aug. 1973, Seite 9 ff. und in den dort angeführten Literaturstellen .
Ein besonders wirksamen Verfahren zur Entfernung einer unerwünschten
Enzymaktivität aus rohen Präparaten besteht in der Behandlung desselben zwecks Inaktivierung des verunreinigenden Enzyms,
während die gewünschte Aktivität praktisch intakt gelassen wird. Trotz der Anwesenheit der inaktiven Verunreinigung im Präparat
ist diese ebenso wirksam neutralisiert, als ob sie physikalisch entfernt worden wäre. "Inaktivierung" in diesem Zusammenhang
bedeutet eine irreversible Inaktivierung und nicht eine bloße Inhibiurung. Daher gibt es nach Entfornung oder Verdünnung des
Inaktivierungcmittels kein erneutes Auftreten der inaktivierten
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Enzymaktivitöt.. Dia Kneten dieser Inaktiv ierungr,vorFahrun sind
wesentlich geringer als Reinigungsverfahran, din kostspielige
Reagenzien und mehrfache Behänd lungs- und Abtrennungsstufen erfordern. In solches Inaktivierungsverfharen ist in der US PS
2 683 682 beschrieben, wobei der pH-Wert eines Proteinase-OUAmylsepräparates zur differentiellen Inaktivierung entweder der
Proteinase oder c^-Amylase eingestellt uiird.
Aufgrund dieses Standes der Technik ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, protaolytische Enzympräparate zu schaffen, die
von Amylaseaktivität praktisch befreit wurden, ohne daO langwierige Abtrennungsstufen oder die Verwendung teurer Reagenzien
notwendig sind.
Ein weiteres Ziel ist die Schaffung eines Verfahrens zur Behandlung von Mischungen aus proteolytischen und amylolytischen Enzymen, insbesondere solchen, die aus bakteriellen und tierischen
Quellen hergeleitet sind, zur Bildung protealytischer, von Amylaseaktivität praktisch freier Enzympräparate. Weiterhin schafft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von
aller anwesenden Mikroorganismen. Die erfindungsgemäOen proteolytischen Enzympräparate sind von Amylaseaktivität praktisch
frei und außerdem lagerungsbeständig.
Es ujurde nun gefunden, daß man ein gemischtes Protease-Amylase-Enzympräparat von seiner Amylseaktivität befreien kann, indem ma
man es mit einem Oxidierungsmittel aus der Gruppe von Chlorit-
und Hypochloritionen behandelt.
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Die Ionen u/erden der Enzymmischung in ausreichender Menge zur Inaktivierung
der Atnylaso in stärkerem Maß als der Protease zugefügt.
Dies bewirkt gewöhnlich eino wesentliche Inaktivierung der
Amylase, während die Protease praktisch auf ihrer ursprünglichen Aktivität im unbchandelten Präparat belassen wird. Da die Ionen
uiährend der Amylase— aktivierung weitgehend durch das Präparat
verbraucht werden und da die inaktivierte Amylase ein enzymatisch unbedeutendes Protein ist, besteht keine Notwendigkeit für irgendwelche
Trennungs- oder Reinigungs- :ufen nach der Behandlung mit
den Ionen. Das Präparat ist nach der Behandlung lagerungsbeständig.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
darin, daß die Ionen die Mikroorganismuspopulation im Präparat verringern oder eliminieren. Diese Populationen können sonst allmählich
zu einem Verderben des Präparates führen oder die durch
Verwendung des Präparates hergestellten Produkte beeinträchtigen.
Bekanntlich kann man Oxidierungs- oder Bleichmittel, einschließlich
Hypochloritionen, mit Enzymen kombinieren (vgl. z.B. die US PSS 2 262 138, 3 709 790, 3 755 085 und 3 795 586 sowie "Chem.
Abstr." 7j):107533 (1973)). Bariumperoxid wurde zum Inaktivieren
von Amylasen sowie Proteinasen verwendet (vgl. die US PS 2 647 854). Weiter ist es bekannt, die mikrobiale Verunreinigung
von Materialien und Oberflächen durch ihre Behandlung mit Hypochlorit
zu verringern. Keine der Literaturstellen lehrt jedoch, daß Amylase in Protease-Amylase-Mischungen differentioll inaktiviert
werden kann; tatsächlich scheinen die Ausführungen in "Chem.Abstr." das Gegenteil nahszulagen.
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Ein geeignetes Oxidierungsmittel zur Inaktivierung der Amylase
sind Hypochloritionen (ClD"). Sie können durch unterchlorige
Säure oder ein Alkalimetallsalz derselben, u/ie Natrium-, Kalium-,
Calcium- oder Magnesiumhypochlorit, geliefert werden. Die Chloritionen
(ClO2") können auch direkt durch chlorige Säure oder ein
Alkalimetallsalz derselben verfügbar sein. Die hier verwendete
Endung "-it" bedeutet, daG ein Ion entweder durch die Säure oder das Salz geliefert wird. Gewöhnlich wird jede Ionenart allein in
wässriger Lösung verwendet. Es körnen jedoch auch Mischungen der beiden Ionen verwendet werden. Außerdem können sie durch eine
in situ Reaktion gebildet werden, die eine oder beide Formen aus den dem Präparat zugefügten Vorläufern liefert. Reaktion und
Ausgangsmateria lien dürfen selbstverständlich für die Protease
nicht ychädlich sein; weiterhin sollten sie vorzugsweise ungefährlich
sein. So ist es z.B. nicht günstig, das Anhydrid von Hypochlorit, Chlormonoxid (Cl2O) in ein wässriges Enzympräparat zur
Bildung des Hypochlorits in situ einzuführen. Statt dessen wird zweckmäßig Natriumhypochlori.t in verdünnter wässriger Lösung zum
Enzympräparat zugefügt. Eine leicht verfügbare verdünnte wässrige Lösung aus Natriumhypochlorit mit einem Gehalt von 5,25 % Natriümhypochlorit
und 94,75 % ineiker Materialien ist unter dem
Handelsnamen CLOROX^ erhältlich.
Geeignete Enzympräparate, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
differentiell inaktiviert werden können, sind aus bakteriellen
und tierischen Quellen erhältlich. Die tierisch hergeleiteten Präparate stammen von Tieren mit diskreten Organen oder Flüssigkeiten,
die zur Gewinnung als Enzymquelle geeignet sind. Ein
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solches Organ ist z.B. die Bauchspeicheldrüse, eine roiche Quelle
von Verdauungscnzyrnen schließlich Protease und Amylase. Ein zur
erfindungsgcmäßen Behandlung geeignetes pankreatisches Enzympräparat
ist Pancreatin, ein bekanntes, L ipaso, Esterase, Protease Und Amylase enthaltendes Material.
Amylsehaltige Proteasen aus vielen verschiedenartigen Bakterien
sind im erfindungsgemäGen Verfahren verwendbar. Besonders bevorzugt
werden die Proteasen aus Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis.
Die Wirksamkeit oder das MaG der differentiellen Inaktivierung der
Amylaso in Proteasepräparaten kann von vielen Faktoren abhängen.
So körrai z.B. das Verhältnis der Konzentrationen einer oder beider
Ionenformen zur Protninmenge im gemischten Protease-Amylase-Präparat,
die Verdünnung desselben sowie pH-Wert, Temperatur und Zeit der Berührung der Ionen mit dem Präparat die Ergebnisse beeinflussen.
Diese Faktoren können vorn Fachmann leicht ausgeglichen werden, so daß die Amylase in gewünschtem MaG inaktiviert
wird, während die Proteaseaktivität praktisch gleich bleibt. Es
ist gewöhnlich zweckmäßig, mindestens etwa 80 % der Amylase zu
inaktivieren, während die Proteaseaktivität weniger als etwa 20 % verringert wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man
gewöhnlich eine Verminderung der Amylaseaktivität von mehr als 95 %
erreichen, während gleichzeitig die Proteaseaktivität um weniger als 5 % verringert wird. Die Inaktivierung kann nach jeder üblichen
Bestimmung der proteolytischen und amylolytischen Aktivität
verfolgt werden.
Günstige Ergebnisse erzielt man nach dem erfindunqsgemäGen Verfahren
über ninen weiten Dernich nn Geujic htsverhältnissen von
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Enzympräparat zu zugefügten Ionen. Das Präpatat braucht nur mit
ausreichend Ionen zur wesentlichen Inaktivierung seiner Amylaseaktiv/ität
behandelt zu werden, u/obei die Proteaseaktivität praktisch
unverändert bleibt. So liefern z.B. etwa 0,1-5 Gew.-/5 Ionen,
bezogen auf das Trockengeu/icht des pulverisierten Enzympräparates
in der umgebenden Luft, zufriedenstellende Ergebnisse. Vorzugsweise
vuerden etwa 0,2-0,5 % Hypochloritionen oder etwa 0,2-2 %
Chloritionen verwendet. Die am meisten bevorzugte Konzentration Jeder getrennt verwendeten Ionenform liegt bei etwa 0,30 %
Hypochlorit bzw. bei etwa 0,35 % Chlorit. Gewöhnlich wird für
Jede gegebene Chloritmenge etwas weniger Hypochlorit verwendet.
Insgesamt ist die Menge der verwendeten Ionen nicht entscheidend. Zu wenig führt zu einer relativ hohen restlichen Amylaseaktivita't,
obgleich dies für manche Verwendungszwecke des behandelten Präparates wünschenswert sein kann, während zu viel eine Verschwendung
an Reagenz ist.
Die zu behandelnden Enzympräparate können praktisch oder im wesentlichen
zellfreie Lösungen, wie Filtrate von Fermentationsbrühen, rohe Tierorganextrakte oder Lösungen getrockneter Fermentationsbrühenfiltrate
sein. Die Präparate können nicht nur eine Fermentationsbrühe sondern auch die Zellen des verwendeten Mikroorganismus
allein oder in Kombination mit einer Vielzahl anderer Arten zur Herstellung der gemischten Protease-Amylase-Präparate enthal-
ten. Weiter kann jedes der obigen Präparate Zellen von Verunreinigungen
enthalten. Diese Zellen werden durch die Behandlung abgetötet, was ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäOen Verfahrens ist,
Daher braucht man keine Abtrennungsstufe im erfindungsgcmäOen Verfahren
anzuwenden, um das Präparat von lebenden Zellen frei zu
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machon. Es uiird bemerkt, daß eine groGe Zaiil von Zellen so viele
Ionen verbrauchen, daß sine Ergänzung der zugefügten Ionen notwendig
sein kann, um die gewünschte Inaktivierung der Amylase
zu gewährleisten.
Geeignete Quellen der gemischten, als Ausgangsmaterialien irn
erfindungsgemäOen Verfahren verwendbaren Protease-Amylase-Enzmysysteme
sind bekannt und können durch mikrobiale Fermentation
nach bekannten Fermentationsverfahren hergestellt werden, wie sie
in Kirk-Othmer "Encyclopedia of Chemical Technology" 8, 173-230
und den dort genannten Literaturstellen beschrieben werden. Die Anwendung von bakteriellen Quellen zur Herstellung gemischter
proteolytischer und amylolytischor Enzymsystome durch Fermentation
ist besonders in der U5 PS 2 530 210 beschrieben.
Eine besonders geeignete Quelle eines Protease enthaltenden Enzympräparates^ist Bacillus subtilis. Dieser Mikroorganismus ist
eine weit verbreitete, sporenbildende, aerobe und catalasepositive
Bakterienart, die in "Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology", Seite 613-621, 7. Aufl. 1957, erschienen bei Williams and Wilkings Co, Baltimore, Md., sowie in "Aerobic Spore
Forming Bacteria", Agricultural Monograph" Nr. 16, U.S. Department of Agriculture, klassifiziert ist. Dieser Mikroorganismus ist
aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Natur der Öffentlichkeit leicht zugänglich.' Auch zahlreiche Kulturen dieses Mikroorganismus
sind in öffentlichen Niederlegungsstellen verfügbar, die
der Öffentlichkeit einen leichten Zugang des Deponates gewährleisten.
Ein solches Deponat befindet sich z.B. bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Bezeichnung
ATCC 6051a. Ein weiteres Beispiel diuses Mikroorganismus
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ist die beim U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research
Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, I1L» unter der Nr. IMRRL B-3411 deponierte Kultur. Weitere
Beispiele sind dem Fachmann aus den verschiedenen öffentlichen Niederlegungsstcllen für Mikroorganismen in der ganzen Welt bekannt.
Das Enzympräparat kann bei Berührung mit dem Oxidierungsmittel
trocken, in Lösung oder als Aufschlämmung vorliegen. Seine Konzentration
in der Lösung ist nicht entscheidend. Gewöhnlich werden
etwa 5-75 Ce .-% Feststoffe in Wasser oder einem Puffer, vorzugsweise
etuia 20 Gem. -f3f verwendet. Die gewählte Konzentration hängt
weitgehend davon ob, welche Verarbeitung5verfahren vor oder nach
der Behandlung angewendet worden sollen. Ein geringer Feststoffgehalt
ist z.B. kennzeichnend für Fermentationsbrühen, die im
erfindungsgemäßen Verfahren ohne weitere Verarbeitung behandelt
u/erden können. Wünscht man dagegen ein konzentriertes Endprodukt,
dann kann die Lösung des Präparates vor der Dehmdlung auf das
entsprechende MaO entwässert werden.
Man kann jeden pH-Wert für die Behandlung wählen, der die Proteaseaktivität
nicht beeinträchtigt; diese variiert als Funktion des pH-Wertes in Abhängigkeit von der Quelle des Enzympräparates. Aus
praktischen Gründen enthalten die meisten rohen Präparate aus bakteriellen oder tierischen Quellen eine Vielzahl von Proteasen,
die jeweils über einen unterschiedlichen pH-Bereich aktiv sind. Eben diese Verteilung der Proteasen bestimmt den pH Aktivitätsbereiph
der Enzyme. Wo ein Enzym daher innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 3-10 die beste Proteaseaktivität zeigt, hängt von
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der Verteilung dor Proteasen im Präparat ab. Bei Verwendung dor
B. subtilis Enzynmischung iuird uin Dereich von etwa 5,8-7 bevorzugt,
wobei etwa 6,3 optimal ist. Gegobenonfalls kann die Einstellung
der Enzymmischung auf den gowünschten pH-Wert durch Zugabe
einer geoigenten Mange an verdünnter Säure oder Alkali erfolgen
.
Weder die Temperatur noch die Dauer der Ionenbehandlung sind
kritisch, obgleich die Temperatur nicht so hoch sein sollte, daß die Protease inaktiviert irird. Lösungen einer Temperatur zwischen
etwas oberhalb des Gefrierpunktes bis etrna 6D°C. können z.B.
mehrere Minuten bis 3 Stunden lang behandelt u/erden. Gewöhnlich
sind längere Behandlungszeiten mit niedrigeren Temperaturen und
Ionenkonzentrationen notwendig. Vorzugsweise werden die Lösungen
etwa 1 Stunde und 15 Minuten etwa bei Zimmertemperatur behandelt.
Die Wahl dieser Parameter beruht weitgehend auf wirtschaftlichen Überlegungen.
Nach der Behandlung mit dem Oxidierungsmittel kann die Lösung
in üblicher Weise behandelt werden, um das Produkt zur weiteren Verwendung bereitzumachen. Sie wird gewöhnlich lyophilisiert oder
sprühgetrocknet, wobei diese Verfahren auch restliche Chlorit- oder Hypochloritionen entfernen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung,
ohne sie zu beschränken.
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"«p
Ein alkalischos Proteasepräparat aus B. subtilis (als "Alkaline
Protease" von der Firma Wallorstein Co. im Handel) wurde in Leitungswasser auf eine Konzentration von 20 Gnw.-^ό, bezogen auf das
Trockengewicht des Präparates bei Zimmertemperatur, gelöst. Es wurde nicht versucht, unlösliches Material zu entfernen, obgleich
dies gegebenenfalls leicht hätte getan werden können. Der pH-Wert
dieser Lösung lag bei 6,3. Es wurden ausreichende Mengen an wässriger Natriumhypochlorit- und Natriumchloritlösung durch Mischen
zu 26-g-Aliquoten der Proteaselösung zugefügt, um verschiedene
Natriumhypochlorit- und -chloritkonzentrationen, bezogen auf das Trockengewicht des Enzympräparates bei Zimmertemperatur, zu
erhalten. Diese Konzentrationen sind in Tabelle I in % aufgeführt. Die unterschiedlichen Anteile der inaktivierenden Ionenlösung
wurden durch Zugabe von Wasser «ausgeglichen. Die Zugabo der inaktivierenden
Ionen veränderte den anfänglichen pH-Wert der Enzymlöeung nicht merklich. Die Ionen blieben mit der Enzymlösung etwa
1 1/4 Stunden in Berührung, dann wurde die Lösung auf Protease-
und Amylaseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.
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zugef. Ionensalz
Wirkung der Chlorit- und Hypochloritzugabe auf
die Protease- und Amyfeseaktivität
Ionensalz
Amylseaktivität
Verlust
Proteaseaktivität*
Verlust
Natriumchlorit
0,152
0,304
0,486
1,94
282
151
14
47
95
99
99
40 300 40 800 40 800 39 900 37 200
0 0 1 8
n> fJatriumhypochlorit
0,125 0,25 0,40
583
242
16
11
55
97
97
93
25 900 25 100 2 5 90Π
24 600
0 5
Amylase und Protease vuurden nach dem Verfahren in "Food Chemicals Codex", First Sppletnent,
2. Aufl. Seite 66 bzui. 89 bestimmt-
B β i s p i ο 1 2
Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Natriumchlorat oder Natriumperchlorat
als Ionensalz wiederholt. Die Salze wurden in Mengen von 0,179-2,29 bzui. 0,236-3,02 Gew.-^, bezogen auf das trockene
Enzympulver bei Zimmertemperatur, verwendet. Diese Mengen an Notriumchlorat und Natriumperchlorat sind die entsprechenden
molaren Äquivalente der Natriumhypochloritkonzentrationen von 0,125-1,6 %. Keines dieser Salze hatte irgendeine Wirkung auf
die Protease- oder Amylaseaktivität trotz der Tatsache, das Natriumchlorat
und Natriumperchlorat mit Chlorit und Hypochlorit nahe verwandt sind. Dies unterstreicht das äußerst selektive und unerwartete
Verhalten der erfindungsgemäQen Hypochlorit- und ChIoritionen
bei der selektiven Inaktivierung der Amylase.
Gasförmiges Chlor wurde bsi Zimmertemperatur durch 25 g der in
Beispiel 1 beschriebenen Enzymlösung geleitet, wodurch Protease und Amylase vollständig inaktiviert wurden. Chlor ist ein bekanntes
Bleichmittel, dennoch versagt es überraschenderweise bei der
selektiven Inaktivierung von Amylase, wie sie durch die erfindungsgemäßen
Hypochlorit- und Chloritionen erzielbar ist.
Gemäß Beispiel 1 wurde eine Enzymlösung hergestellt und auf pH 6,4 eingestellt. Zu 976 g der pH-eingestellten Lösung wurde
Natriumhypochlori,t auf eine Konzentration von 0,3 %, bezogen auf
das Gewicht des Enzympräparates, zugefügt. Das Gesamtgewicht iturde
mit Leitungswasser auf 1000 g gebracht. Der endgültige pH-Wert
jedoch betrug 6,5, Dann wurde dieses Verfahren wiederholt, uiobei/Wasserstoffperoxid
auf eine Konzentration von 0,15 %, bezogen auf das
Gewicht des Enzympriipsrates, zugefügt wurde. Der pH-Wort betrug
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6,4. Diese Wassorstoffporoxidkonzc-ntration ist um 9,5 % höher als
eine dem Natriumhypochlorit in 0,3-^iger Konzentration entsprnchende
äquimolare Menge. Die übrigo Bohandlung nrfolgte gemäG
Beispiel 1. Die Protease- und Amylaseaktivitäten sind in Tabelle
Beispiel 1. Die Protease- und Amylaseaktivitäten sind in Tabelle
2 genannt.
Vergleich der Wirkung von Wasser stoffperoxid und
Hypochlorit auf Protease-AmyIse-Mischungen
Hypochlorit auf Protease-AmyIse-Mischungen
Cxidierungsmittel Amylase- Proteaseakt i vit ät
Natriumhypochlorit 3 27 365
Wasserstoffperoxid 236 29 579
Dann wurden die behandelten Lösungen sprühgetrocknet, erneut
gelöst und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
gelöst und analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Untersuchung des sprühgetrocknetes Produktes
Untersuchung des sprühgetrocknetes Produktes
Oxidierungsmittel Amylase- Protease-
' '_ \ akt ivität
Natriumhypochlorit 15 147 65Π
Wasserstoffperoxid 1250 157 512
Die Daten aus Tabelle 2 und 3 zeigen, daß Wasserstoffperoxid, ein
bekanntes Oxidierungsmittel, bei der 3Glektiuen Inaktivierung von
aktiv
Amylase wesentlich weniger'als das erfindungsgemäße Hypochlorit
Amylase wesentlich weniger'als das erfindungsgemäße Hypochlorit
B β i s ρ i e 1 5
Ein von der Firma Cudahy Co. erhaltencsPancreatin wurde in isotonischer
Salzlösung (n,9 % NaCl) auf eine Konzentration von 3,13 g
in 25 g Lösung gelöst; die Lösung hatte einen pH-Wert von 6,5.
Es wurdn eine Natriumhypochloritlüsung ("CLOROX"^ zugefügt und
die Anteile durch Zugabe von isotonischer Salzlösung nqualisiert. Die isotonische Salzlösung wurde v/arwondet, um eine mögliche Zornotzuny r.'or Lösung bo.ν ΓΠ;ρ!ιηη .tu vormnidnn. Wie hug Tabelle h
Es wurdn eine Natriumhypochloritlüsung ("CLOROX"^ zugefügt und
die Anteile durch Zugabe von isotonischer Salzlösung nqualisiert. Die isotonische Salzlösung wurde v/arwondet, um eine mögliche Zornotzuny r.'or Lösung bo.ν ΓΠ;ρ!ιηη .tu vormnidnn. Wie hug Tabelle h
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ersichtlich, hatto das Salz keine Wirkung auf die differentielle
Inaktiviorung. Ein ähnlicher Mangel an V/irkung wurde bei der Verwendung
einer Enzymlösung tnit einem pH-Wert von 5,8 anstelle von
6,5 festgestellt. Die Enzymmischung luurdo 1 1 '4 Stunden bei Zimmertonperatur
behandelt und dann auf Protease- und Amylaseaktivität
untersuch t.Wie in den obigen Beispielen ist dor Prozentsatz an
Natriumhypochlorit auf den Feststoffgohalt der Enzymlcsung bezogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.
Wirkung der Hypochloritzugabe auf Pancreatin
% Natriumhypo- Amy läse- % Protease- %
chlbrit aktivität* Verlust aktivität* Verlust
0 1076 -- 27 300
1,8 467 57 28 400 0
3,6 31 97 24 800 9
7,2 3 100 19 100 30
10,8 0 100 11 200 59
* Bestimmung von Amylase- und Proteaseaktiv ität wie in Tabelle 1
Bei s ρ i el 6_
11,34 kg einer unstandardisierten, trockenen Enzymmischung, erhalten
durch Trocknen des geklärten Kulturfiltrates aus der aeroben
Fermentation von Bacillus subtilis in einem u/ässrigen, assimilierbares
C, N und Mineralsalze enthaltenden Nährkulturmedium, die laut Bestimmung neutele.Protease, alkalische Protease und Amylase
enthielt, wurde mit 45,4 kg Wasser bei 21-29,50C. gemischt und
zum leichteren Lösen gerührt. Die Lösung wurde durch langsame Zugabe einer 20-^igen wässrigen NaOH Lösung auf pH 6,2-6,6 eingestellt
Dann wurden 758 g CLORHX ®(mlt einem NaOCl Gehalt von
5,25 %) langsam zur obig™ Enzymlösung zugefügt, was eine Zugabe
von 40 g oder 0,35 % NaOCl, bezogen auf das Gewicht der trockenen
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Mischung ergab. Das NaOCl zerstörte sofort die Amylase,und die
erhaltene Lösung wurde dann sprühgetrocknet.
Die Analyse des Enzymausgangcinaterials und des endgültigen,
sprühgetrockneten Materials nach den in Tabelle 1 genannten Verfahren zeigte, daß etwa 98 % der Amylase inaktiviert waren,
während mehr als 90 % der Protease (in neutraler und alkalischer
Form) im Endprodukt bewahrt geblieben waren.
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Claims (1)
1.- Verfahren zur S8 lc!: tiven Innkti νierung von Amylar.ü in einer
Mischung aus Protonse und Arnylasc, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Mischung mit einem Oxidicrungsmilto1 aus der Gruppe von
Hyppchloridioncn und Chloritionon in einer Nnnge in Berührung
bringt, die zum Inaktivieren dor Amylase auf ein wesentlich
höheres MaQ als der Protease wirksam ist.
2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekannte ichnot, daß etwa
0,1-5 % OxidierungsmittG] , bezogun :iuf das Gericht der Mischung
verwendet werden.
3,- V/erfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die Mischung aus einer bakteriellen oder tierischen Quelle erhalten
wird,
A.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daG als Oxidierungsmittel Hypochloritionen in einer Menge von etu/a
0,2-0,5 %, bezogen auf das Gewicht der Mischung, verwendet
uierden.
5.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
als Oxidierungsmittel Chloritionen in einer Menge von etiua 0,2-2
%, bezogen auf das Gewicht der Mischung, verwendet werden.
6.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daG die Menge des verwendeten Oxidierungsmittels wirksam ist, um
mehr als etu/a 00 % der Amy laseaktivi tat, jedoch weniger als etwa
20 % der Protoaseaktivität zu inaktivieren. 7,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daG
die Hypochlorit- oder Chloritionen als ihre Alkalimotalisa]ze
vorliegen.
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ORIGINAL INSPECTED
8,- Vorfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gnkennzeichnet,
daß die Hypochlorit- oder Ch lor it inn en als unlü rchlor iqc; Säure
bzw. chlorige Säure vorliegen.
9,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 0, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Mischung aus einer Dacillusart, insber, on der e Oacillus
subtilis oder Bacillus 1ichrniPormis, oder Bauchspeicheldrüsen
erhält.
■10,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daIi
die Lösung einen pH-Wort von etwa 5,8-7 hat.
11.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch geksnnzeichnet,
daß eine zellfreie Mischung verwendet wird.
12,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lösung nach Inaktivierung der Amylase sprühgetrocknet
wird.
Der Patentanwalt:
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