DE3012924C2

DE3012924C2 - Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin

Info

Publication number: DE3012924C2
Application number: DE3012924A
Authority: DE
Inventors: Sven Charlottenlund Branner-Joergensen; Peter Kopenhagen Eigtved; Palle Ballerup Schneider
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1979-04-09
Filing date: 1980-04-02
Publication date: 1983-04-21
Also published as: FI801072A; AR222534A1; DD149999A5; FR2453897A1; CH650022A5; AU5711880A; FI66728B; SE8002640L; FI66728C; DK145679A; NL191064C; IT1188922B; ES490363A0; DE3012924A1; US4357357A; AU525451B2; ES8103931A1; BE882689A; NL191064B; NL8002050A

Description

Bei der Herstellung von Käse wird die Milch koaguliert, um den Quark von der Molke zu trennen. Produkte, die Rennin bzw. Labferment enthalten, das ein aus Kälbermägen isoliertes milchkoagulierendes Enzym ist, wurden lange Zeit für diesen Zweck angewandt. In der Vergangenheit konnte der Bedarf an Rennin durch Labferment (aus Kälbermägen) gedeckt werden, aber in den letzten Jahren wurden verschiedene Austauschstoffe für Labferment entwickelt, wie insbesondere mikrobiologisches Rennin von Mucor miehei und Mucor pusillus. Rennin von Mucor miehei wird zur Käseherstellung bevorzugt aufgrund seiner geringen Kosten, seiner geringen unspezifischen proteolytischen Aktivität und seiner großen Ähnlichkeit mit Labferment bezüglich der Empfindlichkeit gegen Calciumionen.

Eine andere vorteilhafte Eigenschaft von Rennin von Mucor miehei, die zumindest teilweise seiner hohen thermischen Stabilität zugeschrieben wurde, ist seine ausgezeichnete Lagerbeständigkeit.

Ein Teil der pasteurisierten Molke wird als Zusatz zu Vollmilch angewandt, z. B. in Form von Molkenpulver, um eine angereicherte Milch herzustellen, z. B. als Babynahrung. Die pasteurisierte Molke, die bei der Herstellung von Käse mit Rennin von Mucor miehei anfällt, kann auf Grund der hohen Stabilität von Rennin von Mucor rneihei noch kleine Mengen Renninaktivität enthalten. Eine etwaige Restrenninaktivität im Molkenpulver ist jedoch unerwünscht, da keine Proteinkoagulation mehr auftreten soll. Eine solche könnte jedoch auftreten, wenn das Molkenpulver angewandt wird zur Herstellung von angereicherter Milch als Babynahrung. Die angereicherte Milch kann dann koagulieren, bevor sie in den Magen des Säuglings kommt, z. B. in der Flasche, wodurch der Milchfluß verstopft wird.

In Biochim. Biophys. Acta 271 (1972) 93-101 (W. S.

ίο Rickert. Structural and functional determinants of Mucor miehei protease, I. Modification of the NH2 terminus and lysine residues by carbamyhtion) ist angegeben, daß Protease von Mucor miehei (die wirksame Komponente von Rennin von Mucor miehei) mit Kaliumcyanat carbamyliert werden kann und das carbamylierte Produkt eine leichte Verringerung der thermischen Stabilität zeigt. Praktische Versuche haben jedoch gezeigt, daß die Verringerung der thermischen Stabilität des carbamylierten Enzyms zu gering ist, um das oben erwähnte Problem der Renninaktivität in pasteurisierter Molke zu lösen. In der DE-OS 29 51 793 wird vorgeschlagen, das Enzym zur Verringerung der thermischen Stabilität zu acylieren.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wirtschaftlich durchführbares Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe die thermische Stabilität von mikrobiologischem Rennin in einem solchen Ausmaß verringert werden kann, daß die von der restlichen mikrobiologischen Renninaktivität stammenden Nachteile in pasteurisierter Molke wirtschaftlich überwunden werden können.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin, wie es im Anspruch 1 angegeben ist.

Die Ansprüche 2 bis 7 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Die Erfindung betrifft auch den Gegenstand des Anspruchs 8.

Es hat sich gezeigt, daß mikrobiologisches Rennin, das erfindungsgemäß modifiziert worden ist, deutlich weniger stabil ist und daß die Destabilisierung ausreicht, um den Erfordernissen zu entsprechen, wie sie bei der Verwendung von Molke auftreten, ohne daß nachteilige Wirkungen auf die Lagerstabilität der Renninzubereitung auftreten. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß es erfindungsgemäß möglich ist, eine Verringerung der thermischen Stabilität (wie später näher erläutert) von mindestens 5°C, vorzugsweise 7 bis 11°C zu erreichen, die in dem bevorzugten Bereich dazu führt, daß die thermische Stabilität des modifizierten Enzyms derjenigen von Kälberrennin (Labferment) entspricht, wobei die günstigen Eigenschaften des Kälberrennins kombiniert sind mit den günstigen Eigenschaften des mikrobiologischen Rennins.

Die Renninaktivität wird nach dem British Standard 3624, 1963 gemessen (Verfahren zur Bestimmung der Koagulationskraft von Rennin für Milch).

Da die Erfindung sich auf eine gesteuerte Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin bezieht, sind im folgenden die Verfahren zur Messung der thermischen Stabilität und zur Quantifizierung der Verringerung der thermischen Stabilität näher ausgeführt, wobei die Verringerung der thermischen Stabilität in ⁰C angegeben ist.

Unter idealen Bedingungen kann ein Enzym bei einer entsprechenden (hohen) Temperatur so inaktiviert werden, daß die Restaktivität des Enzyms abnimmt als Funktion der Zeit entsprechend einer exponentiell abfallenden Kurve, d. h. mit einer gut definierten

Halbwertszeit, die eine Funktion der Temperatur (⁰C) ist

Die Halbwertszeit T\n kann nach der folgenden Formel berechnet werden:

in der A ι die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf eine bestimmte Temperatur für die Zeit i| bedeutet, während A₂ die Enzymaktivität nach dem Erhitzen auf die gleiche Temperatur für die Zeit iv angibt Die Halbwertszeit ist kürzer, je höher die Temperatur ist bei sonst gleicher Arbeitsweise. Bei vielen Enzymen wird die Halbwertszeit wesentlich verändert durch eine Veränderung des pH-Werts der Errzymlösung und der lonenstärke sowie das Vorhandensein bestimmter Salze. Außerdem kann die Halbwertszeit wesentlich verändert werden durch die chemische Modifizierung des Enzyms. Wenn eine chemische Modifizierung eines bestimmten Enzyms zu einer Verringerung der thermischen Stabilität des Enzyms führt, ist der Grad der Verringerung der thermischen Stabilität n°C, wenn das ursprüngliche (nicht modifizierte) und das modifizierte Enzym die gleiche Halbwertszeit bei N⁰C und (N-nJPC besitzen.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Verringerung der Werte der thermischen Stabilität bis zu einem gewissen Grad nur Näherungswerte darstellen, da die Halbwertszeit immer nur ein Näherungswert ist. Alle Werte für die Verringerung der thermischen Stabilität dieser Beschreibung sind bei einem pH-Wert von 6,0 gemessen, da die Ergebnisse der Stabilitätsmessungen pH-abhängig sind.

Normalerweise wird die erfindungsgemäße₍B,ehandlung von einem Aktivitätsverlust begleitet und es hat sich gezeigt, daß aus wirtschaftlichen Gründen die Verringerung der thermischen Stabilität nicht weiter als bis zu einem Aktivitätsverlust von ungefähr Vo, vorzugsweise ungefähr 30%, und insbesondere weniger als 10% durchgeführt werden sollte. ·

In einem typischen Fall scheint die Verringerung der thermischen Stabilität von 10% mit einem Aktivitätsverlust, der auf weniger als 10% begrenzt ist, ein annehmbarer Kompromiß zwischen den oben angegebenen sich widersprechenden Faktoren zu sein.

Beispiele für geeignete Oxidationsmittel, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind ein Hypochlorit, z. B. Natriumhypochlorit, ein Hypobromit, z. B. Natriumhypobromit, freies Chlor, N-Chlorsuccinimid, Chloramin-T, und Trichlorisocyanursäure.

Das Oxidationsmittel sollte in einer solchen Konzentration angewandt werden, daß die gewünschte Verringerung der thermischen Stabilität in einer annehmbaren Zeit erreicht wird, die irgendwo zwischen einigen Minuten bis zu 48 Stunden oder sogar darüber liegen kann, wenn die Reaktion nicht abgebrochen wird. Wenn die Konzentration an Oxidationsmittel zu gering ist, ist die Verringerung der thermischen Stabilität zu gering, und wenn die Konzentration an Oxidationsmittel zu hoch ist, wird der Aktivitätsverlust zu hoch. Die optimalen Konzentrationen entsprechen üblicherweise einem Gewichtsverhältnis zwischen Oxidationsmittel und Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung von ungefähr 3 bis 30 Teilen Oxidationsmittel auf 100 Teile Gesamtprotein. Wenn das mikrobiologische Rer.nin auf eine hohe Einheitsaktivität gereinigt worden ist, kann die Menge an Oxidationsmittel auf so geringe Mengen wie Ig pro 100 g Gesamiprotein verringert werden (vgl. in diesem Zusammenhang den Anspruch i).

Der pH-Wert, bei dem die Reaktion stattfindet, kann innerhalb weiter Grenzen variieren, d. h. zwischen einem pH-Wert von 3 bis 10, wobei der bevorzugte Bereich hauptsächlich von dem angewandten Oxidationsmittel abhängt So liegt der bevorzugte Bereich bei Verwendung von Hypochlorit als Oxidationsmittel bei 5 bis 9 und insbesondere bei 6 bis 8.

Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, so lange sie auf Werten z. B. unterhalb ungefähr 30°C gehalten wird, bei denen die Stabilität des Enzyms noch ausreichend ist Die Stabilität des Enzyms kann jedoch verbessert werden durch Zugabe bekannter proteinstabilisierender Mittel, z. B. von NaCl in einer Menge von 5 bis 20%, bezogen auf die Enzymzubereitung, oder Sorbit in den üblichen enzymstabilisierenden Mengen.

Der Reaktionsmechanismus (durch den die Verringerung der thermischen Stabilität eintritt) ist noch nicht vollständig aufgeklärt und es ist auch noch nicht geklärt, ob das erhaltene destabilisierte Enzymmolekül HaIogensubstituenten enthält oder nicht Offensichtlich kann das Enzym wie alle Proteinmoleküle zahlreiche und unterschiedliche Reaktionen eingehen, z. B. Oxidationsund Chlorierungsreaktionen. Da im vorliegenden Falle die Verringerung der thermischen Stabilität von Interesse ist, sind Reaktionen, die zu einer Desaktivierung des Enzyms führen, unerwünscht, während solche Reaktionen, die zu einer Verringerung der thermischen Stabilität des Enzyms ohne Veränderung der Enzymaktivität führen, erwünscht sind.

Eine Verringerung der thermischen Stabilität von mindestens 5° C, vorzugsweise zwischen 7 und 10⁰C und der damit verbundene Aktivitätsverlust von nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 30%, am besten weniger als 10% werden für die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Grenzen angesehen. Die aktives Halogen enthaltenden Oxidationsmittel erfüllen diese Voraussetzung.

Freies Chlor disproportioniert, wenn es in ein wäßriges Medium eingeleitet wird, in Chlorid- und Hyprochloritionen. Die oben angegebenen N-Chlorverbindungen wandeln sich entsprechend in Hypochloritionen um. Das bevorzugte Reagens ist Natriumhypochlorit, das bei einem pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, angewandt wird.

Die in der DE-OS 29 51 793 angegebene Acelierung führt zu einer Verringerung der thermischen Stabilität von ungefähr 3° C. Die Oxidation mit Wasserstoffperoxid führt ebenfalls zu einer Verringerung der thermischen Stabilität.

Die direkte Behandlung des Enzyms mit einem aktives Halogen enthaltenden Reagens, z. B. Natriumhypochlorit, besitzt verschiedene Verfahrensvorteile gegenüber der Umsetzung mit Peroxid. Der Hauptvorteil liegt vermutlich darin, daß das Reagens mit aktivem Halogen vollständig in dem Reaktionsgemisch aufgebracht werden kann, während die Reaktion mit Peroxid abgebrochen werden muß z. B. durch Zugabe von Katalase.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Rennin mi^einem Oxidationsmittel behandelt, das Chlor enthält. Außerdem ist es bevorzugt, die erfindungsgemäße Behandlung bis zu einer Verringerung der thermischen Stabilität von mindestens 5^CC, vorzugsweise 7 bis ITC, und einem Renninaktivitätsverlust von nicht mehr als 50%, vorzugsweise nicht mehr als 30%, durchzuführen. Günstig ist die Verwendung eines Oxidationsmittels, das

ein Halogen mit einer Oxidationszahl von 0 bis 1 enthält, insbesondere von Hypochlorit Ferner ist es besonders günstig, das erfindungsgemäße Verfahren auf Rennin anzuwenden, das von Mucor miehei gebildet worden ist Das Gewichtsverhältnis von Oxidationsmittel zu Gesamtprotein in der Enzymzubereitu.ig liegt zwischen 0,01 und 1, vorzugsweise zwischen 0,03 und 03. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums beträgt 5 bis 9 und die Temperatur liegt vorteilhafterweise bei 0 bis 30° C

Die Erfindung bezieht sich auch auf die Anwendung des erfindungsgemäß modifizierten mikrobiologischen RennLü zur Koagulation von Milch bei der Käseherstellung. Die bei diesem Käseherstellungsverfahren anfallende Molke kann nach Pasteurisierung als proteinhaltiger Zusatz zu Nahrungsmitteln, insbesondere Babynahrung, angewandt werden.

In der Praxis hat es sich gezeigt, daß die Anwendung von Rennin mit verringerter thermischer Stabilität zur Herstellung von haltbaren Käsesorten besonders günstig ist.

In zwei parallelen Behältern zur Käseherstellung mit einem Fassungsvermögen von 150 ml wurde jeweils ein Käse mit Hilfe von Rennin von Mucor miehei entsprechend Beispiel 16 und mit Hilfe von nicht modifiziertem Rennin von Mucor miehei hergestellt. Es wurden 2 mal 6 Versuche durchgeführt Aus diesen Versuchen wurde geschlossen, daß das erfindungsgemäß modifizierte Rennin im Stande war, übliche dänische Käsearten, wie Samso und Danbo mit mindestens ebenso guten Eigenschaften zu erzeugen wie das nicht modifizierte Rennin.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität wird vorzugsweise durchgeführt als letzte Stufe bei der Herstellung von mikrobiologischem Rennin. Es kann (handelsübliches) reines mikrobiologisches Rennin oder Renninkonzentrat für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden. So wird z. B. der pH-Wert einer mikrobiologischen Renninlösung, die sonst für die üblichen Aufbereitungsstufen vor der Abgabe fertig ist, auf einen vorbestimmten Bereich für die Behandlung (z. B. pH 7) eingestellt und die Lösung dann unter Rühren bei Raumtemperatur mit einer Lösung des Oxidationsmittels vermischt, wobei die Menge an Oxidationsmittel in dem oben erwähnten Bereich von 3 bis 30 Teilen (beispielsweise 20 Teile Natriumhypochlorit) auf 100 Teile Gesamtprotein in der mikrobiologischen Renninlösung liegt Das Gemisch wird dann einige Stunden stehen gelassen, bis der erwünschte Destabilisierungsgrad erreicht ist, z. B. 2 bis 3 Stunden. Die Reaktion kann abgebrochen werden durch Zugabe von Aktivkohle oder einem Reduktionsmittel wie Natriumsulfit, nach einer entsprechenden Zeit. Das destabilisierte Enzymprodukt kann dann den üblichen Aufarbeitungsschritten z. B. Filtration, Einstellung von pH-Wert und Enzymaktivität auf Standardstärken usw. unterworfen werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Als Ausgangsmaterial wurde ein Rennin-Konzentrat angewandt, das hergestellt worden war entsprechend »2. Pilot plant experiment« in der GB-PS 11 08 287, wobei nur die Kulturflüssigkeit auf eine Aktivität entsprechend einer 1 °/oigen Lösung des reinen Enzyms konzentriert worden war (Comptes Rendus des Traveaux du Laboratoire Carlsberg, Bd. 3/, Nr. 14, 301-325) und 18% NaCI zu dem rohen Konzentrat zugegeben worden waren (der Einfachheit halber im folgenden als »Rennilase 46« bezeichnet}.

Beispiel 1

Zwei Versuchsreihen von je 3 mal 25 m! eines Gemisches aus 12,5 ml Rennilase 46 und 12,5 ml Wasser . wurden durch Zugabe von 1 η NaOH auf einen pH-Wert von 7,0, 8,0 bzw. 9,0 eingestellt und zu jedem Gemische 0,4 ml einer 2,25 m Lösung von NaCIO zugegeben, wobei der pH-Wert auf den oben angegebenen Werten konstant gehalten wurde. > Die erste Reihe aus drei Proben wurde über Nacht (ungefähr 18 Stunden) in den Kühlschrank gestellt Die zweite Reihe aus drei Proben wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Abfallen des pH-Wertes wurde nach dieser Zeit gemessen und notiert Dann wurden die Proben durch Vermischen von 0,2 ml Probe mit 50 ml Wasser verdünnt und gleichzeitig der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt

Das Absinken des pH-Wertes und die Restaktivitäten nach Beendigung der Reaktion zwischen dem Rennin und dem Natriumhypochlorit sind in der folgenden Tabelle angegeben.

>5 Anfangs-pH pH nach

2h

Restaktivität (%) nach

18 h

2h

7,0	6,9	6,9	86,3	83,1
8,0	7,6	7,6	86,1	81,7
9,0	8,2	8,2	78,4	75,4

Jetzt wurden die verdünnten Proben 30 Minuten bei einem pH von 6,0 auf 55°C erwärmt und anschließend die Restaktivität gemessen. Man erhielt die folgenden Werte:

Anfangs-pH

Restaktivität (%) nach 30 min bei 55 ⁰C

2-h-Probe

18-h-Probe

7	16,3	98,7	4,2
8	16,3	4,3
9	32,3	14,6
Vergleich

Die oben angegebenen Restaktivitäten entsprechen den folgenden Weiten für die Halbwertszeit und die Destabilisierung.

Anfangs-pH

Γ1/2 (min); 30 min 55 ⁰C, pH 6,0

2-h-Probe

18-h-Probe

Verringerung der thermischen Stabilität (⁰C)

2-h- 18-h-

Probe Probe

11,5
11,5
18,4

6,5

6,6

10,8

11 11 10

12 12 11

Vergleich

Beispiel 2

Der pH-Wert von drei 150-ml-Proben Rennilase 46 wurde auf 5.0. 6.0 bzw. 7.0 eingestellt, lede dieser drei

Proben wurde in drei Teile aufgeteilt, zu denen jeweils 0,8, 1,2 bzw. 1,6 ml einer handelsüblichen 2,25m Lösung von NaOCl gegeben wurden, und der pH-Wert wurde konstant auf den angegebenen Werten gehalten.

Diese 9 Proben wurden dann 18 bis 20 Stunden bei 5 Raumtemperatur (22° C) stehen gelassen und anschließend von jeder der neun Proben 1.0 ml entnommen. Zu diesen 10-ml-Proben wurden jeweils 0,4, 0,6 bzw. 0,8 ml Im Na2SO3 Lösung gegeben, je: nach dem, wieviel NaOCl zu der jeweiligen Probe zugesetzt worden war, ι ο

um überschüssiges Hypochlorit, soweit vorhanden, zu zerstören.

0,2 ml der so behandelten Proben wurden mit 50 ml Wasser verdünnt und der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt. Diese verdünnten Proben wurden 30 Minuten auf 55° C erwärmt. Die Aktivitätsausbeute, die Restaktivität nach der Wärmebehandlung und die berechnete Halbwertszeit sowie die Verringerung der thermischen Stabilität gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

pH	Zugesetztes	Aktivitäts	Restaktivität	Tm (min)	Verringerung
	NaOCl	ausbeute	(%) 30 min	30 min	der therm.
			bei 55°C,	bei 55°C	Stabilität
			pH6_r0	pH 6,0
	(ml)	(%)			(⁰C)
5,0	0,8	99,4	59,4	39,9	8
	1,2	95,3	57,6	37,7	9
	1,6	84,8	56,1	36,0	9
6,0	0,8	100	53,9	33,6	9
	1,2	91,6	50,5	30,4	9
	1,6	81,4	47,9	28,3	9
7,0	0,8	98,1	49,1	29,2	9
	1,2	87,7	42,7	24,4	10
	1,6	78,3	35,7	20,2	10

Beispiel 3

600 ml Rennilase 46 wurden bei einer Temperatur von ungefähr 10⁰C mit Hilfe von 4 η NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Diese Probe wurde in 6 Teile von jeweils 100 ml aufgeteilt Zu diesen 6 Proben wurden jeweils 0, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 bzw. 2,4 ml einer handelsüblichen 2,25m NaOCl Lösung gegeben und der pH-Wert jeweils auf 7 eingestellt.

Nach ungefähr 15 Stunden bei ungefähr 5°C wurden 2 ml Im Na2SO3 zugegeben, um überschüssiges Hypoch- <to lorit, soweit vorhanden, zu zerstören. Durch die Sulfitzugabe wurde die Stabilität des Rennins nicht verändert. Die Aktivitätsänderung wurde gemessen. Es wurden auch 5 ml der Proben lOfach in 0,1m Acetatpuffer, pH 6,0, verdünnt und anschließend 5 ml der verdünnten Proben 15 Minuten auf 60° C erwärmt. Die Restaktivität nach der Wärmebehandlung wurde bestimmt und die Halbwertszeit und die Verringerung der thermischen Stabilität berechnet Man erhielt die folgenden Ergebnisse.

Zugesetztes	Änderung der	Restaktivität	T_1n (min)	Verringerung
2^5 m NaOCl	Gesamtaktivität	nach Wärme	IS min	der therm.
		behandlung	bei 60⁰C	Stabilität
(ml)	(%)	(%)	pH 6,0	(⁰C)
0	_	99	_	_
0,8	+ 0,6	35	9,9	9
U	0	19	6,3	10
1,6	- 4.4	14	5,3	10
2,0	- 8,5	10	4,5	10
2,4	-14,9	7	3,9	11

Beispiel 4

in diesem Beispiel wurde nicht Rennilase 46 verwendet sondern ein entsprechendes Produkt zu dem kein NaCl zugegeben worden war.

Aus dem oben angegebenen Ausgangsmaterial wurden 5 Proben von 200 g mit 0, 5, 10, 15 bzw. 20% NaCl hergestellt Der pH-Wert wurde mit Hilfe von 4 η NaOH auf 6,0 eingestellt

Von jeder der oben angegebenen 5 200-g-Proben wurden 100 ml entnommea. Zu jeder dieser fünf Proben wurde 1 ml einer handelsüblichen 2£5 η NaOCl Lösung gegeben, wobei die Temperatur zwischen 5 und 10⁰C gehalten wurde. Der pH-Wert aller fünf Proben wurde dann mit 4 η NaOH auf 7,0 eingestellt und die Proben bei ungefähr 5°C stehengelassen.

Nach ungefähr 20 Stunden langem Stehen wurde die Aktivitätsänderung bestimmt Ferner wurden 5 ml dieser Proben auf das lOfache mit 0,1m Acetatpuffer, pH 6,0, verdünnt und anschließend 5 ml der verdünnten Proben 15 Minuten auf 60⁰C erwärmt Die Restaktivität wurde bestimmt Eine nicht behandelte Probe wurde als Blindprobe durchgeführt

Die Versuchsparameter und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

ίο

Zugegebenes NaCl	Zugegebenes 2.25 m NaOCl	Änderung der Gesamtaktivität	Restaktivität nach der Wärmebe handlung	Ty₂ (min) 15 min bei 60⁰C, pH 6,0	Verringerung der therm. Stabilität
, % )	ml)	(%)	(%)		(⁰C)
O (	)	_	98	_	_
O		-4,2	31	8,9	9
5		+7,8	32	9,1	8
10		+4,0	40	11,3	8
15		+6,8	46	13,4	8
20		+2,4	51	15,4	8

Beispiel 5

Es wurden 10 Versuchsreihen durchgeführt bei unterschiedlichen pH-Werten, nämlich 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 2ü 6.0, 7,0,8,0,9,0,10,0 und 11,0. Jede Reihe bestand aus drei Proben, die hergestellt worden waren durch Verdünnen von jeweils 12,5 ml Rennilase 46 mit einem gleichen Volumen Wasser. Zu der ersten Probe jeder Reihe wurden 75 μΐ, zu der zweiten 150 μΙ und zu der dritten 300 μΐ handelsübliche 2,25m Natriumhypochloritlösung gegeben, entsprechend (ungefähr) 4, 8, bzw. 16 g Natriumhypochlorit auf 100 g Gesamtprotein in der Probe. Der pH-Wert der 10 Reihen wurde konstant auf den angegebenen Werten gehalten. Die Reaktionstem-

peratur war für alle Proben gleich (ungefähr 5°C).

Nach einer Reaktionszeit von ungefähr 114, 66 bzw. 90 Stunden für die erste, zweite bzw. dritte Probe jeder Reihe wurden alle Proben auf 50 ml ergänzt. Proben zur Analyse wurden hergestellt durch entsprechende Verdünnung (ungefähr 1 :125), wobei der pH-Wert gleichzeitig mit Hilfe von Essigsäure/Natriumacetatlösung auf 6,0 eingestellt wurde.

Diese Proben wurden dann 30 Minuten auf 55°C erwärmt. Die Aktivitätsausbeute, Restaktivität nach der Wärmebehandlung berechnete Halbwertszeit und die Verringerung der thermischen Stabilität sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Anfangs-pH	Zugesetztes NaClO (μi/25 ml Probe)	End-pH-Wert	Aktivitätsaus beute (%)	Restaktivität (%)	T_m (min)	B Verringerung % der therm. \| Stabilität a (°c) I
2,5	75	2,52	93,0	77,3	80,8	6 §
	150	2,75	80,5	71,6	62,2	7 i
	300	2,50	16,2	40,7	23,1	⁹ I
3	75	3,00	101,3	76,9	79,2	6 I
	150	3,15	97,6	60,5	41,4	8 1
	300	3,00	32,4	70,0	22,7	9 i
4	75	3,96	106,1	71,8	62,8	7 i
	150	4,05	102,4	64,2	46,9
	300	3,94	69,8	41,3	23,5	9
5	75	4,95	104,4	74,5	70,6	7
	150	4,99	99,4	62,2	43,8	⁸ 1
	300	4,80	71,1	45,1	26,1	10 f
6	75	5,86	101,7	59,4	39,9	8 !
	150	5,98	94,8	40,8	23,2	O * ^y ί
	300	5,66	61,5	8,6	8,48	11 \
7	75	6,61	96,3	39,5	22,4	9
	150	6,64	90,2	7,1	7,86	11 ]
	300	6,51	49,2	4,0	6,46	¹¹ I
8	75	7,40	94,3	48,3	28,6	8 \
	150	7,26	87,1	6,4	7,57	Ii 1
	300	_	_	—	—

Fortsetzung

Anfangs-pH

Zugesetztes NaClO (μ 1/25 ml Probe)

End-pH-Wert

Aktivitätsausbeute Restaktivität

T_u2 (min)

Verringerung
der therm.
Stabilität

(⁰C)

10

75
150
300

8,02

7,79 7,34

8,34 8,23 7,83

11 75 10,34

150 10,02

300 9,80 *) 10 min Wärmebehandlung.

90,4

77,7 47,3

81,2 68,5 44,4

57,2

42,2

9,9 68,2
17,5
9,3*)

78,6
34,0
9,3*)

93,5
74,4

54,3
11,9
2,92*)

86,4
19,3
2,92*)

30,9
70,3

10
13

13

4
7

Diese Werte zeigen, daß die folgenden Bedingungen für die DeStabilisierung mit Natriumhypochlorit optimal 2^r, sind:

pH-Bereich6bis8.

Mende an Natriumhypochlorit: 150 μΐ einer 2,55m Lösung pro Probe, entsprechend (ungefähr) 8 g Natriumhypochlorit pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 6

Es wurden zwei Proben hergestellt durch Vermischen von 25 mi Rennilase 46 mit 20 g Eiswasser und der pH-Wert mit Hilfe von 4 η NaOH auf 7,0 eingestellt. Zu diesen beiden Proben wurden 33 bzw. 66 mg N-Chlorsuccinimid, jeweils in 5 ml Eiswasser, zugegeben, wobei der pH-Wert gleichzeitig auf 7,0 eingestellt wurde.

Zwei Stunden später wurden 0,2 ml der Proben mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei gleichzeitig der pH-Wert mit Hilfe von Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt wurde.

Die Restaktivität nach der Umsetzung von Rennin mit N-Chlorsuccinimid betrug:

Zugesetztes N-Chlorsuccinimid (%) Restaktivität (%)

33
66

99,0 96,5

50

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurde eine Wärmebehandlung 30 Minuten bei 55°C, pH 6,0, durchgeführt. Anschließend wurde die Restaktivität bestimmt und die Halbwertszeit und die Verringerung der thermischen Stabilität berechnet

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Zugesetztes	Restaktivität	Τι α (min)	Verringerung
N-Chlor	(%), 30 min	30 min	der therm.
succinimid	bei 55°C,	bei 55°C,	Stabilität
	pH 6,0	pH 6,0
(mg)			(⁰C)
33	41,5	23,6	10
66	26.4	15,6	10

55

60

65

Beispiel 7

Eine ungefähr 2m Lösung von NaOBr wurde hergestellt durch Zutropfen von 3 g Br2 zu 10 ml 4 η NaOH unter Rühren und Kühlen im Eis-Wasser-Bad.

25 ml Rennilase 46 wurden mit 25 ml Wasser vermischt und der pH-Wert mit 1 η NaOH auf 7,5 eingestellt. Zu 25 ml dieser Lösung wurden 0,5 ml der wie oben hergestellten Natriumhypobromit-Lösung in ungefähr 1 Stunde zugegeben, wobei der pH-Wert zwischen 7,3 und 7,8 gehalten wurde durch Zugabe von 1 η HCl.

Ungefähr 30 Minuten später wurde der Aktivitätsverlust und die Thermostabilität bestimmt. Es zeigte sich, daß der Aktivitätsverlust ungefähr 20% betrug und die Restaktivität nach 20 Minuten langer Behandlung bei pH 6,0 und 6O⁰C 14% betrug, entsprechend einer Halbwertszeit von ungefähr 7 Minuten oder einer Verringerung der thermischen Stabilität von ungefähr 8⁰C.

Beispiele

50 ml Rennilase 46 wurden mit 50 ml Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde im Eisbad gekühlt und der pH-Wert mit 1 η NaOH auf 7,0 eingestellt. Dann wurden ungefähr 0,1 g freies Chlor eingeleitet, wodurch der pH-Wert auf ungefähr 3,8 sank und die Flüssigkeit trüb und heller wurde. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 10 Minuten stehen gelassen und dann 4 ml Im Na2SÖ₃ Lösung zugegeben, um überschüssiges Chior zu entfernen.

Vor und nach der Chlorzugabe wurden 0,2 ml Proben mit 50 ml Wasser verdünnt und der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt. Der bei der Reaktion zwischen Rennin und Chlor eintretende Aktivitätsverlust betrug 21%.

Nach 30 Minuten langer Behandlung des mit Chlor behandelten Rennins bei 55° C wurde eine Restaktivität von 63% gefunden. Das entspricht einer Halbwertszeit von ungefähr 45 Minuten oder einer Verringerung der thermischen Stabilität von ungefähr 8° C.

Beispiel 9

Es wurden 2 Proben durch Vermischen von 25 ml Rennilase 46 und 25 g Eiswasser hergestellt und der pH

mit 4 η NaOH auf 7,0 eingestellt. Zu diesen beiden Gemischen wurden 60 bzw. 120 mg Trichlorisocyanursäure gegeben und gleichzeitig der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Ungefähr 4 Stunden später wurden 0,2 ml der oben angegebenen Gemische mit 50 ml Wasser verdünnt und gleichzeitig der pH-Wert mit Natriumacetat/Essigsäure auf 6,0 eingestellt. Die so verdünnten Proben wurden 30 Minuten bei 55°C behandelt.

Die Aktivitätsausbeuten, die Restaktivitäten nach der Wärmebehandlung und die berechneten Halbwertszeiten und DeStabilisierungen gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

15

20

25

30

35

Zugesetzte	Aktivitäts	T_m (min)	Verringerung
Trichloriso	ausbeute	30 min	der therm.
cyanursäure		bei 55°C,	Stabilität
		pH 6,0
(mg)	(%)		(⁰C)

93,0
81,5

35
16

9
10

Beispiel 10

Es wurden zwei Anteile von je 25 ml Rennilase 46 mit je 20 g Eiswasser verdünnt und der pH-Wert mit 4 η NaOH auf 7,0 eingestellt. Dann wurden 70 bzw. 140 mg Chloramin-T in 5 ml Eiswasser zu den beiden Proben gegeben und gleichzeitig der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Ungefähr 2 Stunden später wurden 0,2 ml der oben angegebenen Proben mit 50 ml Wasser verdünnt, wobei der pH-Wert gleichzeitig mit Natriumacetat/Essigsäure

auf 6,0 eingestellt wurde. Die so erhaltenen Proben wurden 30 Minuten auf 55°C erwärmt. Die Aktivitätsausbeuten und Restaktivitäten nach der Wärmebehandlung, berechneten Halbwertszeiten und die Verringerungen der thermischen Stabilität gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Zugesetztes	Aktivitäts	T_u2 (min)	Verringerung
Chloramin-T	ausbeute	30 min	der therm.
		bei 55°C,	Stabilität
		pH 6,0
(mg)	(%)		(⁰C)

96,5

77,9

19,2
8,5

Beispiel 11

10 12

Der pH-Wert von 25 ml Rennilase 46 wurde mit 1 η NaOH auf 10,0 eingestellt. .

Das Gemisch wurde in Eiswasser gekühlt und einzelne Anteile von 2 ml einer Lösung, enthaltend 0,05m J2 in 0,25m KJ, wurden zu der oben angegebenen Rennilaselösung gegeben, wobei gleichzeitig der pH-Wert mit 1 η NaOH nach jeder Zugabe von 2 ml des Jodreagenzes auf 10 eingestellt wurde. Es wurde eine Vergleichsprobe entnommen sowie eine Probe von 0,5 ml vor jeder neuen Zugabe von 2 ml Jodreagenz. ·

Zu Analysezwecken wurden die 0,5 ml Proben verdünnt und der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt. Dann wurden die Proben 30 Minuten auf 60° C erwärmt.

Die Versuchsergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

Zugesetzte
Lösung von
J₂ in KJ

(ml)

Aktivitätsausbeute

Restaktivität 60°C, 30 min Γι/2 (min)
30 min, 6O⁰C
pH 6,0

Verringerung der therm. Stabilität

(⁰C)

0
2
4
6
8
10

100
100
96
91
76
63

Beispiel 12

88 88 90 88 85 71

zugesetztes NaC! wurde auf das dreifache verdünnt 20 ml der so verdünnten Rennilase 46 wurden auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und auf 0⁰C gekühlt, woraufhin 0,7 ml einer Lösung von 0,05m J2 in 0,25m KJ zugegeben wurden. Ungefähr 15 Minuten später wurde der pH-Wert durch Zugabe von 0,1 m NaHSO3 auf 6 eingestellt

Für Analysezwecke wurde diese Probe verdünnt und gleichzeitig der pH-Wert mit Essigsäure/Natriumacetat auf 6,0 eingestellt Dann wurde die Probe 30 Minuten auf 60° C erwärmt

Die Aktivitätsausbeute betrug 42,6%.

Die Restaktivität nach der Wärmebehandlung betrug 35%.

Die berechnete Halbwertszeit bei 60°C und pH 6 betrug 20 Minuten.

163
163
197
163
128
61

0
0
0
0

1
3

Das entspricht einer Verringerung der thermischen

Stabilität Von ungefähr 5° C₁ da iific Vergicichspr«~>be die gleiche Halbwertszeit von ungefähr 20 Minuten bei 65° C zeigte.

Beispiel 13

3 g Protease von Mucor pusillus (Noury, 1 :220 000) wurden in 30 ml 10%iger NaCl Lösung gelöst und der pH-Wert bei 5 bis 10°C auf 6,5 eingestellt 3 mal 50 μΐ 15%ige NaOCl Lösung wurden in Intervallen von 30 Minuten zugegeben. Nach 3 Stunden langem Rühren wurde das Gemisch 16 Stunden bei 4° C stehen gelassen und der pH-Wert anschließend auf 5,0 eingestellt Es wurden Proben zur Bestimmung der Aktivität und Thermostabilität entnommen.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

	15	Aktiviiäts- ausueute	30 12 924	bei pH 6,0, 55 ⁰C	16	Verringerung der therm. Stabilität (⁰C)
Reaktionszeit der Probe		100 84-91 14	Halbwertszeit (min) 0-30 min bei 5O⁰C	18-31
Vergleich Beis	pie I	144-155 26- 22

In diesem Beispiel wurde anstelle von Rennilase 46 ein ähnliches Produkt verwendet, bei dem anstelle von 18% NaCI nur 6% NaCl zugesetzt worden waren.

1 Liter dieses Ausgangsmaterials wurde in 4 Proben von jeweils 250 ml aufgeteilt. Die Temperatur wurde auf 5 —1O⁰C gehalten und der pH-Wert von 3 Proben mit 4 η NaOH auf 6,5 eingestellt. Ferner wurden 1, 1,2 bzw. 1,4 Vol.-% einer Lösung von 13,5 Gew.-% NaOCl zu den

3 Proben gegeben und anschließend der pH-Wert mit

4 η NaOH auf 7,5 eingestellt und die Proben bei ungefähr 5° C inkubiert

Nach einer Reaktionszeit von 3, 27 bzw. 53 Stunden wurden 50 ml der mit Hypochlorit behandelten Proben entnommen und zu jeder dieser 50-ml-Proben 250 mg (0,5% Gew./Vol.) Aktivkohle gegeben. Am Tag nach der Zugabe der Aktivkohle wurden die Proben filtriert und auf die Stabilität und Renninaktivität untersucht (!.Bestimmung). Die Proben wurden 9 Tage nach Zugabe des Hypochlorits auf 5° C gehalten und anschließend erneut die Stabilität und Renninaktivität (Aktivitätsausbeute bzw. Endaktivität) bestimmt (2. Bestimmung). Nach weiteren 4 Tagen bei ungefähr 5°C und 2 Tagen bei ungefähr 25° C wurde die Renninaktivität erneut bestimmt und die Aktivitätsausbeute berechnet (3. Bestimmung).

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt, aus denen hervorgeht, daß keine deutliche Änderung der Destabilisierung oder Aktivitätsausbeute auftritt, wenn die Reaktionszeit von 3 auf 53 Stunden verlängert wird.

Tabelle 1

Zugesetztes

Hypo-

chlo.it

(VoI.-⁰/.)

Bestimmung

Verringerung der therm.Stabilität (⁰C)

Reaktionszeit

3 h 27 h

Tabelle 2

9,2
9,3
10,0
10,0
10,6
10,6

9,4
9,4
10,1
10,1
10,7
10,6

Zugesetztes
Hypochlorit

Bestimmung

Aktivitätsausbeute (%)

Reaktionszeit

3 h 27 h

1.

2.
3.

96
97
97

99
99

97 Zugesetztes Bestimllypomung

chlnrit

(VoI.-⁰/.)

Aktivitätsausbeute (%}

Reaktionszeit

3 h 27 h

1,2

1,4

90
94
92
89
92
91

'· eispiel 15

93 90 94 91 89 89

Fünf 25-ml-Proben von Rennilase 46 wurden einen pH-Wert von 2,2,5,3,3,5 bzw. 6,0 eingestellt.

Zu jeder dieser Proben wurden 0,04 g Natriumchlorit gegeben, wobei der pH-Wert jeweils konstant auf dem angegebenen Wert gehalten wurde.

Die Proben wurden 6 Tage bei 5° C stehen gelassen und anschließend die Restaktivität und die Thermostabilität bei 55° C und pH 6,0 untersucht.

Anfangs-pH	Restaktivität	Halbwertszeit	Verringerung
		(min) mach	der therm.
		30 min lan	Stabilität
		ger Wärme
		behandlung)
	(%)		(⁰C)

2,0 23 122 5,5

2,5 73 63 6,7

3,0 90 53 7,0

3,5 97 48 7,3

6,0 94 49 7,2

Beispiel 16

In diesem Beispiel wurde anstelle von Rennilase 46 ein ähnliches Enzymprodukt verwendet, das in zwei Punkten modifiziert war: 1. Die Kulturbrühe war auf eine Aktivität entsprechend einer Lösung von ungefähr 1,6% reinem Enzym konzentriert (im Gegensatz zu 1% reinem Enzym) und 2. waren zu dem Rohkonzentrat 9% NaCl (anstelle von 18% NaCl) zugesetzt worden.

Auf diese Weise wurden in einer Technikumsanlage 5952 kg modifizierte Rennilase 46 hergestellt.

Der pH-Wert wurde mit 34% NaOH bei 9°C auf 6,4

h'> eingestellt und 109 kg einer Lösung von 12,5Gew.-% NaOCl zugegeben. Während dieser Behandlung stieg der pH-Wert auf 8,0 und wurde mit 37%iger HCI auf 7,4 eingestellt.

308 116/307

Nach 18 Stunden bei 9 bis 5°C war der pH-Wert auf 6,9 gefallen. Dann wurde 1% Aktivkohle bei 4 bis 5⁰C zugegeben. 26 Stunden später wurde das Gemisch mit Hilfe einer Filterpresse filtriert und die Verringerung der thermischen Stabilität erneut gemessen. Schließlich wurde die überstehende Flüssigkeit unter vermindertem Druck bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,7 eingeengt und NaCl auf eine Gesamtmenge von 18% zugesetzt

Es zeigte sich, daß die Halbwertszeit des Endproduktes 11 Minuten betrug und die Verringerung der thermischen Stabilität 10⁰C.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Verringerung der thermischen Stabilität von mikrobiologischem Rennin bis zu einem Aktivitätsverlust von nicht mehr als 50%, dadurch gekennzeichnet, daß man das Rennin in einem wäßrigen Medium zwischen einem pH-Wert von 3 bis 10 mit einem Oxidationsmittel aus der Gruppe der halogenierten Verbindungen behandelt, wobei das Halogenatom eine Oxidationszahl von 0 bis 3 besitzt und in dem Reaktionsgemisch das Gewichtsverhältnis von Oxidationsmittel zu Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung zwischen 0,01 und 1 liegt

2. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Halogen Chlor ist.

3. Verfahren nach 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel eine halogenhaltige Verbindung einsetzt, wobei das Halogenatom eine Oxidationszahl von 0 oder 1 besitzt.

4. Verfahren nach 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel ein Hypochlorit einsetzt.

5. Verfahren nach 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gewichtsverhältnis in dem Reaktionsgemisch von Oxidationsmittel zu Gesamtmenge an Protein in der Enzymzubereitung zwischen 0,03 und 0,3 einsetzt.

6. Verfahren nach 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert zwischen 5 und 9 arbeitet.

7. Verfahren nach 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Medium bei einer Temperatur zwischen 0 und 30⁰C arbeitet.

8. Verwendung des nach Anspruch 1 bis 7 hergestellten Rennins zur Koagulation von Milch bei der Käseherstellung.