DE2515021C2 - Lipolytisches Enzymsystem, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung - Google Patents

Lipolytisches Enzymsystem, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

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DE2515021C2 DE2515021A DE2515021A DE2515021C2 DE 2515021 C2 DE2515021 C2 DE 2515021C2 DE 2515021 A DE2515021 A DE 2515021A DE 2515021 A DE2515021 A DE 2515021A DE 2515021 C2 DE2515021 C2 DE 2515021C2
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Description

25
Die Erfindung betrifft ein lipolytisches Enzymsystem, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur hydrolytischen Spaltung von Triglyceriden; sie ist durch die Patentansprüche 1 bis 3 definiert
Viele Arten von Nahrungsmitteln, besonders solche, die durch Fermentation hergestellt worden sind, enthalten enzymatisch hergestellte Geschmacksstoffe. Hei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Backwaren, Kaffeeweißmachern, Milchschokolade, Margarine und dergleichen, ist es wünschenswert, daß das Endprodukt einen milch- oder butterähnlichen Geschmack besitzt Bei bestimmten Käsearten und Käseprodukten, insbesondere bei den sogenannten Weichkäsesorten und stark schmeckenden Käsesorten, *o wie den italienischen Sorten, hängen die ausgeprägten Geschmacksnoten von verschiedenen Enzymsystemen ab, die während der Käseherstellung verwendet wurden.
Im Falle von fetthaltigen Nahrungsmitteln besteht die hauptsächliche enzymatische Wirkung in einer Lipolyse oder einer durch Enzyme katalysierten hydrolytischen Spaltung von Triglyceriden. Obwohl gleichzeitig mit der Lipolyse auch andere enzymatische Geschmacksstoffentwicklungen stattfinden können, bezieht sich die vorliegende Erfindung hauptsächlich auf die letztere Wirkungsweise.
Seit vielen Jahren hat eine spontane und nicht steuerbare Lipolyse der Nahrungsmittelindustrie Schwierigkeiten bereitet, da dadurch unerwünschte Geschmacksnoten oder eine starke Ranzigkeit entstehen können. In neuerer Zeit hat jedoch die Entwicklung einer gesteuerten Lipolyse zu vielen verbesserten Nahrungsmittelprodukten geführt. In der Molkereiindustrie ist es zum Beispiel üblich, Milchfette mit lipolytischen Enzymen zu behandeln, um einen ge- M wünschten Geschmack zu erzeugen. Das lipolytische Enzym wirkt auf die Triglyceride, um freie Fettsäuren zu erzeugen, die in einigen Fällen wiederum in andere Verbindungen, wie Ketone, umgewandelt werden können. Die Menge und Art der erzeugten Fettsäuren hängt von der Menge und Art des in dem Nahrungsmittelprodukt enthaltenen Fettes, der Menge und Art des üpolytischen Enzymprodukts und der Dauer und Temperatur der mit dem lipolytischen Enzym durchgeführten Behandlung ab. Weitere Einzelheiten über herkömmliche gesteuerte Upolyseverfahren können dem J, Amer, Oil Chem. Soc. 49,559—62 (1971) und den darin genannten Literaturstellen entnommen werden.
Es sind verschiedene lipolytische Enzyme bekannt, beispielsweise pankreatische Lipase, prägastrische Esterase, Milchlipase und Pilzlipase. Die Pilzlipasen werden zum Beispiel gemäß der US-Patentschrift 24 80 090 aus AspergUlus, gemäß der US-Patentschrift 32 62 863 aus Rhizopus und gemäß der US-Patentschrift 36 16 233 aus Mucor erhalten. Die Wirkung dieser Pilzlipasen hinsichtlich der Entwicklung von Ranzigkeit in Fetten wird in bezug auf AspergUlus in J. Gen. AppL Microbiol. 10, 13—22 (1964); in bezug auf Rhizopus in Agr. BioL Chem. 33, 729—38 (1969) und in bezug auf Mucor in AppL MicrobioL 16. 617—19 (1968) und 17, 606—10 (1969) beschrieben.
Die infolge der Knappheit an von Tieren gewonnenen lipolytischen Enzymen entwickelte Herstellung von lipolytischen Enzymsystemen von einer mikrobiologischen Quelle bietet den Vorteil von leichterer Verfügbarkeit und außerdem die Wahrscheinlichkeit, ein Produkt von größerer GIpichmäßigkeit durch gesteuerte Fermentation des Organismus zu erhalten. Nicht von allen mikrobiologischen lipolytischen Enzymen erhält man jedoch ein erwünschtes Geschmackverleihungssystem.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines lipolytischen Enzymsystems, das zur Geschmacks- und Aromaverbesserung von Triglyceridfetten und -fetthaltigen Nahrungsmitteln, insbesondere lipolysiertem Milchfett, verwendet werden kann.
Es wurde nun gefunden, daß von bestimmten Stämmen von Mucor miehei ein enzymatisches Geschmackverleihungssystem für Triglyceridfette von ausgezeichneter Qualität gewonnen werden kann. Dieses enzymatische Geschmackverleihungssystem wird hier durch das Verhältnis der Esterasewirksamkeit (EA) zur Lipasewirksamkeit (LA) oder als EA: LA näher charakterisiert
Die Esterasewirksamkeit ist die Wirksamkeit des Enzyms auf die wasserlöslichen Fette, nämlich auf diejenigen Fette, die eine Länge der Kohlenstoffketten von etwa 4 bis 10 Atomen haben. Dagegen ist die Lipasewirksamkeit die Wirksamkeit des Enzyms auf die wasserunlöslichen Fette, nämlich auf diejenigen Fette, die eine Länge der Kohlenstoffkette von etwa 12 und mehr, insbesondere von 12 bis 22, Atomen haben.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise gefunden, daß das lipolytische Enzymsystem, das von den im f atentanspruch 1 genannten Stämmen erhalten wird, im Gegensatz zu demjenigen von anderen Pilzen (Fungi) wie Aspergillus oder Rhizopus, die wünschenswerte Eigenschaft besitzt, eine größere Esterasewirksamkeit als Lipasewirksamkeit zu zeigen, und zwar in ähnlicher Weise wie die kommerziell verwendeten prägastrischen Esterasen vom Kalb, Zicklein und Lamm. Das heißt, es zeigt ein EA : LA-Verhältnis von mehr als 1. Zum Vergleich sei erwähnt, daß von Aspergillus und Rhizopus hergestellte lipolytische Systeme EA: LA= Verhältnisse von weniger als 1 aufweisen und deshalb für die erfindungsgemäßen Zwecke ungeeignet sind. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis EA : LA mehr als 2, und Verhältnisse von etwa 2 bis 10 sind für die erfindungsgemäßen Zwecke hervorragend geeignet.
Die Esterasewirksamkeit wird durch einen Test mit Tributyrin gemessen, während die Lipasewirksamkeit
durch einen Test auf einem Olivenölsubstrat ermittelt wird. Diese Tests werc^n wie folgt durchgeführt:
Esterase-Verfahren
Dieses Verfahren wird zur Bestimmung der Esterase, durch weiche Tributyrin hydrolysiert wird, verwendet Die Esterase wird mit einer Tributyrinlösung mit einem pH-Wert von 6 bei einer Temperatur von 37°C inkubiert Die Säure, die innerhalb von 10 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird auf einem pH-Wert von 8,7 titriert Die Ergebnisse zeigen ein praktisch lineares Verhältnis zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration innerhalb des empfohlenen Bereichs,
Lösungen
4, Liter aufgefüllt
Enzymlösungen.
1. Substratlösung.
13 g Gummiarabikum UJS.P. werden zu 114 ml einer 0,05-m Natriumacetatlösung (6,8 g NaC2H3O2 · 3 HjO zu 11) gegeben, dann werden etwa 50 mg Thymol dazugegeben und 25 Minuten gerührt, um alles zu lösen. Zu der gepufferten Gummilösung werden 22,7 g Tributyrin (75 mMol) gegeben und das Ganze 5 Minuten lang in einer Waring-Mischvorrichtung emulgiert Dann wird die Emulsion mit 0,5 n-NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt Es werden weniger als 1 ml an Alkali benötigt Die Lösung kann wenigstens 3 Tage lang verwendet werden, wenn sie in einem Kühlschrank aufbewahrt wird. Sie soll jeweils vor Gebrauch gut geschüttelt und der pH-Wert gegebenenfalls erbeut auf 6,0 eingestellt werden.
Für die enzymfreie Vergleidislösu^g (siene unten) wird eine Lösung von 13 g Gummiarabikum in 114 ml 0,05-m Natriumacetat verwendet Die Gummi/Acetatlösung wird auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt wozu 3 bis 4 ml 0,1 n-NaOH benötigt werden.
2. 0,02 n-NaOH.
3. Acetatpuffer, pH-Wert 53 bis 6,2,0,05 m.
6,8 g Natriumacetat · 3 H2O werden in etwa 500 ml Wasser gelöst, dann wird 1 ml 1 n-HCl dazugegeben und das Ganze mit destilliertem Wasser auf 1 Alle Lösungen und Verdünnungen werden mit Acetatpuffer (siehe Nr. 3 oben) zubereitet Die benötigten Konzentrationen sind unten unter »Bereich« beschrieben.
10 Verfahren
Die Substratlösung wird geschüttelt und dann werden 50,0 ml in einen 125-ml-Erlenraeyer-Kolben getropft Nun werden 10 ml Enzymlösung dazugegeben, das Ganze schnell gemischt und eine Probe von 10,0 ml entnommen, die in 40 ml Wasser gegeben und sofort mit
is 0,02Ti-NaOH auf einen pH-Wert von 8,7 titriert wird, Sofort nach Entfernen der Probe wird die restliche Mischung in ein Bad, das eine Temperatur von 37° hat gegeben (dies wird als Zeitpunkt Null betrachtet), wo sie 40 Minuten lang unter ständigem Rühren (mit einem eingetauchten magnetischen Rührer) gehalten wird. Nach genau 40 Minuten ab dem Zeitpunkt Null wird eine weitere Probe von 10 ml entfernt in 40 ml Wasser gegeben und auf einen pH-Wert von 8,7 titriert Der Unterschied zwischen den zwei Titrationen drückt den Grad aus, in welchem das Tributyrin durch das Enzym hydrolysiert worden ist
Vergleicfcslösungen
Ein Nullsubstrat ist nicht notwendig, aber bei rohen Enzymzusammensetzungen kann eine NuUenzymzusammensetzung notwendig sein. Es wird, wie oben beschrieben, vorgegangen, jedoch wird die eingestellte Gummiarabikum-Lösung ohne Tributyrin anstelle der regulären Substratlösung verwendet Das Hauptergebnis wird korrigiert, indem die bei der Vergleichslösung festgestellte Titrationserhöhung abgezogen wird.
Einheiten
Eine Esteraseeinheit erzeugt unter den Versuchsbedingungen 1 Säuremikroäquivalent pro Minuie.
Die Esterasewirksamkeit (EA) ergibt sich aus der Anzahl der Einheiten pro Gramm der Zusammensetzung.
Berechnung
EA =
ml NaOH x η NaOH X 1000 X ml aufgeschlossene Mischung Minuten x g Zusammensetzung in aufgeschl. Misch. X ml Probe
worin ml NaOH die Titrationserhöhung bei einer Probe von 10 ml und nNaOH die Normalität des für die Titrierung verwendeten NaOH bedeutet.
.. c . ml NaOH Χ 0,02 Χ 1000 X 60
Also: EA = — — ■
40Xg Zusammensetzung X 10
EA
ml NaOH X 3
g Zusammensetzung in aufgeschlossener Mischung
Bereich
Die Probenverdünnung sollte so sein, daß man Das Voranschreiten der Tributyrinhydrolyse verläuft
Titrationserhöhungen zwischen 0,5 und 1,5 ml erhält. 65 linear mit der Zeit, und es ist möglich, Versuche mit Nötigenfalls sollten Wiederholungsversuche durchgeführt werden, um Ergebnisse innerhalb dieses Bereichs
zu erhalten.
kürzeren als mit 40-Minuten-AufschluBzeiten durchzuführen. Die Gleichung (3) muß dann natürlich dem entsprechenden Zeitfaktor angepaßt werden.
Lipaseverfahren
Dieses Verfahren wird verwendet um die Lipase zu bestimmen, durch welche Olivenöl hydrolysiert wird. Die Lipase wird mit einer Olivenölemulsion, die einen pH-Wert von 6,5 hat bei 300C inkubiert Die Säure, die im Verlauf von 5 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird auf einen pH-Wert von 8,0 titriert Die Ergebnisse zeigen ein praktisch lineares Verhältnis zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der En- in zymkonzentration innerhalb des empfohlenen Bereichs.
Chemikalien
1. OlivenöLUÄP.
2. Von Lanolin herrührende freie Sterine
3. Natriumbarbital, N.F.
4. Gummiarabikum, U.S.P.
5. Natriumacetat - 3 H2O1CP.
6. Natriumchlorid, C.P.
7. 0,Sn-NaOH
8. 0,02IU-NaOH
9. 0,1 n-HCI
10. Äthylalkohol (der denaturierte Äthylalkohol Nr. 23Aist geeignet)
Geräte und Vorrichtungen -1
»Waringw-Mischvorrichtung.
2 magnetische Rührer, von denen einer zum Eintauchen in das Wasserbad geeignet ist pH-Messer für Titrationen, ausgestattet mit einer kleinen Kombinationselektrode.
Mikrobürette, 10 ml, mit 0,02-ml-Unterteilurgen mit einer Spritzen-Nadel, 38,1 mm.
L
2.
4.
Lösungen
35
2.
Substratemulsion
30 g Gummiarabikum und 270 ml destilliertes Wasser werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur magnetisch gerührt Gegebenenfalls anwesende Klumpen werden mit einem Glasstab ao zerkleinert Die Mischung wird auf 5" C abgekühlt. Dann werden 6 g Amerchol in ein 400-ml-Becherglas gegeben, 72 g Olivenöl und 222 g der gekühlten Gummiarabikum-Lösung dazugegeben, und die Mischung mit einem Glasstab gerührt und π in eine »Waringw-Mischvc.-richtung gegossen. Sie wird 5 Minuten lang gemischt dann wird der pH-Wert mit 0,5 n-NaOH auf 63 eingestellt, die Mischung auf 5° C abgekühlt und nochmals 7 Minuten lang gemischt Die Temperatur kann auf vi höchstens 47°C und der pH-Wert auf 6,5 angestiegen sein. Falls dies nicht der Fall ist, wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt Die Emulsion ist für wenigstens 8 Tage beständig, falls sie in einem Kühlschrank aufbewahrt wird. Es sollte vermieden v> werden, daß die Temperatur auf unter 1 ° C absinkt. Puffer.
a) Grundlösung. 9,7 g Natriumacetat ■ 3 H2O und 14,7 g Natriumbarbital werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 500 ml aufgefüllt. Diese mi Lösung hat die folgenden Werte: 0,14 n-Bärbital, 0,14 η-Acetat, pH-Wert 9,9. Sie wird im Kühlschrank aufbewahrt.
Arbeitslösung. 40 ml der Grundlösung, 16 ml 8,5%ige NaCI-Lösung und 53 ml 0,1 n-HCI ■. werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 200 ml aufgefüllt Der pH-Wert beträgt 6,5. Für geringfügige Einstellungen des pH-Werts
b)
werden 0,1 n-HC| oder 0,1 n-NaOH verwendet Die Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt Falls sich während der Lagerung Kristalle bilden, wird die Lösung verworfen,
3. Enzymlösungen.
Für Versuche mit Feststoffzusammensetzungen wird zunächst eine Grundlösung hergestellt ind/?.m die Probe in einer geeigneten Menge Wasser etwa 30 Minuten lang magnetisch gerührt wird, bevor die endgültige verdünnte Lösung durch weitere Verdünnung mit Wasser zubereitet wird. Die Grundlösung ist bei 5°C mehrere Stunden lang beständig; dagegen sollte die stark verdünnte endgültige Lösung innerhalb von 5 Minuten verwendet werden. Bei Versuchen mit unbekannten Zusammensetzungen ist es notwendig, den geeigneten Verdünnungsgrad durch Versuche zu ermitteln. Zusammensetzungen, deren Wirksamkeit in etwa bekannt ist sollten auf etwa 1 bis 3,6 Lipaseeinheitfcn/ml verdünnt werden. Der Begriff »Lipaseeinheiten« ist nachfolgend definiert.
Verfahren
Emulsion und Puffer werden in einem Gewichtsverhältnis von 3:1 vorgemischt um ein Substrat zu ergeben. Substratmengen von 8,0 ml werden in 100-ml-Bechergläser gegeben, die mit magnetischen Rührstäben ausgestattet sind. Die Substratlösung wird magnetisch gerührt Jede das Substrat enthaltende Probe wird zweimal (Nullprobe und Probe) wie folgt behandelt:
Nullprobe:
1. Es werden 40 ml Äthylalkohol zugegeben.
2. Es werden 2,0 ml einer Probe der Enzymlösung zugegeben.
Probe:
1. Das Substrat wird in einem Wasserbad von 300C equilibriert
2. Es werden 2,0 ml einer Probe der Enzymlösung zügegeben.
3. Das Substrat wird 5 Minuten lang bei 300C inkubiert
4. Es werden 40 ml Äthylalkohol zugegeben.
Sowohl die Nullprobe als auch die Probe werden mit 0,02 n-NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt
Berechnungen
1 Lipaseeinheit (LU) = die Lipasemenge, die für 1 Mikromol H' /Minute notwendig ist.
L.ipasewirksamkeit (LA) = Anzahl an LU/Gramm der Zusammensetzung.
LA = ml NaOH xn-NaOH χ lOVmg zugegebene Enzymzusammensetzung χ ΙΟ-3 χ Minuten.
Wenn 0,02 η NaOH und eine Reaktionszeit von 5 Minuten verwendet werden, ist die Lipasewirksamkeit (LA) = ml NaOH x4000/mg Enzym.
Die Abküi'z"ngen haben die folgende Bedeutung:
U.S.P. = United States Pharmacopoeia
N.F. = National Formulary
CP. = chemisch rein
Du- Herstel'ung des gewünschten iipolyüschen Enzymgeschmackgebungssystems kann nach jedem herkömmlichen Fermentationsverfahren, gefolgt von geeigneten Gewinnungsverfahren, durchgeführt wer-
den. Beispielsweise kann ein Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenmineralstoffe enthält, mit einer Kultur eines erfindungsgemäß einsetzbaren Stammes inkubiert und dann bei einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer Temperatur von 20 bis 500C 2 bis 14 Tage lang unter aeroben Bedingungen, von Flüssigkeit bedeckt, fermentiert werden. Stämme des Mucor miehei, die auf diese Weise fermentiert werden können, um das gewünschte Enzymgeschmack -gebungssystem herzustellen, sind unter den Bezeichnun- in gen NRRLA 13.131 und A 13.042 bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, für die Öffentlichkeit ohne Beschränkungen erhältlich.
Nach bisheriger Praxis wurden die Esterasen und Lipasen bei der Gewinnung des gewünschten Labpro- 1 "· dukts entweder entfernt oder inaktiviert, wie es beispielsweise in den US-Patentschriften 36 16 233 und 37 63 011, der OLS 22 32 996 und der britischen Patentschrift !2 07 892 beschrieben wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das gewünschte Enzymgeschmackgebungssystem durch Abtrennen von der Fermentationsmaische gewonnen, um ein geeignetes EA : LA-Verhältnis zu erhalten. Dieses Abtrennen kann durch Filtrieren der Maische bei einem niedrigen pH-Wert von 4—5, durch Extrahieren des Filterkuchens bei einem hohen pH-Wert von 10—12, durch Ansäuern des Extrakts auf einen pH-Wert von 7 und anschließendes Gewinnen durch Filtrieren oder Konzentrieren des angesäuerten Extrakts durch Abdampfen oder Ultrafiltrieren und schließlich Trock- ;» nen des Konzentrats, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder dergleichen, durchgeführt werden.
Für bestimmte Verwendungszwecke ist es wünschenswert, ein lipolytisches Enzymsystem zu verwenden, das praktisch frei von einer Labe/izymWirksamkeit r, ist Dies kann erreicht werden, indem das oben beschriebene Gewinnungsverfahren oder andere Reinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angewendet werden.
Das gewonnene lipolytische Enzymgeschmackge- »o bungssystem kann Milch, Milchfett, Butteröl, Käse, Milchschokolade, Margarineöl, Kaffeweißmachern und anderen Triglyceridfett-haltigen Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelkomponenten zugegeben und bei Temperaturen von etwa 10 bis 5O0C während einer Dauer »'· von etwa 2 Stunden bis 20 Tagen inkubiert werden, um erwünschte milch- und butterähnliche Geschmacksnoten zu erhalten. Es kann auch zur Beschleunigung oder Intensivierung des in diesen Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelkomponenten natürlich entwickelten ■■ GeschmacKS verwendet und mit bekannten Geschmacksentwicklungsmitteln gemischt werden, um eine Vielfalt an Geschmacksrichtungen zu erhalten. Beispielsweise kann es mit prägastrischen Esteraseenzymzusammensetzungen gemäß der US-Patentschrift 25 3! 329 gemischt oder zusammen mit den aus Penicillium roquefort! gewonnenen Geschmackgebungszusammensetzungen gemäß der US-Patentschrift 51 00 153 verwendet werden. Im allgemeinen wird das gewonnene lipolytische Enzym in Mengen von etwa 0,001 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Triglyceridfetthaltige Substrat, und im FaO von Milch voreise in Mengen von etwa 3,5 bis 56,7 g pro 453,59 kg Milch zugegeben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Herstellung von Käse das lipolytische Enzymsystem in emer Menge von etwa 0,01 bis 0,1 Gew.-% zugegeben. Wird als Nahrungsmittelkomponente Butteröl verwendet, so beträgt die zugegebene Menge an dem Enzymsystem vorzugsweise etwa 0,005 bis 0,05 Gew.-% (bezogen auf das Butterfett) und die Inkubationsbehandlung wird bevorzugt bei etwa 22 bis 370C während einer Dauer von etwa 1 bis 3 Tagen durchgeführt. Bei Verwendung von Vollmilchpulver beträgt die zugegebene Menge an dem lipolytischen Enzym etwa 0,001 bis 0,01 Gew.-% (bezogen auf die Vollmilchfett-Feststoffe) und die Inkubierung findet vorzugsweise bei etwa 22 bis 33° C während einer Dauer von etwa 4 bis 8 Stunden statt.
Beispiele für Triglycendfette, die mit dem erfindungsgemäßen lipolytischen Enzymgeschmackgebungssystem behandelt werden können, sind tierische Fette, wie Milchfett, Schweinefett und Talg, sowie pflanzliche Fette, wie Leinöl, Sojaöl, Maisöl, Erdnußöl, Safranöl, Palmöl, Kokosöl und Margarine- und Backölmischun-
für
cnrtAn ff'ir
gemäße lipolytische Enzymgeschmackgebungssystem zur Entwicklung eines gewünschten Geschmacks verwendet werden kann, sind: Provolone, Romano, Feta, Pizza, Mozzarella, Cheddar, Schweizerkäse, Blauschimmelkäse, Parmesan, Colby, Gouda und Edamer.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Mucor-miehei-Schimmelpilz NRRL 13.042 wird unter aseptischen Bedingungen von einer Agar-Fläche entfernt und in einen l-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 200 ml des folgenden Mediums enthält:
Sojamehl 1,5%
getrocknete Molke 3,0%
enzymatisch aufgeschlossene
Maisstärke 12,0%
Wasser 83,5%
insgesamt 100.0%
Der Kolben wird 114 Stunden lang bei 37° C auf einer Drehschüttelvorrichtung inkubiert wobei von einem pH-Wert von etwa 6 ausgegangen wird. Das gewünschte lipolytische Enzymsystem wird wie folgt gewonnen: Die Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und dann filtriert Das Filtrat wird mit einer verdünnten NaOH-Lösung, die einen pH-Wert von 10—11 aufweist extrahiert, und der Extrakt wird auf einen pH-Wert von 7 angesäuert Der angesäuerte Extrakt wird dann in einem Gewinnungsansatz (A; filtriert und zu einem Konzentrat mit einem EA-Wert von 253 und einem EA: LA-Verhältnis von 2,6 eingedampft und anschließend in einem weiteren Gewinnungsansatz (B) nochmals filtriert, eingedampft und zu einem Feststoff mit einem EA: LA-Verhältnis von 3,5 sprühgetrocknet
Das von Mucor miehei hergestellte lipolytische Enzym, das in dem oben beschriebenen Gewinnungsverfahren A mit dem angegebenen EA: LA-Verhältnis von 2,6 erhalten worden ist, wird zur Entwicklung eines gewünschten Käsegeschmacks verwendet, und zwar wie folgt:
454 g-schwere Proben von Cheddar-Käse (Current A) (2—4 Wochen alter Käse mit einem leeren Geschmack) werden mit einer elektrischen Mühle gemahlen, und das lipolytische Enzym wird damit gemischt, bis es gleichmäßig in einem Verhältnis von 440 mg pro 454 g
Käse verteilt ist. Die Enzym-Käse-Mischungen werden dann in sterile Kunststoff-Petrischalen gefüllt. Die Schalen werden in einen anaeroben Behälter gegeben, um ein Schimmelwachstum zu verhindern, und mehrere Proben werden 4 Tage lang bei 20° C inkubiert, während andere Proben 11 Tage lang bei 20° C inkubiert werden. Nach den genannten Inkubationszeiten wurde der Käse auf «eine organoleptischen Eigenschaften untersucht, und pis wurde gefunden, daß er ein sauberes Geschmacksprofil hatte, das demjenigen, das man mit der ι ο im Handel erhältlichen prägastrischen Esterase erhält, die in der gleichen Weise getestet wurde, glich. Beide Käsesorten entwickelten eine erwünschte leichte bis mittlere Ranzigkeit. Zu Vergleichszwecken wurde eine Esterasezusammensetzung verwendet, die von der Schimmelpilzart Aspergillus flavus erhalten worden war, und es wurde gefunden, daß sie ein EA : L.A-Verhältnis von 0,08 aufwies und in dem oben beschriebenen Versuch ein unerwünschtes strenges Geschmacksprofil, das an Buttersäure, Kapronsäure und Kaprinsäure erinnerte, hervorrief und einen leichten metallischen Nachgeschmack erzeugte.
Beispiel 2
Mucor miehei NRRL 13.042 wurde zur Herstellung eines lipolytischen Enzymsystems gemäß Beispiel 1 verwendet, wobei die Fermentation jedoch in einem Herstellungstank durchgeführt wurde, der mit einem wäßrigen Nährmedium gefüllt war, welches 16% Maisstärke, die mit bakterieller «-Amylase verflüssigt jo war, 4% entfettetes Sojamehl und 2% sprühgetrocknete sülle Molke enthielt. Beim Gewinnen nach 77 Stunden Fermentation wurden in der Maische die folgenden EA- und LA-Werte gefunden.
J5
EA = 24,9
LA = 2,8
EA : LA = 8,9.
Das lipolytische Enzymprodukt wurde gewonnen und ^ dazu verwendet, wie in Beispiel 1 einen wünschenswerten Käsegeschmack zu entwickeln, und man erhielt praktisch äquivalente, gute Ergebnisse.
Das in den folgenden Beispielen verwendete lipolytische Mucor-miehei-Enzym ist das gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellte Enzymsystem mit EA-Werten zwischen 10 und 100.
Beispiel 3
Ein von Mucor miehei gewonnenes Iipolytisches Enzym wird vor der Zugabe der Starterkultur in einer Menge von 3,5—56,7 g pro 453,69 kg Milch zu Käsemilch gegeben, um eine gesteuerte Lipolyse zu entwickeln und bei der Herstellung von italienischen Käsesorten, nämlich Asiago-Mozzarella, Provolone bzw. Romano, Geschmacksnoten von zart und butterartig bis pfefferartig und scharf-pikant zu erzeugen, wobei diejenigen Käsemilchmengen, die für die Herstellung von Romano und anderen scharf schmeckenden Käsesorten bestimmt waren, mit höheren Werten des ω lipolytischen Enzyms behandelt wurden.
Beispiel 4
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird vor Zugabe der Starterkultur in einer Menge von 3,5 bis 7 g pro 453,69 kg Milch zu Käsemilch gegeben, um eine gesteuerte Lipolyse zu entwickeln und eine größere Menge an kurzkettigen Fettsäuren im Verhältnis zu den langkettigen Fettsäuren zu erzeugen, die mit den Endprodukten der Sporen Penicilliurn roquefort! metabolisiert werden, um einen gewünschten Geschmack und den gewünschten Gehalt an Methylkctonen und CO2 in Blauschimmelkäse zu erhalten.
Beispiel 5
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird zu Cheddar, Colby, Romano, Schweizerkäse, Mozzarella, Blauschimmelkäse, Gouda, Edamer, Provolone und Parmesan in mazerierter Form gegeben, und zwar in Mengen von 0,01 bis 0,1 Gew.-% des gemahlenen Käses oder der Käsefeststoffe und teilweise zusammen mit anderen Enzymen, um durch das Enzym modifizierte Käsearten mit einem ausgeprägten Geschmack zu erhalten, die anstelle der bei der Herstellung von pasteurisierten Käsearten, käsehaltigen Nahrungsmitteln, Streichkäse, Streukäse, Käsegebäck, Käsesaucen, Käsetunken und Salatsaucen verwendeten Käsefeststoffe geeignet waren. Um eine Geschmacksbeständigkeit zu erhalten, wird das lipolytische Enzym in dem Enzym-modifizierten Käse durch eine Behandlung des Produkts bei 70°C von 15 Minuten Dauer bei einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert
Beispiel 6
Butter, die aus gebuttertem Rahm hergestellt und mit Wasser gewaschen worden ist, wird durch Erwärmen auf 39°C und Zentrifugieren, um das restliche Butterserum zu entfernen, in Butterschmalz umgewandelt Dieses Butterschmalz wird mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym in einer Menge von 0,005 bis 0,05 Gew.-% des Butterfettes in dem sterilisierten Butterschmalz behandelt Das mit dem lipolytischen Enzym behandelte Butterschmalz wird 1 bis 3 Tage lang bei 22° C bis 37° C inkubiert, um eine geeignete Geschmacksentwicklung zu erreichen, bevor das Enzym durch eine 15 Minuten dauernde Behandlung bei 70° C und einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert wird. Das mit dem lipolytischen Enzym behandelte Butterschmalz wird sowohl allein als auch zusammen mit anderen Geschmackssäuren, nämlich Essigsäure und Buttersäure, und/oder zusammen mit anderen Geschmacksstoffen, wie Diacetyl, als Geschmacksstoff und Strukturmittel in Butter, Margarine, Milchimitationsprodukten, milchschokoladeartigen Süßigkeiten und butterartigen Brotaufstrichen und -Saucen verwendet
Beispiel 7
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird zu der 200fachen Gewichtsmenge an sterilisierter Sahne mit einem Butterfettgehalt von 35% gegeben. Nachdem die Sahne mit Milchsäure oder einer Milchkultur auf einen Säure-pH-Wert eingestellt worden ist, wird die Mischung 4 Stunden lang bei 37° C gerührt. Die erhaltene Mischung wird einem herkömmlichen Butterherstellungsverfahren unterworfen, und man erhält Butter mit einem ausgezeichneten, verbesserten Geschmack.
Beispiel 8
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Erizym wird in einer Menge von 0,001 bis 0,01% einmal mit und einmal ohne anderes Enzymsystem zu einer wiederhergestellten Aufschlämmung von 9—14%igen Vonmflchfeststoffen gegeben, bevor eine Inkubation von 4—8 Stunden Dauer bei 22 bis 33° C erfolgt Die
gesteuerte Lipolyse wird wie in Beispiel 6 inaktiviert. Das durch das lipolytische Enzym modifizierte Vollmilchpulver wird verwendet, um Nahrungsmittelprodukten, wie Milchschokoladesüßigkeiten, Kaffeeweißmachern, Käseimitationen und Molkereiprodukten, einen milchartigen Geschmack zu verleihen.
Beispiel 9
Mit dem von Mncor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym modifizierte Käsefeststoffe, die gemäß Beispiel 5 ι ο hergestellt worden sind, werden in Mengen von 1,0 bis 10,0% der gesamten Zusammensetzung in Tiernahrungszusammensetzungen, nämlich Hundefutterzusammensetzungen, verwendet, um den Tierfutterzusammensetzungen einen nahrhaften, verbesserten Geschmack zu verleihen.
Beispiel 10
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird dazu verwendet, um wieder verwertbaren ™ Altkäse nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zu behandeln, worauf dann eine Hitzebehandlung bei 77°C von 15 Sekunden Dauer folgt, um den unerwünschten Schimmel und die Bakterien in dem Altkäse zu vernichten und das lipolytische Enzym in dem Produkt wirksam zu inaktivieren. Der mit dem lipolytischen Enzym behandelte Altkäsc ist für Tierfutterzusammensetzungen verwendbar.
Beispiel 11
30
Vollmilchpulver, das gemäß Beispiel 8 mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym behandelt (modifiziert) worden ist, wird in einer Menge von 5,0 bis 15,0% zur Herstellung eines verbesserten Kaffeeweißmachers mit einem volleren Geschmack verwendet.
Beispiel 12
Vollmilchpulver, das gemäß Beispiel 8 mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym behan- «o delt (modifiziert) worden ist, wird in einer Menge von 2,0 bis 10,0% zur Herstellung einer verbesserten imitierten sauren Sahne mit einem reicheren, volleren Geschmack verwendet.
Beispiel 13
Ein Blauschimmelkäse wird aus roher Milch hergestellt, die bei 32,2° C homogenisiert und mit Benzoylperoxyd gebleicht worden ist Die Milch wird auf 300C erhitzt und mit 1% eines Streptococcuslactis-Startermittels geimpft Nach einer kurzen Verweilzeit wird die Milch mit einem mikrobiologischen »Rennin«-Produkt von der Züchtung des Stamms Mucor miehei (NRRL A 13.042) in einer Menge von 85 g pro 453,69 kg Milch und mit J,54 bis 7,09 g des von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym1» pro 453,69 kg Milch geimpft. Die Mischung wird gerührt, bis ein Gerinnungsprodukt von ausreichender Festigkeit erhalten wird. Dieses wird dann mit Sporen von Peniccilin roquefort! geimpft, von der Molke abgetrennt und in Reifen gegeben. Der in den Reifen befindliche Käse wird gesalzen, indem er 3 Tage lang in Salzwasser getaucht wird, und dann in einen luftleeren Kunststoffbeutel verpackt. In den Käse werden überall kleine Löcher gemacht, um den Zugang von Luft zu ermöglichen und das Schimmelwachstum zu erleichtern. Dann läßt man den Käse reifen, indem man ihn 2 Monate lang bei 10°C und 90% Luftfeuchtigkeit in einem Reiferaum lagert, und man erhält einen Blauschimmelkäse von ausgezeichneter Qualität, der im Vergleich zu dem ohne die Zugabe des lipolytischen Enzyms hergestellten Käse einen verbesserten Geschmack aufweist.
R ρ i s η i e. I 14
Aus teilweise entrahmter Milch, die etwa 2% Fett enthält, wird ein Käse der Sorte Romano hergestellt. Die Milch wird auf 31,1 bis 32,2° C erwärmt, und es wird 1% an Kulturen, die zu gleichen Teilen aus Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus bestehen, dazugegeben. Dann wird in ausreichender Menge Lab zugegeben, um die Milch in 15—17 Minuten zu koagulieren (etwa 85 g pro 453,69 kg). Danach wird das aus Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym in einer Menge von 28,3 bis 56,7 g pro 453,69 kg Milch dazugegeben. Das ausgeflockte Gerinnungsprodukt wird mit Messern von 9,5 mm zerkleinert. Nach der Zerkleinerung wird das Produkt bei 46,7 bis 47,8° C 30 Minuten lang gehalten und dann von der Molke abgetrennt Der Käse wird in Reifen gegeben, gepreßt, in einem Gestell 2 bis 4 Tage getrocknet und dann auf einen Salzgehalt von 4—5% gesalzen. Dann läßt man den Käse bei 10 bis 15,6° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70% reifen und erhält einen Käse der Sorte Romano von ausgezeichneter Qualität, der gegenüber einem gleichen Käse, der ohne das erfindungsgemäße lipolytische Enzym hergestellt worden ist, einen verbesserten Geschmack aufweist.
Beispiel 15
Ein flüssiges Backfett gemäß der US-Patentschrift 28 15 286 und ein weiches Backfett gemäß der US-Patentschrift 2132 393 werden beide mit 1 bis 15Gew.-% des von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzyms bei 32,2° C 1 bis 24 Stunden lang inkubiert, um den gewünschten Geschmack zu entwikkeln, wonach das Enzym dann 15 Minuten lang bei 21,TC und bei einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert wird.

Claims (3)

Patentansprüche;
1. Lipolytisches Enzymsystem mit einem Verhältnis der Esterasewirksamkeit zur Ljpasewirksamkeit von mehr als 1 und erhältlich durch 2- bis Htägiges Züchten von Mucar miehei NRRL A 13.131 oder NRRL A 13.042 in einem flüssigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 3 bis 8 und einer Temperatur von 20 bis 500C, ι ο Filtrieren der Fermentationsbrühe bei einem pH-Wert von 4 bis 5, Extrahieren des Filterkuchens bei einem pH-Wert von 10 bis 12, Ansäuern des Extrakts auf pH 7, Filtrieren oder Konzentrieren des angesäuerten Extrakts durch Abdampfen oder is Ultrafiltrieren und Trocknen des Konzentrats.
2. Verfahren zur Herstellung des lipolytischen Enzymsystems gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die im Anspruch 1 genannten Maßnahmen.
3. Verwendung des lipolytischen Enzymsystems gemäß Anspruch 1 zur hydrolytischen Spaltung von Triglyceriden.
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