SE430560B - Forfarande for framstellning av ett enzymmodifierat helmjolkspulver - Google Patents

Description

'?9Q2358-6 2 emellertid utvecklingen av reglerad lipolys resulterat i manga förbättrade livsmedelsprodukter. Det tillhör således sedvanlig praxis inom mejeriindustrin att behandla mjölkfetter med li;olytiska enzymer för produktion av önskade aromer. Det lipolytiska enzymet inverkar på triglyceriderna under bildning av fria fettsyrcr, vilka i sin tur i vissa fall ytterligare kan överföras till andra före- ningar, såsom ketoner. Mängden och typen av producerade fettsyror är beroende a' mängden och typen av fettet i livsmedelsprodukten, mängden och typen av den lipolytiska enzymprodukten och tidrymden och tem- peraturen för behandling med det lipolytiska enzymet. Ytterligare detaljer beträffande konventionell, reglerad lipolys finner man i J. Amar. Oil Chem. Soc., gg (1971), 559-562, och däri angivna referen- ser.

Uppfinningen avser ett förbättrat förfarande för framställ- ning av ett enzymmodifierat helmjölkspulver, vilket närmare definie- ras i patentkravet, med hjälp av ett enzympreparat av Mucor míehei.

Olika lipolytiska enzymer är kända, såsom pankreatisk lipas, pregastrisk esteras, mjölklipas och fungal lipas. De fungala lipaserna erhålles exempelvis från Aspergillus (se exempelvis USl-patentskrif- ten 2.480.090), Rhizopus (USP 3.262.863) och Hucor (USP 3.6l6.233).

Effekten av dessa fungala lipaser avseende utveckling av härskenhet från Aspergillus beskrivas i J. Gen. ßppl. Hicrobiol., lg 13-22, från Rhizopus i Agr. Biol. Chem., åå (1969), 729-73 Hucor i Appl. Eicrobiol., lá (l968), 617-619, och ll (1969 , 606-610.

Typiska, i handeln tillgängliga, hittills använda esteraser och lipaser utgöres av pregastriska esteraser, såsom sådana so: erhålles från Dairyland Food Laboratory under beteckningarna "Italase“ och "Capalase"; den pankreatiska lipas som tillhandahållas av Feræco Laboratories under beteckningen "Fermlipase PL"; och den ftngala lipas som erhålles från Rohm à Haas under beteckningen "Lipaee B".

Pâ grund av bristen på från djur härrörande lipolyt~ enzymer är det lättare att erhålla sådana från mikrobiella källor och sannolikheten är därvid högre för att man skall erhålla en produkt fav en jämnare avalitet på grund av reglerad fermentation av organis- men. Icke alla mikrobiella lipolytiska enzymer ger emellertid ett fördelaktigt aromsystem. ' Det har nu visat sig att man kan erhålla ett enzymatisït "å I-'WQ- producerat :riglyceridfett av utomordentlig kvalitet från ' biella organismen Huoor miehei. Detta enz atiska system definie- ras häri i form av förhållandet mellan esterasaktivitet (El) och lipasaktivitet (LA), dvs. E&ÅLA. '7 02313943 l n' »I a 3 Esterasaktiviteten avser häri den aktivitet som enzymet har på Vattenlösliga fetter, nämligen fetter med en kolkedjelängd av ungefär 4-10. Lipasaktiviteten är omvänt den aktivitet som enzymet har på de vatten-olösliga fetterna, nämligen fetter med en kolkedje- längd av ungefär 12 och högre, särskilt 12-22.

I samband med uppfinningen har det helt oväntat visat sig att det lipolytiska system som produceras av vissa arter av släktet Hucor, särskilt Hucor miehei, i motsats till andra fungi, sasom Aspergillus och Rhizopus, har den önskvärda egenskapen att visa en högre esteras- än lipasaktivitet på ett liknande sätt som den av kommersiellt använda progastriska esterasen från kalv, ki1lin¿ och lamm. Detta innebär således ett EA/LA-förhållande högre än l. Vid jämförelse har det visat sig att med Aspergillus och Rhizopus pro- ducerade lipolytiska system har EA/IA-förhållanden som är lägre än l.

EA/LA-förhållandet är företrädesvis högre än 2 och förhållanden av ungefär 2-10 är i hög grad lämpliga enligt uppfinningen.

Esterasaktiviteten uppmätes företrädesvis medelst ett test på tributyrin, medan lipasaktiviteten lämpligen uppmätes medelst ett test på ett olivoljesubstrat. Dessa tester kan utföras pa följande sätt.

Esterasmetodæ.Denna metod användes för bestämning av den esteras som hydrolyserar tributyrin. Esteras inkuberas med en tributyrine lösning med pH 6 vid en temperatur av 37oC. Den under 10 minuter i reaktionsblandningen frigjorda syran titreras till pH 8,7. Resultatet återspeglar ett praktiskt taget linjärt samband mellan reaktions- hastighet och enzymkoncentration inom det rekommenderade intervallet.

Lösninaar: l. Substratlösning.

Sätt 13 g gummi arabikum (U.S.P.) till ll4 ml 0,05M'natrium- acetatlösning (6,8 g NaC2H3O2.3H2O till l liter), tillsätt därefter ungefär 50 mg tymol och omrör 25 minuter för upplösning. Satt 22,7 g tributyrin (75 mmol) till den buffrade gummilösningen och emulgera fem minuter i en "Waring Blender". Inställ emulsionen med O,5H NaOH på pH 6,0. Kindre än 1 ml alkali erfordras. Lösningen kan användas minst tre dagar vid förvaring i ett kylskåp. kaka omsorgsfullt före varje användning och install åter pH på 6,0, om så erfordras.

För "enzymblindprovet" (se "Kontroller"idet följande) använd en lösning av 13 g gummi arabikum i ll4 ml 0,05M natriumacetat. In- stall gummi/acetat-lösningen på pH 6,0, varvid 3-4 ml O,lH Naüñ er- fordras. 2. 0,02N Na0H. '_79@235.~'6 u. oc» 4 3. Acetatbuffert, pH 5,9-6,2, 0,05M.

Lös 6,8 g natriumacetat .3H20 i 500 ml vatten, tillsätt 1,0 ml lä HC1 och install volymen på 1 liter med destillerat vatten. 4. Enzymlösningar.

Bered samtliga lösningar och serieutspädningar med acetat- buffert (nr 3 ovan). De erforderliga koncentrationerna beskrivas under "Intervall i det följande.

Frocedur.

Skaka substratlösning och pipettera 50,0 ml i en 125 ml erlen~ meyerkolv. Tillsätt 10,0 ml enzymlösning, blanda hastigt och avlägsna en portion om 10,0 ml, som sättes till 40 ml vatten och titreras omedelbart med 0,02N Na0H till pH 8,7. Omedelbart efter elimineringen av nämnda portion placera den kvarvarande lösningen i ett bad med en temperatur av 3700 (vilken punkt betraktas såsom noll-tidpunkten), vari den upprätthålles 40 minuter under kontinuerlig omröring (ned- sänkt magnetisk omrörare). Avlägsna exakt 40 minuter efter no1l-tid- punkten en portion om 10,0 ml, nedför den i 40 ml vatten och titrera till pH 8,7. Skillnaden mellan de båda titreringarna uttrycker den grad i vilken tribyturinen hydrolyserats av enzymet.

Kontroller.

Ett substratblindprov behövs icke, men orena enzympreparat kan erfordra ett enzymblindprov. Fortsätt enligt ovan, men använd den pH-inställda gummi arabikum-lösningen utan tributyrin i stället för den vanliga substratlösningen. Korrigera huvudresultatet-genom att fråndraga den titerökning som observeras för kontrollen.

Enheter.

En esterasenhet ger under testbetingelserna en mikroekvivalent syra per minut.

Esterasaktiviteten (EA) är antalet enheter per gram preparat.

Beräkning. ml NaOH X N Na0H x 1000 x ml uppsluten blandning (1) EA - minuter X g preparat i uppsluten blandning x ml protion vari ml Na0H är titerökningen för en portion om 10 ml och N NaOH är normaliteten av den för titrering använda natriumhydroxiden. ml NaOH x 0,02 X 1000 x 60 (2) Således: EA = 40 x g preparat x 10 ° ml Na0H x 3 ,3) r-:A '~ g preparat i uppsluten blandning intervall.

Provutspädningen bör vara sådan att titern ökar mellan 0,5 och ïfïlüíWïfå-ö J 1,5 ml. Upprepade försök bör göras, om så erfordras, för att erhålla resultat inom detta intervall.

Förloppet av t*ibutyrinhydrolysen är linjär med tiden och det är möjligt att utföra analysen inom en tidrymd kortare än upp- slutningsperioder om 40 minuter. Ekvation (3) måste givetvis korri- geras med ifrågavarande tidsfaktor.

Lioasmetoden.

Denna metod användes för att bestämma den lipas som hydrcly- serar olivolja. Lipas inkuberas med en olivoljeemulsion vid pH 6,5 och 3000. Den syra som frigöres i reaktionsblandningen under fem minuter titreras till pH 8,0. Resultatet återspeglar ett praktiskt taget linjärt samband mellan reaktionshastighet och enzymkoncentra- tion inom det rekommenderade intervallet.

Kemikalier. l. Olivolja, U.S.P. 2. "Amerchol L-lOl" (från lanolin härledda, fria steroler), American Cholesterol Products, Edison, New Jersey. 3. Natriumbarbital, N.F. 4. Gummiarabikum, U.S.P.

. Natriumacetat .3H2O, C.P. 6. Natriumklorid, C.P. 7. 0,5 N Na0H. 8. 0,2N NQOH. 9. 0,lN H01.

. Etylalkohol (denaturerad No. 23A är lämplig).

Anordningar. 1. "Waring Blender". 2. Två magnetiska omrörare, varav den ena är lämplig att ned- sänkas i vattenbad (Model MS-7, Tri-R Instruments, Jamaica, tew York). 3. pH-mätare för titreringar, försedd med en liten kombinations- elektrod (såsom No. 4858-Ll5, A.H. Thomas). 4. Mikrobyrett, 10 ml med 0,02 ml delning (Kimble áVl7l07F med injektionsnai av Luer-typ eos, i-i/zfl).

Lösninear. 1. Substratemulsion.

Omrör magnetiskt 30 g gummi arabikum och 270 ml destillerat vatten under 30 minuter vid rumstemperatur. Bryt sände- :ven- tuella klumpar med en glasstav. Kyl till 500. Uppväg 6 g Amerchol i en 400 ml bägare, tillsätt 72 g olivolja och 222 g kyld gummi arabikum-lösning. Omrör med en glasstav och hall i Waring Blender. Omblanda fem minuter. Instüll på pH 6,3 med 0,5N NaOH, kyl till 500 och blanda åter sju minuter. Tempera- ?9f'27=š8-6 n N, 6 turen kan ha ökat till maximalt 4700 och pä till 6,5.

Om icke, install på pH 6,5. Emulsionen är beständig under minst åtta dagar vid förvaring i ett kylskåp. Temperaturen bör icke tillåtas falla under loC. 2. Buffert. a. Förrådslösning. Lös 9,7 g natriumacetat .3H20 och 14,7 g natriumbarbital med destillerat vatten till 500 ml. Denna lös- ning är O,l4N barbital och O,l4N acetat, pH 9,9. Förvara i kylskåp. b. Arbetslösning. Lös 40 ml förrådslösning, lö ml 8,5%-ig NaCl- lösning och 53 ml O,lN HCl med destillerat vatten till 200 ml, pH 6,5. För mindre korrigeringar använd O,lN HCl eller O,lH äaOH. Förvara i kylskåp. Bortkasta kristaller, om sådana bil- das under lagring. 3. Enzymlösningar.

För analys av fasta preparat bered en första förrádslösning genom att omröra provet magnetiskt i en lämplig mängd vatten under ungefär 30 minuter före framställningen av den slutliga lösningen genom ytterligare utspädning med vatten. Förràds- lösningen är beständig under flera timmar vid 500, men den i hög grad utspädda slutliga lösningen bör användas inom fem minuter. För analys av okända preparat är det nödvändigt att finna den lämpliga utspädningen genom försök. Preparat vilkas aktivitet är ungefär känd bör utspädas till l-3,6 lipasenheter/ ml. Uttrycket "lipas-enhet" definieras i det följande.

Procedur.

Emulsion och buffert blandas på förhand i viktförhållandet 3:1 för bildning av substratet. Portioner om 8,0 ml substrat nedföres i lOO ml bägare, innehållande magnetiska omröringsstavar. Omrör substratlösningen magnetiskt. Dubblera varje försök (blindprov och prov) på följande sätt: 7 Blindnrov. l. Tillsätt 40 ml etylalkohol. 2. ïilïsätt 2,0 ml prov av enzymlösningen. ïâlfl l. Jämviktsinställ substratet i ett vattenbad med en temperatur av 3000. 2. Tillsätt °,C ml prov från enzymlösningen. 3. Inkubera 5,0 minuter via 3o°c. 4. Tillsätt 40 ml etylalkohol.

Titrera både blindprov och prov med 0,02N NaOH till pH 8,0. f f.

Beräkningar. l lipasenhet (LU) = den mängd lipas som erfordras för att ge l mikromol H+/minut.

Lipasaktivitet (LA) = antalet LU/g preparat.

LA = ml NaOH x N NaÖH X lO3/mg tillsatt enzympreparat x 1000 x minuter.

När 0,02N Na0H och en reaktionstid om fem minuter användes är LA = ml NaOH x 4000/mg enzym.

U.S.P. = United States Pharmacopocia N.F. = National Formulary C.P. = kemiskt ren.

Det bör beaktas att föreliggande uppfinning icke är begränsad till de ovan beskrivna metoderna för uppmätning av esteraktivitet och lipasaktivitet, eftersom fackmannen lätt inser att andra metoder och modifikationer av nämnda metoder kan tillämpas.

Produktion av det önskade lipolytiska enzymaromsystemet kan utiöras med konventionella fermentationsprooedurer och efterföljande lämpliga utvinningsmetoder. Ett näringsmedium, innehållande assimiler- bart kol, kväve och spärmineralämnen, inkuberas med en kultur av Mucor miehei, och fermenteras under submersa, aeroba betingelser vid ett pH av ungefär 3-8 och en temperatur av ungefär -5000 under ungefär 2-14 dagar. Exempel på utvalda stammar av Mucor miehei, som kan fermenteras på så sätt för bildning av det önskade enzymaromsystemet utan begränsningar, är tillgängliga för allmänheten under kodbeteckningarna NRRL A 13.131 och A 13.042 vid Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois. Andra lämpliga stammar av Mucor miehei är uppenbara för fackmannen efter läsning av föreliggande beskrivning.

Enligt tidigare praxis har esteraser och lipaser vanligen an- tingen avlägsnats eller inaktiverats såsom hjälpmedel för utvinning av den önskade löpeprodukten, såsom beskrivas i de amerikanska patent- skrifterna 3.616.233 och 3.763.011, DOS 2.232.996 och den brittiska patentskriften l.207.892.

Enligt uppfinningen tillvaratages det önskade enzymarom- .systemet genom separation från fermentationsvätskan på så sätt att man uppnår ett lämpligt EA/LA-förhållande, definierat på häri angivet sätt. Detta kan utföras genom filtrering av vätskan vid ett lågt pH, ungefär 4-5, extraktion av filterkakan vid högt pH, ungefär -l2, surgöring av extraktet till ett pH av ungefär 7 och därefter genom filtrering eller koncentrering av det surggorda extraktet genom indunstning eller ultrafiltrering och efterföljande torkning av koncentratet, såsom genom sprejtorkning och liknande. 1:5" <2? ??.:2š" » É3 3-6 - 8 Det bör beaktas att det för vissa ändamål är önskvärt att använda ett lipolytiskt enzymsystem som även är i huvudsak fritt från löpeenzymaktivitet. Detta kan åstadkommas genom att man till- lämpar nämnda utvinningsprocèdur eller annan reningsteknik, som är uppenbar för fackmannen.

Det tillvaratagna lipolytiska enzymaromsystemet kan sättas till mjölk, mjölkfett, smörolja, ost, mjölkchoklad, margarinolja, kaffedrycksutspädningsmedel och andra triglyceridfett-haltiga livs- medel och livsmedelskomponenter och inkuberas vid en temperatur av ungefär 10-5000 under ungefär 2 timmar till 20 dagar för tildning av önskvärda mjölk- och smörliknande aromer. Det kan användas för acceleration eller intensifiering av naturligt utvecklade atomer hos dessa livsmedel och livsmedelskomponenter och kan blandas med kända aromutvecklande medel för produktion av ett flertal olika aromprofiler.

Således kan det exempelvis blandas med pregastriska esterasenzymkompo- sitioner enligt den amerikanska patentskriften 2.531.329 (tillgänglig såsom “Italase" från Dairyland Food Laboratory) eller också kan det användas tillsammans med Penicillium roqueforti-framkallaíe arom- kompositioner enligt den amerikanska patentskriften 3.100.153. Det tillvaratagna lipolytiska enzymet tillsättes vanligen i en mängd av ungefär 0,001-O}l viktprocent, räknat på det triglyceridfett- haltiga substratet och vad beträffar mjölk företrädesvis i en mängd av ungefär 8-125 g/1000 liter mjölk.

Uppfinningen àskidliggöree närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader.

Iemoel 1.

Huccr miehei, RERL 13.042, överföras från en snedagarkultur under aseptiska betingelser till en erlenmeyerkolv om 1 liter, inne- hållande 200 ml av följande medel: Sojamjöl ("Nutrisoy 300 C") 1,5 ß Torkad'vassla 3,0 Enzymatiskt nedbruten majs- stärkelse ~ 12,0 "Vatten 3,,5 100,0 % Kolvcn inkuberas på en roterande skakanordning vid 3700 under 114 timmar, varvid man utgår från ett slutligt pH av ungefär 6. Det önskade lipolytiska enzymsystemet tillvaratages på följande sätt: Fermentationsvätskan inställes på pH 5 och filtreras därefter. Filt- ratet extraheras med utspädd NaOH-lösning vid pH 10-11 och extraktet 799235 ~-6 u 9 surgöres till pH 7. Det surgjorda ertraktet filtreras och indunstas till ett koncentrat med ett EA-värde av 25,8 och ett EA/LA-förhállan- de av 2,6 under ett utvinningsförsök (A), filtreras, indunstas och sprejtorkas till en fast substans med ett EA/LA-förhållande av 3,5 vid ett annat utvinningsförsök (B).

Det från äueor miehci hürledda lipolytiska enzymet, erhållet vid försök (A) med det angivna Ei/LA-förhàliendet 2,6 anvënies vid förfarandet enligt uppfinningen.

Ezemnel 2.

Kucor mienei, NRRL l3.042, användes för framställning av ett lipolytiskt enzymsystem enligt exempel l, men med det undantaget att fermentationen utfördes i en produktionstank med ett näringsvatten- medium, innehållande 16 % majsstärkelse, som gjorts flytande med bak- teriell a-amylas, 4 % avfettar "Kaysoy"-sojamjöl och 2 á sçrejtorkad, söt vassla. Vid skörd 77 timmar efter ïermentaticn analyserades màsken med avseende på EA- och LA-värden med följande resultat: EA = 24,9 Li = 2,8 EA/LA = 8,9 ' Den lipolytiska enzymprcdukten tillvaratages och användes vid förfarandet enligt uppfinningen med lika gott resultat.

Claims (1)

1. 0 PATENTKRAV Förfarande för framställning av ett enzymmodifierat helmjölkspulver, k ä n n e t e c k n a t därav, att man för- sätter helmjölkspulver med 0,001-0,01 % av ett lipolytiskt enzymsystem, som uppvisar ett esteraktivitets/lipasaktivitets- värde högre än l óch tíllvaratagits ur den fermenterade till- växtprodukten av Mucor miehei, räknat på vikten av de fasta mjölkfettsbestândsdelarna, och inkuberar 4-8 timmar vid 22-33°C.