CN102703404A

CN102703404A - 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用

Info

Publication number: CN102703404A
Application number: CN2012100673820A
Authority: CN
Inventors: 伊夫·勒布隆; 尼古拉斯·穆兹; 阿兰·马蒂; 让·路易·乌里韦拉雷亚
Original assignee: LABORATOIRES MA
Current assignee: LABORATOIRES MA
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2006-06-15
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2026-06-15
Also published as: CN102703404B

Abstract

用于生产解脂耶氏酵母耐酸重组体脂肪酶的方法，该方法利用的培养基除其使用的物质外不含任何动物来源的产物或未表征的混合物比如胰胨、蛋白胨或抗乳血清。可以生产过多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重组菌株被称作YL-LIP2-6C，该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为I-3542，本文还涉及其应用。

Description

用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用

本申请是申请日为2006年6月15日、申请号为200680054940.2(PCT/FR2006/001352)的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种通过使用产生耐酸的重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞来生产脂肪酶的方法，该方法允许生产能用作药物的脂肪酶；本发明还涉及一种过度产生耐酸重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其应用。

背景技术

人类每日摄取的食品主要由脂类、蛋白质和糖组成。在它们被吸收之前，所有这些组成要经受消化道内的酶的催化水解。这些酶中任何一种的缺乏可以因此引起消化紊乱，并且导致相当严重的营养不良。即，例如，在一些病态情况的病例中，比如囊性纤维化或外分泌胰腺的不足与胰脂酶缺乏有关。为校正这些缺乏，通常建议口服给药胰腺提取物。然而，这些疗法的效率受限于如下事实：这些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)会因胃介质的酸性而快速失活。

因此，有人建议使用抗胃环境的脂肪酶制剂，比如，其例子有通过基因工程生产的哺乳动物胃脂肪酶制剂，比如申请人为于文尼尔研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHE JOUVENIAL SA)的法国专利申请公开2699179描述的制剂、或者在酸性介质中具有适当活性的微生物脂肪酶制剂[ZENTLER-MONRO等，Pancreas，7，311-319(1992)]。

在酸性介质中有活性的微生物脂肪酶中，可能会尤其提到真菌脂肪酶，比如来自欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)[YOSHIDA等，Biochim.Biophys.Acta.；154，586-588(1968)]、来自星状丝孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI等，Biotechnol.Appl.Biochem.，26，111-116(1997)]、来自爪哇根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBROECK等，Biol.Chem.Hoppe Seyler，374，245-254，(1993)]、或来自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta Biotechnol.，2，159-167(1991)；NOVOTNY等，J.Basic Microbiol.28，221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它们在酸性pH下的活性之外，这些脂肪酶当它们的底物存在时，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗胆盐作用的特性(当存在10mM牛磺胆酸钠时它们的活性可保持)。

已经有人描述了解脂耶氏酵母用于生产所研究基因的应用。因此，申请人为INRA和 CNRS的专利申请EP 1108043描述了包含所研究基因的表达盒和Zeta序列(zeta sequences)的整合载体的应用，该整合载体对应于解脂耶氏酵母Ylt逆转录转座子的LTR序列。这样的表达载体允许将插入所研究基因的数个拷贝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因组DNA中。该系统尤其已经用于将编码脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已经允许在培养基条件(未详述)下，与未转化的菌株相比，转化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。

其他研究描述了如专利申请EP 1108043所述的相同表达载体用于在解脂耶氏酵母中产生重组体脂肪酶的应用(国际申请WO 01/83773；PIGNEDE等，Journal of Bacteriology，vol.182，No.10，p.2802-2810(2000)以及PIGNEDE等，Applied and Environmental Microbiology，vol.66，No.8，p.3283-3289(2000))。具体为：

-国际申请WO 01/83773，申请人为法国米奥里大药厂(Laboratoires MAYOLY SPINDLER)，描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCM I-2294)的产生，该MS4克隆包含被整合入其DNA的10个拷贝的LIP2基因表达盒、并且描述了其用于生产脂肪酶的应用，产率为每升培养液上清液含有0.5g左右的脂肪酶、以及使用橄榄油作为底物测得的12,000U/ml的催化活性，其中一个活性单位对应于每分钟能够催化释放1μmol脂肪酸的酶量，即，超过原始菌株200倍。然而，该申请所述的产生脂肪酶的方法的主要缺点在于其使用了含有细菌用蛋白胨(bactopeptone)或细菌用胰胨(bactotryptone)的培养基。这些未被表征并且含有各种蛋白质水解物的产物通常用作氮源和碳源。因此，该申请所述的方法不可能得到可以直接用作药物的脂肪酶。

-PIGNEDE等(Journal of Bacteriology，2000)更具体地表征了被解脂耶氏酵母(PO1d菌株)LIP2基因编码的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究内容：

·从各种野生型菌株(缺乏Ylt1的PO1d和含有Ylt1的E150)以及从包括JMY184(PO1d-6-15)和JMY279(PO1d-6-17)在内的各种重组菌株分泌脂肪酶的情况，以及

·转化体JMY184的脂肪酶过度产生情况。

PIGNEDE等的文章比较了被野生型菌株、突变株和根据如上所述方法(国际申请WO01/83773)得到的重组菌株的脂肪酶生产情况。野生型菌株分泌的脂肪酶为30～50U/mL，而在N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NNNG)的作用下得到的突变株在优化培养条件下产生的脂肪酶多出25倍，即1200U/mL的脂肪酶，该优化的培养条件涉及含有蛋白胨的培养基(预培养培养基)和含有乳清的培养基(发酵培养基)(也请参见DESTAIN等，1997)。借助于该表达盒中的包含受POX2启动子和非同源整合调节的LIP2基因的呈多拷贝和呈分散方式的构造，得到了重组菌株。PIGNEDE等得到了稳定的转化体(例如菌株JMY184)，其在未优化的条件下，即在YPDH培养基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L细菌用蛋白胨、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄榄油)中产生2000U/mL的脂肪酶，相当于约0.5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式，PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶制剂不适用于医疗用途，并且尤其不适合于临床批量的制备，因为它们的生产需要使用含有蛋白胨或乳清的培养基。

-在其文献中，PIGNEDE的研究小组(Applied and Environmental Microbiology，2000)研究了用包含LIP2基因表达盒的载体转化的解脂耶氏酵母菌株。该作者发现，对于8种这样的转化体，LIP2基因表达盒的拷贝数在6和16之间(平均10个拷贝)，这导致在不同的基因座处所述表达盒发生2至15次整合。该JMY184菌株因此包含12个拷贝的在4个不同的基因座处整合的LIP2基因表达盒。此外，该作者更具体地研究了该JMY184转化体。他们确认，JMY184菌株在丰富的YPDH培养基(含有细菌用蛋白胨)上培养会产生0.5g脂肪酶/L上清液，使用橄榄油作为底物进行测量时，该上清液的活性为1500U/mL(相对地，野生型菌株PO1d为50U/mL)。根据这些数值可以推定脂肪酶的比活性为约3000U/mg。该作者另外报告到，优化JMY184菌株在发酵罐中的脂肪酶生产可以得到活性高达10,000U/mL的制品。然而，作者未公开得到该结果的培养条件。在该文献中，作者另外研究了这些转化体在培养基中的稳定性，尤其是JMY184克隆的稳定性，并且显示它们的稳定性为120代。PIGNEDE等认为，为了优化脂肪酶的生产，待考虑的因素是转化体的稳定性和培养条件。

此外，他们显示，在整合的LIP2基因的拷贝数和脂肪酶的过度产生之间有强相关性。

然而，对于脂肪酶的生产，在该文献中公开的仅有的培养基是含有蛋白胨的培养基，比如丰富的YPDH培养基。

生产脂肪酶的现有技术方法，即使它们使得到提高的脂肪酶产率成为可能，也不适用于适合医疗目的的脂肪酶的生产。

实际上，通常使用的培养基全部含有未被表征的动物来源的混合物和/或产物，比如蛋白胨、胰胨或乳清。因此需要开发允许生产适合医疗使用的重组体脂肪酶制品的体系。

发明内容

为了解决该问题，本发明人开发了用于生产脂肪酶的方法，其与现有技术生产的方法相比能更好地满足这些需要。更具体地讲，本发明人开发了一种用于生产脂肪酶的方法，其中使用的培养基不含上述产物，即，培养基不包含动物来源的产物并且不包含未被表征的混合物比如蛋白胨、胰胨或乳清。本发明人另外还筛选出一种新颖的用于生产脂肪酶Lip2的重组体解脂耶氏酵母菌株，该菌株与所述方法相结合可以显著地提高脂肪酶的产率。

因此，本发明的主题是一种使用被载体转化的解脂耶氏酵母菌株用于生产脂肪酶的方法，该载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒，其特征在于，使用的培养基不包含动物来源的产物或未被表征的混合物，比如蛋白胨、胰胨或者乳清。

更具体地说，本发明的主题是一种用于生产脂肪酶的方法，该方法包括：

a)在允许脂肪酶产生的条件下用于培养使用表达载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤，所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒；

b)用于回收由所述培养基的上清液产生的脂肪酶的步骤；

该方法的特征在于，用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料(例如乳清)或它们的酶消化产物(例如胰胨或蛋白胨)所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行。

根据所述方法的优选实施方式，根据步骤a)的所述培养基包含：

-作为氮源的无机氮，并且优选硫酸铵；

-碳源，其选自于碳水化合物来源的碳源，多元醇例如甘油、以及脂类来源的碳源例如脂肪酸和甘油酯；以及

-无机盐、微量元素和维生素。

根据所述方法的另一个优选的实施方式，步骤a)包括：

a1)用于在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养如上限定的转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤；以及

a2)所述细胞的发酵步骤，包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期，以及在含有选自短链、中链或长链三酸甘油酯的脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶合成期。于是，发酵在允许细胞生长的第一种情况下进行，例如在存在碳水化合物来源的碳源时进行，以及在允许生物合成所述脂肪酶的条件下的第二种情况下进行，例如在存在脂肪酸型的化学诱导剂作为唯一碳源时进行，该化学诱导剂包括比如短链三酸甘油酯(例如三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(比如三辛酸甘油酯)或长链三酸甘油酯(例如橄榄油或者三油酸甘油酯)。

优选进行发酵时，常数pO₂为15％～25％，并且优选pH小于6.5。例如发酵可以在下述条件下进行：空气流量约为1vvm，其中一个vvm单位是每液体体积每分钟1体积的空气(例如，对于一个30升的发酵罐，1vvm等于30l/min；而对于一个5升的发酵罐，1vvm等于5l/min)。

根据本实施方式的优越特征，进行预培养步骤a1)直至OD_600nm值为3～10每1mL，并且在发酵步骤a2)中，当培养液的OD_600nm值达到60～70每1mL时开始所述脂肪酶合成期。

根据本实施方式的另一个优越特征，当OD_600nm值达到300～350每毫升时启动步骤b)。另外步骤b)可以包括：

b1)从所述培养液上清液中分离脂肪酶；

b2)在步骤b1)中得到的脂肪酶的纯化。

这两个步骤按本领域已知的传统方法进行：物理分离(过滤、层析、离心法)或者物理化学分离法(沉淀法)。

从上清液中分离脂肪酶可以由本领域的技术人员进行，例如通过选自中空纤维切向过滤、正面过滤以及连续式或分批式离心法的技术进行。

脂肪酶的纯化尤其包括降低生物载荷(bioload)，即，微生物的存在，并且可以通过本领域的技术人员所熟知的任何合适的纯化技术进行，例如选自过滤、分级沉淀、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析的技术。

任选地，用于生产根据本发明的脂肪酶的方法也可以包括浓缩或富集步骤，该步骤包括提高制品中脂肪酶的浓度。这样的步骤例如可以在提纯步骤之后进行。也可以与该提纯步骤同时进行。

根据本发明的生产方法尤其有可能以约1至3g的纯化脂肪酶每升培养液上清液的量生产出重组体脂肪酶。在特别优越的方式中，根据本发明的方法允许生产催化活性大于培养液上清液的15,000U/mL的重组体脂肪酶制品。优选所述制品的活性大于培养液上清液的20,000U/mL。在pH 6时通过使用三辛酸甘油酯作为底物测定这些数值。脂肪酶制品的该活性值对于本申请上下文的药剂开发尤其重要。实际上现在可以给药剂量降低的根据本发明方法生产的脂肪酶，同时保持足够的效力以得到欲期的治疗效果，例如可以是与脂肪酶缺乏有关的胰腺不足相关的脂肪吸收障碍的矫正。

现在根据本发明的方法，在无需动物来源的产物的情况下通过使用重组体解脂耶氏酵母菌株可以生产出脂肪酶Lip2，该事实成为重要的优势，并且大大地促进了脂肪酶用于医疗目的的应用。

用于获得在本发明的方法中使用的重组体解脂耶氏酵母细胞的表达载体是一整合载体，其具有至少一个拷贝的LIP2基因和用于调节表达的元件。然后该载体可以被整合入质粒DNA或者整合入酵母的基因组DNA。整合载体的一个尤其优选的例子是如国际申请WO 01/83773所述的载体JMP6或载体JMP10。载体JMP6包含有LIP2基因的表达盒，其编码解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前体，其上游设置用于酰基CoA氧化酶ACO2的称为POX2的解脂耶氏酵母启动子。载体JMP10也包含LIP2基因，其上游是用于Lip2脂肪酶的解脂耶氏酵母启动子。这两种启动子可被三酸甘油酯和脂肪酸诱导。在这些载体中的各个中，表达盒和启动子被设置在如上所述Zeta序列之间。该整合可以是靶向整合，即针对某位点，或者是随机的整合。因此，当转化的解脂耶氏酵母菌株不含Zeta序列时(例如，PO1d菌株的情形)，表达盒的整合分散于所述菌株基因组DNA中。另一方面，当解脂耶氏酵母菌株包含Zeta序列(例如，E150菌株的情形)时，整合主要针对这些序列。

根据所述方法的另一个优选的实施方式，转化的解脂耶氏酵母菌株优选是称为YL-LIP2-6C的菌株，该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，C.N.C.M.，法国巴黎道可图罗斯大街28号，企业邮递特投15，邮编75724)，保藏编号为I-3542。该YL-LIP2-6C菌株遗传学稳定。

为本发明的目的，在此使用的术语“稳定”、“遗传学稳定”、“基因稳定”及其变化表述是指，对于将所研究的核酸整合入克隆的DNA而言相同数量的基因座至少保持30代。选用30代这一数量作为计算遗传稳定性的基础，是因为本发明人注意到该数量对应于细胞群的许多次复制，足以允许使用一方法进行脂肪酶的生产，所述方法包含至少一个预培养重组体解脂耶氏酵母细胞的步骤和一个在适当的发酵条件下生产脂肪酶的步骤。为本发明的目的，世代被定义为细胞群的复制，并且可以根据公式Y＝X×2^g计算，其中Y是在时间t时的细胞群(例如，表示为细胞密度)；X是在时间t₀时的启始细胞群，并且g代表细胞群从数值X至数值Y所必需经过的传代数。优选在至少30代以后，当至少90％的被分析菌落含有与起始克隆相同数量的所研究基因的基因座时，克隆被认为是遗传学稳定的。因此，作为明显的例子，克隆YL-LIP2-6C被认为是稳定的，这是因为在100代后，几乎100％的被分析菌落含有6个LIP2基因的基因座(一个基因座对应于用于整合LIP2基因的表达盒的内源性LIP2基因+5个基因座)。

令人惊讶的是，当根据本发明的方法使用这一特殊的菌株时，本发明人成功地大量地生产出重组体脂肪酶，并且在整个所述生产期间进行较好的控制。本发明人的确成功地提高了脂肪酶的产率，并且尤其能够得到1～3g纯脂肪酶每升培养液上清液的产率。他们也能得到活性接近20,000U/mL的脂肪酶制品。

为本发明的目的，脂肪酶的活性对应于其酶催化活性。脂肪酶溶液的催化活性表示为单位(U)每毫升分析溶液。比活力表示为单位(U)每毫克纯化蛋白质(脂肪酶)。一个单位相当于每分钟能够催化释放1μmol脂肪酸的酶量。脂肪酶的比活力根据用作底物的三酸甘油酯的性质变化。

除提高脂肪酶的产率之外，本发明人也能提供生产方法较好的再现性，提高最终产品的均一性，并且改善用于纯化脂肪酶的条件。

因此，这些各种改进可以获得满足医疗用途所需条件的脂肪酶。事实上，在他们的研究的上下文中，本发明人现在已经观察到，Lip2脂肪酶在pH值大于3并且直至pH值接近8的范围内具有活性，最优的活性在pH 5～6之间。另一方面，其在pH 3或者pH 8.5下保温2小时会不可逆地失活。经分析，Lip2脂肪酶的比活力也与不同的底物有关，并且本发明人因此测定在pH 4下纯化脂肪酶对于短链三酸甘油酯(三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(三辛酸甘油酯)和长链三酸甘油酯(橄榄油)的比活力值分别为约10,760U/mg、约16,920U/mg和约12,260U/mg。最后，本发明人惊讶地观察到，Lip2脂肪酶在胆盐存在时具有活性，并且该活性随着胆盐的浓度而增加。直到现在，仅仅发现与辅助脂肪酶相结合的胃脂肪酶和胰脂酶在胆盐存在时具有这种活性。因此，具有较高比活性的Lip2脂肪酶的应用不需要辅助脂肪酶的存在。

克隆YL-LIP2-6C含有数个拷贝的该Lip2脂肪酶的表达盒，导致在不同的基因座处产生5次LIP2基因的整合。当置于适合产生脂肪酶的条件下时，相比现有技术领域的转化解脂耶氏酵母菌株，克隆YL-LIP2-6C生产出更多的脂肪酶。脂肪酶的产率大于1g/L培养液上清液，即，大于如上所述观察到的现有技术领域克隆的产率。

本发明的主题还涉及脂肪酶制品，其可以通过根据本发明的方法而得到。

根据所述脂肪酶制品的优选实施方式，当按如上所指出的方法测定时，其活性至少等于15,000U/ml，优选大于20,000U/ml。

另外，本发明的主题还涉及根据本发明的脂肪酶制品用于制备药物的应用，其目的在于治疗与脂肪(例如短链、中链或长链脂肪酸)吸收失调有关的疾病，尤其是与胰腺不足、特别是外分泌胰腺不足相关的疾病。

本发明的主题还涉及一种药物，其特征在于，其包含如上限定的脂肪酶制品。

本发明的主题还涉及一种用载体转化的解脂耶氏酵母菌株，所述载体用于表达酵母耐酸脂肪酶，其特征在于，该菌株是称为YL-LIP2-6C的克隆，其于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.，法国巴黎道可图罗斯大街28号，企业邮递特投15，邮编75724)，保藏编号为I-3542。

另外，本发明的主题还涉及如上限定的细胞用于生产酵母耐酸脂肪酶的应用。

附图说明

除前述特征外，本发明还包括如下说明书中出现的其他特征，下面参照实施本发明方法的实施例和下述附图，对这些特征进行描述：

-图1显示了用于在生产脂肪酶的方法期间控制YL-LIP2-6C克隆的遗传稳定性的总体方法。

-图2显示了在发酵工艺期间，在600nm下光密度(OD_600nm，左侧Y轴)的变化(-◆-)和生长速率(h^-1，右侧Y轴)的变化(-■-)与时间(小时，X轴)的关系。箭头显示了诱导脂肪酶的产生。

-图3显示了在不同的基因座处将LIP2基因整合入23个菌落的基因组(车道24至43)的整合次数的Southern blot分析，菌落收集时间点T33对应于发酵结束，即在发酵开始后约100小时。拷贝数1～6：6个LIP2基因的基因座(5个用于整合LIP2基因表达盒的基因座+1个用于内源性LIP2基因的基因座)。M：大小标记。

-图4显示了在T16至T33的生产期间YL-LIP2-6C克隆产生重组体脂肪酶的SDS-PAGE监测情况。箭头显示了诱导产生脂肪酶(T17，发酵48小时)。M：分子量梯度；右手部分凝胶中的五个泳道对应于已知量(2.5μg至20μg)的纯化Lip2脂肪酶。

-图5显示了在时间点T33(发酵工艺终点)处上清液中脂肪酶纯度的SDS-PAGE分析情况。MW：分子量梯度；参照Lip2F5：Lip2脂肪酶范围1至10μg；YL-LIP2-6C上清液：被分析的上清夜的体积为μL。

-图6显示了通过MALDI-TOF型质谱分析法测定的YL-LIP2-6C克隆生产的重组体脂肪酶的质谱。

具体实施方式

实施例1--材料和方法

1)使用的培养基

显示的最终浓度是母液中的浓度。

未富集的基础培养基02130S

成分	最终浓度
		葡萄糖	10g/l
KH₂PO₄	3g/l
		Na₂HPO₄	3g/l
H₃BO₃	0.34g/l
		(NH₄)₂SO₄	3g/l
C₅H₈O₄NNa(谷氨酸)	1g/l
		MgSO₄	0.5g/l
CaCl₂	0.023g/l
		MnSO₄	0.038g/l
ZnSO₄	0.04g/l

另外富集培养基02130S包含下述添加剂：

添加剂	最终浓度
		微量元素溶液	1ml/l
维生素溶液	1ml/l

微量元素溶液配方

成分	最终浓度
		CoCl₂	0.5g/l
Na₂MoO₄	0.06g/l
		CuSO₄	0.9g/l

维生素溶液配方

成分	最终浓度
		D-生物素	0.05g/l
泛酸钙	1g/l
		烟酸	1g/l
肌醇	25g/l
		硫胺盐酸盐	0.25g/l
维生素B6盐酸盐	0.25g/l
		对氨基苯甲酸	0.05g/l

[0074] 无机盐溶液配方

成分	最终浓度
		MgSO₄	26.76g/l
CaCl₂	6.40g/l
		FeSO₄	5.61g/l
CoCl₂	0.29g/l
		ZnSO₄	7.72g/l
Na₂MoO₄	0.09g/l
		H₃BO₃	0.34g/l
MnCl₂	0.47g/l
		CuSO₄	0.61g/l

FeSO₄溶液配方

成分	最终浓度
		FeSO₄	0.9g/l

氨水溶液，14％

消泡液：Struktol J673稀释至1/10倍(Schill+Seilacher AG，Moorfleeter Str 28，22113，汉堡，德国)

2)基因组DNA的提取和Southern blot分析

a)基因组DNA的提取

将由4mL培养物中得到的细胞团粒悬浮在0.5mL的山梨糖醇缓冲液(0.9M山梨糖醇；0.1M的tris-HCl，pH 8.0；0.1M EDTA)中。以0.28M的浓度添加50μL的

20T(6mg/mL)(Euromedex，67458Mundolsheim Cedex，法国)、50μL的2-巯基乙醇，并且将溶液在37℃下搅拌(180rpm)保温1小时。溶液离心，并且将细胞团粒悬浮在0.5mL的TE缓冲液(50mM的tris-HCl，pH 8；20mM EDTA)中。添加50μL的10％SDS，通过倒置混合溶液，并且在65℃下保温20分钟。添加0.2mL的5M乙酸钾，然后混合溶液，并且在冰中保持30分钟，然后离心5分钟。

将上清液转移至1.5mL试管中，然后添加0.8mL预先在冰中冷却的100％乙醇。通过倒置混合溶液，然后离心。在除去上清液后，添加0.4mL含有100μg/ml的RNase A(Invitrogen，美国)的TE缓冲液，并且将溶液在37℃下保温1小时。在添加1mL预先在冰中冷却的100％乙醇后，轻轻地混合溶液，直至DNA沉淀，然后离心。除去上清液，然后将DNA团粒在大气中自然干燥，然后悬浮在100μL的无菌水中，然后在4℃下保温过夜。

b)用酶HindIII消化

通过测定260nm(A260)和280nm(A280)下的吸光度，测量基因组DNA的浓度。将1μg的基因组DNA与无菌水混合至42.5μL的最终体积。添加5μL的缓冲液(5X)和2.5μL的HindIII(50u/μL)(Invitrogen，美国)，并且将溶液在37℃下4小时。

c)Southern blot分析

按照从罗氏诊断公司(Roche Diagnostic)购买的“DIG High Prime DNA Labeling and Detection”试剂盒所述的工序，进行Southern blot型转印。

d)标记探针的工序

借助于酶Phusion DNA聚合酶(Finzyme)和下述两种引物，通过在基因组DNA上进行PCR，得到了对应于编码Lip2脂肪酶的完整基因的探针：

正义引物：5′-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3′(SEQ ID No.1)

反义引物：5′-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3′(SEQ ID No.2)

在PCR反应后，借助于″Nucleospin Extract II″试剂盒(Macherey Nagel)，将探针进行凝胶纯化。然后借助于购自罗氏公司的“DIG high prime DNA labeling”试剂盒，对纯化的探针进行金标记(digoxygenin)。

e)凝胶分离、DNA转印和信号检测

将2μg的HindIII消化的DNA与加载的缓冲液混合，然后在0.8％琼脂糖凝胶上沉淀。在50V下进行2小时30分钟的迁移，然后将DNA转印到Hybond+薄膜(Amersham Bioscience公司)上。利用在薄膜上标记探针的杂交、接着通过X-射线曝光目测，检测基因组DNA中LIP2基因的基因座数量。

3)蛋白质浓度的测定

通过Bradford方法测定蛋白质浓度。借助于Bradford方法直接在发酵培养的上清液上进行蛋白质定量。将这样测定蛋白质的量与纯化Lip2脂肪酶的已知量相比较。在试管内，将20μL的标准样以适当的稀释度与1mL含有染料的经稀释(5倍)的试剂混合。然后相对于得到的对照物(单独的稀释染料)OD₅₉₅值来测定样品OD₅₉₅值。

4)重组体脂肪酶比活力的测量

借助于pH滴定设备(RADIOMETER)，于37℃下对脂肪酶的活性进行电位滴定法测量。使用的底物是三辛酸甘油酯。使10mM的底物在15mL含有1mM tris-HCl(pH 5.5)、150mM NaCl，5mM CaCl₂和4mM牛磺脱氧胆酸钠(sodium taurodeoxycholate)(SIGMA 公司)的反应缓冲液中乳化。将比活力单位定义为每分钟每毫克蛋白质释放1μmol脂肪酸。

5)变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将包含25％含有SDS和还原剂的混合物的12μL的样品加载至4-12％的bistris凝胶(Biorad)上。在160V下进行45min迁移。

然后通过用考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色来分析凝胶。

6)通过MALDI-TOF(基质协助激光解吸电离-飞行时间)型质谱分析法，测定YL-LIP2-6C克隆生产的Lip2脂肪酶的分子量

通过使用购自Perseptive Biosystems公司(马萨诸塞州(Framingham)，MA)、具有在337nm发射的氮激光器的“Voyager Elite XL time of flight”质谱仪，进行激光解吸/电离型质谱分析。通过使用具有25kV加速电压、0.3％栅极电流、0.3％离子引导电流、以及1000ns停滞时间的线性的和延迟抽出模式(delayed extraction mode)，得到了Lip2蛋白质正离子模式(positive mode)的质谱。每一个光谱都是100个激光脉冲方式的结果。将待分析的材料与相等体积的芥子酸(Fluka)饱和溶液混合，所述芥子酸饱和溶液是在含有50％(v/v)乙腈/三氟乙酸水溶液的溶液中制备的。将2μL等分的这种混合物沉淀在不锈钢样品平板上，并且在进行分析之前在大气中自然干燥。借助α-糜蛋白酶原A(Sigma)，进行外部校准。表示的数值是平均值，并且对应于离子[M+H]⁺。

实施例2--表达载体的构建和YL-LIP2-6C克隆的产生

通过用专利申请EP1108043所述的、称为JMP6的、并且包含编码解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前体的LIP2基因的表达载体来转化不含Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株PO1d，得到了YL-LIP2-6C菌株，所述LIP2基因的上游是ACO2启动子。如上所述，所述表达盒侧翼为Zeta序列。根据专利申请EP1108043所述的方法，进行载体JMP6的构建和PO1d菌株的转化。包含5个不同的用于LIP2基因表达盒整合的基因座的该YL-LIP2-6C菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(CNCM，法国巴黎道可图罗斯大街28号，企业邮递特投15，邮编75724)，保藏编号为I-3542。

实施例3--用YL-LIP2-6C菌株生产脂肪酶以及YL-LIP2-6C遗传稳定性的验证

使用YL-LIP2-6C菌株用于生产脂肪酶的方法，该方法包括适合于产生脂肪酶的预培养步骤和发酵步骤。该方法的综合法如图1所示。然后分析这样生产的脂肪酶的活性和质量。另外，通过测定LIP2基因的表达盒的基因座数量，分析了YL-LIP2-6C的遗传稳定性。

1)生产方法

预培养和发酵

将装在甘油小瓶中的YL-LIP2-6C克隆保藏液解冻，并且取5μL保藏液加入25mL的富集02130S培养基中，在250mL锥形瓶(Erlen Meyer bottle)中培养，所述培养基含有1％(v/v)的维生素溶液和1％(v/v)的微量元素溶液。将培养物在28℃下搅拌(180rpm)温育36小时。将得到的25mL预培养物(预培养物1)接种入装在2升锥形瓶中的200mL的富集02130S培养基中，在28℃下搅拌(180rpm)温育36小时。将这样得到的预培养物2(225mL)接种在发酵罐内的富集02130S培养基中。

在发酵工艺的时间点T0处，将2mL的FeSO₄溶液添加至培养液。每隔6至9小时，将2至3mL的维生素溶液添加至发酵培养液，并且在发酵34小时后(在T12处)，启动葡萄糖的供应。葡萄糖供应量逐渐提高持续14小时，然后在T17(对应于发酵48小时)中断，然后启动用油酸的诱导。在接下来的54小时，油酸的供应逐渐增加，然后在T33(发酵102小时)时OD₆₀₀值达到340，终止发酵工艺。将最终的3升培养液离心(14,000rpm)。回收上清液并且在-20℃下储存。

培养液的监测

在发酵期间，监测温度、氧分压和pH，并且分别保持在28℃、20％和6.2。大约每隔3小时，采集培养液样品并且测量OD₆₀₀值，以便监测生长速率的变化。结果显示于图2中。取两个1mL该样品的提取物，以14,000rpm离心5min，并且将细胞团粒和上清液在-20℃下储存。表I显示了发酵工艺的监测情况。

脂肪酶的纯化

任选地，进行用于纯化脂肪酶的附加步骤。

借助于切向微过滤设备，在陶瓷薄膜(购自PALL公司的pilot X6型)上从培养液中分离脂肪酶，该薄膜允许尺寸大于截流尺寸(0.1μm)的酵母保留下来。首先以浓缩模式、然后以渗滤模式来回收含有脂肪酶的渗透液。根据厂商的介绍进行这些步骤，包括适当的改进。包含在渗透液中的微生物的浓度然后通过过滤(0.2μm)(Millipore公司)而降低，从而得到小于10cfu/mL的生物载荷。通过使用Profux M12设备(Millipore公司)，将脂肪酶溶液浓缩至约5升的体积，并且通过使用Biomax 10kDa标准Pellicon薄膜进行切向超滤作用，以便除去低分子量的杂质。除去不包含脂肪酶的超滤液。然后按如上所述通过除去微生物，再次提纯脂肪酶溶液，从而得到小于5cfu/mL的生物载荷。可以另外冻干这样纯化得到的脂肪酶。

3)YL-LIP2-6C生产的重组体脂肪酶的表征

a)在发酵工艺期间监测YL-LIP2-6C菌株生产脂肪酶

在各个测量点，对培养液样品进行离心法，并且通过SDS-PAGE分析上清液。将75μL的上清液与75μL水混合，然后取5μL加载于26孔凝胶上。含有已知量Lip2脂肪酶的样品也被分析。结果如图4所示。通过将在发酵终止(T33)_时得到的脂肪酶量与已知量Lip2脂肪酶的斜率相比较，可以估计出在发酵100小时后得到的脂肪酶浓度是1.5g/L。

此外，本发明人使用根据本发明生产脂肪酶的方法，最终体积约为35升，其使得脂肪酶的生产产率为1～3g每升培养液上清液。

b)蛋白质浓度的测定和重组体脂肪酶产率的估计

如实施例1所示(Bradford方法)测定培养液上清液中的蛋白质浓度。进行七次单独的测量，并且上清液中蛋白质浓度是2.3g/L。通过SDS-PAGE估计上清液中Lip2蛋白质的纯度。结果如图5所示。纯度估计为约70％。因此，使用YL-LIP2-6C克隆由发酵步骤得到的脂肪酶产率是1.6g/L。

c)YL-LIP2-6C生产的重组体脂肪酶的比活力测量

如实施例1所示测量由YL-LIP2-6C克隆生产的脂肪酶的比活力。在缓冲液中将对应于发酵上清液的样品稀释100倍，该缓冲液含有50mM的Na₂HPO₄、50mM的KH₂PO₄、150mM的NaCl，pH 6.0。在37℃下用三辛酸甘油酯进行3次独立实验而测定的催化活性是21,883.33U/mL上清液(表II)。

表II：发酵上清液样品活性的测量

从上清液中Lip2脂肪酶的估计浓度(参见上面)看，脂肪酶的比活力是13,675U/mg，可与为临床研究生产的脂肪酶的比活力相比较。由YL-LIP2-6C克隆产生的脂肪酶的比活力符合临床批量所需要的条件。

d)重组体脂肪酶的分子量

在离心后，无需纯化，对发酵培养液上清液进行质谱分析(参见实施例1)。结果如图6所示。观察的主峰显示了37,648Da的分子量。由YL-LIP2-6C生产的Lip2脂肪酶具有合理的分子量，这是因为该观测值符合临床批量所需要的条件，即37,500+/-1000Da。

该实施例显示了稳定克隆YL-LIP2-6C的筛选(在该情况下，在30代后分析的100％克隆具有与初始克隆相同数量的LIP2基因的基因座)。另外，所述克隆的遗传稳定性不受用于生产脂肪酶的培养条件的影响(在预培养期间；就在发酵之前；就在通过油酸诱导脂肪酶产生之前；在发酵终止)。

3)YL-LIP2-6C克隆的遗传稳定性

在时间点T0、T17和T33筛选的菌落中，通过测定解脂耶氏酵母DNA中在不同的基因座整合的LIP2基因的表达盒的发生数，分析了YL-LIP2-6C克隆在包括预培养步骤和发酵步骤的生产脂肪酶方法期间的遗传稳定性。

菌落的筛选

稀释预培养物2的样品(T0，发酵开始)、在T17时(就在诱导之前)和在T33时(发酵终点)发酵条件下的培养液样品，在第一情况下稀释至OD₆₀₀＝1，然后稀释1000倍。将10μL的该稀释溶液各自涂布在3个YPD培养基培养平板上。然后平板在28℃下温育48小时，并且然后在4℃下储存直到筛选出用于基因座数量分析的菌落。

将20个来源于在发酵开始点(T0)收集的样品的菌落、20个来源于就在诱导(T17)之前收集的样品的菌落、和100个来源于在发酵终止时(T33)收集的样品的菌落分别接种在4mL的富集02130S培养基中，然后培养72小时。接着，在30％甘油中制备保藏液，用于DNA的提取和Southern blot分析(见材料和方法部分)。

b)对于140个来源于YL-LIP2-6C菌株的菌落，测定在不同的基因座处LIP2基因整合的发生数

对于在20个在时间点T0(发酵开始)收集的菌落上、20个在时间点T17(发酵48小时)收集的菌落上、和100个在时间点T33(发酵100小时)收集的菌落上的不同的LIP2基因的基因座整合的发生数的Southern blot分析结果如图3所示。结果表明，分析的所有菌落都含有6个LIP2基因的基因座。因为野生型菌株含有一个拷贝的内源性LIP2基因，因此YL-LIP2-6C菌株含有5个用于整合LIP2基因表达盒的基因座。因此YL-LIP2-6C克隆在100个小时发酵工艺期间是100％稳定的。

Claims

1.一种用于生产重组体脂肪酶的方法，其包括：

a)培养用载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤，所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒，所得到的解脂耶氏酵母细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为I-3542；以及

b)从培养液上清液中回收用所述YL-LIP2-6C细胞生产的所述重组体脂肪酶的步骤，

该方法的特征在于，

用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料或它们的酶消化产物所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行的；并且

所述培养基包含：

-作为氮源的无机氮；

-碳源，其选自于碳水化合物来源的碳源、多元醇、以及脂类来源的碳源；以及

-无机盐和维生素；并且

所述步骤a)包括：

a1)在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养所述YL-LIP2-6C细胞；

a2)发酵步骤，包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期，以及在含有脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶生产期。

2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述无机氮是硫酸铵。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪酸是油酸。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述发酵在15％～25％的恒定pO₂和pH小于6.5的条件下进行。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，进行用于预培养的步骤a1)直至OD_600nm值为3～10每1mL，在用于发酵的步骤a2)中，当所述培养液的OD_600nm值达到60～80每1mL时，开始所述脂肪酶生产期。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，当所述OD_600nm值达到300～350每1mL时，进行收集所述脂肪酶的步骤b)。

7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤b)包括：

b1)从所述培养液上清液中分离所述脂肪酶；以及

b2)纯化步骤b1)中得到的脂肪酶。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，采用从中空纤维切向过滤、正面过滤、和连续式或分批式离心中选出的技术来进行所述分离，采用从过滤、分级沉淀、离子交换层析、疏水交互作用层析、和凝胶过滤层析中选出的技术来进行所述纯化。

9.一种被载体转化的解脂耶氏酵母细胞，所述载体包含酵母耐酸胞外脂肪酶的表达盒，其特征在于，所述细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为I-3542。

10.如权利要求9所述的细胞用于生产所述酵母耐酸脂肪酶的应用。