CN101506359B - 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 - Google Patents
用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101506359B CN101506359B CN2006800549402A CN200680054940A CN101506359B CN 101506359 B CN101506359 B CN 101506359B CN 2006800549402 A CN2006800549402 A CN 2006800549402A CN 200680054940 A CN200680054940 A CN 200680054940A CN 101506359 B CN101506359 B CN 101506359B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- lip2
- recombinant chou
- substratum
- goods
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 153
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 153
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 153
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 33
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 27
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 27
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 6
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 6
- VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N trioctanoin Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 claims 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 claims 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 abstract description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 235000007754 Achillea millefolium Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000000073 Achillea millefolium Species 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 29
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 108700012830 rat Lip2 Proteins 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 101000924474 Homo sapiens Annexin A2 Proteins 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 13
- 101150021155 LIP2 gene Proteins 0.000 description 13
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 6
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 6
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 4
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040958 Aconitate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 2
- 101000965314 Homo sapiens Aconitate hydratase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101100084403 Homo sapiens PRODH gene Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150059359 POX2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100028772 Proline dehydrogenase 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100029251 Zea mays PER2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003020 exocrine pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 description 2
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 2
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 108091016642 steapsin Proteins 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710158368 Extracellular lipase Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001235480 Nakazawaea ernobii Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000588264 Rhizopus javanicus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710128940 Triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 1
- 241001634948 Trichosporon asteroides Species 0.000 description 1
- BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N Triolein Natural products O([C@H](OCC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)C(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N 0.000 description 1
- PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N Trioleoylglycerol Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000005908 glyceryl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003918 potentiometric titration Methods 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M sodium taurocholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 JAJWGJBVLPIOOH-IZYKLYLVSA-M 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- -1 triglycerides lipid Chemical class 0.000 description 1
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 description 1
- 229940117972 triolein Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
用于生产解脂耶氏酵母耐酸重组体脂肪酶的方法,该方法利用的培养基除其使用的物质外不含任何动物来源的产物或未表征的混合物比如胰胨、蛋白胨或抗乳血清。可以生产过多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重组菌株被称作YL-LIP2-6C,该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.),保藏编号为I-3542,本文还涉及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过使用产生耐酸的重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞来生产脂肪酶的方法,该方法允许生产能用作药物的脂肪酶;本发明还涉及一种过度产生耐酸重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其应用。
背景技术
人类每日摄取的食品主要由脂类、蛋白质和糖组成。在它们被吸收之前,所有这些组成要经受消化道内的酶的催化水解。这些酶中任何一种的缺乏可以因此引起消化紊乱,并且导致相当严重的营养不良。即,例如,在一些病态情况的病例中,比如囊性纤维化或外分泌胰腺的不足与胰脂酶缺乏有关。为校正这些缺乏,通常建议口服给药胰腺提取物。然而,这些疗法的效率受限于如下事实:这些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)会因胃介质的酸性而快速失活。
因此,有人建议使用抗胃环境的脂肪酶制剂,比如,其例子有通过基因工程生产的哺乳动物胃脂肪酶制剂,比如申请人为于文尼尔研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHEJOUVENIAL SA)的法国专利申请公开2 699 179描述的制剂、或者在酸性介质中具有适当活性的微生物脂肪酶制剂[ZENTLER-MONRO等,Pancreas,7,311-319(1992)]。
在酸性介质中有活性的微生物脂肪酶中,可能会尤其提到真菌脂肪酶,比如来自欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)[YOSHIDA等,Biochim.Biophys.Acta.;154,586-588(1968)]、来自星状丝孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI等,Biotechnol.Appl.Biochem.,26,111-116(1997)]、来自爪哇根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBROECK等,Biol.Chem.Hoppe Seyler,374,245-254,(1993)]、或来自解脂耶氏酵母[HADEBALL,Acta Biotechnol.,2,159-167(1991);NOVOTNY等,J.Basic Microbiol.28,221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它们在酸性pH下的活性之外,这些脂肪酶当它们的底物存在时,具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性,并且具有抵抗胆盐作用的特性(当存在10mM牛磺胆酸钠时它们的活性可保持)。
已经有人描述了解脂耶氏酵母用于生产所研究基因的应用。因此,申请人为INRA和CNRS的专利申请EP 1 108 043描述了包含所研究基因的表达盒和Zeta序列(zetasequences)的整合载体的应用,该整合载体对应于解脂耶氏酵母Ylt逆转录转座子的LTR序列。这样的表达载体允许将插入所研究基因的数个拷贝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因组DNA中。该系统尤其已经用于将编码脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA,并且已经允许在培养基条件(未详述)下,与未转化的菌株相比,转化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。
其他研究描述了如专利申请EP 1 108 043所述的相同表达载体用于在解脂耶氏酵母中产生重组体脂肪酶的应用(国际申请WO 01/83773;PIGNEDE等,Journal of Bacteriology,vol.182,No.10,p.2802-2810(2000)以及PIGNEDE等,Applied and Environmental Microbiology,vol.66,No.8,p.3283-3289(2000))。具体为:
-国际申请WO 01/83773,申请人为法国米奥里大药厂(Laboratoires MAYOLYSPINDLER),描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCM I-2294)的产生,该MS4克隆包含被整合入其DNA的10个拷贝的LIP2基因表达盒、并且描述了其用于生产脂肪酶的应用,产率为每升培养液上清液含有0.5g左右的脂肪酶、以及使用橄榄油作为底物测得的12,000U/ml的催化活性,其中一个活性单位对应于每分钟能够催化释放1μmol脂肪酸的酶量,即,超过原始菌株200倍。然而,该申请所述的产生脂肪酶的方法的主要缺点在于其使用了含有细菌用蛋白胨(bactopeptone)或细菌用胰胨(bactotryptone)的培养基。这些未被表征并且含有各种蛋白质水解物的产物通常用作氮源和碳源。因此,该申请所述的方法不可能得到可以直接用作药物的脂肪酶。
-PIGNEDE等(Journal of Bacteriology,2000)更具体地表征了被解脂耶氏酵母(PO1d菌株)LIP2基因编码的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究内容:
·从各种野生型菌株(缺乏Ylt1的PO1d和含有Ylt1的E150)以及从包括JMY184(PO1d-6-15)和JMY279(PO1d-6-17)在内的各种重组菌株分泌脂肪酶的情况,以及
·转化体JMY184的脂肪酶过度产生情况。
PIGNEDE等的文章比较了被野生型菌株、突变株和根据如上所述方法(国际申请WO01/83773)得到的重组菌株的脂肪酶生产情况。野生型菌株分泌的脂肪酶为30~50U/mL,而在N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NNNG)的作用下得到的突变株在优化培养条件下产生的脂肪酶多出25倍,即1200U/mL的脂肪酶,该优化的培养条件涉及含有蛋白胨的培养基(预培养培养基)和含有乳清的培养基(发酵培养基)(也请参见DESTAIN等,1997)。借助于该表达盒中的包含受POX2启动子和非同源整合调节的LIP2基因的呈多拷贝和呈分散方式的构造,得到了重组菌株。PIGNEDE等得到了稳定的转化体(例如菌株JMY184),其在未优化的条件下,即在YPDH培养基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L细菌用蛋白胨、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄榄油)中产生2000U/mL的脂肪酶,相当于约0.5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式,PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶制剂不适用于医疗用途,并且尤其不适合于临床批量的制备,因为它们的生产需要使用含有蛋白胨或乳清的培养基。
-在其文献中,PIGNEDE的研究小组(Applied and Environmental Microbiology,2000)研究了用包含LIP2基因表达盒的载体转化的解脂耶氏酵母菌株。该作者发现,对于8种这样的转化体,LIP2基因表达盒的拷贝数在6和16之间(平均10个拷贝),这导致在不同的基因座处所述表达盒发生2至15次整合。该JMY184菌株因此包含12个拷贝的在4个不同的基因座处整合的LIP2基因表达盒。此外,该作者更具体地研究了该JMY184转化体。他们确认,JMY184菌株在丰富的YPDH培养基(含有细菌用蛋白胨)上培养会产生0.5g脂肪酶/L上清液,使用橄榄油作为底物进行测量时,该上清液的活性为1500U/mL(相对地,野生型菌株PO1d为50U/mL)。根据这些数值可以推定脂肪酶的比活性为约3000U/mg。该作者另外报告到,优化JMY184菌株在发酵罐中的脂肪酶生产可以得到活性高达10,000U/mL的制品。然而,作者未公开得到该结果的培养条件。在该文献中,作者另外研究了这些转化体在培养基中的稳定性,尤其是JMY184克隆的稳定性,并且显示它们的稳定性为120代。PIGNEDE等认为,为了优化脂肪酶的生产,待考虑的因素是转化体的稳定性和培养条件。
此外,他们显示,在整合的LIP2基因的拷贝数和脂肪酶的过度产生之间有强相关性。
然而,对于脂肪酶的生产,在该文献中公开的仅有的培养基是含有蛋白胨的培养基,比如丰富的YPDH培养基。
生产脂肪酶的现有技术方法,即使它们使得到提高的脂肪酶产率成为可能,也不适用于适合医疗目的的脂肪酶的生产。
实际上,通常使用的培养基全部含有未被表征的动物来源的混合物和/或产物,比如蛋白胨、胰胨或乳清。因此需要开发允许生产适合医疗使用的重组体脂肪酶制品的体系。
发明内容
为了解决该问题,本发明人开发了用于生产脂肪酶的方法,其与现有技术生产的方法相比能更好地满足这些需要。更具体地讲,本发明人开发了一种用于生产脂肪酶的方法,其中使用的培养基不含上述产物,即,培养基不包含动物来源的产物并且不包含未被表征的混合物比如蛋白胨、胰胨或乳清。本发明人另外还筛选出一种新颖的用于生产脂肪酶Lip2的重组体解脂耶氏酵母菌株,该菌株与所述方法相结合可以显著地提高脂肪酶的产率。
因此,本发明的主题是一种使用被载体转化的解脂耶氏酵母菌株用于生产脂肪酶的方法,该载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒,其特征在于,使用的培养基不包含动物来源的产物或未被表征的混合物,比如蛋白胨、胰胨或者乳清。
更具体地说,本发明的主题是一种用于生产脂肪酶的方法,该方法包括:
a)在允许脂肪酶产生的条件下用于培养使用表达载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤,所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒;
b)用于回收由所述培养基的上清液产生的脂肪酶的步骤;
该方法的特征在于,用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料(例如乳清)或它们的酶消化产物(例如胰胨或蛋白胨)所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行。
根据所述方法的优选实施方式,根据步骤a)的所述培养基包含:
-作为氮源的无机氮,并且优选硫酸铵;
-碳源,其选自于碳水化合物来源的碳源,多元醇例如甘油、以及脂类来源的碳源例如脂肪酸和甘油酯;以及
-无机盐、微量元素和维生素。
根据所述方法的另一个优选的实施方式,步骤a)包括:
a1)用于在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养如上限定的转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤;以及
a2)所述细胞的发酵步骤,包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期,以及在含有选自短链、中链或长链三酸甘油酯的脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶合成期。于是,发酵在允许细胞生长的第一种情况下进行,例如在存在碳水化合物来源的碳源时进行,以及在允许生物合成所述脂肪酶的条件下的第二种情况下进行,例如在存在脂肪酸型的化学诱导剂作为唯一碳源时进行,该化学诱导剂包括比如短链三酸甘油酯(例如三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(比如三辛酸甘油酯)或长链三酸甘油酯(例如橄榄油或者三油酸甘油酯)。
优选进行发酵时,常数pO2为15%~25%,并且优选pH小于6.5。例如发酵可以在下述条件下进行:空气流量约为1vvm,其中一个vvm单位是每液体体积每分钟1体积的空气(例如,对于一个30升的发酵罐,1vvm等于30l/min;而对于一个5升的发酵罐,1vvm等于51/min)。
根据本实施方式的优越特征,进行预培养步骤a1)直至OD600nm值为3~10每1mL,并且在发酵步骤a2)中,当培养液的OD600nm值达到60~70每1mL时开始所述脂肪酶合成期。
根据本实施方式的另一个优越特征,当OD600nm值达到300~350每毫升时启动步骤b)。另外步骤b)可以包括:
b1)从所述培养液上清液中分离脂肪酶;
b2)在步骤b1)中得到的脂肪酶的纯化。
这两个步骤按本领域已知的传统方法进行:物理分离(过滤、层析、离心法)或者物理化学分离法(沉淀法)。
从上清液中分离脂肪酶可以由本领域的技术人员进行,例如通过选自中空纤维切向过滤、正面过滤以及连续式或分批式离心法的技术进行。
脂肪酶的纯化尤其包括降低生物载荷(bioload),即,微生物的存在,并且可以通过本领域的技术人员所熟知的任何合适的纯化技术进行,例如选自过滤、分级沉淀、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析的技术。
任选地,用于生产根据本发明的脂肪酶的方法也可以包括浓缩或富集步骤,该步骤包括提高制品中脂肪酶的浓度。这样的步骤例如可以在提纯步骤之后进行。也可以与该提纯步骤同时进行。
根据本发明的生产方法尤其有可能以约1至3g的纯化脂肪酶每升培养液上清液的量生产出重组体脂肪酶。在特别优越的方式中,根据本发明的方法允许生产催化活性大于培养液上清液的15,000U/mL的重组体脂肪酶制品。优选所述制品的活性大于培养液上清液的20,000U/mL。在pH6时通过使用三辛酸甘油酯作为底物测定这些数值。脂肪酶制品的该活性值对于本申请上下文的药剂开发尤其重要。实际上现在可以给药剂量降低的根据本发明方法生产的脂肪酶,同时保持足够的效力以得到欲期的治疗效果,例如可以是与脂肪酶缺乏有关的胰腺不足相关的脂肪吸收障碍的矫正。
现在根据本发明的方法,在无需动物来源的产物的情况下通过使用重组体解脂耶氏酵母菌株可以生产出脂肪酶Lip2,该事实成为重要的优势,并且大大地促进了脂肪酶用于医疗目的的应用。
用于获得在本发明的方法中使用的重组体解脂耶氏酵母细胞的表达载体是一整合载体,其具有至少一个拷贝的LIP2基因和用于调节表达的元件。然后该载体可以被整合入质粒DNA或者整合入酵母的基因组DNA。整合载体的一个尤其优选的例子是如国际申请WO 01/83773所述的载体JMP6或载体JMP10。载体JMP6包含有LIP2基因的表达盒,其编码解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前体,其上游设置用于酰基CoA氧化酶ACO2的称为POX2的解脂耶氏酵母启动子。载体JMP10也包含LIP2基因,其上游是用于Lip2脂肪酶的解脂耶氏酵母启动子。这两种启动子可被三酸甘油酯和脂肪酸诱导。在这些载体中的各个中,表达盒和启动子被设置在如上所述Zeta序列之间。该整合可以是靶向整合,即针对某位点,或者是随机的整合。因此,当转化的解脂耶氏酵母菌株不含Zeta序列时(例如,PO1d菌株的情形),表达盒的整合分散于所述菌株基因组DNA中。另一方面,当解脂耶氏酵母菌株包含Zeta序列(例如,E150菌株的情形)时,整合主要针对这些序列。
根据所述方法的另一个优选的实施方式,转化的解脂耶氏酵母菌株优选是称为YL-LIP2-6C的菌株,该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,C.N.C.M.,28 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15),保藏编号为I-3542。该YL-LIP2-6C菌株遗传学稳定。
为本发明的目的,在此使用的术语“稳定”、“遗传学稳定”、“基因稳定”及其变化表述是指,对于将所研究的核酸整合入克隆的DNA而言相同数量的基因座至少保持30代。选用30代这一数量作为计算遗传稳定性的基础,是因为本发明人注意到该数量对应于细胞群的许多次复制,足以允许使用一方法进行脂肪酶的生产,所述方法包含至少一个预培养重组体解脂耶氏酵母细胞的步骤和一个在适当的发酵条件下生产脂肪酶的步骤。为本发明的目的,世代被定义为细胞群的复制,并且可以根据公式Y=X×2g计算,其中Y是在时间t时的细胞群(例如,表示为细胞密度);X是在时间t0时的启始细胞群,并且g代表细胞群从数值X至数值Y所必需经过的传代数。优选在至少30代以后,当至少90%的被分析菌落含有与起始克隆相同数量的所研究基因的基因座时,克隆被认为是遗传学稳定的。因此,作为明显的例子,克隆YL-LIP2-6C被认为是稳定的,这是因为在100代后,几乎100%的被分析菌落含有6个LIP2基因的基因座(一个基因座对应于用于整合LIP2基因的表达盒的内源性LIP2基因+5个基因座)。
令人惊讶的是,当根据本发明的方法使用这一特殊的菌株时,本发明人成功地大量地生产出重组体脂肪酶,并且在整个所述生产期间进行较好的控制。本发明人的确成功地提高了脂肪酶的产率,并且尤其能够得到1~3g纯脂肪酶每升培养液上清液的产率。他们也能得到活性接近20,000U/mL的脂肪酶制品。
为本发明的目的,脂肪酶的活性对应于其酶催化活性。脂肪酶溶液的催化活性表示为单位(U)每毫升分析溶液。比活力表示为单位(U)每毫克纯化蛋白质(脂肪酶)。一个单位相当于每分钟能够催化释放1μmol脂肪酸的酶量。脂肪酶的比活力根据用作底物的三酸甘油酯的性质变化。
除提高脂肪酶的产率之外,本发明人也能提供生产方法较好的再现性,提高最终产品的均一性,并且改善用于纯化脂肪酶的条件。
因此,这些各种改进可以获得满足医疗用途所需条件的脂肪酶。事实上,在他们的研究的上下文中,本发明人现在已经观察到,Lip2脂肪酶在pH值大于3并且直至pH值接近8的范围内具有活性,最优的活性在pH 5~6之间。另一方面,其在pH 3或者pH 8.5下保温2小时会不可逆地失活。经分析,Lip2脂肪酶的比活力也与不同的底物有关,并且本发明人因此测定在pH4下纯化脂肪酶对于短链三酸甘油酯(三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(三辛酸甘油酯)和长链三酸甘油酯(橄榄油)的比活力值分别为约10,760U/mg、约16,920U/mg和约12,260U/mg。最后,本发明人惊讶地观察到,Lip2脂肪酶在胆盐存在时具有活性,并且该活性随着胆盐的浓度而增加。直到现在,仅仅发现与辅助脂肪酶相结合的胃脂肪酶和胰脂酶在胆盐存在时具有这种活性。因此,具有较高比活性的Lip2脂肪酶的应用不需要辅助脂肪酶的存在。
克隆YL-LIP2-6C含有数个拷贝的该Lip2脂肪酶的表达盒,导致在不同的基因座处产生5次LIP2基因的整合。当置于适合产生脂肪酶的条件下时,相比现有技术领域的转化解脂耶氏酵母菌株,克隆YL-LIP2-6C生产出更多的脂肪酶。脂肪酶的产率大于1g/L培养液上清液,即,大于如上所述观察到的现有技术领域克隆的产率。
本发明的主题还涉及脂肪酶制品,其可以通过根据本发明的方法而得到。
根据所述脂肪酶制品的优选实施方式,当按如上所指出的方法测定时,其活性至少等于15,000U/ml,优选大于20,000U/ml。
另外,本发明的主题还涉及根据本发明的脂肪酶制品用于制备药物的应用,其目的在于治疗与脂肪(例如短链、中链或长链脂肪酸)吸收失调有关的疾病,尤其是与胰腺不足、特别是外分泌胰腺不足相关的疾病。
本发明的主题还涉及一种药物,其特征在于,其包含如上限定的脂肪酶制品。
本发明的主题还涉及一种用载体转化的解脂耶氏酵母菌株,所述载体用于表达酵母耐酸脂肪酶,其特征在于,该菌株是称为YL-LIP2-6C的克隆,其于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.,28 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex15),保藏编号为I-3542。
另外,本发明的主题还涉及如上限定的细胞用于生产酵母耐酸脂肪酶的应用。
附图说明
除前述特征外,本发明还包括如下说明书中出现的其他特征,下面参照实施本发明方法的实施例和下述附图,对这些特征进行描述:
-图1显示了用于在生产脂肪酶的方法期间控制YL-LIP2-6C克隆的遗传稳定性的总体方法。
-图2显示了在发酵工艺期间,在600nm下光密度(OD600nm,左侧Y轴)的变化(-◆-)和生长速率(h-1,右侧Y轴)的变化(-■-)与时间(小时,X轴)的关系。箭头显示了诱导脂肪酶的产生。
-图3显示了在不同的基因座处将LIP2基因整合入23个菌落的基因组(车道24至43)的整合次数的Southern blot分析,菌落收集时间点T33对应于发酵结束,即在发酵开始后约100小时。拷贝数1~6:6个LIP2基因的基因座(5个用于整合LIP2基因表达盒的基因座+1个用于内源性LIP2基因的基因座)。M:大小标记。
-图4显示了在T16至T33的生产期间YL-LIP2-6C克隆产生重组体脂肪酶的SDS-PAGE监测情况。箭头显示了诱导产生脂肪酶(T17,发酵48小时)。M:分子量梯度;右手部分凝胶中的五个泳道对应于已知量(2.5μg至20μg)的纯化Lip2脂肪酶。
-图5显示了在时间点T33(发酵工艺终点)处上清液中脂肪酶纯度的SDS-PAGE分析情况。MW:分子量梯度;参照Lip2 F5:Lip2脂肪酶范围1至10μg;YL-LIP2-6C上清液:被分析的上清夜的体积为μL。
-图6显示了通过MALDI-TOF型质谱分析法测定的YL-LIP2-6C克隆生产的重组体脂肪酶的质谱。
具体实施方式
实施例1--材料和方法
1)使用的培养基
显示的最终浓度是母液中的浓度。
未富集的基础培养基02130S
成分 | 最终浓度 |
葡萄糖 | 10g/l |
KH2PO4 | 3g/l |
Na2HPO4 | 3g/l |
H3BO3 | 0.34g/l |
(NH4)2SO4 | 3g/l |
C5H8O4NNa(谷氨酸) | 1g/l |
MgSO4 | 0.5g/l |
CaCl2 | 0.023g/l |
MnSO4 | 0.038g/l |
ZnSO4 | 0.04g/l |
另外富集培养基02130S包含下述添加剂:
添加剂 | 最终浓度 |
微量元素溶液 | 1ml/l |
维生素溶液 | 1ml/l |
微量元素溶液配方
成分 | 最终浓度 |
CoCl2 | 0.5g/l |
Na2MoO4 | 0.06g/l |
CuSO4 | 0.9g/l |
维生素溶液配方
成分 | 最终浓度 |
D-生物素 | 0.05g/l |
泛酸钙 | 1g/l |
烟酸 | 1g/l |
肌醇 | 25g/l |
硫胺盐酸盐 | 0.25g/l |
维生素B6盐酸盐 | 0.25g/l |
对氨基苯甲酸 | 0.05g/l |
无机盐溶液配方
成分 | 最终浓度 |
MgSO4 | 26.76g/l |
CaCl2 | 6.40g/l |
FeSO4 | 5.61g/l |
CoCl2 | 0.29g/l |
ZnSO4 | 7.72g/l |
Na2MoO4 | 0.09g/l |
H3BO3 | 0.34g/l |
MnCl2 | 0.47g/l |
CuSO4 | 0.61g/l |
FeSO4溶液配方
成分 | 最终浓度 |
FeSO4 | 0.9g/l |
氨水溶液,14%
消泡液:Struktol J673稀释至1/10倍(Schill+Seilacher AG,Moorfleeter Str 28,22113,汉堡,德国)
2)基因组DNA的提取和Southern blot分析
a)基因组DNA的提取
将由4mL培养物中得到的细胞团粒悬浮在0.5mL的山梨糖醇缓冲液(0.9M山梨糖醇;0.1M的tris-HCl,pH 8.0;0.1M EDTA)中。以0.28M的浓度添加50μL的20T(6mg/mL)(Euromedex,67458 Mundolsheim Cedex,法国)、50μL的2-巯基乙醇,并且将溶液在37℃下搅拌(180rpm)保温1小时。溶液离心,并且将细胞团粒悬浮在0.5mL的TE缓冲液(50mM的tris-HCl,pH 8;20mM EDTA)中。添加50μL的10%SDS,通过倒置混合溶液,并且在65℃下保温20分钟。添加0.2mL的5M乙酸钾,然后混合溶液,并且在冰中保持30分钟,然后离心5分钟。
将上清液转移至1.5mL试管中,然后添加0.8mL预先在冰中冷却的100%乙醇。通过倒置混合溶液,然后离心。在除去上清液后,添加0.4mL含有100μg/ml的RNase A(Invitrogen,美国)的TE缓冲液,并且将溶液在37℃下保温1小时。在添加1mL预先在冰中冷却的100%乙醇后,轻轻地混合溶液,直至DNA沉淀,然后离心。除去上清液,然后将DNA团粒在大气中自然干燥,然后悬浮在100μL的无菌水中,然后在4℃下保温过夜。
b)用酶HindIII消化
通过测定260nm(A260)和280nm(A280)下的吸光度,测量基因组DNA的浓度。将1μg的基因组DNA与无菌水混合至42.5μL的最终体积。添加5μL的缓冲液(5X)和2.5μL的HindIII(50u/μL)(Invitrogen,美国),并且将溶液在37℃下4小时。
c)Southern blot分析
按照从罗氏诊断公司(Roche Diagnostic)购买的“DIG High Prime DNA Labeling andDetection”试剂盒所述的工序,进行Southern blot型转印。
d)标记探针的工序
借助于酶Phusion DNA聚合酶(Finzyme)和下述两种引物,通过在基因组DNA上进行PCR,得到了对应于编码Lip2脂肪酶的完整基因的探针:
正义引物:5′-GTGTACACCTCTACCGAGACCTCT-3′(SEQ ID No.1)
反义引物:5′-TTAGATACCACAGACACCCTCGGT-3′(SEQ ID No.2)
在PCR反应后,借助于"Nucleospin Extract II"试剂盒(Macherey Nagel),将探针进行凝胶纯化。然后借助于购自罗氏公司的“DIG high prime DNA labeling”试剂盒,对纯化的探针进行金标记(digoxygenin)。
e)凝胶分离、DNA转印和信号检测
将2μg的HindIII消化的DNA与加载的缓冲液混合,然后在0.8%琼脂糖凝胶上沉淀。在50V下进行2小时30分钟的迁移,然后将DNA转印到Hybond+薄膜(AmershamBioscience公司)上。利用在薄膜上标记探针的杂交、接着通过X-射线曝光目测,检测基因组DNA中LIP2基因的基因座数量。
3)蛋白质浓度的测定
通过Bradford方法测定蛋白质浓度。借助于Bradford方法直接在发酵培养的上清液上进行蛋白质定量。将这样测定蛋白质的量与纯化Lip2脂肪酶的已知量相比较。在试管内,将20μL的标准样以适当的稀释度与1mL含有染料的经稀释(5倍)的试剂混合。然后相对于得到的对照物(单独的稀释染料)OD595值来测定样品OD595值。
4)重组体脂肪酶比活力的测量
借助于pH滴定设备(RADIOMETER),于37℃下对脂肪酶的活性进行电位滴定法测量。使用的底物是三辛酸甘油酯。使10mM的底物在15mL含有1mM tris-HCl(pH 5.5)、150mM NaCl,5mM CaCl2和4mM牛磺脱氧胆酸钠(sodium taurodeoxycholate)(SIGMA公司)的反应缓冲液中乳化。将比活力单位定义为每分钟每毫克蛋白质释放1μmol脂肪酸。
5)变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
将包含25%含有SDS和还原剂的混合物的12μL的样品加载至4-12%的bistris凝胶(Biorad)上。在160V下进行45min迁移。
然后通过用考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色来分析凝胶。
6)通过MALDI-TOF(基质协助激光解吸电离-飞行时间)型质谱分析法,测定YL-LIP2-6C克隆生产的Lip2脂肪酶的分子量
通过使用购自Perseptive Biosystems公司(马萨诸塞州(Framingham),MA)、具有在337nm发射的氮激光器的“Voyager Elite XL time of flight”质谱仪,进行激光解吸/电离型质谱分析。通过使用具有25kV加速电压、0.3%栅极电流、0.3%离子引导电流、以及1000ns停滞时间的线性的和延迟抽出模式(delayed extraction mode),得到了Lip2蛋白质正离子模式(positive mode)的质谱。每一个光谱都是100个激光脉冲方式的结果。将待分析的材料与相等体积的芥子酸(Fluka)饱和溶液混合,所述芥子酸饱和溶液是在含有50%(v/v)乙腈/三氟乙酸水溶液的溶液中制备的。将2μL等分的这种混合物沉淀在不锈钢样品平板上,并且在进行分析之前在大气中自然干燥。借助α-糜蛋白酶原A(Sigma),进行外部校准。表示的数值是平均值,并且对应于离子[M+H]+。
实施例2--表达载体的构建和YL-LIP2-6C克隆的产生
通过用专利申请EP1 108 043所述的、称为JMP6的、并且包含编码解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前体的LIP2基因的表达载体来转化不含Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株PO1d,得到了YL-LIP2-6C菌株,所述LIP2基因的上游是ACO2启动子。如上所述,所述表达盒侧翼为Zeta序列。根据专利申请EP1108043所述的方法,进行载体JMP6的构建和PO1d菌株的转化。包含5个不同的用于LIP2基因表达盒整合的基因座的该YL-LIP2-6C菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(CNCM,28 rue duDocteur Roux,75724 Paris Cedex 15),保藏编号为I-3542。
实施例3--用YL-LIP2-6C菌株生产脂肪酶以及YL-LIP2-6C遗传稳定性的验证
使用YL-LIP2-6C菌株用于生产脂肪酶的方法,该方法包括适合于产生脂肪酶的预培养步骤和发酵步骤。该方法的综合法如图1所示。然后分析这样生产的脂肪酶的活性和质量。另外,通过测定LIP2基因的表达盒的基因座数量,分析了YL-LIP2-6C的遗传稳定性。
1)生产方法
预培养和发酵
将装在甘油小瓶中的YL-LIP2-6C克隆保藏液解冻,并且取5μL保藏液加入25mL的富集02130S培养基中,在250mL锥形瓶(Erlen Meyer bottle)中培养,所述培养基含有1%(v/v)的维生素溶液和1%(v/v)的微量元素溶液。将培养物在28℃下搅拌(180rpm)温育36小时。将得到的25mL预培养物(预培养物1)接种入装在2升锥形瓶中的200mL的富集02130S培养基中,在28℃下搅拌(180rpm)温育36小时。将这样得到的预培养物2(225mL)接种在发酵罐内的富集02130S培养基中。
在发酵工艺的时间点T0处,将2mL的FeSO4溶液添加至培养液。每隔6至9小时,将2至3mL的维生素溶液添加至发酵培养液,并且在发酵34小时后(在T12处),启动葡萄糖的供应。葡萄糖供应量逐渐提高持续14小时,然后在T17(对应于发酵48小时)中断,然后启动用油酸的诱导。在接下来的54小时,油酸的供应逐渐增加,然后在T33(发酵102小时)时OD600值达到340,终止发酵工艺。将最终的3升培养液离心(14,000rpm)。回收上清液并且在-20℃下储存。
培养液的监测
在发酵期间,监测温度、氧分压和pH,并且分别保持在28℃、20%和6.2。大约每隔3小时,采集培养液样品并且测量OD600值,以便监测生长速率的变化。结果显示于图2中。取两个1mL该样品的提取物,以14,000rpm离心5min,并且将细胞团粒和上清液在-20℃下储存。表I显示了发酵工艺的监测情况。
脂肪酶的纯化
任选地,进行用于纯化脂肪酶的附加步骤。
借助于切向微过滤设备,在陶瓷薄膜(购自PALL公司的pilot X6型)上从培养液中分离脂肪酶,该薄膜允许尺寸大于截流尺寸(0.1μm)的酵母保留下来。首先以浓缩模式、然后以渗滤模式来回收含有脂肪酶的渗透液。根据厂商的介绍进行这些步骤,包括适当的改进。包含在渗透液中的微生物的浓度然后通过过滤(0.2μm)(Millipore公司)而降低,从而得到小于10cfu/mL的生物载荷。通过使用Profux M12设备(Millipore公司),将脂肪酶溶液浓缩至约5升的体积,并且通过使用Biomax 10kDa标准Pellicon薄膜进行切向超滤作用,以便除去低分子量的杂质。除去不包含脂肪酶的超滤液。然后按如上所述通过除去微生物,再次提纯脂肪酶溶液,从而得到小于5cfu/mL的生物载荷。可以另外冻干这样纯化得到的脂肪酶。
3)YL-LIP2-6C生产的重组体脂肪酶的表征
a)在发酵工艺期间监测YL-LIP2-6C菌株生产脂肪酶
在各个测量点,对培养液样品进行离心法,并且通过SDS-PAGE分析上清液。将75μL的上清液与75μL水混合,然后取5μL加载于26孔凝胶上。含有已知量Lip2脂肪酶的样品也被分析。结果如图4所示。通过将在发酵终止(T33)_时得到的脂肪酶量与已知量Lip2脂肪酶的斜率相比较,可以估计出在发酵100小时后得到的脂肪酶浓度是1.5g/L。
此外,本发明人使用根据本发明生产脂肪酶的方法,最终体积约为35升,其使得脂肪酶的生产产率为1~3g每升培养液上清液。
b)蛋白质浓度的测定和重组体脂肪酶产率的估计
如实施例1所示(Bradford方法)测定培养液上清液中的蛋白质浓度。进行七次单独的测量,并且上清液中蛋白质浓度是2.3g/L。通过SDS-PAGE估计上清液中Lip2蛋白质的纯度。结果如图5所示。纯度估计为约70%。因此,使用YL-LIP2-6C克隆由发酵步骤得到的脂肪酶产率是1.6g/L。
c)YL-LIP2-6C生产的重组体脂肪酶的比活力测量
如实施例1所示测量由YL-LIP2-6C克隆生产的脂肪酶的比活力。在缓冲液中将对应于发酵上清液的样品稀释100倍,该缓冲液含有50mM的Na2HPO4、50mM的KH2PO4、150mM的NaCl,pH 6.0。在37℃下用三辛酸甘油酯进行3次独立实验而测定的催化活性是21,883.33U/mL上清液(表II)。
表II:发酵上清液样品活性的测量
从上清液中Lip2脂肪酶的估计浓度(参见上面)看,脂肪酶的比活力是13,675U/mg,可与为临床研究生产的脂肪酶的比活力相比较。由YL-LIP2-6C克隆产生的脂肪酶的比活力符合临床批量所需要的条件。
d)重组体脂肪酶的分子量
在离心后,无需纯化,对发酵培养液上清液进行质谱分析(参见实施例1)。结果如图6所示。观察的主峰显示了37,648Da的分子量。由YL-LIP2-6C生产的Lip2脂肪酶具有合理的分子量,这是因为该观测值符合临床批量所需要的条件,即37,500+/-1000Da。
该实施例显示了稳定克隆YL-LIP2-6C的筛选(在该情况下,在30代后分析的100%克隆具有与初始克隆相同数量的LIP2基因的基因座)。另外,所述克隆的遗传稳定性不受用于生产脂肪酶的培养条件的影响(在预培养期间;就在发酵之前;就在通过油酸诱导脂肪酶产生之前;在发酵终止)。
3)YL-LIP2-6C克隆的遗传稳定性
在时间点T0、T17和T33筛选的菌落中,通过测定解脂耶氏酵母DNA中在不同的基因座整合的LIP2基因的表达盒的发生数,分析了YL-LIP2-6C克隆在包括预培养步骤和发酵步骤的生产脂肪酶方法期间的遗传稳定性。
菌落的筛选
稀释预培养物2的样品(T0,发酵开始)、在T17时(就在诱导之前)和在T33时(发酵终点)发酵条件下的培养液样品,在第一情况下稀释至OD600=1,然后稀释1000倍。将10μL的该稀释溶液各自涂布在3个YPD培养基培养平板上。然后平板在28℃下温育48小时,并且然后在4℃下储存直到筛选出用于基因座数量分析的菌落。
将20个来源于在发酵开始点(T0)收集的样品的菌落、20个来源于就在诱导(T17)之前收集的样品的菌落、和100个来源于在发酵终止时(T33)收集的样品的菌落分别接种在4mL的富集02130S培养基中,然后培养72小时。接着,在30%甘油中制备保藏液,用于DNA的提取和Southern blot分析(见材料和方法部分)。
b)对于140个来源于YL-LIP2-6C菌株的菌落,测定在不同的基因座处LIP2基因整合的发生数
对于在20个在时间点T0(发酵开始)收集的菌落上、20个在时间点T17(发酵48小时)收集的菌落上、和100个在时间点T33(发酵100小时)收集的菌落上的不同的LIP2基因的基因座整合的发生数的Southern blot分析结果如图3所示。结果表明,分析的所有菌落都含有6个LIP2基因的基因座。因为野生型菌株含有一个拷贝的内源性LIP2基因,因此YL-LIP2-6C菌株含有5个用于整合LIP2基因表达盒的基因座。因此YL-LIP2-6C克隆在100个小时发酵工艺期间是100%稳定的。
序列表
<110>法国米奥里大药厂
伊夫.勒布隆
尼古拉斯.穆兹
<120>用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用
<130>F269Cas39PCT
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物正义序列
<400>1
gtgtacacct ctaccgagac ctct 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物反义序列
<400>2
ttagatacca cagacaccct cggt 24
Claims (5)
1.一种酵母耐酸的重组体脂肪酶制品,其通过包括下述步骤的方法得到:
a)培养解脂耶氏酵母细胞的步骤,所述细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆,所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.),保藏编号为I-3542;以及
b)从培养液上清液中回收用所述细胞生产的所述重组体脂肪酶的步骤,
该方法的特征在于,
所述步骤a)包括:
a1)在由下述成分组成的培养基中预培养所述解脂耶氏酵母细胞:
其中所述培养基用下述添加剂富集:
添加剂 最终浓度
微量元素溶液 1ml/l
维生素溶液 1ml/l
其中微量元素溶液配方为:
维生素溶液配方为:
a2)发酵步骤,包括:
-在步骤a1)的培养基中的细胞生长期,以及
-在含有油酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶生产期,
并且所述重组体脂肪酶制品在pH6时的催化活性为15,000至22750个单位每毫升培养液上清液,其中一个单位对应于当使用的底物是三辛酸甘油酯时每分钟能催化释放1μmol脂肪酸的酶的量,是在含有50mM的Na2HPO4、50mM的KH2PO4、150mM的NaCl、pH6.0的缓冲液中、于37℃下测量的脂肪酶活性;并且/或者所述重组体脂肪酶制品中所述脂肪酶的浓度大于1g脂肪酶/L。
2.如权利要求1所述的重组体脂肪酶制品,其特征在于,所述重组体脂肪酶制品在pH6时包含的催化活性为20,000至22750个单位每毫升培养液上清液。
3.如权利要求1或2所述的重组体脂肪酶制品的应用,用于生产治疗与胰腺不足相关的脂肪吸收不良综合症的药物。
4.一种用于治疗与脂肪吸收失调有关的疾病的药物,其特征在于,包含如权利要求1或2所述的重组体脂肪酶制品。
5.如权利要求4所述的药物,其特征在于,所述疾病是与胰腺不足相关的脂肪吸收不良综合症。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/FR2006/001352 WO2007144475A1 (fr) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | Procede de production de lipase, cellule de yarrowia lipolytica transformee apte a produire ladite lipase et leurs applications |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210067382.0A Division CN102703404B (zh) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101506359A CN101506359A (zh) | 2009-08-12 |
CN101506359B true CN101506359B (zh) | 2013-09-04 |
Family
ID=37591884
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2006800549402A Active CN101506359B (zh) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8334130B2 (zh) |
EP (1) | EP2035556B1 (zh) |
JP (1) | JP5592648B2 (zh) |
KR (1) | KR101497159B1 (zh) |
CN (1) | CN101506359B (zh) |
AU (1) | AU2006344466B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0621829B8 (zh) |
CA (1) | CA2657949C (zh) |
CR (1) | CR10515A (zh) |
CU (1) | CU24009B1 (zh) |
DK (1) | DK2035556T3 (zh) |
EA (1) | EA017963B1 (zh) |
EC (1) | ECSP099057A (zh) |
ES (1) | ES2550537T3 (zh) |
HK (1) | HK1129702A1 (zh) |
MX (1) | MX2008015978A (zh) |
NO (1) | NO342291B1 (zh) |
NZ (1) | NZ573601A (zh) |
PL (1) | PL2035556T3 (zh) |
PT (1) | PT2035556E (zh) |
SI (1) | SI2035556T1 (zh) |
UA (1) | UA97246C2 (zh) |
WO (1) | WO2007144475A1 (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2327776A1 (en) | 2009-11-30 | 2011-06-01 | Institut National De La Recherche Agronomique | Method for the production of Very Long Chain Fatty Acids (VLCFA) by fermentation with a recombinant Yarrowia sp |
US20130295605A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-11-07 | Csir | Method for producing a polypeptide in yarrowia lipolytica |
CN102533692A (zh) * | 2010-12-08 | 2012-07-04 | 刘刚 | 一种酸性条件下具有降解脂肪能力的脂肪酶 |
CN106754446B (zh) * | 2016-10-31 | 2020-05-19 | 华中科技大学 | 一种转化解脂耶氏酵母及其构建方法与应用 |
AU2020336468A1 (en) | 2019-08-30 | 2022-03-03 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Engineered lipase variants |
FR3111559A1 (fr) * | 2020-06-18 | 2021-12-24 | Azurrx Biopharma, Inc. | Formulations non porcines et leurs procédés |
KR102510688B1 (ko) | 2022-06-15 | 2023-03-17 | 아스티스(주) | 야로위아 리폴리티카 변이균주 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0706562A4 (en) * | 1993-07-01 | 2000-12-06 | Merck & Co Inc | CULTURE MEDIUM FOR RECOMBINANT YEAST |
PT1276874E (pt) | 2000-04-28 | 2008-01-11 | Mayoly Spindler Lab | Clonagem e expressão de uma lipase extracelular resistente aos ácidos de yarrowia lipolytica |
CN101084307B (zh) * | 2004-09-30 | 2011-06-01 | 诺维信股份有限公司 | 具有脂肪酶活性的多肽和编码其的多核苷酸 |
-
2006
- 2006-06-15 WO PCT/FR2006/001352 patent/WO2007144475A1/fr active Application Filing
- 2006-06-15 PL PL06764790T patent/PL2035556T3/pl unknown
- 2006-06-15 AU AU2006344466A patent/AU2006344466B2/en active Active
- 2006-06-15 EP EP06764790.9A patent/EP2035556B1/fr active Active
- 2006-06-15 EA EA200970012A patent/EA017963B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-06-15 DK DK06764790.9T patent/DK2035556T3/en active
- 2006-06-15 BR BRPI0621829A patent/BRPI0621829B8/pt active IP Right Grant
- 2006-06-15 US US12/304,822 patent/US8334130B2/en active Active
- 2006-06-15 UA UAA200814355A patent/UA97246C2/ru unknown
- 2006-06-15 CA CA2657949A patent/CA2657949C/fr active Active
- 2006-06-15 CN CN2006800549402A patent/CN101506359B/zh active Active
- 2006-06-15 PT PT67647909T patent/PT2035556E/pt unknown
- 2006-06-15 SI SI200631987T patent/SI2035556T1/sl unknown
- 2006-06-15 NZ NZ573601A patent/NZ573601A/en unknown
- 2006-06-15 ES ES06764790.9T patent/ES2550537T3/es active Active
- 2006-06-15 KR KR1020097000800A patent/KR101497159B1/ko active IP Right Grant
- 2006-06-15 MX MX2008015978A patent/MX2008015978A/es active IP Right Grant
- 2006-06-15 JP JP2009514831A patent/JP5592648B2/ja active Active
-
2008
- 2008-12-09 NO NO20085119A patent/NO342291B1/no unknown
- 2008-12-15 CU CU2008000242A patent/CU24009B1/es active IP Right Grant
- 2008-12-17 CR CR10515A patent/CR10515A/es unknown
-
2009
- 2009-01-12 EC EC2009009057A patent/ECSP099057A/es unknown
- 2009-09-17 HK HK09108505.2A patent/HK1129702A1/zh unknown
-
2012
- 2012-08-10 US US13/571,869 patent/US8834867B2/en active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Biotechnology》.2003,第19卷(第1期),17-20. * |
M.M. Camargo-de-Morais,et al.Oil/mineral-salts medium designed for easy recovery of extracellular lipase from Fusarium oxysporum AM3.《World Journal ofMicrobiology & Biotechnology》.2003,第19卷(第1期),17-20. |
M.M. Camargo-de-Morais,et al.Oil/mineral-salts medium designed for easy recovery of extracellular lipase from Fusarium oxysporum AM3.《World Journal ofMicrobiology & * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101506359B (zh) | 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 | |
Uma et al. | Production and properties of invertase from a Cladosporium cladosporioides in SmF using pomegranate peel waste as substrate | |
CN1216061A (zh) | 具有磷脂酶活性的蛋白质 | |
RU2642290C2 (ru) | Применение активности эндогенной днказы для понижения содержания днк | |
Taskin et al. | Lipase production with free and immobilized cells of cold-adapted yeast Rhodotorula glutinis HL25 | |
CN102703404B (zh) | 用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用 | |
EP0036737B1 (en) | Lactase preparation | |
CN100402640C (zh) | 内酯酶的制造方法及其应用 | |
KR100773075B1 (ko) | 클루이베로마이세스 푸레질리스 변이주 및 이로부터 생산된락타아제 | |
Qureshi et al. | Production of alkaline phosphatase from newly isolated Aspergillus fumigatus EFRL05 | |
CN110938554B (zh) | 一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株 | |
JPH09224688A (ja) | B.セレウスからのdna−配列、該配列を含有するベクター、大腸菌属の微生物、ロイシン−デヒドロゲナーゼの製法、及び非蛋白質由来l−アミノ酸の製法 | |
US20220298534A1 (en) | Method for increasing the production of small molecules in submerged corynebacterium culture | |
KR101095468B1 (ko) | 체지방 분해에 관여하는 콜레스테롤 산화효소를 생산하는 신규한 노카디아 속 nes115 균주와 이를 이용한 콜레스테롤 산화효소의 생산방법 | |
AU2002314063A1 (en) | Process for the fermentative preparation of l-amino acids using coryneform bacteria | |
EP0179789A1 (en) | Method of production of quinoproteins | |
JP4426664B2 (ja) | ホスホリパーゼdおよびその製造法 | |
CN115895918A (zh) | 一种裂解性多糖单加氧酶及其应用 | |
JPS62118883A (ja) | リパ−ゼの生産方法 | |
Uma et al. | Optimized Production and Characterization of β-fructofuranosidase from Penicillium brevicompactum | |
JPS6328389A (ja) | β−グルコシダ−ゼ及びその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |