JP4426664B2 - ホスホリパーゼｄおよびその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大豆、卵黄、魚介類に含まれているホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質と各種水酸基をもつ化合物とから、乳化剤、農薬、医薬、食品、工業用試薬等に有用なリン脂質誘導体を製造するのに用いられるホスホリパーゼＤ、その製造方法及びホスホリパーゼＤを産生する新規微生物に関するものである。
【従来の技術】
ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。この酵素は、その起源によっては加水分解反応以外に、グリセロール、セリン、エタノール、フェノール等のアルコール性およびフェノール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスファチジル基を上記水酸基を有する化合物に転移させ、新たなリン酸エステルを生成する反応（ホスファチジル基転移反応）を生起させる作用を有する。
【０００２】
この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス属、ミクロノスポラ属、ノカルディオプシス属、アクチノマデューラ属又はノカルディア属等の微生物を用いた発酵法により製造できることが知られている。例えば、特公昭５２−３９９１８号公報、特公昭５８−５２６３３号公報、特公平１−１２４７４号公報、特公平８−８８６６号公報、特開昭５８−６３３８８号公報、特開昭５８−６７１８３号公報、特開昭６０−１６４４８３号公報、特開平４−１６６０８３号公報、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５１巻、９号、２５１５−２５２４頁（１９８７年）、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１１９３頁（１９９０年）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Bioscience Biotechnology Biochemistry)５７巻、１１号、１９４６−１９４８頁（１９９３年）およびバイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１２５５巻、２７３−２７９頁（１９９５年）を参照されたい。しかしながら、これら従来の製造法により得られるホスホリパーゼＤは、それぞれ基質特異性、反応性などが異なっており、新規な特性を有するホスホリパーゼＤの提供が望まれている。
又、従来の製造方法によると、ホスホリパーゼＤ産生能を有する菌株を用いた発酵法により作られる培養液中に占める夾雑タンパク質の生成量が多く、従って培養液中のホスホリパーゼＤの純度が低いといった問題がある。そのため食品等の製造に用いる際には夾雑タンパク質を取り除き、ホスホリパーゼＤを濃縮する工程を設ける必要の有る場合があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な特性を有するホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。
本発明は、又、ホスホリパーゼＤを高純度で得ることができる製造法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生する新規微生物を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産する能力を有する多数の微生物について、ホスホリパーゼＤの生産効率が高く、特にその培養物中にホスホリパーゼＤの占める割合が高く、夾雑タンパク質の生産量が低い菌株を探索する実験を繰り返した結果、岡山県上房郡賀陽町吉川地区で採取した土壌から分離した新菌株ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces.sp.）ＴＨ−２が優れた性能を有し、これにより上記課題を有効に解決できるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐＨ約８であることを特徴とするホスホリパーゼＤを提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌を提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤ生産菌を培地で培養し、産生したホスホリパーゼＤを回収することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐＨ約８で、カルシウム又はマグネシウムイオン要求性のホスホリパーゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌としては、ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２株を用いるのが好ましい。この株は、工業技術院微生物工業技術研究所に平成１１年３月２４日付けで寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９号である。その菌学的特徴を次に示す。
【０００６】
▲２▼細胞壁のアミノ酸組成および糖組成
胞子壁タイプ Ｉ型
ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ＋
meso−ジアミノピメリン酸 −
ジアミノ酪酸 −
グリシン ＋
アスパラギン酸 −
オルニチン −
リジン −
アラビノース*2 −
ガラクトース*2 −
主要キノン系 ＭＫ−９（Ｈ８）、−９（Ｈ６）、−９（Ｈ４）
【０００７】
【０００８】
この菌株が、ストレプトマイセス属のStreptomyces septatus に属し、新菌株であることは、Nonomura,H.: J.Ferment.Technol., 52, 78-92(1974)及びShirling.E.B. and Gotilleb.D.: Int.J.Syst.Bacteriol., 22, 265-394(1972) に基づいて決定した。
本発明のホスホリパーゼＤを製造するための、上記ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２の培養は、放線菌一般の培養に通常採用される方法に従って行うことができるが、特に好ましくは培地には炭素源として、例えばクエン酸、コハク酸、ブドウ糖、果糖等を単独で、または組み合わせて適宜行うことができる。また窒素源として、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、大豆タンパク等を用いることができる。培地には、他に食塩、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、各種ビタミン、その他、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を適宜添加することができる。好ましい培地ｐＨは５〜９、特に好ましくは６〜７である。培養法としては深部培養法が好ましいが、固体培養法を採用することもできる。培養は約２０〜４０℃で行うことができるが、好ましい培養温度は３３〜３５℃である。好ましい培養期間は温度、ｐＨ、培地によって異なるが、通常１〜６日程度であり、目的物であるホスホリパーゼＤの生産量が最大に達した頃に培養を停止する。
【０００９】
培養終了後、培溶液から菌体を遠心分離あるいはろ別し、その遠心上精あるいはろ液をホスホリパーゼＤ溶液として用いることができる。または、遠心上精あるいはろ液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮、採取するにあたっては、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、後述するホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２の生産するホスホリパーゼＤは以下の理化学的性質を有するものである。
（ａ）作用
▲１▼加水分解反応
一般式（Ｉ）で示されるリン脂質を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる。
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ1 及びＲ2 はアシル基またはアルキル基、Ｘは１つ以上の水酸基を含む塩基の水酸基１個を除いた後に残る有機基を表す。）
▲２▼ホスファチジル基転移反応
上記一般式（Ｉ）で表されるリン脂質のホスファチジル基を下記一般式（II）で示される水酸基を有する化合物の共存下、
【化２】
Ｒ3 −ＯＨ
（但し、Ｒ3 はアルコール性またはフェノール性水酸基に結合した有機基を表す。）
一般式（II）で表される化合物の水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式（III)で示されるリン脂質誘導体を生成する。
【００１２】
【化３】
【００１３】
（但し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同様の基を表す。）
本発明の酵素の移転反応における反応性／加水分解における反応性の比が３倍以上であるのが好ましい。
（ｂ）至適ｐＨ：約5.０
（ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９で安定
（ｄ）至適温度：約４０℃
（ｅ）熱安定性：
ｐＨ5.０およびリン脂質の非共存下において、６０℃、１０分間の熱処理でも全く失活しない。
（ｆ）分子量：
5.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による。）
（ｇ）等電点：
ｐＨ8.０（等電点電気泳道法による。）
（ｈ）Ｎ末端アミノ酸配列：
ＡｓｐＳｅｒＡｌａＡｓｐＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｌａＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｓｐＡｌａＶａｌＧｌｕＧｌｎＧｌｎＬｅｕＡｒｇＧｌｎ（エドマン反応を用いた気相法Ｎ末端アミノ酸配列決定法による。）
（ｉ）カルシウム又はマグネシウム要求性
カルシウムイオン（５０マイクロモル／ｍｌ）共存下におけるジパルミトイルホスファチジルコリンの加水分解活性を１００とした時の各種イオン存在下におけるホスホリパーゼＤの活性を表−１に示す。
【００１４】
【表１】
表−１
添加化合物 相対活性
なし ０
ＣａＣｌ2 １００
ＭｇＣｌ2 １７３
ＺｎＣｌ2 ０
ＣｄＣｌ2 ０
ＭｎＣｌ2 １１
ＦｅＣｌ2 ３
ＣｏＣｌ2 ２８
ＥＤＴＡ １
【００１５】
なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性は基質であるリン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分解した際に生じる塩基を定量することによって求める。一般的には、ホスファチジルコリンを基質とした場合に生じるコリンをコリンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを組み合わせて定量することにより加水分解活性を決定することが通例である。しかし、本発明ではより簡便な方法であるホスファチジルパラニトロフェノールを基質とした場合に生ずるパラニトロフェノールを直接定量することにより加水分解活性を決めた。なお、このホスファチジルパラニトロフェノールを基質とした場合ではカルシウムあるいはマグネシウムを活性に必要とはしない。この明細書に記載した酵素活性は、アナリティカ・キミカ・アクタ（Analytica Chimica Acta）３０４巻、２４９−２５４項（１９９５年）記載の方法により合成されるホスファチジルパラニトロフェノールを基質として用いる下記の方法により測定されたものであって、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離する酵素活性を１ユニット（ｕ）としている。
【００１６】
加水分解活性測定法：，ホスファチジルパラニトロフェノール３６０ｍｇに、ジエチルエーテル１ｍｌ加え溶解した後、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌ、および１０％トリトン×１００を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌを添加し、６０℃で溶液が透明になるまで加温する。これを減圧下でジエチルエーテルを留去し基質保存液（１６ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。基質保存液を、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）で２ｍＭホスファチジルパラニトロフェノールとなるように希釈したものを基質溶液とし、あらかじめ３７℃で加温する。基質溶液９５０μＬに対してあらかじめ３７℃で加温した酵素液５０μＬを添加後、混合しホスホリパーゼＤの加水分解反応によって遊離してくるパラニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度を測定することおよびパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数１8.４５から、１分間あたりのパラニトロフェノール生成量を換算し、酵素活性値を決定する。
【００１７】
また、ホスホリパーゼＤの転移活性は、以下のようにして求めた。ホスファチジルパラニトロフェノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶解し、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液0.２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ5.０）溶液0.１ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌの牛アルブミン溶液0.０５ｍｌを混合し、１５分間超音波にて分散し、エマルジョン化する。これを３７℃で５分間加温した後、酵素溶液0.０５ｍｌを加え、反応を開始する。これと平行して、酵素溶液のかわりにパラニトロフェノールを1.０、0.８、0.６、0.４、0.２、0.０μモル含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とする。３７℃、１０分間反応を行った後、１Ｎ塩酸溶液0.１ｍｌを加え反応を停止した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液0.１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／１溶液0.４ｍｌを加え混合後、４℃で１０分間遠心分離する。水相を0.０２ｍｌとり、0.１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ8.０）0.１８ｍｌと混合し、マイクロプレートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノール量を換算し、転移活性を決定する。なおこの反応での１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義する。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、高いホスファチジル基転移活性を示す新規なホスホリパーゼＤが提供される。又、本発明の製造法によれば、上述のように従来の製造法により得られるものと比較して、きわめて高い純度のホスホリパーゼＤをきわめて容易に製造することができる。すなわち、従来報告されているホスホリパーゼＤの生産菌株の培養物１Ｌあたりの総タンパク質に対するホスホリパーゼＤの含有率は、例えばアグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５１巻、９号、２５１５−２５２４項（１９８７年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が３１５７ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が５０２０ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が６８８ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.２３％と見積もられる。アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１１９３項（１９９０年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が２８２ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が１９６２ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が２３９０ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.２９％と見積もられる。バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Bioscience Biotechnology Biochemistry)５７巻、１１号、１９４６−１９４８項（１９９３年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が２８６ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が３２００ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が１４３6.８ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.７８％と見積もられる。また、バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１２５５巻、２７３−２７９項（１９９５年）に記載の２種の菌株を用いた方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が５２００ｍｇ／Ｌあるいは６６００ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が１０６７ｕ／Ｌあるいは１１６８ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が４1.７２ｕ／ｍｇあるいは４4.９０ｕ／ｍｌであることから換算すると、0.４９％あるいは0.３９％となる。このように従来報告されているホスホリパーゼＤの製造法は、いずれもその培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤの含有率は１％未満といった低い水準のものであるから、最大で１３％以上もの高い含有率を占める本発明の製造法によれば、高いホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤの製造能率の飛躍的な向上が可能になる。
次に本発明を実施例により説明する。
【００１９】
【実施例】
実施例１
培地として0.５％ブドウ糖、0.２％ＫＨ2 ＰＯ4 、0.０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵母エキスを含むｐＨ7.０のものを用意し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１５分滅菌後ＴＨ−２株前培養液３ｍｌ（上記組成の培地にて３７℃１２５ｒｐｍで３ないし４日間培養したもの）をフラスコ１本につき殖菌し、計１０本分をロータリーシェーカーにて３４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌培養を２４時間行った。菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定したところ、１８０ｕ／Ｌであり、その際のタンパク質濃度は１２０ｍｇ／Ｌであった。その培養物を遠心（６０００ｒｐｍ、３０分、４℃）し、その上精を７０％飽和硫酸アンモニウムによりホスホリパーゼＤ活性を含む画分を濃縮した。生成した沈殿を５ｍＭトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.５）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。その後、同じ緩衝液で平衡化したハイロードＳＰ−セファロースＨＰ２６／１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に通し、不純物であるタンパク質および色素の大半を素通りさせた。吸着したホスホリパーゼＤは塩化ナトリウム濃度を０Ｍから0.２Ｍまで変化させる直線濃度勾配法によりホスホリパーゼＤ画分を溶出した。得られたホスホリパーゼＤは、電気泳動的に単一まで精製され、精製品の加水分解活性の比活性は１1.１４ｕ／ｍｇであった。
上記精製工程におけるホスホリパーゼＤの収量は3.３ｍｇであり、その回収率は約２０％であった。上記精製工程で用いた培養物のタンパク濃度は１２０ｍｇ／Ｌであり、培養物中に含まれるホスホリパーゼＤ加水分解活性は１８０ｕ／Ｌであることから、精製ホスホリパーゼＤの比活性から換算すれば、培養物には１6.１５ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約１3.４６％と見積もられた。
【００２０】
実施例２
培地として、0.５％ブドウ糖、0.５％クエン酸２ナトリウム、0.２％ＫＨ2 ＰＯ4 、0.０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵母エキスを含むｐＨ7.０のものを用意し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１５分滅菌後ＴＨ−２株前培養液３ｍｌを殖菌し、ロータリーシェーカーにて３４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌培養を行った。経時的に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ加水分解活性を測定したところ、９６時間目に最大活性を示し、その値は３８０ｕ／Ｌであった。また、その際のタンパク質濃度は４５０ｍｇ／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水分解の比活性が１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養物には３4.１ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約7.６％と見積もられた。また、炭素源を0.５％ブドウ糖のみを用い、それ以外の組成は上記のもので同様な条件で培養した場合、経時的に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ活性を測定したところ、４８時間目に最大活性を示し、そのホスホリパーゼＤ加水分解活性は２４０ｕ／Ｌであり、その際のタンパク質濃度は４６０ｍｇ／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水分解の比活性が１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養物には２1.６ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約4.７％と見積もられた。
【００２１】
実施例３
実施例１で得た精製ホスホリパーゼＤを用いて、至適ｐＨにおける、本酵素の加水分解反応および転移反応における１秒あたりのターンオーバーナンバー（ｋｃａｔ）およびＫｍを測定した。その結果、加水分解反応において、ｋｃａｔは９7.０ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは1.０２ｍＭであった。この値から加水分解反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、９5.４ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。一方、転移反応において、ｋｃａｔは２４4.０ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは0.６８ｍＭであった。この値から転移反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、３６1.０ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。また、この転移反応におけるエタノールに対するＫｍは１４1.２ｍＭであった。加水分解および転移反応におけるｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＴＨ−２株由来の精製ホスホリパーゼＤは加水分解における反応性と比べ約3.８倍転移における反応性が高いことが判明した。
【００２２】
比較例１
電気泳動的に単一な純度をもつ、旭化成工業社製ＰＬＤＰ（ホスホリパーゼＤＰ）を用いて、至適ｐＨにおける、実施例３と同様な試験を行った。加水分解反応および転移反応における１秒あたりのターンオーバーナンバー（ｋｃａｔ）およびＫｍを測定した。その結果、加水分解反応において、ｋｃａｔは６0.９ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは0.４２ｍＭであった。この値から加水分解反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１４5.０ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。一方、転移反応において、ｋｃａｔは２５4.５ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは2.１７ｍＭであった。この値から転移反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１１7.５ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。また、この転移反応におけるエタノールに対するＫｍは２８7.５ｍＭであった。加水分解および転移反応におけるｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＰＬＤＰは転移における反応性が、加水分解における反応性の約0.８倍となることが判明した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、大豆、卵黄、魚介類に含まれているホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質と各種水酸基をもつ化合物とから、乳化剤、農薬、医薬、食品、工業用試薬等に有用なリン脂質誘導体を製造するのに用いられるホスホリパーゼＤ、その製造方法及びホスホリパーゼＤを産生する新規微生物に関するものである。
【従来の技術】
ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。この酵素は、その起源によっては加水分解反応以外に、グリセロール、セリン、エタノール、フェノール等のアルコール性およびフェノール性水酸基を有する化合物の共存下でグリセロリン脂質のホスファチジル基を上記水酸基を有する化合物に転移させ、新たなリン酸エステルを生成する反応（ホスファチジル基転移反応）を生起させる作用を有する。
【０００２】
この酵素は、キャベツ、ニンジン、ホウレンソウ、綿実等の植物体からの抽出あるいはストレプトマイセス属、ミクロノスポラ属、ノカルディオプシス属、アクチノマデューラ属又はノカルディア属等の微生物を用いた発酵法により製造できることが知られている。例えば、特公昭５２−３９９１８号公報、特公昭５８−５２６３３号公報、特公平１−１２４７４号公報、特公平８−８８６６号公報、特開昭５８−６３３８８号公報、特開昭５８−６７１８３号公報、特開昭６０−１６４４８３号公報、特開平４−１６６０８３号公報、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５１巻、９号、２５１５−２５２４頁（１９８７年）、アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１１９３頁（１９９０年）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Bioscience Biotechnology Biochemistry)５７巻、１１号、１９４６−１９４８頁（１９９３年）およびバイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１２５５巻、２７３−２７９頁（１９９５年）を参照されたい。しかしながら、これら従来の製造法により得られるホスホリパーゼＤは、それぞれ基質特異性、反応性などが異なっており、新規な特性を有するホスホリパーゼＤの提供が望まれている。
又、従来の製造方法によると、ホスホリパーゼＤ産生能を有する菌株を用いた発酵法により作られる培養液中に占める夾雑タンパク質の生成量が多く、従って培養液中のホスホリパーゼＤの純度が低いといった問題がある。そのため食品等の製造に用いる際には夾雑タンパク質を取り除き、ホスホリパーゼＤを濃縮する工程を設ける必要の有る場合があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な特性を有するホスホリパーゼＤを提供することを目的とする。
本発明は、又、ホスホリパーゼＤを高純度で得ることができる製造法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生する新規微生物を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤを生産する能力を有する多数の微生物について、ホスホリパーゼＤの生産効率が高く、特にその培養物中にホスホリパーゼＤの占める割合が高く、夾雑タンパク質の生産量が低い菌株を探索する実験を繰り返した結果、岡山県上房郡賀陽町吉川地区で採取した土壌から分離した新菌株ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces.sp.）ＴＨ−２が優れた性能を有し、これにより上記課題を有効に解決できるとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐＨ約８であることを特徴とするホスホリパーゼＤを提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌を提供する。
本発明は、又、上記ホスホリパーゼＤ生産菌を培地で培養し、産生したホスホリパーゼＤを回収することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の至適ｐＨが約５、至適温度が約４０℃、分子量が約５.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、等電点がｐＨ約８で、カルシウム又はマグネシウムイオン要求性のホスホリパーゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌としては、ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２株を用いるのが好ましい。この株は、工業技術院微生物工業技術研究所に平成１１年３月２４日付けで寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９号である。その菌学的特徴を次に示す。
▲２▼細胞壁のアミノ酸組成および糖組成
胞子壁タイプ Ｉ型
ＬＬ−ジアミノピメリン酸 ＋
meso−ジアミノピメリン酸 −
ジアミノ酪酸 −
グリシン ＋
アスパラギン酸 −
オルニチン −
リジン −
アラビノース*2 −
ガラクトース*2 −
主要キノン系 ＭＫ−９（Ｈ８）、−９（Ｈ６）、−９（Ｈ４）
【０００７】
この菌株が、ストレプトマイセス属のStreptomyces septatus に属し、新菌株であることは、Nonomura,H.: J.Ferment.Technol., 52, 78-92(1974)及びShirling.E.B. and Gotilleb.D.: Int.J.Syst.Bacteriol., 22, 265-394(1972) に基づいて決定した。
本発明のホスホリパーゼＤを製造するための、上記ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２の培養は、放線菌一般の培養に通常採用される方法に従って行うことができるが、特に好ましくは培地には炭素源として、例えばクエン酸、コハク酸、ブドウ糖、果糖等を単独で、または組み合わせて適宜行うことができる。また窒素源として、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、大豆タンパク等を用いることができる。培地には、他に食塩、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、各種ビタミン、その他、菌の生育やホスホリパーゼＤの生産促進に有効な物質を適宜添加することができる。好ましい培地ｐＨは５〜９、特に好ましくは６〜７である。培養法としては深部培養法が好ましいが、固体培養法を採用することもできる。培養は約２０〜４０℃で行うことができるが、好ましい培養温度は３３〜３５℃である。好ましい培養期間は温度、ｐＨ、培地によって異なるが、通常１〜６日程度であり、目的物であるホスホリパーゼＤの生産量が最大に達した頃に培養を停止する。
【０００９】
培養終了後、培溶液から菌体を遠心分離あるいはろ別し、その遠心上精あるいはろ液をホスホリパーゼＤ溶液として用いることができる。または、遠心上精あるいはろ液からさらにホスホリパーゼＤを濃縮、採取するにあたっては、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、凍結乾燥、等電点電気泳動等の方法を、後述するホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件下で採用すればよい。
ストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２の生産するホスホリパーゼＤは以下の理化学的性質を有するものである。
（ａ）作用
▲１▼加水分解反応
一般式（Ｉ）で示されるリン脂質を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる。
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ1 及びＲ2 はアシル基またはアルキル基、Ｘは１つ以上の水酸基を含む塩基の水酸基１個を除いた後に残る有機基を表す。）
▲２▼ホスファチジル基転移反応
上記一般式（Ｉ）で表されるリン脂質のホスファチジル基を下記一般式（II）で示される水酸基を有する化合物の共存下、
【化２】
Ｒ3 −ＯＨ
（但し、Ｒ3 はアルコール性またはフェノール性水酸基に結合した有機基を表す。）
一般式（II）で表される化合物の水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式（III)で示されるリン脂質誘導体を生成する。
【００１２】
【化３】
（但し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同様の基を表す。）
本発明の酵素の移転反応における反応性／加水分解における反応性の比が３倍以上であるのが好ましい。
（ｂ）至適ｐＨ：約5.０
（ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９で安定
（ｄ）至適温度：約４０℃
（ｅ）熱安定性：
ｐＨ5.０およびリン脂質の非共存下において、６０℃、１０分間の熱処理でも全く失活しない。
（ｆ）分子量：
5.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による。）
（ｇ）等電点：
ｐＨ8.０（等電点電気泳道法による。）
（ｈ）Ｎ末端アミノ酸配列：
ＡｓｐＳｅｒＡｌａＡｓｐＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｌａＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｓｐＡｌａＶａｌＧｌｕＧｌｎＧｌｎＬｅｕＡｒｇＧｌｎ（エドマン反応を用いた気相法Ｎ末端アミノ酸配列決定法による。）
（ｉ）カルシウム又はマグネシウム要求性
カルシウムイオン（５０マイクロモル／ｍｌ）共存下におけるジパルミトイルホスファチジルコリンの加水分解活性を１００とした時の各種イオン存在下におけるホスホリパーゼＤの活性を表−１に示す。
【００１４】
【表１】
表−１
添加化合物 相対活性
なし ０
ＣａＣｌ2 １００
ＭｇＣｌ2 １７３
ＺｎＣｌ2 ０
ＣｄＣｌ2 ０
ＭｎＣｌ2 １１
ＦｅＣｌ2 ３
ＣｏＣｌ2 ２８
ＥＤＴＡ １
【００１５】
なお、ホスホリパーゼＤの加水分解活性は基質であるリン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分解した際に生じる塩基を定量することによって求める。一般的には、ホスファチジルコリンを基質とした場合に生じるコリンをコリンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを組み合わせて定量することにより加水分解活性を決定することが通例である。しかし、本発明ではより簡便な方法であるホスファチジルパラニトロフェノールを基質とした場合に生ずるパラニトロフェノールを直接定量することにより加水分解活性を決めた。なお、このホスファチジルパラニトロフェノールを基質とした場合ではカルシウムあるいはマグネシウムを活性に必要とはしない。この明細書に記載した酵素活性は、アナリティカ・キミカ・アクタ（Analytica Chimica Acta）３０４巻、２４９−２５４項（１９９５年）記載の方法により合成されるホスファチジルパラニトロフェノールを基質として用いる下記の方法により測定されたものであって、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノールを遊離する酵素活性を１ユニット（ｕ）としている。
【００１６】
加水分解活性測定法：，ホスファチジルパラニトロフェノール３６０ｍｇに、ジエチルエーテル１ｍｌ加え溶解した後、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌ、および１０％トリトン×１００を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５），１５ｍｌを添加し、６０℃で溶液が透明になるまで加温する。これを減圧下でジエチルエーテルを留去し基質保存液（１６ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。基質保存液を、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）で２ｍＭホスファチジルパラニトロフェノールとなるように希釈したものを基質溶液とし、あらかじめ３７℃で加温する。基質溶液９５０μＬに対してあらかじめ３７℃で加温した酵素液５０μＬを添加後、混合しホスホリパーゼＤの加水分解反応によって遊離してくるパラニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度を測定することおよびパラニトロフェノールのミリモル分子吸光係数１8.４５から、１分間あたりのパラニトロフェノール生成量を換算し、酵素活性値を決定する。
【００１７】
また、ホスホリパーゼＤの転移活性は、以下のようにして求めた。ホスファチジルパラニトロフェノールを１ｍｌあたり１６ｍｇの割合で、ベンゼンに溶解し、基質溶液（２０ｍＭホスファチジルパラニトロフェノール）とする。１サンプルにつき、この基質溶液0.２ｍｌに２Ｍエタノールを含む２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ5.０）溶液0.１ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌの牛アルブミン溶液0.０５ｍｌを混合し、１５分間超音波にて分散し、エマルジョン化する。これを３７℃で５分間加温した後、酵素溶液0.０５ｍｌを加え、反応を開始する。これと平行して、酵素溶液のかわりにパラニトロフェノールを1.０、0.８、0.６、0.４、0.２、0.０μモル含む溶液を各々添加した系列をつくり検量線用試料とする。３７℃、１０分間反応を行った後、１Ｎ塩酸溶液0.１ｍｌを加え反応を停止した後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液0.１５ｍｌおよびクロロホルム／メタノール＝３／１溶液0.４ｍｌを加え混合後、４℃で１０分間遠心分離する。水相を0.０２ｍｌとり、0.１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ8.０）0.１８ｍｌと混合し、マイクロプレートリーダー等の手段により４０５ｎｍの吸光度を測定する。別途作成した検量線用試料の吸光度値から検量線を作成し、転移反応により遊離したパラニトロフェノール量を換算し、転移活性を決定する。なおこの反応での１ユニットは１分間あたり１マイクロモルのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義する。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、高いホスファチジル基転移活性を示す新規なホスホリパーゼＤが提供される。又、本発明の製造法によれば、上述のように従来の製造法により得られるものと比較して、きわめて高い純度のホスホリパーゼＤをきわめて容易に製造することができる。すなわち、従来報告されているホスホリパーゼＤの生産菌株の培養物１Ｌあたりの総タンパク質に対するホスホリパーゼＤの含有率は、例えばアグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５１巻、９号、２５１５−２５２４項（１９８７年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が３１５７ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が５０２０ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が６８８ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.２３％と見積もられる。アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural Biological Chemistry)５４巻、５号、１１８９−１１９３項（１９９０年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が２８２ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が１９６２ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が２３９０ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.２９％と見積もられる。バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Bioscience Biotechnology Biochemistry)５７巻、１１号、１９４６−１９４８項（１９９３年）記載の方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が２８６ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が３２００ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が１４３6.８ｕ／ｍｇであることから換算すると、0.７８％と見積もられる。また、バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)１２５５巻、２７３−２７９項（１９９５年）に記載の２種の菌株を用いた方法によれば、培養物１Ｌあたりの遠心上精のタンパク濃度が５２００ｍｇ／Ｌあるいは６６００ｍｇ／Ｌであり、そのうちホスホリパーゼＤの占める割合は、ホスホリパーゼＤ活性が１０６７ｕ／Ｌあるいは１１６８ｕ／Ｌであること及び精製されたホスホリパーゼＤの比活性が４1.７２ｕ／ｍｇあるいは４4.９０ｕ／ｍｌであることから換算すると、0.４９％あるいは0.３９％となる。このように従来報告されているホスホリパーゼＤの製造法は、いずれもその培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤの含有率は１％未満といった低い水準のものであるから、最大で１３％以上もの高い含有率を占める本発明の製造法によれば、高いホスファチジル基転移活性を示すホスホリパーゼＤの製造能率の飛躍的な向上が可能になる。
次に本発明を実施例により説明する。
【００１９】
【実施例】
実施例１
培地として0.５％ブドウ糖、0.２％ＫＨ2 ＰＯ4 、0.０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵母エキスを含むｐＨ7.０のものを用意し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１５分滅菌後ＴＨ−２株前培養液３ｍｌ（上記組成の培地にて３７℃１２５ｒｐｍで３ないし４日間培養したもの）をフラスコ１本につき殖菌し、計１０本分をロータリーシェーカーにて３４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌培養を２４時間行った。菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤの加水分解活性を測定したところ、１８０ｕ／Ｌであり、その際のタンパク質濃度は１２０ｍｇ／Ｌであった。その培養物を遠心（６０００ｒｐｍ、３０分、４℃）し、その上精を７０％飽和硫酸アンモニウムによりホスホリパーゼＤ活性を含む画分を濃縮した。生成した沈殿を５ｍＭトリス−マレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.５）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。その後、同じ緩衝液で平衡化したハイロードＳＰ−セファロースＨＰ２６／１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に通し、不純物であるタンパク質および色素の大半を素通りさせた。吸着したホスホリパーゼＤは塩化ナトリウム濃度を０Ｍから0.２Ｍまで変化させる直線濃度勾配法によりホスホリパーゼＤ画分を溶出した。得られたホスホリパーゼＤは、電気泳動的に単一まで精製され、精製品の加水分解活性の比活性は１1.１４ｕ／ｍｇであった。
上記精製工程におけるホスホリパーゼＤの収量は3.３ｍｇであり、その回収率は約２０％であった。上記精製工程で用いた培養物のタンパク濃度は１２０ｍｇ／Ｌであり、培養物中に含まれるホスホリパーゼＤ加水分解活性は１８０ｕ／Ｌであることから、精製ホスホリパーゼＤの比活性から換算すれば、培養物には１6.１５ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約１3.４６％と見積もられた。
【００２０】
実施例２
培地として、0.５％ブドウ糖、0.５％クエン酸２ナトリウム、0.２％ＫＨ2 ＰＯ4 、0.０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、0.５％ペプトン、0.５％酵母エキスを含むｐＨ7.０のものを用意し、その１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、１２０℃、１５分滅菌後ＴＨ−２株前培養液３ｍｌを殖菌し、ロータリーシェーカーにて３４℃、１２５ｒｐｍ、で通気攪拌培養を行った。経時的に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ加水分解活性を測定したところ、９６時間目に最大活性を示し、その値は３８０ｕ／Ｌであった。また、その際のタンパク質濃度は４５０ｍｇ／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水分解の比活性が１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養物には３4.１ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約7.６％と見積もられた。また、炭素源を0.５％ブドウ糖のみを用い、それ以外の組成は上記のもので同様な条件で培養した場合、経時的に菌体外に分泌されたホスホリパーゼＤ活性を測定したところ、４８時間目に最大活性を示し、そのホスホリパーゼＤ加水分解活性は２４０ｕ／Ｌであり、その際のタンパク質濃度は４６０ｍｇ／Ｌであった。ホスホリパーゼＤの加水分解の比活性が１1.１４ｕ／ｍｇであることから、培養物には２1.６ｍｇ／Ｌの濃度でホスホリパーゼＤが含まれ、培養物中の総タンパク質に占めるホスホリパーゼＤは約4.７％と見積もられた。
【００２１】
実施例３
実施例１で得た精製ホスホリパーゼＤを用いて、至適ｐＨにおける、本酵素の加水分解反応および転移反応における１秒あたりのターンオーバーナンバー（ｋｃａｔ）およびＫｍを測定した。その結果、加水分解反応において、ｋｃａｔは９7.０ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは1.０２ｍＭであった。この値から加水分解反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、９5.４ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。一方、転移反応において、ｋｃａｔは２４4.０ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは0.６８ｍＭであった。この値から転移反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、３６1.０ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。また、この転移反応におけるエタノールに対するＫｍは１４1.２ｍＭであった。加水分解および転移反応におけるｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＴＨ−２株由来の精製ホスホリパーゼＤは加水分解における反応性と比べ約3.８倍転移における反応性が高いことが判明した。
【００２２】
比較例１
電気泳動的に単一な純度をもつ、旭化成工業社製ＰＬＤＰ（ホスホリパーゼＤＰ）を用いて、至適ｐＨにおける、実施例３と同様な試験を行った。加水分解反応および転移反応における１秒あたりのターンオーバーナンバー（ｋｃａｔ）およびＫｍを測定した。その結果、加水分解反応において、ｋｃａｔは６0.９ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは0.４２ｍＭであった。この値から加水分解反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１４5.０ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。一方、転移反応において、ｋｃａｔは２５4.５ｓｅｃ-1であり、ホスファチジルパラニトロフェノールに対するＫｍは2.１７ｍＭであった。この値から転移反応における酵素の反応性を示す指標であるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１１7.５ｍＭ-1・ｓｅｃ-1となった。また、この転移反応におけるエタノールに対するＫｍは２８7.５ｍＭであった。加水分解および転移反応におけるｋｃａｔ／Ｋｍ値を比較すると、ＰＬＤＰは転移における反応性が、加水分解における反応性の約0.８倍となることが判明した。
Claims (3)
- 下記の理化学的性質を有することを特徴とするホスホリパーゼＤ。
（ａ）作用
(1)加水分解反応
一般式（Ｉ）で示されるリン脂質を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離させる。
式（Ｉ）
（式中、Ｒ1 及びＲ2 はアシル基またはアルキル基、Ｘは１つ以上の水酸基を含む塩基の水酸基１個を除いた後に残る有機基を表す。）
(2)ホスファチジル基転移反応
上記一般式（Ｉ）で表されるリン脂質のホスファチジル基を下記一般式（II）で示される水酸基を有する化合物の共存下、
Ｒ3 −ＯＨ （II）
（但し、Ｒ3 はアルコール性またはフェノール性水酸基に結合した有機基を表す。）
一般式（II）で表される化合物の水酸基にホスファチジル基を転移させ、下記一般式（III)で示されるリン脂質誘導体を生成する。
式（III)
（但し、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同様の基を表す。）
（ｂ）至適ｐＨ：5.０
（ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜９で安定
（ｄ）至適温度：４０℃
（ｅ）熱安定性：ｐＨ5.０およびリン脂質の非共存下において、６０℃、１０分間の熱処理でも全く失活しない。
（ｆ）分子量：5.５万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による。）
（ｇ）等電点：ｐＨ8.０（等電点電気泳動法による。）
（ｈ）Ｎ末端アミノ酸配列：
ＡｓｐＳｅｒＡｌａＡｓｐＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｌａＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｓｐＡｌａＶａｌＧｌｕＧｌｎＧｌｎＬｅｕＡｒｇＧｌｎ（エドマン反応を用いた気相法Ｎ末端アミノ酸配列決定法による。）
（ｉ）カルシウム又はマグネシウム要求性
カルシウムイオン（５０マイクロモル／ｍｌ）共存下におけるジパルミトイルホスファチジルコリンの加水分解活性を１００とした時の各種イオン存在下におけるホスホリパーゼＤの活性を以下に示す。
添加化合物 相対活性
なし ０
ＣａＣｌ2 １００
ＭｇＣｌ2 １７３
ＺｎＣｌ2 ０
ＣｄＣｌ2 ０
ＭｎＣｌ2 １１
ＦｅＣｌ2 ３
ＣｏＣｌ2 ２８
ＥＤＴＡ １ - 請求項１記載のホスホリパーゼＤを産生するストレプトマイセス属のホスホリパーゼＤ生産菌であるストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９号）。
- 請求項１記載のホスホリパーゼＤ生産菌であるストレプトマイセス・エスピーＴＨ−２株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２９号）を培地で培養し、産生したホスホリパーゼＤを回収することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。
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