JP2804067B2 - 新規なホスホリパーゼｄ―ｋ及びその製造法 - Google Patents
新規なホスホリパーゼｄ―ｋ及びその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なホスホリパーゼＤ−Ｋ及びその製造法
に関する。本酵素をリン脂質に作用させることにより優
れた食品用乳化剤を得ることができる。
に関する。本酵素をリン脂質に作用させることにより優
れた食品用乳化剤を得ることができる。
従来の技術 ホスホリパーゼＤとしては種々のもの、例えば植物、
微生物、動物由来のもの〔酵素ハンドブック、朝倉書店
（1982）〕、ストレプトミセス属微生物由来のもの〔特
開昭48−99386号公報、ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Journal of Biochemistry）85,79−95（197
9）〕、ミクロモノスポラ属微生物由来のもの（特開昭5
4−44094号公報）、ノカルディオプシス属微生物由来の
もの（特開昭58−63388号公報）、〔アグリカルチャル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultur
al ＆ Biological Chemistry），48（９）,2181〜2188
（1984）〕，ニンジン由来のもの〔ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry），231,703（1958）〕、ストレプトミセス
・プルニカラーSK・02・81株由来のもの（特開昭63−21
9373号公報）等が知られている。さらに、ホスホリパー
ゼＤ−Ｐとして、ストレプトミセス属微生物由来のもの
が知られている〔特開昭58−152481号公報〕。
微生物、動物由来のもの〔酵素ハンドブック、朝倉書店
（1982）〕、ストレプトミセス属微生物由来のもの〔特
開昭48−99386号公報、ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Journal of Biochemistry）85,79−95（197
9）〕、ミクロモノスポラ属微生物由来のもの（特開昭5
4−44094号公報）、ノカルディオプシス属微生物由来の
もの（特開昭58−63388号公報）、〔アグリカルチャル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultur
al ＆ Biological Chemistry），48（９）,2181〜2188
（1984）〕，ニンジン由来のもの〔ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry），231,703（1958）〕、ストレプトミセス
・プルニカラーSK・02・81株由来のもの（特開昭63−21
9373号公報）等が知られている。さらに、ホスホリパー
ゼＤ−Ｐとして、ストレプトミセス属微生物由来のもの
が知られている〔特開昭58−152481号公報〕。
発明が解決しようとする課題 従来のホスホリパーゼＤ及びホスホリパーゼＤ−Ｐは
Caイオンを要求したり、Caイオン、Triton X−100で活
性化されたり、EDTAで阻害されたり、広範囲のpH域で熱
安定性が悪い。
Caイオンを要求したり、Caイオン、Triton X−100で活
性化されたり、EDTAで阻害されたり、広範囲のpH域で熱
安定性が悪い。
従来のホスホリパーゼＤを使用して、食品用乳化剤と
しての改質レシチンを製造する際には幾多の問題点を存
在している。従来の酵素の要求するCaイオンは、使用さ
れる食品の物性に好ましいからざる影響を与えることが
知られている。例えば多くの食品乳化物がCaイオンの存
在によってその乳化安定性が極めて低下すること〔フー
ドケミカル、Vol.14,54（1988）、特開昭61−199749号
公報〕、各種の食品蛋白質がCaイオンにより凝集するこ
とと〔ジャーナル・オブ・フード・サイエンス（Journa
l of Food Science）,Vol.38,1139（1973），ジャーナ
ル・オブ・デーリー・サイエンス（Journal of Dairy S
cience）Vol.63,223（1980）〕などが知られている。ま
た、活性化因子として界面活性剤を用いて製造した改質
リン脂質は食品に使用する場合、反応後に界面活性剤を
除去するために極めて煩雑な操作が必要である。このた
め、広範囲のpH域で熱安定性が高く、Caイオンを要求し
ない、Caイオンや界面活性剤で活性化されないホスホリ
パーゼＤが求められている。
しての改質レシチンを製造する際には幾多の問題点を存
在している。従来の酵素の要求するCaイオンは、使用さ
れる食品の物性に好ましいからざる影響を与えることが
知られている。例えば多くの食品乳化物がCaイオンの存
在によってその乳化安定性が極めて低下すること〔フー
ドケミカル、Vol.14,54（1988）、特開昭61−199749号
公報〕、各種の食品蛋白質がCaイオンにより凝集するこ
とと〔ジャーナル・オブ・フード・サイエンス（Journa
l of Food Science）,Vol.38,1139（1973），ジャーナ
ル・オブ・デーリー・サイエンス（Journal of Dairy S
cience）Vol.63,223（1980）〕などが知られている。ま
た、活性化因子として界面活性剤を用いて製造した改質
リン脂質は食品に使用する場合、反応後に界面活性剤を
除去するために極めて煩雑な操作が必要である。このた
め、広範囲のpH域で熱安定性が高く、Caイオンを要求し
ない、Caイオンや界面活性剤で活性化されないホスホリ
パーゼＤが求められている。
課題を解決するための手段 本発明は下記の性質を有する新規なホスホリパーゼＤ
−Ｋ及びその製造法を提供する。
−Ｋ及びその製造法を提供する。
（ａ） 作用 リン脂質に作用してリン酸と塩との間のエステル結合
を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離する。
を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離する。
（ｂ） 基質特異性 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロ
ール、リゾホスファチジルコリンに対して作用する。
ミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロ
ール、リゾホスファチジルコリンに対して作用する。
（ｃ） 至適pH:7.5〜8.5 （ｄ） pH安定性及び熱安定性 pH4.0−8.5の範囲で、温度50℃で１時間加熱処理して
も活性はほぼ100％残存する。
も活性はほぼ100％残存する。
pH7で60℃まで安定である。
（ｅ） 阻害及び活性化 Caイオンキレート剤により阻害されない。又、Caイオ
ン又は界面活性剤により活性化されない。
ン又は界面活性剤により活性化されない。
（ｆ） 至適温度:50〜75℃ （ｇ） 分子量：約54,000（SDSアクリルアミドゲル電
気泳動による） 次にホスホリパーゼＤ−Ｋの活性を測定法、性質につ
いて説明する。
気泳動による） 次にホスホリパーゼＤ−Ｋの活性を測定法、性質につ
いて説明する。
1. 酵素活性測定法 酵素活性を含む50mMトリス塩酸緩衝液0.5mlと50mM精
製卵黄レシチン（シグマ社製）エマルジョン0.5mlを37
℃のプレインキュベーション後、混合し反応を開始し
た。10分後に15％トリクロロ酢酸0.5mlを添加した反応
を停止させた後、１規定水酸化ナトリウム0.44mlを添加
して中和した。次にデタミナーChE（コリンエステラー
ゼ測定試薬：協和メデックス（社）製）を用いて、反応
液中に生成したコリンを定量した。対照としてあらかじ
め熱失活した酵素を用いて同様に反応させた物を定量し
た。そして１分間に１μmolのコリンを遊離する酵素活
性を１単位とする。
製卵黄レシチン（シグマ社製）エマルジョン0.5mlを37
℃のプレインキュベーション後、混合し反応を開始し
た。10分後に15％トリクロロ酢酸0.5mlを添加した反応
を停止させた後、１規定水酸化ナトリウム0.44mlを添加
して中和した。次にデタミナーChE（コリンエステラー
ゼ測定試薬：協和メデックス（社）製）を用いて、反応
液中に生成したコリンを定量した。対照としてあらかじ
め熱失活した酵素を用いて同様に反応させた物を定量し
た。そして１分間に１μmolのコリンを遊離する酵素活
性を１単位とする。
2. Caイオンによる活性化 CaCl2濃度 相対活性 0mM 100 10mM 72 50mM 83 本酵素はCaイオンによって活性化されない 3. Caイオンキレート剤による阻害 濃度 相対活性 無添加 − 100 EDTA 2mM 100 クエン酸ナトリウム 500mM 100 本酵素はCaイオンキレート剤であるEDTA,クエン酸ナ
トリウムによって阻害されない。
トリウムによって阻害されない。
4. 各種金属イオンによる活性化 濃度 相対活性 無添加 − 100 MgCl2 10mM 78 MnCl2 10mM 95 KCl 50mM 109 NaCl 50mM 107 本酵素はCaイオン以外の上記金属イオンによって活性
化されない。
化されない。
5. 各種界面活性剤による活性化 濃度（％） 相対活性 無添加 − 100 Triton X−100 0.5 102 ラウリル硫酸ナトリウム 0.1 35 ツイン20 0.5 103 コール酸ナトリウム 0.5 98 本酵素は上記界面活性剤によって活性化されない。
6. 至適pH 前記の酵素活性測定法における50mMトリス塩酸緩衝液
の代わりに、クエン酸・リン酸二ナトリウム緩衝液（pH
3−８）、トリス・マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH7−
９）、アンモニア・塩化アンモニウム緩衝液（pH8−
９）を用いて、ホスホリパーゼＤ−Ｋのリン脂質に対す
る酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す。乃適
pHは7.5〜8.5の範囲であると認められた。
の代わりに、クエン酸・リン酸二ナトリウム緩衝液（pH
3−８）、トリス・マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH7−
９）、アンモニア・塩化アンモニウム緩衝液（pH8−
９）を用いて、ホスホリパーゼＤ−Ｋのリン脂質に対す
る酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す。乃適
pHは7.5〜8.5の範囲であると認められた。
7. pH安定性及び熱安定性 本酵素をクエン酸・リン酸二ナトリウム緩衝液（pH3
−８）及びトリス・マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH7
−９）に溶解し、37℃と50℃の各温度で１時間処理し、
その後水冷して前記の酵素活性の測定法に従ってホスホ
リパーゼＤ−Ｋの酵素活性（残存活性）を測定した。そ
の結果を第２図に示す。37℃ではpH4−９において50℃
ではpH4−８においてほぼ100％残存した。また、クエン
酸・リン酸二ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した本
酵素を5,40,50,60,70及び80℃の各温度で１時間処理
し、その後水冷し残存活性を測定した。その結果を第３
図に示す。本酵素は60℃まで安定であった。
−８）及びトリス・マレイン酸ナトリウム緩衝液（pH7
−９）に溶解し、37℃と50℃の各温度で１時間処理し、
その後水冷して前記の酵素活性の測定法に従ってホスホ
リパーゼＤ−Ｋの酵素活性（残存活性）を測定した。そ
の結果を第２図に示す。37℃ではpH4−９において50℃
ではpH4−８においてほぼ100％残存した。また、クエン
酸・リン酸二ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した本
酵素を5,40,50,60,70及び80℃の各温度で１時間処理
し、その後水冷し残存活性を測定した。その結果を第３
図に示す。本酵素は60℃まで安定であった。
8. 至適温度 酵素活性測定において、反応温度30,40,50,60,70,80
及び90℃で10分間反応した際の酵素活性を測定した。そ
の結果を第４図に示す。至適温度は50〜75℃の範囲であ
ると認められた。
及び90℃で10分間反応した際の酵素活性を測定した。そ
の結果を第４図に示す。至適温度は50〜75℃の範囲であ
ると認められた。
次にホスホリパーゼＤ−Ｋの製造法について説明す
る。
る。
ホスホリパーゼＤ−Ｋはストレプトミセス属に属し、
ホスホリパーゼＤ−Ｋ生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にホスホリパーゼＤ−Ｋを生成蓄積さ
せ、該培養物よりホスホリパーゼＤ−Ｋを採取すること
によって得られる。
ホスホリパーゼＤ−Ｋ生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にホスホリパーゼＤ−Ｋを生成蓄積さ
せ、該培養物よりホスホリパーゼＤ−Ｋを採取すること
によって得られる。
用いられる微生物としてはストレプトミセス属に属
し、ホスホリパーゼＤ−Ｋ生産能を有するものであれば
いずれも用いることができる。具体的には、ストレプト
ミセス・ラヴェンデュラー（Streptomyces lavendula
e）IFO3125（以下、IFO3125と称す）が用いられる。
し、ホスホリパーゼＤ−Ｋ生産能を有するものであれば
いずれも用いることができる。具体的には、ストレプト
ミセス・ラヴェンデュラー（Streptomyces lavendula
e）IFO3125（以下、IFO3125と称す）が用いられる。
用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩等
を程よく含有する培地ならば、合成培地又は天然培地の
いずれでもよい。
を程よく含有する培地ならば、合成培地又は天然培地の
いずれでもよい。
炭素源としては、グルコース、シュクロース、乳糖、
麦芽糖、スターチ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。
麦芽糖、スターチ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、コーン・ステ
ィープ・リカー、カザミノ酸、肉エキス等が用いられ
る。
化アンモニウム、ペプトン、酵母エキス、コーン・ステ
ィープ・リカー、カザミノ酸、肉エキス等が用いられ
る。
無機塩としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化カリウム、硝酸カリ
ウム、塩化ナトリウム等があげられる。
ム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化カリウム、硝酸カリ
ウム、塩化ナトリウム等があげられる。
培養は温度20〜35℃、好ましくは25〜30℃で10〜48時
間行う。
間行う。
培養終了後、培養液からホスホリパーゼＤ−Ｋを採取
するには、通常の方法が用いられる。本酵素は水に易溶
性であって、主として培養液中に存在する。培養液
中に存在するホスホリパーゼＤ−Ｋは培養液を濃縮す
るか、硫安などで飽和沈澱させるか、メタノール、エタ
ノール、アセトン等の有機溶媒を添加することによって
沈澱させること等により得ることができる。
するには、通常の方法が用いられる。本酵素は水に易溶
性であって、主として培養液中に存在する。培養液
中に存在するホスホリパーゼＤ−Ｋは培養液を濃縮す
るか、硫安などで飽和沈澱させるか、メタノール、エタ
ノール、アセトン等の有機溶媒を添加することによって
沈澱させること等により得ることができる。
濃縮物あるいは沈澱物は水に溶解し半透膜で透析する
ことによって低分子の不純物を除去することが出来る。
各種イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過クロマト
グラフィー等を利用して培養液中の不純物を除去しさ
らに精製することが可能である。
ことによって低分子の不純物を除去することが出来る。
各種イオン交換クロマトグラフィー、ゲル過クロマト
グラフィー等を利用して培養液中の不純物を除去しさ
らに精製することが可能である。
以下に実施例を示す。
実施例1. グリセロール２％、ペプトン２％、硝酸カリウム0.1
％、リン酸二カリウム0.05％、硫酸マグネシウム0.05％
及び食塩0.05％の組成を有する培地（pH7.0）15を30
のジャーファメンターに入れ、加熱滅菌（120℃、20
時間）後、これに前記と同組成の培地で培養（28℃、20
時間）したIFO3125の種培養液の500mlを接種し、28℃で
通気撹拌培養（通気量:15／分、撹拌:250r.p.m）を行
った。約20時間後に酵素活性の最大値が得られた（1.2U
/ml）。
％、リン酸二カリウム0.05％、硫酸マグネシウム0.05％
及び食塩0.05％の組成を有する培地（pH7.0）15を30
のジャーファメンターに入れ、加熱滅菌（120℃、20
時間）後、これに前記と同組成の培地で培養（28℃、20
時間）したIFO3125の種培養液の500mlを接種し、28℃で
通気撹拌培養（通気量:15／分、撹拌:250r.p.m）を行
った。約20時間後に酵素活性の最大値が得られた（1.2U
/ml）。
ついで、得られた培養液15を遠心分離（10000r.p.
m,10分間）して菌体を除去した。得られた上澄15を３
まで減圧濃縮した。この濃縮液に３のエタノールを
添加し沈澱画分を除去した後、７のエタノールをさら
に添加し静置後上澄を除去した。得られた沈澱物を１
の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に溶解した。これを1
5の同緩衝液に対して透析を行い低分子の夾雑物質を
除去した。透析終了後、本酵素液を濃縮してセファデッ
クスＧ−100〔Pharmacia Fine Chemicals Inc.〕を用い
たゲル過クロマトグラフィーを行ってさらに精製し酵
素標品（活性収率:75％）を得た。
m,10分間）して菌体を除去した。得られた上澄15を３
まで減圧濃縮した。この濃縮液に３のエタノールを
添加し沈澱画分を除去した後、７のエタノールをさら
に添加し静置後上澄を除去した。得られた沈澱物を１
の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に溶解した。これを1
5の同緩衝液に対して透析を行い低分子の夾雑物質を
除去した。透析終了後、本酵素液を濃縮してセファデッ
クスＧ−100〔Pharmacia Fine Chemicals Inc.〕を用い
たゲル過クロマトグラフィーを行ってさらに精製し酵
素標品（活性収率:75％）を得た。
発明の効果 ホスホリパーゼＤ−Ｋは広範囲のpH域で熱安定性が良
く、Caイオン又は界面活性剤により活性化されず、Caイ
オンキレート剤により阻害されない新規酵素である。本
酵素をリン脂質に作用させることにより優れた食品用乳
化剤を得ることができる。
く、Caイオン又は界面活性剤により活性化されず、Caイ
オンキレート剤により阻害されない新規酵素である。本
酵素をリン脂質に作用させることにより優れた食品用乳
化剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】 第１図はホスホリパーゼＤ−Ｋの至適pHを示す。 第２図はホスホリパーゼＤ−ＫのpH安定性及び熱安定性
を示す。 第３図はホスホリパーゼＤ−Ｋの熱安定性（pH7.0）を
示す。 第４図はホスホリパーゼＤ−Ｋの至適温度（反応時間10
分）を示す。
を示す。 第３図はホスホリパーゼＤ−Ｋの熱安定性（pH7.0）を
示す。 第４図はホスホリパーゼＤ−Ｋの至適温度（反応時間10
分）を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】下記の性質を有する新規なホスホリバーゼ
Ｄ−Ｋ。 （ａ）作用 リン脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合
を加水分解し、ホスファチジン酸と塩基とを遊離する。 （ｂ）基質特異性 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロー
ル、リゾホスファチジルコリンに対して作用する。 （ｃ）至適pH:7.5〜8.5 （ｄ）pH安定性及び熱安定性 pH4.0−8.5の範囲で、温度50℃で１時間加熱処理しても
活性はほぼ100％残存する。 pH7で60℃まで安定である。 （ｅ）阻害及び活性化 Caイオンキレート剤により阻害されない。又、Caイオン
又は界面活性剤により活性化されない。 （ｆ）至適温度:50〜75℃ （ｇ）分子量：約54,000〔ドデシル硫酸ソーダ（SDS）
アクリルアミドゲル電気泳動による〕 - 【請求項２】ストレプトミセス属に属し、請求項１記載
のホスホリバーゼＤ−Ｋ生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中に請求項１記載のホスホリバーゼＤ−
Ｋを生成蓄積させ、該培養物より請求項１記載のホスホ
リパーゼＤ−Ｋを採取することを特徴とする発酵法によ
る請求項１記載のホスホリパーゼＤ−Ｋの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1044394A JP2804067B2 (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | 新規なホスホリパーゼｄ―ｋ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1044394A JP2804067B2 (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | 新規なホスホリパーゼｄ―ｋ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222679A JPH02222679A (ja) | 1990-09-05 |
| JP2804067B2 true JP2804067B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=12690290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1044394A Expired - Fee Related JP2804067B2 (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | 新規なホスホリパーゼｄ―ｋ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2804067B2 (ja) |
-
1989
- 1989-02-23 JP JP1044394A patent/JP2804067B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02222679A (ja) | 1990-09-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |