JPS58152482A - 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 - Google Patents
耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法Info
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- JPS58152482A JPS58152482A JP3683482A JP3683482A JPS58152482A JP S58152482 A JPS58152482 A JP S58152482A JP 3683482 A JP3683482 A JP 3683482A JP 3683482 A JP3683482 A JP 3683482A JP S58152482 A JPS58152482 A JP S58152482A
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- enzyme
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はサーマス（Ｔｈｅｍ＋ｕｓ ）属に属する菌株
が産生ずる高度に耐熱性を有する蛋白分解酵素アクアラ
イシンＩに関する。
が産生ずる高度に耐熱性を有する蛋白分解酵素アクアラ
イシンＩに関する。
（２）
従来、耐熱性を有する蛋白分解酵素の生産菌としては、
ストレプトミセスＡｌｌ！ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓＪＩ４）、バチルス属（Ｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ属）
、トルーラ属（’Ｉ’ｏｒｕｌａ属）、およびサーマス
Ｔ −８５１（Ｔｈｅ −ｒｍｕｓ Ｔ−８５１） Ｃ
欧州特許２４１８２号〕等が報告されている。又、本発
明者等は、すでに、栃本県奥鬼怒の温泉源から分離した
サーマス・カルドフィラ７． Ｇ Ｋ −２４（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉ−１ｕｓＧＫ−２４）の
生産する耐熱性蛋白分解酵素について報告（日本農芸化
学会 昭和５３年度大会講演要旨集 ６５ページ、生化
学第５１巻 ７４９ページ（昭和５４年）、日本農芸化
学会 昭和５５年度大会講演要旨集 ２６９ベージ、日
本農芸化学会昭和５６年度大会講演要旨果 ２０１ペー
ジ）してきたが、今回さらに優秀な一株を求めて、公知
の保存菌株も含めて、鋭意Ｇこ検索を続けたところサー
マス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＡＴＣＣ２５１０４）が、従
来のものとは全く異なる高度（こ耐熱性を有する蛋白分
解酵素を産生ずる（３） ことを見出した。
ストレプトミセスＡｌｌ！ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓＪＩ４）、バチルス属（Ｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ属）
、トルーラ属（’Ｉ’ｏｒｕｌａ属）、およびサーマス
Ｔ −８５１（Ｔｈｅ −ｒｍｕｓ Ｔ−８５１） Ｃ
欧州特許２４１８２号〕等が報告されている。又、本発
明者等は、すでに、栃本県奥鬼怒の温泉源から分離した
サーマス・カルドフィラ７． Ｇ Ｋ −２４（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉ−１ｕｓＧＫ−２４）の
生産する耐熱性蛋白分解酵素について報告（日本農芸化
学会 昭和５３年度大会講演要旨集 ６５ページ、生化
学第５１巻 ７４９ページ（昭和５４年）、日本農芸化
学会 昭和５５年度大会講演要旨集 ２６９ベージ、日
本農芸化学会昭和５６年度大会講演要旨果 ２０１ペー
ジ）してきたが、今回さらに優秀な一株を求めて、公知
の保存菌株も含めて、鋭意Ｇこ検索を続けたところサー
マス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＡＴＣＣ２５１０４）が、従
来のものとは全く異なる高度（こ耐熱性を有する蛋白分
解酵素を産生ずる（３） ことを見出した。
サーマス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４の産生ず
る耐熱性蛋白分解酵素は培養条件の違いにより２種類存
在し、培養開始後約１日で産生され、次に示す理化学的
性質を有するものを本発明者等はアクアライシン■と命
名した。
る耐熱性蛋白分解酵素は培養条件の違いにより２種類存
在し、培養開始後約１日で産生され、次に示す理化学的
性質を有するものを本発明者等はアクアライシン■と命
名した。
耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンＩは以下に示す理化
学的性質を有する。
学的性質を有する。
（１）作 用： カゼイン等の蛋白ｊ５［こ作用し
てトリクロル酢酸溶液にロエ溶性 のオリゴペプチドあるいはアミ ノ酸を生ずる。
てトリクロル酢酸溶液にロエ溶性 のオリゴペプチドあるいはアミ ノ酸を生ずる。
（２）至適ｐＨ： 各４ｐＨの０．６％カゼイン基質
５００μｔに本酵素液ｔｏ’。
５００μｔに本酵素液ｔｏ’。
μｔを７０℃、１０分間反応さ
せた。緩衝液はｐＨ３〜６に対
しては５０ ｍＭクエン酸−クエ
ン酸ナトリウム緩＃液、ｐＨ６
〜８に対しては同濃度のリン酸
緩衝液、ｐ）ｆ８．５〜ｌ０１５に対しく４）
ては同濃度のホウ酸緩衝液をそ
れぞれ使用した。その結果、至
適ｐＨは９．４以上である。（第１図）（３） ｐＨ
安定性： 各種ｐＨの緩衝液に本酵素を溶解し、６０℃
、１時間処理 した。緩衝液はｐＨ８，ｐＨ４は ５０ ｍＭクエン酸−クエン酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ６，ｐＨ７，３ は同濃度のリン酸緩衝液、ｐＨ ９，４，ｐＨ１ｏ、５は同濃度のホウ 酸緩衝液を使用した。ｐＨ処理後 酵素液を５０ｍＭリン酸緩衝液 （ｐＨ７，８）で希釈し、０．６％カゼイン基質（ｐＨ
７，８）と７０°Ｃ，１時間反応させた。その結果、
ｐＨ ７，３以上では安定であるが、ｐＨ ６以下では不安定である。（第２ 図） （４）至適温度二 本酵素液（５０ｍＭボウ酸緩衝液、
ＰＨ９，４に溶解）１００μｔと （５） ０．６％カゼイン基質（ｐＨ９，４） ５００μｔを各種温度で１０分間 反応させた。その結果至適温度 は７０℃付近に存在する。（第 ３図） （５）熱安定性二 本酵素液（５０ｒｎＭホウ酸緩衝液
、ｐＨ９，４に溶解）を７０℃及 び８０℃で各時間処理し、その 後０６％カゼイン基質（ｐＨ９，４） と７０℃、１時間反応させ活性 を測定した。その結果７０℃。
安定性： 各種ｐＨの緩衝液に本酵素を溶解し、６０℃
、１時間処理 した。緩衝液はｐＨ８，ｐＨ４は ５０ ｍＭクエン酸−クエン酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ６，ｐＨ７，３ は同濃度のリン酸緩衝液、ｐＨ ９，４，ｐＨ１ｏ、５は同濃度のホウ 酸緩衝液を使用した。ｐＨ処理後 酵素液を５０ｍＭリン酸緩衝液 （ｐＨ７，８）で希釈し、０．６％カゼイン基質（ｐＨ
７，８）と７０°Ｃ，１時間反応させた。その結果、
ｐＨ ７，３以上では安定であるが、ｐＨ ６以下では不安定である。（第２ 図） （４）至適温度二 本酵素液（５０ｍＭボウ酸緩衝液、
ＰＨ９，４に溶解）１００μｔと （５） ０．６％カゼイン基質（ｐＨ９，４） ５００μｔを各種温度で１０分間 反応させた。その結果至適温度 は７０℃付近に存在する。（第 ３図） （５）熱安定性二 本酵素液（５０ｒｎＭホウ酸緩衝液
、ｐＨ９，４に溶解）を７０℃及 び８０℃で各時間処理し、その 後０６％カゼイン基質（ｐＨ９，４） と７０℃、１時間反応させ活性 を測定した。その結果７０℃。
２時間で約９０％残存し、８０
０ｃ、ｇｏ分では約１５％残存す
る。（第４図）
（６）分子量二 本酵素を５ｍＭのＤＦＰ（ジイソプロ
ピルフルオロリン酸）と ５０°ｃ、３ｏ分処理、あるいは １１５ｍＭの塩酸と室温で数１−分 処理して失活させたのち、同駄 の以下の組成物、すなわち６２ （６） ｍＭ）リス塩酸、２．８％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、 ５％β−メルカプトエタノール、 １０％グリセロール、 （ｐＨ６，８）を加えて、１０
０°Ｃ，ａ分間の処 理をし、レムリ（Ｌａｅｍｌｉ）の方 法〔ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ ）第２２７巻６８０
〜６８５頁（１９７０） ）に従ってＳＤＳポリアクリ
ルア ミドゲル電気泳動を行った。
ピルフルオロリン酸）と ５０°ｃ、３ｏ分処理、あるいは １１５ｍＭの塩酸と室温で数１−分 処理して失活させたのち、同駄 の以下の組成物、すなわち６２ （６） ｍＭ）リス塩酸、２．８％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、 ５％β−メルカプトエタノール、 １０％グリセロール、 （ｐＨ６，８）を加えて、１０
０°Ｃ，ａ分間の処 理をし、レムリ（Ｌａｅｍｌｉ）の方 法〔ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ ）第２２７巻６８０
〜６８５頁（１９７０） ）に従ってＳＤＳポリアクリ
ルア ミドゲル電気泳動を行った。
標準蛋白としては牛血清アルブ
ミン（分子量６７．０００）、卵白
アルブミン（分子量４３，０００）
カルボニック・アンヒドラーゼ
（分子量ａｏ、ｏｏｏ）、大豆トリ
プシンインヒビター（分子量
２０．１００）を使用した。
その結果、本酵素の分子量は
約２８，５００である。
（７）電気泳動： 本酵素を前記（６）項と同様の方（
７） 法によりＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動を行った。第 ５図に示すように本酵素は電気 泳動的に単一バンドが得られる。
７） 法によりＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動を行った。第 ５図に示すように本酵素は電気 泳動的に単一バンドが得られる。
（８）阻害剤二 本酵素液を各種阻害剤を含む５０ｍＭ
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，４） とともに５０°Ｃ９３０分間処理 したのち、０．６％カゼイン基質 （ｐＨ９，４）と７０℃、１時間反 応させ残存する活１生を測定した。
ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，４） とともに５０°Ｃ９３０分間処理 したのち、０．６％カゼイン基質 （ｐＨ９，４）と７０℃、１時間反 応させ残存する活１生を測定した。
本酵素はＤＦＰ （ノイソブロビル
フルオロリン酸）により著しく
阻害される。（第１表）
第１表 阻害剤の影響
（８）
＊ｔＤＦＰ ニジイソプロピルフルオロリン酸＊２Ｅ
ＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸＊３ＥＧＴＡ：エチレ
ングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル） Ｎ、 Ｎ’−四酢酸 ＊４ＰＣＭＢ：パラクロロマー午ユリンクペンゾエート 以１−の理化学的性質より、本酵素はアルカリ曲のセリ
ン酵素であると考えられる。
ＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸＊３ＥＧＴＡ：エチレ
ングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル） Ｎ、 Ｎ’−四酢酸 ＊４ＰＣＭＢ：パラクロロマー午ユリンクペンゾエート 以１−の理化学的性質より、本酵素はアルカリ曲のセリ
ン酵素であると考えられる。
（９）安定化剤： 本酵素液を１７７ＬＭ濃度のＣａ２
＋（ＣａＣ１２）を含む５０ｒｎＭグリシンー水酸化ナ
トリウム緩衝液 （ｐＨ９，５）とともに８０°Ｃで、 各時間処理したのち、残存する 活性を測定した。第６図に示す ように、本酵素はＣａ２＋イオン によって安定化される。
＋（ＣａＣ１２）を含む５０ｒｎＭグリシンー水酸化ナ
トリウム緩衝液 （ｐＨ９，５）とともに８０°Ｃで、 各時間処理したのち、残存する 活性を測定した。第６図に示す ように、本酵素はＣａ２＋イオン によって安定化される。
以ｔの性質を有する本酵素は、ソリュプルフロテイ７
（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ：食品添加＋７１
）の製造、ペブチノドの合成、洗剤用添加物、バイオリ
アクター等への利用が期待される。
（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ：食品添加＋７１
）の製造、ペブチノドの合成、洗剤用添加物、バイオリ
アクター等への利用が期待される。
（９）
耐熱性蛋白分解酵素アクアライシン■は、本発明者等が
すでに報告しているサーマス・カルドフィラスＧＫ−２
４の産生ずる耐熱性蛋白分解酵素およびサーマスＴ−３
５１の産生ずる耐熱性蛋白分解酵素カルトリシン（ＣＡ
ＬＤＯＬＹＳ ＩＮ）〔欧州特許２４１８２号参照〕と
は第２表に示すように、各種性質の全く異なる新規酵素
である。
すでに報告しているサーマス・カルドフィラスＧＫ−２
４の産生ずる耐熱性蛋白分解酵素およびサーマスＴ−３
５１の産生ずる耐熱性蛋白分解酵素カルトリシン（ＣＡ
ＬＤＯＬＹＳ ＩＮ）〔欧州特許２４１８２号参照〕と
は第２表に示すように、各種性質の全く異なる新規酵素
である。
本発明の耐熱性蛋白分解酵素アクアライノンＩは、サー
マス属番こ属するアクアライシン■生産微生物を好気的
に培養し、培養物からアクアライシンＩを取得すること
を特徴とする方法によって製造することができる。
マス属番こ属するアクアライシン■生産微生物を好気的
に培養し、培養物からアクアライシンＩを取得すること
を特徴とする方法によって製造することができる。
本発明において使用するアクアライシンＩ生産微生物は
、アクアライシン■を生産することができるサーマス属
に属するすべての菌株、突然変異株、変種を含む。その
好ましい菌株はサーマス・アクアティカフ、 ＡＴＣＣ
２５１０４（Ｔｈｅ −ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＡＴＣＣ２５１０４）である。
、アクアライシン■を生産することができるサーマス属
に属するすべての菌株、突然変異株、変種を含む。その
好ましい菌株はサーマス・アクアティカフ、 ＡＴＣＣ
２５１０４（Ｔｈｅ −ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＡＴＣＣ２５１０４）である。
サーマス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４の培養は
、本閑株が生育することのできる通常の（ｌＯ） 栄養源を含有する培地中で行うことができる。
、本閑株が生育することのできる通常の（ｌＯ） 栄養源を含有する培地中で行うことができる。
例えば、ポリペプトン、酵母エキス、グルコース、無機
塩類などを含む培地が用いられる。ビタミン、アミノ酸
は要求しない。培養は固体培養、液体培養、いずれでも
よいが、通常液体培養の方が工業的に有利である。又、
本菌株は好気性であるため、液体培養においては通気攪
拌を必須とする。
塩類などを含む培地が用いられる。ビタミン、アミノ酸
は要求しない。培養は固体培養、液体培養、いずれでも
よいが、通常液体培養の方が工業的に有利である。又、
本菌株は好気性であるため、液体培養においては通気攪
拌を必須とする。
培養温度は約４０〜７９℃の間ならば生育できるが、よ
り好ましくは７０°Ｃ＠後である。培地ｐＨは７〜８の
間で生胃ｉ■能である。ｐＨ５以下、９．５以上では生
育しない。培養時間は約１日で活性が最大に達する。さ
らζこ培養を延長すると、３日以降に生産される蛋白分
解酵素も存在するが、これはアクアライシン■とは別の
ものである。
り好ましくは７０°Ｃ＠後である。培地ｐＨは７〜８の
間で生胃ｉ■能である。ｐＨ５以下、９．５以上では生
育しない。培養時間は約１日で活性が最大に達する。さ
らζこ培養を延長すると、３日以降に生産される蛋白分
解酵素も存在するが、これはアクアライシン■とは別の
ものである。
このようにして耐熱性蛋白分解酵素アクアライシン■が
培地中に生成される。生成されたアクアライシンエの採
取、精製は公知の方法の組合せによって行うことができ
る。例えば、培養（１２） 液から遠心分離又は濾過によって菌体を除去したのち、
濾液又は上清を硫安塩析し、沈澱を１０ｍＭ’）ン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）に溶解する。本溶液を透析脱塩し、
０Ｍセルロースカラムに吸着させる。溶離は、０．１Ｍ
塩化カリウムを含む、１０ｍＭ ’）ン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）で行なわれる。溶離したアクアライシン工を透
析、濃縮、凍結乾燥すること番こより、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気電気的動的一バンドを与えるアクア
ライシン■粉末が得られる。
培地中に生成される。生成されたアクアライシンエの採
取、精製は公知の方法の組合せによって行うことができ
る。例えば、培養（１２） 液から遠心分離又は濾過によって菌体を除去したのち、
濾液又は上清を硫安塩析し、沈澱を１０ｍＭ’）ン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）に溶解する。本溶液を透析脱塩し、
０Ｍセルロースカラムに吸着させる。溶離は、０．１Ｍ
塩化カリウムを含む、１０ｍＭ ’）ン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）で行なわれる。溶離したアクアライシン工を透
析、濃縮、凍結乾燥すること番こより、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気電気的動的一バンドを与えるアクア
ライシン■粉末が得られる。
次に本酵素の活性測定法Ｏ二ついて述べる。
酵素液１００μｔと０．６％カゼイン溶液（５０ｍＭホ
ウ酸緩衝液、 ｐＨ９，４に溶解） ５００ ｕＬを
混合し、７０’Ｃ，８０分間反応させる。反応終了後、
５％トリクロル酢酸溶液を５００μを加え、沈澱を遠心
により除き、上清の２８０ｎｍの吸収の増〃口を測定す
る。１分間に２８０ ｎｍの吸収を０．００１上昇させ
る酵禦力を０．５単位とする。
ウ酸緩衝液、 ｐＨ９，４に溶解） ５００ ｕＬを
混合し、７０’Ｃ，８０分間反応させる。反応終了後、
５％トリクロル酢酸溶液を５００μを加え、沈澱を遠心
により除き、上清の２８０ｎｍの吸収の増〃口を測定す
る。１分間に２８０ ｎｍの吸収を０．００１上昇させ
る酵禦力を０．５単位とする。
以−Ｆ試験例、実施例により詳しく説明する。
（１３）
試験例１．サーマス属に属す保存菌株を用いて、耐熱性
蛋白分解酵素の生産能を調べた。
蛋白分解酵素の生産能を調べた。
ポリペプトンｏ、ｓ％、酵母エキス０．４％、 ＣａＳ
Ｏ４・２Ｈ２０６０〜／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１０
０”ｆ／ｌ、 ＮａＮ０ａ ６８９１Ｌｆ／ｌ、 Ｆ
ｅ Ｃ１ｇ ・５ Ｈ２Ｏ０，４”ｆ／１． ＭｎＳ
Ｏ４・５Ｈ２０３，１６ｑ／ｌ、 Ｚｎ８０４−７Ｈ２
００，５〜／ｌ、 ＨａＢＯａ ｏ、ｓｑ／ｚ。
Ｏ４・２Ｈ２０６０〜／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１０
０”ｆ／ｌ、 ＮａＮ０ａ ６８９１Ｌｆ／ｌ、 Ｆ
ｅ Ｃ１ｇ ・５ Ｈ２Ｏ０，４”ｆ／１． ＭｎＳ
Ｏ４・５Ｈ２０３，１６ｑ／ｌ、 Ｚｎ８０４−７Ｈ２
００，５〜／ｌ、 ＨａＢＯａ ｏ、ｓｑ／ｚ。
１）Ｈ７，２の組成の培地 各々２００ｍ１を５０〇−
容坂ロフラスコに入れ、各種保存菌株を接種して、７０
℃にて各時間培養し、培養液中の酵素活性を測定した。
容坂ロフラスコに入れ、各種保存菌株を接種して、７０
℃にて各時間培養し、培養液中の酵素活性を測定した。
その結果を第３表番こ示す。表から明らかなように、サ
ーマス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４以外にもサ
ーマス・サーモフィラスＡＴＣＣ２７６３４、サ マス
・カルドフィラスＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５７２３に若干
ではあるが本酵素活性生産能のあることがわかる。
ーマス・アクアティカスＡＴＣＣ２５１０４以外にもサ
ーマス・サーモフィラスＡＴＣＣ２７６３４、サ マス
・カルドフィラスＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、５７２３に若干
ではあるが本酵素活性生産能のあることがわかる。
（１４）
第８表
＊ｍ株名 Ａ：サーマス中アクアティカス（Ｔｈｅｒｍ
−ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２５１０４Ｂ：
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍ−ｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＡＴＣＣ２７６８４ Ｃ：サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍ−ｕｓ
ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ ） ＦＥＷｍ−Ｐ ＮＯ，５７２８ 実施例１．以下の組成の種培地２００ ｍｌを含む５０
０ ｍｔ容坂ロフラスコにサーマス・アクアティカスＡ
ＴＣＣ２５１０４の一白金耳を接種し７５°Ｃで１口振
とう培養した。
−ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２５１０４Ｂ：
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍ−ｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ＡＴＣＣ２７６８４ Ｃ：サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍ−ｕｓ
ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ ） ＦＥＷｍ−Ｐ ＮＯ，５７２８ 実施例１．以下の組成の種培地２００ ｍｌを含む５０
０ ｍｔ容坂ロフラスコにサーマス・アクアティカスＡ
ＴＣＣ２５１０４の一白金耳を接種し７５°Ｃで１口振
とう培養した。
ポリペプトン ０．８％
酵母エキス ０．４％
（１５）
無機塩類： ＣａＳＯ４−２Ｈｚ０ ６０ｍｙ／１Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０１００ ＮａＮＯ３６８９ ＦｅＣ４３・５Ｈ２００，４ Ｍｎ５Ｏ４−５Ｈ２０８，１６ ＺｎＳＯ４４Ｈ２００，５ Ｈ３ＢＯ３０，５ ｐＨ７，５ 上記培地組成と同一の培地１５ｔの入ったジャーファー
メンタ−に種培養液を１％接種し、６５°Ｃで２４時間
通気攪拌したところ、８００ｕ／ｍｌのアクアラインエ
を含む培養液が得られた。
ＳＯ４・７Ｈ２０１００ ＮａＮＯ３６８９ ＦｅＣ４３・５Ｈ２００，４ Ｍｎ５Ｏ４−５Ｈ２０８，１６ ＺｎＳＯ４４Ｈ２００，５ Ｈ３ＢＯ３０，５ ｐＨ７，５ 上記培地組成と同一の培地１５ｔの入ったジャーファー
メンタ−に種培養液を１％接種し、６５°Ｃで２４時間
通気攪拌したところ、８００ｕ／ｍｌのアクアラインエ
を含む培養液が得られた。
実施例２．実施例１で得られた培養液を遠心分離によっ
て菌体を除き、上清９２Ｏｍｔｃこ硫酸アンモニウムを
１００％飽和（こなるように加えた。冷却下、遠心分離
により沈澱を採取し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に溶解し、同じ緩衝液に透析した。透析液を
Ｌ ＯｍＭ ’）ノ酸緩ｆＩｆＩｆｅＬ（ｐＨ６，０）
テ平衡化ＬりＣＭセルロースカラム（径２．８ｃＴｎ
、高さ２．７６ｚ）に吸着させ（１６） た。０．１Ｍ塩化カリウムを含む１０ ｍＭ ’）ン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で溶離を行い、活性画分を集めた
。活性画分を透析脱塩、濃縮、凍結乾燥して６２．９０
０ ｕ／ＩＷのアクアライシンエ粉末を得た。
て菌体を除き、上清９２Ｏｍｔｃこ硫酸アンモニウムを
１００％飽和（こなるように加えた。冷却下、遠心分離
により沈澱を採取し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に溶解し、同じ緩衝液に透析した。透析液を
Ｌ ＯｍＭ ’）ノ酸緩ｆＩｆＩｆｅＬ（ｐＨ６，０）
テ平衡化ＬりＣＭセルロースカラム（径２．８ｃＴｎ
、高さ２．７６ｚ）に吸着させ（１６） た。０．１Ｍ塩化カリウムを含む１０ ｍＭ ’）ン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で溶離を行い、活性画分を集めた
。活性画分を透析脱塩、濃縮、凍結乾燥して６２．９０
０ ｕ／ＩＷのアクアライシンエ粉末を得た。
このアクアライシンエ粉末はポリアクリルアミドゲルデ
ィスク成気泳動的に単一であった。精製の要約を第４表
に示す。
ィスク成気泳動的に単一であった。精製の要約を第４表
に示す。
第４表
第１図は本発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、第２
図は同じ＜ ｐｔ（安定性を、第３図は（１７） 至適温度を、第４図は熱安定性をそれぞれ示す図である
。第５図は本酵素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示す写真であり、第６図はＣａ２＋イオン
の熱安定性に対する影響を示す図である。 特許出願人 天野製薬株式会社 （１８） 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 Ｈ 第２図 第 ３ 図 ４０ ６０ ８０ １００温
度（６Ｃ） 第４図 時間（ｈｒ） 第５図 時間（分） 手 続 補 正 書（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５７年特許願第３６８３４号 ２ 発明の名称 耐熱性蚤自分解酵素アクアライ／ン１およびその１＃ヘ
リ、３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 愛知県名古啜市中区錦−下目２番７号４ 補
正命令の日付 昭和５７年６月２９日 ５、補正の対策 ［明細書の図面の簡単な説明のａｌ及び［図而１６ 補
正の内容 （１１明細、！Ｆ第１８ページ２行から３行の［第５図
は本酵素のＳＤＳポリγタリルアミドゲル醒気泳動の結
果を示す写真で滲、す、」を−１除する。 （２）明細書第１８ページ４行「第６図」を「第５図」
に訂正する。 （６１添付図面中「第５図」を削除する。 （４１添付図面中「第６図」を「第５図」に訂正する。 ＋５１ ａｍで書いた図面の浄書（内容に変更なし）
を補正する。
図は同じ＜ ｐｔ（安定性を、第３図は（１７） 至適温度を、第４図は熱安定性をそれぞれ示す図である
。第５図は本酵素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示す写真であり、第６図はＣａ２＋イオン
の熱安定性に対する影響を示す図である。 特許出願人 天野製薬株式会社 （１８） 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 Ｈ 第２図 第 ３ 図 ４０ ６０ ８０ １００温
度（６Ｃ） 第４図 時間（ｈｒ） 第５図 時間（分） 手 続 補 正 書（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５７年特許願第３６８３４号 ２ 発明の名称 耐熱性蚤自分解酵素アクアライ／ン１およびその１＃ヘ
リ、３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 愛知県名古啜市中区錦−下目２番７号４ 補
正命令の日付 昭和５７年６月２９日 ５、補正の対策 ［明細書の図面の簡単な説明のａｌ及び［図而１６ 補
正の内容 （１１明細、！Ｆ第１８ページ２行から３行の［第５図
は本酵素のＳＤＳポリγタリルアミドゲル醒気泳動の結
果を示す写真で滲、す、」を−１除する。 （２）明細書第１８ページ４行「第６図」を「第５図」
に訂正する。 （６１添付図面中「第５図」を削除する。 （４１添付図面中「第６図」を「第５図」に訂正する。 ＋５１ ａｍで書いた図面の浄書（内容に変更なし）
を補正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する耐熱性蛋白分解酵素アク
アライシンＩ。 （１） 作 用： カゼイン等の蛋白質に作用して
トリクロル酢酸溶液に可溶 性のオリゴペプチドあるいは アミノ酸を生ずる。 （２）至Ｘｌ１ｐＨ： ｐ）Ｉ ９．４以上。 （３） ｐＨ安定性： ｐＨ７Ｊ以上で安定、ｐＨ
６以下では不安定。 （４） 至４ｉ１１ｉ［： ７０ ｃｃ付近。 （５）熱安定性： ７０℃、２時間で約９０％残存し、
８０℃、３０分では約 １５％残仔する（Ｃａ２拘狛在Ｆ）。 （６）分子量： 約２８，５００（Ｓｉ）Ｓボリア（１
） クリルアミドゲル電気泳動法 による。） （７）［害剤： ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリ
ン酸）により著しく阻 害される。 （８）安定化剤＝ ２価金属イオン、例えばＣａ″イオ
ン番こより安定化される。 ２ サーマス属に属する菌株を培養し培養物から耐熱性
蛋白分解酵素アクアラインン■を取得することを特徴と
する耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンエの製造法。 ３ サーマス属に属する菌株がサーマス・アクアティカ
スＡＴＣＣ２５１０４である特許請求の範囲第２項記載
の耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンエの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3683482A JPS58152482A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3683482A JPS58152482A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58152482A true JPS58152482A (ja) | 1983-09-10 |
| JPS6123994B2 JPS6123994B2 (ja) | 1986-06-09 |
Family
ID=12480768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3683482A Granted JPS58152482A (ja) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | 耐熱性蛋白分解酵素アクアライシンｉおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58152482A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214182A (ja) * | 1987-03-02 | 1988-09-06 | Oriental Yeast Co Ltd | 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0795898B2 (ja) * | 1992-10-30 | 1995-10-18 | 合名会社中村産業 | 土壌改良法 |
-
1982
- 1982-03-08 JP JP3683482A patent/JPS58152482A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63214182A (ja) * | 1987-03-02 | 1988-09-06 | Oriental Yeast Co Ltd | 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製法 |
| JP2639803B2 (ja) * | 1987-03-02 | 1997-08-13 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 耐熱性イソクエン酸脱水素酵素の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6123994B2 (ja) | 1986-06-09 |
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